WO2001090752A1 - Verfahren zur herstellung einer mit biomolekülen beschichteten elektrode - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer mit biomolekülen beschichteten elektrode Download PDF

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WO2001090752A1
WO2001090752A1 PCT/DE2001/001996 DE0101996W WO0190752A1 WO 2001090752 A1 WO2001090752 A1 WO 2001090752A1 DE 0101996 W DE0101996 W DE 0101996W WO 0190752 A1 WO0190752 A1 WO 0190752A1
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electrode
solution
biomolecules
composite
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PCT/DE2001/001996
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Jürgen KRAUSE
Armin Misch
Jürgen SCHÜLEIN
Jörg HASSMANN
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november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the invention relates to a method for producing an electrode coated with biomolecules as well as an electrode produced by this method and their use.
  • the invention relates generally to the field of electrochemical enrichment of biomolecules on electrically conductive surfaces. For this purpose, it is known to immobilize affine biomolecules on the surfaces of the biomolecules to be enriched.
  • WO 95/12808 a plurality of separately addressable electrodes are known, which are arranged in reaction locations. By applying different voltages to the electrodes, certain predetermined reactions can take place on the electrodes.
  • the electrodes have functional
  • the functional groups are arranged here in an intermediate layer.
  • the manufacture of the device is complex.
  • the provision of an intermediate layer on the electrodes is cumbersome.
  • WO 96/01836 describes a chip for the detection of polynucleotide sequences.
  • the chip can be made from a silicon substrate, for example.
  • a large number of reaction fields are provided on the chip, to each of which a predetermined polynucleotide sequence is bound. If the chip is immersed in a solution containing the polynucleotide sequence to be detected, hybridization occurs with the am Chip immobilized complementary nucleotide sequence. The hybridization is detected by fluorescence. - The manufacture of such chips is complex. The verification procedure that can be carried out with this is time-consuming and costly.
  • An electrode is known from US Pat. No. 5,871,918, on the surface of which an electrically conductive polymer film is applied. Polynucleotides are bound to the polymer film. A hybridization with complementary polynucleotides contained in a detection solution is detected electrochemically with intercalating maker molecules. - The process is time consuming because the hybridization is slow.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a method for producing an electrode and an electrode are to be specified which are simple and inexpensive to produce and moreover can be provided with a high occupancy density of biomolecules.
  • Another object of the invention is to reduce the electrical resistance of such an electrode on the surface.
  • the occupancy density can also be varied by varying the parameters of the solution, e.g. pH value, temperature, duration of treatment and the like , can be varied.
  • the process provides electrodes with a significantly improved conductivity. It's easy to do.
  • the electrodes produced are inexpensive.
  • the plastic is a polyester, preferably a polycarbonate.
  • the electrically conductive substance can be carbon fiber or soot. In order to always ensure good electrical conductivity within the composite, it is necessary for the electrically conductive particles to be in point or surface contact with one another.
  • the composite is lit. b treated with an acidic or a basic further solution.
  • Such treatment drastically increases the free binding sites in the plastic, especially in the polycarbonate plastic.
  • a drastically increased density of oligonucleotides can be achieved.
  • the further solution can be an aqueous NaOH or KOH solution.
  • the further solution can be heated to a temperature of up to 90 ° C. It has also proven expedient to treat the composite with the further solution for up to four hours.
  • an electrode is proposed, made from a composite which is formed from an electrically conductive substance bound with plastic and to the surface of which biomolecules are bound. It can be manufactured easily and cheaply. - A micro-roughness expediently generated by treatment with an acidic or a basic solution surprisingly leads to a drastic increase in the coverage density with biomolecules and to an improved conductivity of the electrode. Because of the further configurations of the electrode, reference is made to the previous statements relating to the method.
  • the use of the electrode according to the invention for enriching further biomolecules from a sample solution is also claimed, the further biomolecules having an affinity for the bound biomolecules.
  • Affinity is understood to mean any interaction between biomolecules that leads to binding or attachment.
  • An affinity exists in particular between complementary DNA or RNA or similar molecules that can hybridize.
  • biomolecules by cyclic polarity reversal on the
  • 2 shows a scanning electron micrograph of a treated composite
  • 3 shows the dependence of the occupancy density on the temperature and the duration of treatment
  • Fig. 8 shows the measurement signals of Fig. 7, wherein the background has been subtracted.
  • Fig. 1 shows a composite formed from carbon fibers bonded with polycarbonate.
  • the carbon fibers are in point or surface contact with one another, so that electrical conductivity is ensured by the composite.
  • the surface is essentially covered with polycarbonate.
  • FIG. 2 shows the composite according to FIG. 1 after a 2-hour treatment with 70 M aqueous 5M NaOH. In comparison to FIG. 1, carbon fibers are exposed on the surface or protrude beyond it.
  • a composite which consists of carbon fibers bonded with polycarbonate.
  • the length of the composite is about 130mm, its diameter is about 2mm.
  • the composite is treated for three hours at 70 ° C. in an aqueous 5M NaOH solution and then rinsed three times with distilled water.
  • oligonucleotides are bound directly to the composite pretreated in this way.
  • an oligonucleotide can be used, for example, as shown in the attached Sequence Listing No. 2.
  • the 5 'end of the oligonucleotide is provided with an NH 2 group.
  • Monohydrate, 10 M MgCl 2 , 50 ul 50mM EDTA (pH 5.5) and 10nM of the aforementioned oligonucleotide contains.
  • the composite is treated at a temperature of 37 ° C for two hours in 10 ml of the aforementioned reaction solution. The composite is then washed five times with lxPBS.
  • a fluorescin dithio group can be coupled at its 5 'end.
  • the oligonucleotide is provided at its 3 'end with an NH 2 group and above it bound with the polycarbonate of the composite.
  • the fluoresccin-dithio group can be cleaved off with dithiothreitol and the fluorescence of the released fluorescin in the solution can then be measured.
  • a pH of 8.3 to 8.5 is expediently entered. and treated with 100mM dithiothreitol. The results obtained are shown in FIG. 3.
  • the occupancy density increases with the concentration of the aqueous NaOH solution, with the duration of the treatment and with the temperature of the aqueous NaOH solution.
  • the treatment time of the results shown at 60 ° C was one hour.
  • the concentration of the results shown at 70 and 80 ° C was 5M each.
  • a composite which, for example, consists of carbon fibers or soot particles bound with polycarbonate.
  • the length of the composite is approximately 130 mm and its diameter is approximately 2 mm.
  • the composite is first treated at 80 ° C. in an aqueous 10% SDS solution for one hour and then rinsed three times with Milli-Q water. Then the composite is treated for one minute at 70 ° C. in aqueous 5M NaOH solution and then rinsed 3 times with Milli-Q water.
  • oligonucleotides are bound directly to the composite which has been pretreated in this way.
  • An oligonucleotide with the following sequence can be used for this:
  • CGTAAGCGGAAAATCTGTCTCA The 5 ⁇ end of the oligonucleotide is provided with an NH2 group.
  • a solution is prepared which contains 100mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, 5mM N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt, 100mM (2nd - [N-Morpholino] ethanesulfonic acid) monohydrate (pH5.5), lOmM MgC12 and lOnM of the aforementioned oligonucleotide.
  • the composite is treated at room temperature for two hours in 10 ml of the aforementioned reaction solution.
  • the composite is then washed three times with lxPBS.
  • the electrodes produced in this way can additionally be treated with a solution of, for example, 1% casein in IxPBS (blocking of the surface) in order to be able to prevent non-specific binding of biomolecules.
  • Track C shows a result in which, after the potential has been applied, an opposite potential of minus 0.5 V has been set for 30 seconds in order to repel unspecifically enriched molecules with a negative charge. This shows a particularly strong gang at lOObp. Lanes D and E show results in which no potential has been applied to the electrode. There are no signs of lOObp. An enrichment of the oligonucleotide to be detected from the
  • Lanes F to I show results of experiments in which oligonucleotides with a length of 100 bp contain comparative solutions have been subjected to a PCR in the presence of the electrode according to the invention.
  • the PCR was carried out without the presence of the electrode. It can be seen that the electrode according to the invention apparently inhibits the PCR.
  • Electrodes produced according to the second example under "Manufacture of electrodes" are immersed in a solution which contains lithium DNA (approx. 2 kb).
  • the oligonucleotide bound to the electrode has a sequence that is complementary to a section of the Listeria DNA.
  • a potential is applied to the electrode for 5 min, which is cyclically inverted between +0.6 V and -0.6 V 200 times and ends at -0.6 V.
  • the electrode is then washed three times with 10% SDS solution at 50 ° C. and three times three minutes with 0.5 ⁇ TBE / 0, 1MNaCl at 50 ° C., each time with shaking.
  • the DNA bound from the solution is cleaved thermally at 95 ° C. in 10 mM Tris pH9. A quantitative PCR is then carried out with this solution.
  • FIG. 5 shows the accumulation of L. monocytogenes DNA (148 bp) on electrodes to which (A) an oligonucleotide is bound and to which (B) no oligonucleotide is bound.
  • An electrical potential was applied for enrichment for five minutes, which was cyclically reversed between +0.6 V and -0.6 V 200 times and ended at -0.6 V.
  • Electrodes produced according to the above-mentioned method are suitable for specifically detecting biomolecules by electrochemical methods.
  • an electrode is immersed in a solution that contains the biomolecule to be detected.
  • a platinum electrode for example, serves as the counter electrode.
  • An Ag / AgCl electrode could serve as the reference electrode.
  • Various electrochemical methods for the detection of biomolecules can be carried out with this arrangement.
  • Potential stripping analysis (PSA) is particularly suitable for detecting oligonucleotides with this arrangement.
  • the solution to be examined contains a biomolecule (1) which has an affinity for a biomolecule (2) bound to the surface of an electrode produced by the above-mentioned method
  • the biomolecule can be specifically detected. If the biomolecule (1) carries an electrical charge, it can be specifically enriched by applying an electrical field and in particular by cyclical field inversion on the electrode surface. It is then possible to detect the biomolecule using an electrochemical method, for example PSA.
  • an exemplary embodiment is explained below in which an electrode is used which consists of a composite of polycarbonate and carbon black.
  • Fig. 7 shows PSA measurement curves of the arrangement described above.
  • Curve A shows a measurement, the solution containing no oligonucleotide. If the solution contains an oligonucleotide that has the sequence AGAGAGAGAGAGAG, the measurement curves B, C and D are obtained for concentrations of l ⁇ g / ml, lO ⁇ g / ml and 15 / xg / ml.
  • the background measurement signal can be approximately mathematically calculated. If it is subtracted from the measurement curves, curves are obtained which are shown in FIG. 8.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode mit folgenden Schritten: (a) Bereitstellen eines Komposits, das aus einem mit Kunststoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff hergestellt ist, (b) Bereitstellen eines Komposits, das aus einem mit Kunststoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff hergestellt ist und (c) Behandeln des Komposits mit einer das Biomolekül enthaltenden Lösung, wobei das Biomolekül an die Oberfläche des Kunststoffs gebunden wird.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode sowie eine nach diesem Verfahren hergestellte Elektrode und deren Verwendung.
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der elektrochemischen Anreicherung von Biomolekülen auf elektrisch leitfähigen Oberflächen. Dazu ist es bekannt auf den Oberflächen zu den anzureichernden Biomoleküle affine Biomoleküle zu immobilisieren.
Aus der WO 95/12808 ist eine Mehrzahl separat adressierbarer Elektroden bekannt, welche in Reaktionslokalitäten angeordnet sind. Indem unterschiedliche Spannungen an die Elektroden angelegt werden, können bestimmte vorgegebene Reaktionen an den Elektroden stattfinden. Die Elektroden weisen funktionelle
Gruppen zum Binden von Biomolekülen auf. Die funktioneilen Gruppen sind hier in einer Zwischenschicht angeordnet. - Die Herstellung der Vorrichtung ist aufwendig. Insbesondere ist das Vorsehen einer Zwischenschicht auf den Elektroden um- ständlich.
In der WO 96/01836 ist ein Chip zum Nachweis von Polynukleo- tidseguenzen beschrieben. Der Chip kann z.B. aus einem Siliziumsubstrat hergestellt sein. Auf dem Chip ist eine Vielzahl von Reaktionsfeldern vorgesehen, an die jeweils eine vorgegebene Polynukleotidsequenz gebunden ist. Sofern der Chip in eine die nachzuweisende Polynukleotidsequenz enthaltende Lösung getaucht wird, kommt es zur Hybridisierung mit der am Chip immobilisierten komplementären Nukleotidsequenz . Die Hybridisierung wird durch Fluoreszenz nachgewiesen. - Die Herstellung solcher Chips ist aufwendig. Das damit durchführbare Nachweisverfahren ist zeit- und kostenaufwendig.
Aus der US 5,871,918 ist eine Elektrode bekannt, auf deren Oberfläche ein elektrisch leitender Polymerfilm aufgebracht ist. An dem Polymerfilm sind Polynukleotide gebunden. Eine Hybridisierung mit dazu komplementären in einer Nachweislö- sung enthaltenen Polynukleotiden wird elektrochemisch mit in- terkalierenden Makermolekülen nachgewiesen. - Das Verfahren ist zeitaufwendig, da die Hybridisierung langsam vor sich geht .
Aus der WO 98/02399 ist eine aus Kunststoff hergestellte
Elektrode bekannt, auf der unmittelbar Biomoleküle immobilisiert sind. - Die Elektrode hat den Nachteil, daß die Belegungsdichte der Biomoleküle an der Oberfläche der Elektrode relativ gering und nicht variierbar ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer Elektrode sowie eine Elektrode angegeben werden, die einfach und billig herstell- bar ist und überdies mit einer hohen Belegungsdichte an Biomolekülen versehen werden kann. Weiteres Ziel der Erfindung ist es, den elektrischen Widerstand einer solchen Elektrode an der Oberfläche zu erniedrigen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 12, 22 und 24 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 11, 13 bis 21 und 23. Nach Maßgabe der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung mit einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode mit folgenden Schritten vorgeschlagen:
a) Bereitstellen eines Komposits, das aus einem mit Kunststoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff hergestellt ist und
b) Behandeln des Komposits mit einer das Biomolekül enthal- tenden Lösung, wobei das Biomolekül an die Oberfläche des Kunststoffs gebunden wird.
Mit dem vorgeschlagenen Verfahren ist es auf überraschend einfache Weise möglich, die Belegungsdichte der auf der Ober- fläche des Kunststoffs gebundenen Biomoleküle drastisch zu erhöhen. Die Belegungsdichte kann überdies durch eine Variation der Parameter der Lösung, wie z.B. pH-Wert, Temperatur, Behandlungsdauer und dgl . , variiert werden. Das Verfahren liefert Elektroden mit einer wesentlich verbesserten Leitfä- higkeit . Es ist einfach durchzuführen. Die hergestellten Elektroden sind kostengünstig.
Nach einem Ausgestaltungsmerkmal ist der Kunststoff ein Polyester, vorzugsweise ein Polykarbonat . Der elektrisch leitfä- hige Stoff kann Kohlefaser oder Ruß sein. Um stets eine gute elektrische Leitfähigkeit innerhalb des Komposits zu gewährleisten, ist es erforderlich, daß die elektrisch leitfähigen Partikel untereinander im Punkt- oder Flächenkontakt sich befinden.
Untersuchungen haben gezeigt, daß durch die Behandlung des Kunststoffs mit einer sauren oder basischen weiteren Lösung u.a. Polyesterbindungen aufgebrochen werden. Die Bindung des Biomoleküls an den Kunststoff ist zweckmäßigerweise ein kova- lente Bindung. Der Lösung kann als Biomolekül ein Oligonu- kleotid zugegeben werden, dessen 5 ' -Ende eine NH2-Gruppe aufweist. Der zweiten Lösung kann ferner mindestens einer der folgenden Stoffe zugesetzt sein: l-Ethyl-3- (3-Dimethylamino- propyl) carbodiimid-hydrochlorid, Hydroxysulfosuccinimid- Natriumsalz, (2- [N-Morpholino] ethan-sulfonsäure Monohydrat, Magnesiumchlorid, EDTA.
Nach einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird das Komposit vor dem Schritt lit. b mit einer saueren oder einer basischen weiteren Lösung behandelt. Eine solche Behandlung erhöht drastisch die freien Bindungsstellen im Kunststoff, insbesondere im Polykarbonat-Kunststoff. Es kann damit eine drastisch erhöhte Belegungsdichte an Oligonukleo- tiden erzielt werden. Bei der weiteren Lösung kann es sich um eine wäßrige NaOH- oder KOH-Lösung handeln. Die weitere Lösung kann auf eine Temperatur von bis zu 90°C erwärmt werden. Es hat sich weiter als zweckmäßig erwiesen, das Komposit bis zu vier Stunden mit der weiteren Lösung zu behandeln.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung wird eine Elektrode vorgeschlagen, hergestellt aus einem Komposit, das aus einem mit Kunststoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff gebildet ist, und an dessen Oberfläche Biomoleküle gebunden sind. Sie kann einfach und billig hergestellt werden. - Eine zweckmäßigerweise durch Behandlung mit einer sauren oder eine basischen weiteren Lösung erzeugte Mikrorauhigkeit führt überraschenderweise zu einer drastischen Erhöhung der Belegungs- dichte mit Biomolekülen sowie zu einer verbesserten Leitfähigkeit der Elektrode. Wegen der weiteren Ausgestaltungen der Elektrode wird auf die vorangegangenen das Verfahren betreffende Ausführungen verwiesen.
Beansprucht wird außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen Elektrode zum Anreichern von weiteren Biomolekülen aus einer Probenlösung, wobei die weiteren Biomoleküle eine Affinität zu den gebundenen Biomolekülen aufweisen. Unter Affinität wird jegliche Wechselwirkung zwischen Biomolekülen ver- standen, die zu einer Bindung oder Anlagerung führt. Eine Affinität besteht insbesondere zwischen komplementären DNA- oder RNA- oder ähnlichen Molekülen, die hybridisieren können.
Nach einer Ausgestaltung der Verwendung ist vorgesehen, daß die weiteren Biomoleküle durch zyklische Umpolung auf der
Oberfläche angereichert werden. Dadurch kann die Effektivität der erfindungsgemäßen Elektrode nochmals erheblich verbessert werden.
Schließlich wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Elektrode zum quantitativen elektrochemischen Nachweis von Biomolekülen beansprucht .
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines unbehandelten Komposits,
Fig. 2 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines behandelten Komposits, Fig. 3 die Abhängigkeit der Belegungsdichte von der Temperatur und der Behandlungsdauer,
Fig. 4 die Anreicherung von weiteren Biomoleküle an der Oberfläche der erfindungsgemäßen Elektrode,
Fig. 5 die Anreicherung von L. monocytogenes DNA an verschiedenen Elektroden,
Fig. 6 die Anreicherung von L. monocytones DNA an verschiedenen weiteren Elektroden,
Fig. 7 Meßsignale einer PSA-Messung und
Fig. 8 die Meßsignale nach Fig. 7, wobei der Untergrund subtrahiert worden ist.
Fig. 1 zeigt ein Komposit, das aus mit Polykarbonat gebundenen Kohlefasern gebildet ist. Die Kohlefasern sind unterein- ander im Punkt- oder Flächenkontakt, so daß eine elektrische Leitfähigkeit durch das Komposit gewährleistet ist. Die Oberfläche ist im wesentlichen mit Polykarbonat überzogen.
Fig. 2 zeigt das Komposit gemäß Fig. 1 nach einer 2-stündigen Behandlung mit 70°C heißer wäßriger 5M NaOH. Im Vergleich zu Fig. 1 liegen an der Oberfläche Kohlefasern frei oder ragen darüber hinaus . Herstellung einer Elektrode 1.Beispiel :
Es wird ein Komposit hergenommen, welches aus mit Polykarbonat gebundenen Kohlefasern besteht. Die Läge des Komposits beträgt etwa 130mm, sein Durchmesser etwa 2 mm. Das Komposit wird drei Stunden bei 70°C in wäßriger 5M NaOH-Lösung behandelt und anschließend drei mal mit destilliertem Wasser gespült. An das so vorbehandelte Komposit werden in einem zweiten Schritt unmittelbar Oligonukleotide gebunden. Dazu kann beispielsweise ein Oligonukleotid hergenommen werden, wie es im anhängenden Sequenzprotokoll Nr. 2 wiedergegeben ist. Das Oligonukleotid ist an seinem 5 ' -Ende mit einer NH2-Gruppe versehen. Um ein solches 5 ' -NH2-derivatisiertes Oligonukleotid an die Oberfläche des Komposits zu binden, wird eine Lö- sung hergestellt, die 0,26 Ml-Ethyl-3- (3-Dimethylamino- propyl) carbodiimid-hydrochlorid, l,4mM N-Hydroxysulfosuccin- imid-Natriumsalz, 14mM (2- [N-Morpholino] ethan-sulfonsäure)
Monohydrat, lO M MgCl2, 50 μl 50mM EDTA (ph 5,5) und lOnM des vorgenannten Oligonukleotids enthält. Das Komposit wird bei einer Temperatur von 37°C zwei Stunden in 10ml der vorgenannten Reaktionslδsung behandelt. Anschließend wird das Komposit fünf mal mit lxPBS gewaschen.
Zur Bestimmung der erzielten Belegungsdichte mit dem Oligonu- kleotid kann an dessen 5 ' -Ende eine Fluorescin-Dithio-Gruppe gekoppelt werden. Das Oligonukleotid wird in diesem Fall an seinem 3 ' -Ende mit einer NH2-Gruppe versehen und darüber mit dem Polykarbonat des Komposits gebunden. Zur Messung der Menge des auf der Oberfläche gebundenen Oligonukleotids kann nach Waschen der Oberfläche die Fluoresccin-Dithio-Gruppe mit Dithiothreitol abgespalten und anschließend die Fluoreszenz des freigewordenen Fluorescins in der Lösung gemessen werden. Zweckmäßigerweise wird dazu ein ph von 8,3 bis 8,5 einge- stellt und mit lOOmM Dithiothreitol behandelt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Darin ist die Belegungsdichte vom Oligonukleotid an der Oberfläche eines behandelten Komposits gemäß Fig. 2 gezeigt. Die Belegungsdichte nimmt mit der Konzentration der wäßrigen NaOH-Lösung, mit der Behandlungsdauer sowie mit der Temperatur der wäßrigen NaOH- Lösung zu. Die Behandlungsdauer der bei 60°C gezeigten Ergebnisse hat eine Stunde betragen. Die Konzentration der bei 70 und 80°C gezeigten Ergebnisse hat jeweils 5M betragen.
2. Beispiel :
Es wird ein Komposit hergenommen, welches beispielsweise aus mit Polykarbonat gebundenen Kohlefasern oder Rußpartikeln besteht. Die Länge des Komposits beträgt etwa 130 mm, sein Durchmesser etwa 2 mm. Das Komposit wird erst eine Stunde bei 80°C in wäßriger 10% SDS-Lösung behandelt und anschließend drei mal mit Milli-Q-Wasser gespült. Dann wird das Komposit eine Minute bei 70°C in wäßriger 5M NaOH-Lösung behandelt und anschließend 3mal mit Milli-Q-Wasser gespült. An das so vor- behandelte Komposit werden in einem zweiten Schritt unmittelbar Oligonukleotide gebunden. Dazu kann ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz verwendet werden:
CGTAAGCGGAAAATCTGTCTCA. Das Oligonukleotid ist an seinem 5λ- Ende mit einer NH2-Grupe versehen. Um ein solches 5*-NH2- derivatisiertes Oligonukleotid an die Oberfläche des Komposits zu binden, wird eine Lösung hergestellt, die lOOmM 1- Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimid-hydrochlorid, 5mM N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz, lOOmM (2- [N- Morpholino] ethansulfonsäure) Monohydrat (pH5,5), lOmM MgC12 und lOnM des vorgenannten Oligonukleotids. Das Komposit wird bei Raumtemperatur zwei Stunden in 10ml der vorgenannten Reaktionslösung behandelt. Anschließend wird das Komposit drei mal mit lxPBS gewaschen. Alternativ können die so hergestellten Elektroden noch zusätzlich mit einer Lösung von z.B. 1% Casein in IxPBS behandelt werden (Blocken der Oberfläche) , um unspezifische Bindung von Biomolekülen verhindern zu können.
Anreicherung von Oligonukleotiden an der Elektrode
1. Beispiel:
Zum Nachweis der Anreicherung wird eine nach dem vorgenannten
Verfahren hergestellte Elektrode in eine Lösung getaucht, welche ein zum an die Oberfläche der Elektrode gebundenes komplementäres nachzuweisendes Oligonukleotid enthält. Ein solches Oligonukleotid ist im anhängenden Sequenzprotokoll Nr. 1 gezeigt. Das nachzuweisende Oligonukleotid weist eine Länge von lOObp auf. Anschließend wird ein Stück der Elektro- de in eine PCR-Lδsung gebracht; die aus der Lösung gebundenen nachzuweisenden Oligonukleotide werden thermisch bei 95° C abgespalten. Es wird eine PCR durchgeführt und Amplifikati- onsprodukte durch Gelelektrophorese nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Die Spur A in Fig. 4 zeigt ei- nen Standard. Bei der Spur B ist ein Potential von IV gegen eine Ag/AgCl-Elektrode für 60 Sekunden angelegt worden. Es ist eine starke Bande bei 100 bp erkennbar. In der Spur C ist ein Ergebnis gezeigt, bei dem nach dem Anlegen des Potentials ein entgegengesetztes Potential von minus 0,5V für 30 Sekun- den eingestellt worden ist, um unspezifisch angereicherte Moleküle mit negativer Ladung abzustoßen. Hier zeigt sich eine besonders starke Bande bei lOObp. In den Spuren D und E sind Ergebnisse gezeigt, bei denen kein Potential an die Elektrode angelegt worden ist. Es ist keine Bande bei lOObp erkennbar. Eine Anreicherung des nachzuweisenden Oligonukleotids aus der
Lösung hat hier also nicht stattgefunden. In den Spuren F bis I sind Ergebnisse von Versuchen aufgetragen, bei denen Oligonukleotide mit einer Länge von lOObp enthaltende Vergleichs- lösungen in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Elektrode einer PCR unterzogen worden sind. Bei dem Ergebnis gemäß der Spur J ist die PCR ohne Anwesenheit der Elektrode durchgeführt worden. Es zeigt sich, daß die erfindungsgemäße Elektrode die PCR offenbar hemmt.
2. Beispiel :
Nach dem 2. Beispiel unter "Herstellung von Elektroden" hergestellte Elektroden werden in eine Lösung getaucht, die Li- sterien-DNA (ca. 2kb) enthält. Das an der Elektrode gebundene Oligonukleotid hat eine Sequenz, die komplementär zu einem Abschnitt der Listerien-DNA ist. An die Elektrode wird für 5 min ein Potential angelegt, das zwischen +0,6 V und -0,6 V 200 mal zyklisch invertiert wird und bei -0,6 V endet. An- schließend wird die Elektrode lmal drei Minuten mit 10%-SDS- Lösung bei 50°C und 3mal drei Minuten mit 0,5xTBE / 0 , lMNaCl bei 50°C, jeweils unter Schütteln, gewaschen. Die aus der Lösung gebundene DNA wird thermisch bei 95°C in lOmM Tris pH9 abgespalten. Anschließend wird mit dieser Lösung eine quanti- tative PCR durchgeführt.
Fig. 5 zeigt die Anreicherung von L. monocytogenes DNA (148bp) an Elektroden an die (A) ein Oligonukleotid gebunden ist und an die (B) kein Oligonukleotid gebunden ist. Zur An- reicherung ist jeweils fünf Minuten ein elektrisches Potential angelegt worden, das zwischen +0,6 V und -0,6 V 200mal zyklisch umgepolt worden ist und bei -0,6 V endet.
Fig. 6 zeigt die Anreicherung von L. monocytogenes DNA (148bp) an Elektroden an die
A) ein Oligonukleotid gebunden ist und ein elektrisches Potential von 0,6 V für zehn Minuten angelegt worden ist, B) kein Oligonukleotid gebunden ist und ein elektrisches Potential von 0,6 V für zehn Minuten angelegt worden ist,
C) ein Oligonukleotid gebunden ist und kein elektrisches Po- tential angelegt worden ist und
D) kein Oligonukleotid gebunden ist und kein elektrisches Potential angelegt worden ist.
Detektion von Biomolekülen an einer Elektrode
Nach vorstehend genanntem Verfahren hergestellte Elektroden sind geeignet, um Biomoleküle spezifisch durch elektrochemische Methoden nachzuweisen.
Zur Detektion von Biomolekülen, beispielsweise einem Oligonukleotid, wird eine Elektrode in eine Lösung getaucht, die das nachzuweisende Biomolekül enthält. Als Gegenelektrode dient beispielsweise eine Platin-Elektrode. Als Referenzelektrode könnte eine Ag/AgCl-Elektrode dienen. Mit dieser Anordnung können verschiedene elektrochemische Methoden zur Detektion von Biomolekülen durchgeführt werden. Insbesondere Potential Stripping Analysis (PSA) ist geeignet, um mit dieser Anordnung Oligonukleotid nachzuweisen.
Ist in der zu untersuchenden Lösung ein Biomolekül (1) enthalten, das zu einem an der Oberfläche einer nach vorstehend genanntem Verfahren hergestellten Elektrode gebundenen Biomolekül (2) eine Affinität besitzt, so kann das Biomolekül spe- zifisch nachgewiesen werden. Trägt das Biomolekül (1) eine elektrische Ladung, so kann es durch Anlegen eines elektrischen Feldes und insbesondere durch zyklische Feldinversion an der Elektrodenoberfläche spezifisch angereichert werden. Anschließend ist es möglich, das Biomolekül durch eine elektrochemische Methode, beispielsweise durch PSA, nachzuweisen.
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel erläutert, bei dem eine Elektrode verwendet wird, die aus einem Komposit aus Polykarbonat und Ruß besteht .
Fig. 7 zeigt PSA-Meßkurven der vorstehend beschriebenen Anordnung. Kurve A zeigt eine Messung, wobei die Lösung kein Oligonukleotid enthält. Enthält die Lösung ein Oligonukleotid, das die Sequenz AGAGAGAGAGAGAGAG besitzt, werden die Meßkurven B, C und D für Konzentrationen von lμg/ml, lOμg/ml und 15/xg/ml erhalten. Das Untergrund-Meßsignal läßt sich mathematisch annähernd berechnen. Wird es von den Meßkurven ab- gezogen, erhält man Kurven, die in Fig. 8 dargestellt sind.
Aufgetragen ist jeweils (Fig. 7 u. Fig. 8) die Ableitung der Zeit nach der Spannung (dt/dU) gegen die Spannung U in V.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen eines Komposits, das aus einem mit Kunststoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff hergestellt ist und
b) Behandeln des Komposits mit einer das Biomolekül enthaltenden Lösung, wobei das Biomolekül an die Oberfläche des Kunststoffs gebunden wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kunststoff ein Po- lyester ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Polyester ein Polykarbonat ist .
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der elektrisch leitfähige Stoff Kohlefaser oder Ruß ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindung des Biomoleküls an den Kunststoff eine kovalente Bindung ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Lösung als Biomolekül ein Oligonukleotid zugegeben wird, dessen 5 ' -Ende eine NH2-Gruppe aufweist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der zweite Lösung mindestens einer der folgenden Stoffe zugesetzt ist: l-Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimid- hydrochlorid, Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz, (2- [N- Morpholino] ethan-sulfonsäure Monohydrat, Magnesiumchlorid, EDTA.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Komposit vor dem Schritt lit. b mit einer saueren oder einer basischen weiteren Lösung behandelt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die weitere Lösung eine wäßrige NaOH- oder KOH-Lösung ist .
10. Verfahren Anspruch 9, wobei die weitere Lösung auf eine Temperatur von bis zu 90° C erwärmt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Komposit bis zu vier Stunden mit der weiteren Lösung behandelt wird.
12. Elektrode hergestellt aus einem Komposit, das aus einem mit Kunststoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff gebildet ist, und an dessen Oberfläche Biomoleküle gebunden sind.
13. Elektrode nach Anspruch 12, wobei der Kunststoff ein Polyester ist.
14. Elektrode nach Anspruch 13, wobei der Polyester ein Po- lykarbonat ist.
15. Elektrode nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der leitfähige Zusatz Kohlefaser oder Ruß ist.
16. Elektrode nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei das Biomolekül kovalent an die Oberfläche gebunden ist.
17. Elektrode nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Biomolekül ein Oligonukleotid ist, das über eine am 5 ' -Ende befindliche NH2-Gruppe an den Kunststoff gebunden ist.
18. Elektrode nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei das Oligonukleotid mittels einer Lösung an die Oberfläche bindbar ist, der mindestens einer der folgenden Stoffe zugesetzt ist: l-Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimid-hydrochlorid, Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz, (2- [N-Morpholino] ethan- sulfonsäure Monohydrat, Magnesiumchlorid, EDTA.
19. Elektrode nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei die Oberfläche eine durch Behandlung mit einer saueren oder basi- sehen weiteren Lösung erzeugte Mikrorauhigkeit aufweist, und die weitere Lösung vorzugsweise eine wäßrige NaOH- oder KOH- Lösung ist.
20. Elektrode nach Anspruch 19, wobei die weitere Lösung auf eine Temperatur von bis zu 90° C erwärmt ist.
21. Elektrode nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Komposit bis zu vier Stunden mit der weiteren Lösung behandelt ist.
22. Verwendung der Elektrode nach einem der Ansprüche 12 bis 20 zum Anreichern von weiteren Biomolekülen aus einer Probenlösung, wobei die weiteren Biomoleküle eine Affinität zu den gebundenen Biomolekülen aufweisen.
23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei die weiteren Biomoleküle durch zyklische Umpolung auf der Oberfläche angereichert werden.
24. Verwendung der Elektrode nach einem der Ansprüche 12 bis 20 zum quantitativen elektrochemischen Nachweis von Biomolekülen.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10221435B4 (de) 2002-05-14 2004-10-28 Isabella Dr. Moser Enzymelektrodenanordnung, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie eine diese Enzymelektrodenanordnung umfassende Biosensoranordnung
DE102011006278B4 (de) * 2011-03-28 2013-10-02 Bergolin Gmbh & Co. Kg Lackschichten mit biofunktionalisierter Oberfläche und Verfahren zur Biofunktionalisierung von Lackschichten

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5312527A (en) * 1992-10-06 1994-05-17 Concordia University Voltammetric sequence-selective sensor for target polynucleotide sequences
US5567301A (en) * 1995-03-01 1996-10-22 Illinois Institute Of Technology Antibody covalently bound film immunobiosensor
WO1998002399A1 (de) * 1996-07-12 1998-01-22 Wolf Bertling Verfahren und vorrichtung zur aufreinigung und anreicherung von molekülen
US5871918A (en) * 1996-06-20 1999-02-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
DE19901761A1 (de) * 1999-01-18 1999-07-01 Gerhard Dr Hartwich Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen
WO1999045375A1 (en) * 1998-03-04 1999-09-10 Therasense, Inc. Process for producing an electrochemical biosensor
WO1999067628A1 (en) * 1998-06-24 1999-12-29 Therasense, Inc. Multi-sensor array for electrochemical recognition of nucleotide sequences and methods

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5312527A (en) * 1992-10-06 1994-05-17 Concordia University Voltammetric sequence-selective sensor for target polynucleotide sequences
US5567301A (en) * 1995-03-01 1996-10-22 Illinois Institute Of Technology Antibody covalently bound film immunobiosensor
US5871918A (en) * 1996-06-20 1999-02-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
WO1998002399A1 (de) * 1996-07-12 1998-01-22 Wolf Bertling Verfahren und vorrichtung zur aufreinigung und anreicherung von molekülen
WO1999045375A1 (en) * 1998-03-04 1999-09-10 Therasense, Inc. Process for producing an electrochemical biosensor
WO1999067628A1 (en) * 1998-06-24 1999-12-29 Therasense, Inc. Multi-sensor array for electrochemical recognition of nucleotide sequences and methods
DE19901761A1 (de) * 1999-01-18 1999-07-01 Gerhard Dr Hartwich Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen

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