EP1518109A2 - Vorrichtung zur detektion eines analyten - Google Patents

Vorrichtung zur detektion eines analyten

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Publication number
EP1518109A2
EP1518109A2 EP03738094A EP03738094A EP1518109A2 EP 1518109 A2 EP1518109 A2 EP 1518109A2 EP 03738094 A EP03738094 A EP 03738094A EP 03738094 A EP03738094 A EP 03738094A EP 1518109 A2 EP1518109 A2 EP 1518109A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
electrodes
analyte
electrode material
plate
openings
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03738094A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen SCHÜLEIN
Christine Kugler
Burcu Meric
Hans Kosak
Jörg HASSMANN
Björn GRASSL
Dirk Kuhlmeier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
November AG
Original Assignee
November AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by November AG filed Critical November AG
Publication of EP1518109A2 publication Critical patent/EP1518109A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/308—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells at least partially made of carbon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T29/00—Metal working
    • Y10T29/49—Method of mechanical manufacture
    • Y10T29/49002—Electrical device making

Definitions

  • the invention relates to a device for detecting an analyte contained in a liquid and a measuring device.
  • the analyte can be dissolved or suspended.
  • the invention relates to a method for producing and electrically contacting the device.
  • the invention relates to a use of the device for the detection of an analyte.
  • a fluid sensor for liquid and gaseous organic compounds is known from DE 197 08 529 C1.
  • the fluid sensor has an electrical conductivity that changes in electrical conductivity due to the penetration of fluid.
  • the sensor resistor is applied to a non-conductive substrate. It consists of a non-conductor diffusible by the fluid in question and carbon particles embedded therein.
  • the sensor resistance can be contacted via electrodes, which are contacted through contact holes on the back of the substrate through perforations in the substrate. The contact surfaces establish an electrical connection between several of the electrodes.
  • the fluid sensor is only suitable for the detection of organic compounds that change the conductivity of the sensor resistance. It is not suitable for the detection of other analytes.
  • a silicon chip with an arrangement of electrodes for detecting a nucleic acid in a solution is known.
  • Capture molecules that specifically bind analytes are immobilized on the electrodes via an intermediate layer.
  • the electrodes are electrically contacted by lines on the surface of the chip.
  • the lines are insulated by a silicon nitride layer.
  • the charged analytes can be drawn to the electrodes with the capture molecules and bind to the capture molecules. Unbound or nonspecifically bound analytes can be removed from the area of the electrodes by reversing the polarity.
  • the specifically bound analyte is detected by means of fluorescence.
  • eSensor TM has known a biochip sold under the name eSensor TM, in which gold electrodes are arranged on the surface. The gold electrodes are contacted on the side of the surface of the biochip. Capture molecules are immobilized on the electrodes via an intermediate layer. An analyte bound to an electrode via the capture molecules is detected by means of reporter molecules which bind to the bound analyte and have electrochemically detectable markers. The binding of these reporter molecules is verified electrochemically.
  • a biosensor for measuring the substrate concentration of a liquid sample is known from EP 0 136 362 B1.
  • Biosensor consists of an insulating substrate plate, which is provided with an electrode system with at least one working electrode and one counter electrode.
  • the electrode system is covered by a porous substrate containing an oxidoreductase, which can absorb liquid and a
  • the senor Contains enzyme which is capable of inducing a substrate reaction which can be detected electrochemically by means of the electrode system.
  • the sensor also has an electron acceptor. Both the oxidoreductase and the electron acceptor are soluble in the liquid sample.
  • DE 36 87 646 T3 relates to a biosensor with an electrode system, as is known from EP 0 136 362 B1, the electrode system mainly consisting of carbon and the surface of at least the measuring electrode being covered with albumin or glucose oxidase by adsorption.
  • a disadvantage of the biosensors known from EP 0 136 362 B1 and DE 36 87 646 T3 is that the porous substrate must be replaced after each measurement and that the biosensor is not suitable for measuring concentrations of analytes that are not substrates the oxidoreductase. It is also disadvantageous that the biosensor is not suitable for measuring many different analytes on a miniaturized substrate plate.
  • DE 196 21 241 AI relates to a membrane electrode for measuring the glucose concentration in liquids.
  • This membrane electrode consists of a base membrane with at least one noble metal electrode which is arranged on one side of the base membrane, a proton-selective ion membrane arranged on the base membrane and the noble metal electrode and a double membrane arranged on the ion membrane, in which glucose oxidase is contained in a suitable medium.
  • the membrane electrode is only suitable for measuring glucose concentrations and not for the detection of other analytes in a liquid.
  • a biosensor chip is known from WO 01/75151 A2 and DE 100 15 816 AI, which justifies its priority.
  • the sensor has electrodes which are embedded in an insulator layer made of insulator material. DNA is on each electrode
  • Immobilized probe molecules are part of a silicon-based biosensor chip. Electrode connections are connected to the electrodes, to which the electrical potential to be applied to the electrode can be supplied. The electrode connections are connected to an integrated electrical circuit inside the chip.
  • the disadvantage here is that the biosensor chip is too expensive to manufacture in order to be able to be used as a sensor chip that can only be used once. When the probe molecules interfering or changing analytes, this may be necessary for reproducible measurements.
  • EP 0 690 134 A1 discloses a multi-use electrochemical solid-state sensor with an electrically non-conductive substrate, a working electrode and a semi-permeable membrane which covers the working electrode.
  • the working electrode contains an electrically conductive material which is attached to a part of the substrate.
  • a first part of the conductive material is covered with an electrically insulating dielectric coating and a second part of the conductive material is covered with an active layer.
  • the active layer contains a catalytically effective amount of an enzyme which is carried by platinized carbon powder particles which are distributed within the active layer.
  • the electrochemical solid-state sensor has a relatively complex construction and is therefore expensive to manufacture.
  • a gas detector is known from US Pat. No. 5,363,690, which contains an exchangeable electrochemical sensor device.
  • the electrical contact between the interchangeable sensor device and an evaluation unit for measurement signals is established via an elastomer connector.
  • the device is not suitable for detecting an analyte in a liquid.
  • WO 01/13103 A1 discloses electrodes with a surface coating made of an oxidized phenol compound, a surface-active agent being integrated into the coating. This agent can prevent the detection of certain detergent-sensitive analytes. The electrode can therefore only be used for the detection of certain analytes.
  • a biosensor is known from EP 0 402 917 A2, which contains at least two spaced electrical lines on an electrically non-conductive carrier. An electrically conductive organic polymerized layer of a surface-active substance is in electrical contact with the electrical lines and covers the surface between the lines. A sealing coating is also applied to protect the electrical contacts from contact with water. A layer of organic molecules is bound to the polymerized layer of the surface-active substance, to which complementary molecules from an aqueous medium can bind.
  • a composition for an electrical thick-film conductor for use in electrochemical sensors is known from EP 0 987 333 A2, which contains conductive metal particles, graphite, a thermoplastic polymer and a surface-active substance.
  • the compound can be used to print working electrodes for electrochemical biosensors.
  • such sensors are only suitable for the detection of certain analytes.
  • the electrodes or electrode arrangements mentioned are complex to produce. Their production sometimes requires lithographic techniques. They are too expensive to manufacture in order to use them as single-use electrodes or electrode arrangements. With high electrode densities, it is necessary to provide the leads of the electrodes in several layers, in the so-called multilayer technique. High electrode densities are therefore only possible with considerable manufacturing effort.
  • a protective layer must be applied to the lines.
  • the object of the invention is to avoid the disadvantages of the prior art.
  • a device with electrodes for the detection of an analyte is to be provided which is simple and therefore inexpensive to manufacture.
  • a device for detecting an analyte in a liquid is provided with a plurality of electrodes which are insulated from one another on a first side of an electrically non-conductive plate which is impermeable to the liquid, the electrodes at least partially having an analyte-specific coating or molecules have electrical conductors spanning the plate from a second side of the plate electrically contactable and individually derivable.
  • the coating or molecules are analyte specific in that they have a specific affinity for the analyte or a substance formed due to the presence of the analyte, e.g. B. has a degradation product of the analyte.
  • the device has no derivatives.
  • the electrical conductors can be connected to the plate and the electrodes.
  • the term "electrode” is understood to be purely functional. This means the part of an electrical conductor through which electrical charge carriers can be conducted into the liquid.
  • the electrode can thus be the part of the electrical conductor that is on the first side of the electrically non-conductive plate. However, the electrode can also be a further electrical conductor connected to the electrical conductor spanning the plate.
  • plate is understood to mean any basic body, in particular a flat one, having a first and a second side.
  • “partially” means that both a part of an individual electrode and a part of the electrodes as a whole can have the respective feature.
  • the device according to the invention is simple and therefore inexpensive to manufacture. It is not necessary to apply a protective layer to prevent the liquid from coming into contact with the electrode leads. Furthermore, it is not necessary to apply a leveling layer in order to produce a flat surface of the plate. By eliminating the lateral leads, it is possible to shape the device completely flat in the area outside the electrodes. As a result, the device can be used well as the bottom of a liquid-absorbing chamber without a liquid-tight seal being problematic.
  • Another advantage of the device according to the invention is that a higher electrode density than with laterally derived electrodes is possible because no space for the lines has to be left between the electrodes. The higher electrode density can be provided without complex multilayer technology.
  • Analyte-specific molecules with at least partially different specificity and individually derivable electrodes it is possible to provide a device for the simultaneous detection of many different analytes.
  • the device according to the invention can be used as an electrode array in which the Electrodes are each provided with specific molecules or coatings for the detection of various analytes or analyte combinations.
  • the device according to the invention can be produced in the form of a chip at a fraction of the costs required for producing a silicon-based chip. The device can thus contribute to a breakthrough in routine sensor technology.
  • the device according to the invention can be used in a device provided for contacting the device. All components that are not required for the derivation and measurement of a signal and are not provided by the device according to the invention are provided by the device. Expensive components are therefore reusable.
  • Another advantage of the invention is that the contacting enables short conduction paths from the second side of the plate. In this way, electrical noise caused by the relatively long conduction paths when the electrodes are laterally discharged can be avoided. The electrical noise reduces the sensitivity of the detection and can even prevent the detection of the analyte.
  • the electrical conductors are formed in one piece with the electrodes.
  • the electrodes and the conductors can be made of the same material. This enables good contactability from the second side and very inexpensive production. It is not necessary to make electrical contact between the electrodes and the electrical conductors on the first side of the plate.
  • the coating or the analyte-specific molecules on the electrodes can each be different, so that different electrodes differ from one another.
  • the analyte-specific coatings or analyte-specific molecules can have a different specificity and enable, in particular simultaneous, detection of different analytes.
  • a detectable analyte is a member of a group that is determined by the specificity of the different coatings or molecules.
  • the coating or the analyte-specific molecules can comprise, in particular electrochemically inert, capture molecules.
  • Capture molecules are molecules to which the analyte or a substance formed as a result of the presence of the analyte, e.g. B. a degradation product of the analyte from which liquid binds.
  • the catcher molecules are electro-chemical mix inert if they do not cause a signal when the analyte is electrochemically detected.
  • the capture molecules can be, in particular single-stranded, nucleic acids, nucleic acid analogs, ligands, haptens, peptides, proteins, sugars, lipids or ion exchangers.
  • the capture molecules can be bound covalently and / or directed to the electrodes.
  • the advantage of covalent bonding is that the capture molecules cannot diffuse out of the electrodes. Given the very small distances between the electrodes that are possible with the device according to the invention, even a slight diffusion of capture molecules can lead to a disturbance of a detection reaction.
  • a directional bond is to be understood to mean that the catcher molecules each have a specific position on the catcher molecule, e.g. B. with one end of the molecule to which electrodes are bound. This can ensure that the location of the capture molecules responsible for binding the analyte is not influenced by their binding to the electrodes.
  • the capture molecules can, at least in part, be bound to the electrodes via an intermediate layer, in particular one that is largely electrochemically inert.
  • This intermediate layer can be formed from silane.
  • the intermediate layer is largely electrochemically inert if it does not cause a signal when the analyte is detected electrochemically.
  • the coating comprises at least one semi-permeable coating of the electrodes.
  • the semi-permeable coatings can each have a different permeability, so that the coatings are different
  • Electrodes can be differently permeable.
  • the coatings can be selectively permeable to molecules up to a certain size. It can be a polymeric matrix with a molecular sieve effect. This makes it possible to borrow only small molecules that B. by a specific see breakdown of an analyte, permeate the electrodes so that only these are specifically detected.
  • Such a device according to the invention can be used in a process control for tracking implementations taking place in a reactor.
  • the electrical conductors can be arranged in openings in the plate which taper from the second side of the plate, in particular conically, to the first side.
  • the electrical conductor can be arranged only on the tapered section of the recess formed by the tapering shape of the opening. But it can also protrude freely into the recess.
  • the tapering shape of the recess facilitates electrical contacting from the second side, because a conductor that is made to make contact in the direction of the electrode is also brought up to the electrode when it initially only hits the recess.
  • the plate can be arranged on the bottom of a microfluid chamber or form the bottom of a microfluid chamber.
  • the device according to the invention is well suited to this because of the possibility of a particularly flat design and the associated good sealability.
  • the device can also be a chip. This is understood here to mean a small plate with electronic microstructures that does not necessarily consist of semiconductor material.
  • the electrodes can be arranged in the form of an electrode field (array).
  • the plate can have more than 10, preferably more than 20, 40, 80, 100 or 160, particularly preferably more than 1000, in particular more than 10000, electrodes per cm 2 .
  • the electrodes can be formed at least partially from particles.
  • the particles can be coated with analyte-specific be provided or contain analyte-specific molecules.
  • the particles can be loosely or firmly connected to one another.
  • a loose connection can e.g. B. be provided in that the particles are paramagnetic and are held by magnetic force on the electrode or the electrical conductor.
  • the electrodes can be formed, at least in part, from a non-metallic conductor, in particular carbon.
  • Carbon-containing electrodes are particularly well suited for the detection of biomolecules.
  • the electrodes can be, at least in part, polycarbonate containing pencil, glassy carbon, carbon fibers, carbon paste or plastic composite electrodes, preferably elemental carbon, in particular in the form of graphite or carbon black. Electrodes, act.
  • the carbon black can be industrial carbon black, synthetic carbon black or so-called "carbon black".
  • the invention further relates to a measuring device, comprising a device according to the invention, in which the electrodes comprise at least one reference electrode and at least one counter electrode and a plurality of working electrodes.
  • the measuring device contains current-voltage converters, a potentiostat and a means for measuring the currents flowing through the working electrodes.
  • the electrodes are electrically connected to the potentiostat for generating a predetermined voltage curve between the working electrodes and the reference electrode, with each of the working electrodes being connected downstream of one of the current-voltage converters to all
  • each of the working electrodes can be virtually connected to the circuit ground via a current follower for the individual evaluation of the signals.
  • the invention further relates to a method for producing a device according to the invention with the following steps:
  • the solid electrode material can be, for example, a plurality of pencil leads arranged in parallel, which are encapsulated with epoxy resin.
  • the plastically deformable insulating material can adapt to the shape of the electrode material during insertion and / or can be adapted to it after insertion by pressing together. This ensures a liquid-tight seal.
  • “Hardening” of the electrode material is understood here and below to mean that the originally liquid or pasty electrode material solidifies over time; H. increases in its hardness. That can e.g. B. by polymerizing, by drying or by cooling an electrode material pasty at a higher temperature. The final state of the electrode material after solidification can still be relatively soft.
  • the solid one-piece insulation material can be produced by an injection molding process.
  • the openings are arranged in such a way that electrode material which is filled in on one side of the stacked insulating material fills all of the openings.
  • the electrode material can in the openings z. B. pressed in by extrusion.
  • the method used for this can be a method known from the production of pencil leads.
  • the fusing of the sheath can be by heating or chemical, e.g. B. by adding a solvent dissolving the jacket.
  • both the conductive electrode material and the insulating material are plastically deformable such that both materials can be extruded together as a composite. This enables very inexpensive production.
  • the invention further relates to a method for producing a device according to the invention, comprising the following steps:
  • Electrode material as far as this electrode material electrically connects the electrode material present in the openings.
  • the curing can e.g. B. by polymerization, by drying or by cooling.
  • Step lit. c can be applied simultaneously with the application according to step lit. b or afterwards.
  • the method can be carried out in the manner of a screen printing method, the electrode material being applied instead of the color.
  • the invention also relates to a method for producing a device according to the invention, comprising the following steps:
  • the method has the advantage that step lit. e the removal of excess electrode material is significantly simplified and it enables a larger electrode surface because the electrodes on the first side of the plate are raised due to the height of the shadow mask or screen printing mask.
  • step lit. e the removal of excess electrode material is significantly simplified and it enables a larger electrode surface because the electrodes on the first side of the plate are raised due to the height of the shadow mask or screen printing mask.
  • the breakthroughs in step lit. b can be produced by drilling, in particular by means of a laser beam.
  • a via is an electrically conductive connection between two layers, which are formed here by the first and the second side of the electrically non-conductive plate.
  • the via is generally used on a circuit board or integrated circuit.
  • Methods of making vias are well known.
  • the vias are preferably produced in such a way that they do not protrude beyond the plane formed by the first side of the plate.
  • the lateral extent of the vias should be so small that the shape of the electrodes, preferably in the screen printing process, is not influenced on the ends of the vias on the first side. Such an influence is possible because the vias often have a tubular opening in their interior.
  • the vias preferably have at their end located on the first side of the plate an, in particular smooth, continuous surface, that is to say which has no opening.
  • the vias can consist, for example, of a thin copper layer.
  • the vias in step lit. c produced by galvanic deposition in the openings or by inserting a conductor into the openings.
  • the electrode material can be applied by means of pad printing or by means of a screen-like process. Both techniques are known in principle for the production of electrodes. They enable a particularly inexpensive and exact manufacture of the device according to the invention.
  • pad printing a pasty electrode material, which is arranged in a pattern that corresponds to the desired electrode pattern, is picked up by a pad. The electrode material is then pressed onto the electrically non-conductive in the form of the predetermined pattern by pressing the tampon
  • screen-print electrodes The electrodes produced by means of the screen-printing process are referred to as "screen-print electrodes”.
  • A, in particular analyte-specific, coating can be applied to the electrode material.
  • Analyte-specific molecules can also be introduced into the electrode material. Both of these operations can be performed before, after, or during each of the above steps.
  • Electrode material in the sense of the invention includes both the material used to produce the electrodes and the electrodes formed therefrom.
  • As a coating or analyte-specific molecules in particular electrochemically inert capture molecules can be applied or introduced into the electrode material. On the electrodes or the electrode different coatings can be applied. Different analyte-specific molecules can be introduced into the electrode material.
  • single-stranded, nucleic acids, nucleic acid analogs, ligands, haptens, peptides, proteins, sugars, lipids or ion exchangers can be used as capture molecules.
  • the capture molecules can be bound covalently and / or directed to the electrode material or synthesized on the electrode material or deposited electrochemically.
  • the capture molecules are preferably, at least partially, bound to the electrode material via an intermediate layer, in particular one which is largely electrochemically inert, or are synthesized on the intermediate layer.
  • the intermediate layer is preferably formed from silane.
  • the electrode material can be coated with at least one semi-permeable coating. This can also be done in addition to the coating with scavenger molecules.
  • the electrode material or the electrodes can each be coated with differently permeable semipermeable coatings. Each electrode formed from the electrode material can have a different coating.
  • the invention further relates to a method for electrically contacting a device according to the invention, wherein a plurality of individually derivable electrical conductors are brought into contact with the second side of the plate of the device in such a way that the conductors, at least in part, contact the electrodes in such a way that the electrodes are individually derivable.
  • the conductors are preferably spring-loaded and are connected to the second side of the
  • Elastomer connector consist of alternating ones Layers of electrically conductive and electrically non-conductive elastomer, in particular silicone elastomer.
  • the elastomer connectors can be flat, the layers running perpendicular to a surface.
  • the electrically conductive layer is covered with conductive fibers or particles, eg. B. made of silver, gold or carbon.
  • ZEBRA ® elastomer connectors are sold by Fujipoly America Corporation, 900 Milik Street PO Box 119, Carteret, NJ 07008, USA.
  • the electrodes come into contact with the conductive layers by placing the ZEBRA ® elastomer connector on the second side of the plate and exerting slight pressure on the contact surface between the plate and the ZEBRA ® elastomer connector.
  • the electrodes can be electrically derived by contacting the conductive layers with an electrical evaluation unit.
  • the invention relates to the use of a device according to the invention for detecting at least one analyte in a liquid, the liquid being brought into contact with electrodes on the first side of the plate of the device and the electrodes being electrically contacted from the second side thereof.
  • the liquid is preferably brought into contact with the electrodes under conditions under which the analyte or a substance formed due to the presence of the analyte, e.g. B. a degradation product of the analyte, binds to capture molecules present on the electrodes.
  • the detection of the analyte or substance bound to the capture molecules can be done electrically, e.g. B.
  • analyte or the substance is identified, for example, by identifying by optical detection that electrode to which a fluorescent analyte or a fluorescent substance is specifically bound via the capture molecules. Because the electrode can be assigned to a specific catcher molecule, the analyte or the substance can be identified.
  • the electrodes serve for the electrical attraction and / or repulsion of charged analytes or substances.
  • the charged analytes or the charged substances can be transported electrically into the area of the capture molecules.
  • the binding of the analytes or substances to them can be accelerated by an increased concentration of the analytes or substances in the area of the capture molecules.
  • Analytes or substances that are not or weakly and nonspecifically bound can be removed by applying a repulsive potential to the electrode.
  • the capture molecules are immobilized on the electrodes via an analyte or substance-impermeable intermediate layer. This prevents the analyte or the substance from being electrochemically converted when it comes into direct contact with the electrode. This enables the creation of high potentials for a fast transport of the analytes or substances to the capture molecules.
  • the electrodes can be coated with a semi-permeable coating. This makes it possible to selectively detect only the analytes, degradation products of the analytes or the substances which penetrate the coating.
  • the detection can be electrical, electrochemical, optical, photoelectric, enzymatic, by means of electroluminescence or by means of chemiluminescence. He can also use a Combination of these detection methods are carried out.
  • the electrodes are preferably each coated with differently permeable semipermeable coatings.
  • the analyte can be a biomolecule, in particular a nucleic acid, a protein, an antigen, a sugar, a lipid, a cell or a virus. It can have a marking substance.
  • the marking substance can be e.g. B. an enzyme or a redox-active label.
  • a redox reaction or a catalytic hydrogen evolution can be electrochemically detected.
  • the electrochemical detection can e.g. B. by means of differential pulse voltammetry (DPV), chronopotentiometric stripping analysis (CPSA) or the detection of a change in resistance or impedance.
  • DPV differential pulse voltammetry
  • CPSA chronopotentiometric stripping analysis
  • Electrochemical detection can include the following steps:
  • a potential interval for the measurement is preferably selected, in which essentially only the analyte or the substance causes a signal.
  • the electrodes are preferably treated with a detergent before the analyte is detected. This can be done before or while the liquid containing the analyte is in contact with the electrodes. Treatment with detergent can replace electrochemical conditioning. It is easier, faster and less expensive than electrochemical conditioning.
  • the electrodes can be stored in a liquid containing detergent and z. B. be distributed.
  • the detergent is an ionic detergent.
  • the detergent is advantageously present in a concentration of 0.1% to 10%.
  • the detergent in water preferably has a critical micellar concentration below 10 mmol / 1, in particular below 5 mmol / 1, preferably below 3 mmol / 1.
  • the detergent can be sodium dodezyl sulfate.
  • FIGS. 2a-b show a schematic representation of a method for producing a device according to the invention by severing a composite of electrode material and insulating material
  • 3a-d a schematic representation of a method for producing a composite from parallel orderly elongated electrode material and insulating material
  • 6a-d show a schematic illustration of a screen-like method for producing a device according to the invention
  • FIG. 7a-b show a schematic representation of a method and a device for electrical contacting of the device for detection according to the invention
  • 8a-b show a schematic representation of a method for producing a chip with 4x4 electrodes
  • FIG. 11a-c show a schematic representation of a microfluidic chamber with the detection device according to the invention.
  • FIG. 1 a shows a plastically deformable, electrically insulating base body 10 with a first side 12 and a second side 14.
  • FIG. 1 b shows four electrodes 15 formed from pencil leads.
  • the base body 10 is shown with electrodes 15 inserted therein by mechanical pressure , The electrodes are inserted in such a way that each electrode protrudes on the first side 12 and the second side 14. After the electrodes 15 have been inserted, the base body 10 can be cured.
  • FIG. 1d shows the resulting device for detection 17 in a top view, FIG. Le in a side view.
  • the device 17 can, as shown in FIG. 2a, be severed several times vertically along the lines 16 and thereby be broken down into the disk-shaped devices 17 according to the invention shown in FIG. 2b.
  • Each of the electrodes 15 is in contact with the respective top and bottom of the disks.
  • FIG. 3a An electrode 15 with a jacket 18 made of insulating material is shown in cross section in FIG. 3a and in a top view in FIG. 3b.
  • 3c and FIG. 3d show a cross-section and a top view of a combination of such electrodes that is produced by connecting the sheathings 18.
  • the arrows 20 indicate positions at which the composite can be severed in order to produce disk-shaped devices 17 according to the invention.
  • the base body 10 can, for example, consist of a plastic and be produced by an injection molding process.
  • a mass of an electrically conductive electrode material 15 can be pressed into the first openings 22 of the base body 10. This can be done, for example, by an extrusion process, as is usually used for the production of pencil leads. With the electrode material 15 can be a material for the production of pencil leads.
  • the base body 10 can be severed perpendicular to the first openings 22 filled with electrode material 15, even before the electrode material 15 has hardened, at the points indicated by the arrows 20. This results in the disk-shaped devices according to the invention 17 shown in perspective in FIG. 4c and in the top view in FIG. 4d the first openings 22 coincide.
  • all of the first openings 22 of the disk-shaped base body 10 are then filled.
  • the stack can then be taken apart before the electrode material has hardened.
  • 5c shows a plate-shaped base body 10 with a first side 12 and a second side 14 in cross section.
  • 5b shows this basic body 10 in a top view from the second side 14 and FIG. 5a in a top view from the first side 12.
  • the base body 10 has conical openings 22 widening from the first side 12 to the second side 14.
  • FIG. 6 a the plate-shaped base body 10 is covered on the first side 12 with a shadow mask 24 which has holes 26 which coincide with the openings 22 on the first side 12.
  • FIG. 6b shows electrically conductive pasty electrode material 15 applied to the shadow mask 24.
  • FIG. 6c shows the electrode material 15 after it has been inserted into the holes 26 and 14 in a screen-printing process
  • Breakthroughs 22 has been pressed into it.
  • 6d shows the device 17 according to the invention after removing the shadow mask 24.
  • 7a and 7b show a device for electrical contact 36 of a device for detection 17.
  • the device for electrical contact 36 consists of an elastic matrix 28 made of an electrically insulating material.
  • electrically conductive pins 30 are arranged in parallel, which are electrically connected to contacts 34 on the underside of the matrix.
  • the pins are pressed out of the elastic matrix by a spring 32.
  • the pins 30 are preferably tapered on the side provided for contacting.
  • the contacting of the device for detection 17 shown in FIG. 7b by the device for electrical contact 36 takes place by pressing the two devices 17, 36 together.
  • the pins 30 come into contact with the electrodes 15.
  • the elastic matrix 28 is compressed.
  • the pins 30 can penetrate into the openings 22 of the device 17 for detection tapering toward the first side 12 and thereby contact the electrodes 15.
  • the tapered shape of the pins 30, the tapering openings 22 and the shape of the electrodes 15 provide an enlarged contact area of the pins 30 with the electrodes 15.
  • FIG. 8a An arrangement of cladding 39 and an electrode holder 40 for encapsulating the electrodes 15 with an insulating material, such as epoxy resin, is shown schematically in FIG. 8a before and in FIG. 8b after assembly.
  • One of the casings 39 has an opening 41 for filling in the insulating material.
  • the composite of electrodes and insulating material resulting from the polymerization of the insulating material can be severed, so that disk-shaped devices 17 for detection as chips with 4 ⁇ 4 electrodes are produced.
  • Such a device 17 is shown in FIG. 9.
  • Pencil leads serve as electrode material.
  • the electrodes of one of the chips are electrochemical treated or conditioned for 1 min with 1.2 V in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 4.6.
  • the electrodes of another of the chips have been treated with 10% SDS for 1 min.
  • the chips were deionized water for 1 h at room temperature with gentle shaking in a solution of 1% (v / v) 3- (glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (Fluika), 1% (v / v) (Millipore) and 98% (v / v) ethanol (Merck). They were then dried at 80 ° C. for 30 minutes.
  • the oligonucleotide is an amino link-provided sequence from the c-DNA of the human tumor necrosis factor ⁇ gene.
  • a drop of a 150 p ol / ml oligonucleotide in 0.1 M Na 2 CO 3 , pH 9.5 solution was placed on each of the electrodes of the chips. The chips were then incubated for one hour at room temperature in a humid chamber.
  • the free amino groups of the oligonucleotides form a covalent bond with the silane.
  • the chips were incubated for one hour in 2 ml of 10% SDS at RT.
  • the chips were incubated at RT in 1% bovine serum albumin (BSA) or ethanolamine in phosphate-buffered saline (PBS) for one hour.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the chips are in a solution of 10 nmol / ml of the complementary nucleic acid TNF2k (SEQ ID NO: 2) in detergent-containing hybridization buffer ( Röche) and the bound nucleic acid TNF2k was determined using DPV.
  • Ten measurements each were made with the electrodes carried out electrochemically or with detergent.
  • the detergent treatment led to an increase in sensitivity of more than 10% compared to the electrochemical treatment.
  • the reproducibility of the measurements with detergent-treated electrodes was improved.
  • the standard deviation of the measurements of detergent-treated electrodes was 3 times less than that of an electrochemical treatment.
  • FIG. 10 shows two voltammograms which have been determined by means of DPV measurements of herring sperm DNA carried out in parallel with the device 17 shown in FIG. 9.
  • the electrode material of the device 17 was connected from its second side to an electronic evaluation unit by means of spring contact pins.
  • One of the electrodes has been switched as a reference electrode.
  • 100 ⁇ l of a 2 ⁇ g / ⁇ l herring sperm DNA solution in TE buffer (10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8) were applied to the first side of the device and incubated for 10 min.
  • the DNA was detected in parallel on several electrodes using DPV using the oxidation of guanine and adenine. Significant congruent guanine and adenine oxidation peaks were measured in their position.
  • FIG. 11a schematically shows a top view of a composite microfluid chamber 42 with a plurality of electrodes 15 and the recess 46 for the liquid passage.
  • FIG. 11 b shows a top view of the upper part 44 of the microfluid chamber 42 and
  • FIG. 11 c shows the lower part of this chamber formed by the device 17 according to the invention.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (17) zur Detektion eines Analyten in einer Flüssigkeit mit einer Vielzahl von auf einer ersten Seite (12) einer elektrisch nicht leitenden und für die Flüssigkeit undurchlässigen Platte (10) angeordneten voneinander isolierten Elektroden (15), wobei die Elektroden (15) zumindest teilweise eine Analyt-spezifische Beschichtung oder Analyt-spezifische Moleküle aufweisen und über die Platte (10) durchspannende elektrische Leiter von einer zweiten Seite (14) der Platte her elektrisch kontaktierbar und einzeln ableitbar sind, wobei die Beschichtung oder die Moleküle eine spezifische Affinität für den Analyten oder eine infolge der Anwesenheit des Analyten gebildete Substanz aufweist/aufweisen und wobei die Vorrichtung keine Ableitungen aufweist.

Description

Vorrichtung zur Detektion eines Analyten
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Detektion eines in einer Flüssigkeit enthaltenen Analyten und eine Messvorrichtung. Der Analyt kann gelöst oder suspendiert vorliegen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und elektrischen Kontaktierung der Vorrichtung. Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine Verwendung der Vorrichtung zur Detektion eines Analyten.
Aus der DE 197 08 529 Cl ist ein Fluidsensor für flüssige und gasförmige organische Verbindungen bekannt. Der Fluidsensor weist einen infolge eindringenden Fluids in seiner elektrischen Leitfähigkeit veränderlichen elektrischen Sensorwider- stand auf. Der Sensorwiderstand ist auf einem nicht leitenden Substrat aufgebracht. Er besteht aus einem von dem betreffenden Fluid diffundierbaren Nichtleiter und darin eingebetteten Kohlenstoffpartikeln. Der Sensorwiderstand kann über Elektroden kontaktiert sein, die durch Durchbohrungen des Substrats hindurch mit Kontaktflächen auf der Rückseite des Substrats kontaktiert sind. Die Kontaktflächen stellen eine elektrische Verbindung zwischen mehreren der Elektroden her. Der Fluidsensor ist nur zur Detektion organischer Verbindungen geeignet, welche die Leitfähigkeit des Sensorwiderstands ver- ändern. Er ist nicht zur Detektion anderer Analyte geeignet.
Aus Sosnowsky et al . , (1997) Proc . Natl . Acad. Sei USA, 94, Seiten 1119 bis 1123 ist ein Silizium-Chip mit einer Anordnung von Elektroden zum Nachweis einer Nukleinsäure in einer Lösung bekannt. Auf den Elektroden sind über eine Zwischenschicht Fänger-Moleküle immobilisiert, die Analyten spezifisch binden. Die Elektroden werden durch Leitungen auf der Oberfläche des Chips elektrisch kontaktiert. Die Leitungen sind durch eine Siliziumnitrid-Schicht isoliert. Durch Anle- gen eines negativen oder positiven Potenzials an die Elektro- den können geladene Analyte zu den Elektroden mit den Fänger- Molekülen gezogen werden und an die Fänger-Moleküle binden. Ungebundene oder unspezifisch gebundene Analyten können durch Umpolen wieder von dem Bereich der Elektroden entfernt wer- den. Die Detektion des spezifisch gebundenen Analyten erfolgt mittels Fluoreszenz.
Weiterhin ist von der Firma Motorola ein unter der Bezeichnung eSensor™ vertriebener Biochip bekannt, bei dem auf der Oberfläche Goldelektroden angeordnet sind. Die Goldelektroden sind seitlich auf der Oberfläche des Biochips kontaktiert. An den Elektroden sind über eine Zwischenschicht Fänger-Moleküle immobilisiert. Der Nachweis eines über die Fänger-Moleküle an eine Elektrode gebundenen Analyten erfolgt mittels Reporter- molekülen, welche an den gebundenen Analyten binden und elektrochemisch detektierbare Marker aufweisen. Die Bindung dieser Reportermoleküle wird elektrochemisch nachgewiesen.
Aus der EP 0 136 362 Bl ist ein Biosensor zur Messung der Substratkonzentration einer Flüssigkeitsprobe bekannt. Der
Biosensor besteht aus einer isolierenden Substratplatte, die mit einem Elektrodensystem mit zumindest einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode versehen ist. Das Elektrodensystem ist von einem porösen, eine Oxidoreduktase enthalten- den Substrat bedeckt, das Flüssigkeit aufnehmen kann und ein
Enzym enthält, welches zur Induzierung einer mittels des Elektrodensystems elektrochemisch nachweisbaren Substratreaktion fähig ist. Der Sensor weist weiterhin einen Elektronenakzeptor auf . Sowohl die Oxidoreduktase als auch der Elektro- nenakzeptor sind in der Flüssigkeitsprobe löslich.
Die DE 36 87 646 T3 betrifft einen Biosensor mit einem Elektrodensystem, wie es aus der EP 0 136 362 Bl bekannt ist, wobei das Elektrodensystem hauptsächlich aus Kohlenstoff besteht und die Oberfläche von wenigstens der Messelektrode mit Albumin oder Glucoseoxidase durch Adsorption bedeckt ist. Nachteilig an den aus der EP 0 136 362 Bl und der DE 36 87 646 T3 bekannten Biosensoren ist, dass das poröse Substrat nach jeder Messung ausgetauscht werden muss und dass der Biosensor nicht zur Messung von Konzentrationen von Analyten ge- eignet ist, die nicht Substrat der Oxidoreduktase sind. Ferner ist es nachteilig, dass der Biosensor nicht zur Messung vieler verschiedener Analyte auf einer miniaturisierten Substratplatte geeignet ist.
Die DE 196 21 241 AI betrifft eine Membranelektrode zur Messung der Glucosekonzentration in Flüssigkeiten. Diese Membranelektrode besteht aus einer Grundmembran mit wenigstens einer Edelmetallelektrode, die auf einer Seite der Grundmembran angeordnet ist, einer auf der Grundmembran und der Edelme- tallelektrode angeordneten protonenselektiven Ionenmembran und einer auf der Ionenmembran angeordneten Doppelmembran, in welcher Glucoseoxidase in einem geeigneten Medium enthalten ist. Die Membranelektrode ist ausschließlich zur Messung von Glucosekonzentrationen und nicht zum Nachweis anderer Analy- ten in einer Flüssigkeit geeignet.
Aus der WO 01/75151 A2 und der deren Priorität begründenden DE 100 15 816 AI ist ein Biosensorchip bekannt. Der Sensor weist Elektroden auf, die in einer Isolatorschicht aus Isola- tormaterial eingebettet sind. Auf jeder Elektrode sind DNA-
Sondenmoleküle immobilisiert. Die Sensoren sind Bestandteil eines Biosensorchips auf Siliziumbasis. An den Elektroden sind Elektrodenanschlüsse angeschlossen, an denen das an der Elektrode anzulegende elektrische Potenzial zugeführt werden kann. Die Elektrodenanschlüsse sind mit einer integrierten elektrischen Schaltung innerhalb des Chips verschaltet. Nachteilig ist dabei, dass der Biosensorchip in seiner Herstellung zu teuer ist, um als nur einmal zu verwendender Sensorchip eingesetzt werden zu können. Bei die Sondenmoleküle an- greifenden oder verändernden Analyten kann dies jedoch für reproduzierbare Messungen erforderlich sein.
Aus der EP 0 690 134 AI ist ein mehrfach verwendbarer elek- trochemischer Festkörpersensor mit einem elektrisch nicht leitenden Substrat, einer Arbeitselektrode und einer semiper- meablen Membran, welche die Arbeitselektrode bedeckt, bekannt. Die Arbeitselektrode enthält ein elektrisch leitfähiges Material, welches an einem Teil des Substrats befestigt ist. Ein erster Teil des leitfähigen Materials ist mit einer elektrisch isolierenden dielektrischen Beschichtung bedeckt und ein zweiter Teil des leitfähigen Materials ist mit einer aktiven Schicht bedeckt. Die aktive Schicht beinhaltet eine katalytisch wirksame Menge eines Enzyms, welches von platini- sierten Kohlenstoffpulver-Partikeln getragen wird, die innerhalb der aktiven Schicht verteilt sind. Der elektrochemische Festkörpersensor ist verhältnismäßig aufwändig gebaut und daher in der Herstellung teuer.
Aus der US 5,363,690 ist ein Gasdetektor bekannt, welcher eine austauschbare elektrochemische Sensorvorrichtung enthält. Der elektrische Kontakt zwischen der austauschbaren Sensorvorrichtung und einer Auswerteeinheit für Messsignale wird über einen Elastomer-Verbinder hergestellt. Die Vorrichtung ist nicht zum Detektieren eines Analyten in einer Flüssigkeit geeignet .
Aus der WO 01/13103 AI sind Elektroden mit einer Oberflächen- Beschichtung aus einer oxidierten PhenolVerbindung bekannt, wobei in die Beschichtung ein oberflächenaktives Agens integriert ist. Dieses Agens kann die Detektion bestimmter Deter- genz-sensitiver Analyte verhindern. Die Elektrode ist daher nur zur Detektion bestimmter Analyte einsetzbar. Aus der EP 0 402 917 A2 ist ein Biosensor bekannt, der mindestens zwei beabstandete elektrische Leitungen auf einem elektrisch nicht leitenden Träger enthält. Mit den elektrischen Leitungen steht eine elektrisch leitende organische polymeri- sierte Schicht aus einer oberflächenaktiven Substanz in elektrischem Kontakt und bedeckt die Oberfläche zwischen den Leitungen. Weiterhin ist eine Versiegelungsbeschichtung angebracht, um die elektrischen Kontakte vor einem Kontakt mit Wasser zu schützen. An die polymerisierte Schicht aus der oberflächenaktiven Substanz ist eine Schicht aus organischen Molekülen gebunden, an die komplementäre Moleküle aus einem wässrigen Medium binden können.
Aus der EP 0 987 333 A2 ist eine Zusammensetzung für einen elektrischen Dickschicht-Leiter zur Verwendung in elektrochemischen Sensoren bekannt, welche leitende Metallpartikel, Grafit, ein thermoplastisches Polymer und eine oberflächenaktive Substanz enthält. Die Verbindung kann zum Drucken von Arbeitselektroden für elektrochemische Biosensoren verwendet werden. Wegen der Sensitivität bestimmter Analyten gegenüber oberflächenaktiven Substanzen sind solche Sensoren jedoch nur zur Detektion bestimmter Analyten geeignet.
Die genannten Elektroden bzw. Elektrodenanordnungen sind auf- wändig herzustellen. Deren Herstellung erfordert z.T. litho- grafische Techniken. Sie sind in der Herstellung zu teuer, um sie als nur einmal zu verwendende Elektroden bzw. Elektrodenanordnungen einzusetzen. Bei hohen Elektrodendichten ist es erforderlich, die Ableitungen der Elektroden in mehreren Schichten, in der so genannten Multilayer-Technik, bereitzustellen. Hohe Elektrodendichten sind daher nur mit erheblichem Herstellungsaufwand möglich. Um den Kontakt der elektrischen Leitungen zu den Elektroden mit einer den Analyten enthaltenden Lösung zu verhindern, muss eine Schutzschicht auf die Leitungen aufgetragen werden. Weiterhin ist es für be- stimmte Anwendungen, z. B. als Boden einer Mikrofluidkammer, erforderlich, dass der Biochip eine glatte Oberfläche aufweist. Um die durch die Leitungen bedingten Unebenheiten auszugleichen muss daher eine Ausgleichsschicht aufgetragen wer- den.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu vermeiden. Insbesondere soll eine Vorrichtung mit Elektroden zur Detektion eines Analyten bereitgestellt werden, die einfach und damit kostengünstig herzustellen ist.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 18 bis 22, 35 und 38 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 17, 23 bis 34, 36, 37 und 39 bis 51.
Erfindungsgemäß ist eine Vorrichtung zur Detektion eines Analyten in einer Flüssigkeit mit einer Vielzahl von auf einer ersten Seite einer elektrisch nicht leitenden und für die Flüssigkeit undurchlässigen Platte angeordneten voneinander isolierten Elektroden vorgesehen, wobei die Elektroden zumindest teilweise eine Analyt-spezifische Beschichtung oder Analyt-spezifische Moleküle aufweisen und über die Platte durchspannende elektrische Leiter von einer zweiten Seite der Platte her elektrisch kontaktierbar und einzeln ableitbar sind. Die Beschichtung oder die Moleküle ist/sind Analyt- spezifisch, indem sie eine spezifische Affinität für den Analyten oder eine infolge der Anwesenheit des Analyten gebildete Substanz, z. B. ein Abbauprodukt des Analyten, aufweist bzw. aufweisen. Die Vorrichtung weist keine Ableitungen auf.
Die elektrischen Leiter können mit der Platte und den Elektroden verbunden sein. Der Begriff "Elektrode" wird rein funktioneil verstanden. Darunter wird der Teil eines elektrischen Leiters verstanden, durch den elektrische Ladungsträger in die Flüssigkeit geleitet werden können. Die Elektrode kann somit der Teil des elektrischen Leiters sein, der sich auf der ersten Seite der elektrisch nicht leitenden Platte befindet. Es kann sich bei der Elektrode aber auch um einen mit dem die Platte durchspannenden elektrischen Leiter verbunde- nen weiteren elektrischen Leiter handeln. Unter Platte wird hier ein beliebiger, insbesondere flacher, eine erste und eine zweite Seite aufweisender Grundkörper verstanden. "Teilweise" bedeutet hier und im Folgenden, dass sowohl ein Teil einer einzelnen Elektrode als auch ein Teil der insgesamt vorhandenen Elektroden das jeweilige Merkmal aufweisen kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist einfach und damit kostengünstig herzustellen. Es ist nicht erforderlich eine Schutzschicht aufzutragen, um einen Kontakt der Flüssigkeit mit Elektrodenzuleitungen zu verhindern. Weiterhin ist es nicht erforderlich, eine Ausgleichsschicht aufzutragen, um eine ebene Oberfläche der Platte herzustellen. Durch das Entfallen der seitlichen Ableitungen ist es sehr kostengünstig möglich ist, die Vorrichtung in dem Bereich außerhalb der Elektroden völlig plan auszuformen. Dadurch kann die Vorrichtung gut als Boden einer Flüssigkeit aufnehmenden Kammer verwendet werden, ohne dass eine flüssigkeitsdichte Abdichtung dabei problematisch wäre. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass eine höhere Elektrodendichte als mit seitlich abgeleiteten Elektroden möglich ist, weil zwischen den Elektroden kein Raum für die Leitungen freigelassen werden muss. Die höhere Elektrodendichte ist ohne eine aufwändige Multilayer-Technik bereitstellbar. Durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit hoher Elektrodendichte und Analyt-spezifischen Beschichtungen oder
Analyt-spezifischen Molekülen mit zumindest teilweise unterschiedlicher Spezifität und einzeln ableitbaren Elektroden ist es möglich, eine Vorrichtung zur gleichzeitigen Detektion vieler verschiedener Analyte bereitzustellen. Die erfindungs- gemäße Vorrichtung kann als Elektrodenarray, bei dem die Elektroden jeweils mit spezifischen Molekülen oder Beschichtungen versehen sind, zum Detektieren verschiedener Analyte oder Analytkombinationen bereitgestellt werden.
Der allgemeine Trend bei der Entwicklung von Biosensor-Chips geht dahin, immer komplexere Chipstrukturen zu realisieren. Diese sind jedoch in der Herstellung aufwändig und letztendlich zu teuer für eine Routinesensorik, insbesondere verschiedener Analyte. Bekannte auf Siliziumbasis hergestellte Chips weisen keine den Chip so durchspannende elektrische Leiter auf, dass auf dem Chip auf einer Seite vorhandene Elektroden von der anderen Seite abgeleitet werden könnten. Vielmehr ist zumindest ein Teil des Siliziumträgers undurchbrochen und vorhandene Elektroden werden letztendlich seit- lieh abgeleitet. Der Verzicht auf jegliche Ableitung bei gleichzeitiger Kontaktierbarkeit von der zweiten Seite der Platte her ermöglicht einen so einfachen Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung, dass diese derart kostengünstig hergestellt werden kann, dass sie zum einmaligen Gebrauch ge- eignet ist. Messungen, bei denen die Elektroden, deren Analyt-spezifische Beschichtungen oder die Analyt-spezifischen Moleküle angegriffen werden, können reproduzierbar nur mit einer Vorrichtung zum einmaligen Gebrauch durchgeführt werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in Form eines Chips zu einem Bruchteil der zur Herstellung eines Siliziumbasierten Chips erforderlichen Kosten hergestellt werden. Die Vorrichtung kann somit zu einem Durchbruch in der Routinesensorik beitragen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in einem zur Kontaktierung der Vorrichtung vorgesehenen Gerät ein- gesetzt werden. Alle zum Ableiten und Messen eines Signals erforderlichen nicht von der erfindungsgemäßen Vorrichtung bereitgestellten Komponenten werden dabei von dem Gerät bereitgestellt. Teuere Komponenten sind somit wiederverwendbar. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Kontaktierung von der zweiten Seite der Platte her kurze Leitungswege ermöglicht. Dadurch kann ein durch die verhältnismäßig langen Leitungswege bei seitlicher Ableitung der Elek- troden verursachtes elektrisches Rauschen vermieden werden. Das elektrische Rauschen vermindert die Sensitivität der Detektion und kann dadurch die Detektion des Analyten sogar verhindern .
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung sind die elektrischen Leiter zusammen mit den Elektroden einstückig ausgebildet. Die Elektroden und die Leiter können aus demselben Material bestehen. Das ermöglicht eine gute Kontaktierbarkeit von der zweiten Seite her und eine sehr kostengünstige Herstellung. Es ist nicht erforderlich auf der ersten Seite der Platte einen elektrischen Kontakt zwischen den Elektroden und den elektrischen Leitern herzustellen.
Die Beschichtung oder die Analyt-spezifischen Moleküle an den Elektroden können jeweils unterschiedlich sein, so dass sich verschiedene Elektroden dadurch voneinander unterscheiden. Dadurch können die Analyt-spezifischen Beschichtungen oder Analyt-spezifischen Molekülen eine unterschiedliche Spezifi- tät aufweisen und eine, insbesondere gleichzeitige, Detektion verschiedener Analyte ermöglichen. Ein detektierbarer Analyt ist dabei Mitglied einer Gruppe, die durch die Spezifität der unterschiedlichen Beschichtungen oder Moleküle vorgegeben ist .
Die Beschichtung oder die Analyt-spezifischen Moleküle können, insbesondere elektrochemisch inerte, Fänger-Moleküle umfassen. Fänger-Moleküle sind dabei Moleküle, an die der Analyt oder eine infolge der Anwesenheit des Analyten gebildete Substanz, z. B. ein Abbauprodukt des Analyten, aus der Flüs- sigkeit heraus bindet. Die Fänger-Moleküle sind elektroche- misch inert, wenn sie bei einer elektrochemischen Detektion des Analyten kein Signal verursachen. Bei den Fänger- Molekülen kann es sich um, insbesondere einzelsträngige, Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Analoga, Liganden, Haptene, Pepti- de, Proteine, Zucker, Lipide oder Ionenaustauscher handeln. Die Fänger-Moleküle können kovalent und/oder gerichtet an die Elektroden gebunden sein. Der Vorteil der kovalenten Bindung besteht darin, dass die Fänger-Moleküle nicht von den Elektroden abdiffundieren können. Bei den mit der erfindungsgemä- ßen Vorrichtung möglichen sehr kleinen Abständen zwischen den Elektroden kann bereits eine geringe Abdiffusion von Fänger- Molekülen zu einer Störung einer Nachweisreaktion führen. Unter einer gerichteten Bindung ist zu verstehen, dass die Fänger-Moleküle jeweils mit einer bestimmten Stelle des Fänger- Moleküls, z. B. mit einem Ende des Moleküls, an die Elektroden gebunden sind. Dadurch kann gewährleistet werden, dass die für das Binden des Analyten verantwortliche Stelle der Fänger-Moleküle durch deren Bindung an die Elektroden nicht beeinflusst wird. Die Fänger-Moleküle können, zumindest teil- weise, über eine, insbesondere elektrochemisch weit gehend inerte, Zwischenschicht an die Elektroden gebunden sein. Diese Zwischenschicht kann aus Silan gebildet sein. Die Zwischenschicht ist elektrochemisch weit gehend inert, wenn sie bei einer elektrochemischen Detektion des Analyten kein Si- gnal verursacht.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Beschichtung mindestens einen semipermeablen Überzug der Elektroden. Die semipermeablen Überzüge können jeweils eine unterschiedliche Durchlässigkeit aufweisen, so dass die Überzüge verschiedener
Elektroden unterschiedlich durchlässig sein können. Die Überzüge können selektiv für Moleküle bis zu einer bestimmten Größe durchlässig sein. Es kann sich dabei um eine polymere Matrix mit Molekularsieb-Wirkung handeln. Dadurch ist es mög- lieh, nur kleine Moleküle, welche z. B. durch einen spezifi- sehen Abbau eines Analyten entstehen, zu den Elektroden durchdringen zu lassen, so dass spezifisch nur diese nachgewiesen werden. Eine solche erfindungsgemäße Vorrichtung kann bei einer Prozesssteuerung zur Verfolgung von in einem Reak- tor stattfindenden Umsetzungen eingesetzt werden.
Die elektrischen Leiter können in Durchbrüchen der Platte angeordnet sein, welche sich von der zweiten Seite der Platte her, insbesondere konisch, zur ersten Seite hin verjüngen. Dabei kann der elektrische Leiter nur am verjüngten Abschnitt der durch die sich verjüngende Form des Durchbruchs gebildeten Ausnehmung angeordnet sein. Er kann aber auch frei in die Ausnehmung hinein ragen. Die sich verjüngende Form der Ausnehmung erleichtert die elektrische Kontaktierung von der zweiten Seite her, weil ein zur Kontaktierung in Richtung der Elektrode geführter Leiter auch dann an die Elektrode herangeführt wird, wenn er zunächst nur in die Ausnehmung trifft.
Die Platte kann auf dem Boden einer Mikrofluidkammer angeord- net sein oder den Boden einer Mikrofluidkammer bilden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist wegen der Möglichkeit der besonders ebenen Ausführung und der damit einher gehenden guten Abdichtbarkeit dazu gut geeignet.
Bei der Vorrichtung kann es sich auch um einen Chip handeln. Darunter wird hier eine nicht notwendigerweise aus Halbleitermaterial bestehende kleine Platte mit elektronischen Mi- krostrukturen verstanden. Die Elektroden können dabei in Form eines Elektrodenfelds (Array) angeordnet sein.
Die Platte kann mehr als 10, vorzugsweise mehr als 20, 40, 80, 100 oder 160, besonders bevorzugt mehr als 1000, insbesondere mehr als 10000, Elektroden pro cm2 aufweisen. Die Elektroden können zumindest teilweise aus Partikeln gebildet sein. Die Partikel können mit Analyt-spezifischer Beschich- tung versehen sein oder Analyt-spezifische Moleküle enthalten. Die Partikel können dabei untereinander lose oder fest verbunden sein. Eine lose Verbindung kann z. B. dadurch bereitgestellt werden, dass die Partikel paramagnetisch sind und durch Magnetkraft an der Elektrode bzw. dem elektrischen Leiter gehalten werden.
Weiterhin können die Elektroden, zumindest teilweise, aus einem nichtmetallischen Leiter, insbesondere Kohlenstoff, ge- bildet sein. Kohlenstoff enthaltende Elektroden sind besonders gut zum Nachweis von Biomolekülen geeignet. Bei den Elektroden kann es sich, zumindest teilweise, um Pencil-, Glassy-Carbon- , Kohlenstofffasern enthaltende, Kohlenstoff- Paste- oder Kunststoff-Komposit-Elekroden, vorzugsweise ele- mentaren Kohlenstoff, insbesondere in Form von Grafit oder Ruß, enthaltende Polycarbonat-Elektroden, handeln. Bei dem Ruß kann es sich um Industrieruß, synthetischen Ruß oder so genanntes "Carbon Black" handeln.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Meßvorrichtung, umfassend eine erfindungsgemäße Vorrichtung, bei der die Elektroden mindestens eine Referenz- und mindestens eine Gegenelektrode sowie eine Vielzahl an Arbeitselektroden umfassen. Die Meßvorrichtung enthält Strom-Spannungskonverter, einen Poten- tiostaten und ein Mittel zum Messen der durch die Arbeitselektroden fließenden Ströme. Die Elektroden sind elektrisch mit dem Potentiostaten zur Erzeugung eines vorgegebenen Spannungsverlaufs zwischen den Arbeitselektroden und der Referenzelektrode verbunden, wobei jeder der Arbeitselektroden einer der Strom-Spannungskonverter nachgeschaltet ist, um sämtliche
Arbeitselektroden auf demselben Potenzial zu halten. Dabei ist lediglich ein einziger Potentiostat zur Erzeugung eines an sämtliche Arbeitselektroden gleichzeitig angelegten identischen vorgegebenen Spannungsverlaufs erforderlich. Indem sämtliche Arbeitselektroden auf demselben Potenzial gehalten werden, ist es beispielsweise möglich, die durch die Arbeitselektroden fließenden Ströme parallel zu messen. Dazu kann jede der Arbeitselektroden über einen Stromfolger zur individuellen Auswertung der Signale virtuell an der Schaltungs- masse anliegen.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit folgenden Schritten:
a) Herstellen eines Verbunds von im Wesentlichen parallel angeordnetem länglichem Elektrodenmaterial und das Elektrodenmaterial umgebendem Isoliermaterial wobei der Verbund hergestellt wird mittels
Umgießen eines festen Elektrodenmaterials mit einem aushärtenden Isoliermaterial,
Einführen eines festen Elektrodenmaterials in im Wesent- liehen parallele Ausnehmungen oder Durchbrüche eines festen Isoliermaterials oder in ein plastisch verformbares Isoliermaterial,
Einfüllen von pastöse oder flüssigem aushärtendem Elek- trodenmaterial in im Wesentlichen parallele Ausnehmungen oder Durchbrüche eines festen einstückigen Isoliermaterials oder eines gestapelten plattenförmigen Isoliermaterials mit sich deckend angeordneten Durchbrüchen,
- Verbinden von Elektrodenmaterial, welches eine aus Isoliermaterial bestehende Ummantelung aufweist, durch Verschmelzen, Vergießen oder Verkleben der Ummantelung oder
Extrudieren eines Verbunds aus von Isoliermaterial umge- benem Elektrodenmaterial und
b) Trennen des Verbunds im Wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung des Elektrodenmaterials durch Schneiden, Sägen oder mittels einer Trennscheibe oder durch Auseinandernehmen des gestapelten plattenförmigen Isoliermaterials .
Bei dem festen Elektrodenmaterial kann es sich beispielsweise um mehrere parallel angeordnete Bleistiftminen handeln, die mit Epoxydharz umgössen werden. Das plastisch verformbare Isoliermaterial kann sich der Form des Elektrodenmaterials beim Einführen anpassen und/oder daran nach dem Einführen durch Zusammenpressen angepasst werden. Dadurch ist ein flüssigkeitsdichter Abschluss gewährleistet. Unter "Aushärten" des Elektrodenmaterials wird hier und im Folgenden verstanden, dass sich das ursprünglich flüssige oder pastöse Elektrodenmaterial mit der Zeit verfestigt, d. h. in seiner Härte zunimmt. Das kann z. B. durch Polymerisieren, durch Trocknen oder durch Abkühlen eines bei höherer Temperatur pastösen Elektrodenmaterials erfolgen. Der Endzustand des Elektrodenmaterials nach dem Verfestigen kann aber immer noch verhältnismäßig weich sein.
Das feste einstückige Isoliermaterial kann durch ein Spritz- guss-Verfahren hergestellt werden. Beim Einfüllen des Elektrodenmaterials in das gestapelte plattenförmige Isoliermaterial sind die Durchbrüche so angeordnet, dass Elektrodenmaterial, welches auf einer Seite des gestapelten Isoliermaterials eingefüllt wird, alle Durchbrüche füllt. Das Elektroden- material kann in die Durchbrüche z. B. durch Extrusion hin- eingepresst werden. Das dazu verwendete Verfahren kann ein aus der Herstellung von Bleistiftminen bekanntes Verfahren sein. Das Verschmelzen der Ummantelung kann durch Erhitzen oder chemisch, z. B. durch Zusatz eines die Ummantelung anlösenden Lösungsmittels, erfolgen.
Beim Herstellen des Verbunds mittels Extrudieren des Verbunds aus von Isoliermaterial umgebenem Elektrodenmaterial ist sowohl das leitfähige Elektrodenmaterial als auch das Isoliermaterial plastisch so verformbar, dass beide Materialien gemeinsam als Verbund extrudiert werden können. Das ermöglicht eine sehr kostengünstige Herstellung.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen einer elektrisch nicht leitenden Platte mit Durchbrüchen,
b) Aufbringen eines pastösen aushärtenden Elektrodenmateri- als auf eine erste Seite der Platte,
c) Hineindrücken des Elektrodenmaterials in die Durchbrüche und
d) Entfernen des zwischen den Durchbrüchen vorhandenen
Elektrodenmaterials so weit dieses Elektrodenmaterial das in den Durchbrüchen vorhandene Elektrodenmaterial elektrisch leitend verbindet.
Das Aushärten kann z. B. durch Polymerisieren, durch Trocknen oder durch Abkühlen erfolgen. Schritt lit. c kann gleichzeitig mit dem Aufbringen gemäß Schritt lit. b oder danach durchgeführt werden. Das Verfahren kann in der Art eines Siebdruckverfahren durchgeführt werden, wobei statt der Farbe das Elektrodenmaterial aufgebracht wird. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen einer elektrisch nicht leitenden Platte mit Durchbrüchen,
b) Auflegen einer Lochmaske mit den Durchbrüchen, zumindest teilweise, entsprechenden Löchern oder einer Siebdruckmaske mit den Durchbrüchen, zumindest teilweise, entsprechenden durchlässigen Flächen auf die erste Seite der Platte so, dass sich die Löcher oder die Flächen mit den Durchbrüchen der Platte, zumindest teilweise, decken,
c) Aufbringen eines pastösen aushärtenden Elektrodenmaterials auf die Lochmaske oder Siebdruckmaske,
d) Hineindrücken des Elektrodenmaterials über die Löcher oder durchlässigen Flächen in die Durchbrüche und
e) Abnehmen der Lochmaske oder Siebdruckmaske von der Platte.
Das Verfahren hat den Vorteil, dass durch Schritt lit. e das Entfernen überschüssigen Elektrodenmaterials deutlich vereinfacht wird und es eine größere Elektrodenoberfläche ermöglicht, weil die Elektroden auf der ersten Seite der Platte, bedingt durch die Höhe der Lochmaske bzw. Siebdruckmaske, erhaben sind. Indem bei derselben Platte durch die Lochmaske bzw. Siebdruckmaske bei wiederholt durchgeführten Schritten lit. b bis lit. e verschiedene Durchbrüche abgedeckt und offen gelassen werden, kann in die Durchbrüche unterschiedliches Elektrodenmaterial hineingedrückt werden. Insbesondere kann das Elektrodenmaterial unterschiedliche Analyt- spezifische Moleküle aufweisen. Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen einer elektrisch nicht leitenden Platte,
b) Herstellen von Durchbrüchen in der Platte,
c) Herstellen von Vias in den Durchbrüchen zur Herstellung des die Platte durchspannenden elektrischen Leiters und
d) Aufbringen eines pastösen aushärtenden Elektrodenmaterials auf die Vias auf der ersten Seite der Platte.
Die Durchbrüche beim Schritt lit. b können durch Bohren, insbesondere mittels eines Laserstrahls, hergestellt werden.
Bei einem Via handelt es sich um eine elektrisch leitfähige Verbindung zwischen zwei Schichten, die hier durch die erste und die zweite Seite der elektrisch nicht leitenden Platte gebildet werden. Der Via wird im Allgemeinen bei einer Platine oder einem integrierten Schaltkreis verwendet. Verfahren zur Herstellung von Vias sind allgemein bekannt. Beim erfin- dungsgemäßen Verfahren werden die Vias vorzugsweise so hergestellt, dass sie nicht über die durch die erste Seite der Platte gebildete Ebene hinausragen. Die seitliche Ausdehnung der Vias sollte so klein sein, dass dadurch die Form der, bevorzugt im Siebdruckverfahren, auf die Endigungen der Vias auf der ersten Seite aufgebrachten Elektroden nicht beein- flusst wird. Eine solche Beeinflussung ist möglich weil die Vias in ihrem Inneren häufig eine röhrenförmige Öffnung aufweisen. Ist diese Öffnung zu groß, kann auf den Via aufgetragenes pastöses oder flüssiges Elektrodenmaterial in die Öff- nung eindringen und statt diese abzudichten dazu führen, dass die Platte bzw. die erfindungsgemäße Vorrichtung für Flüssigkeit durchlässig wird. Vorzugsweise haben die Vias an ihrem auf der ersten Seite der Platte gelegenen Ende eine, insbesondere glatte, durchgehende, d. h. keine Öffnung aufweisen- de, Oberfläche.
Die Vias können beispielsweise aus einer dünnen Kupferschicht bestehen. Vorzugsweise werden die Vias beim Schritt lit. c durch galvanisches Abscheiden in den Durchbrüchen oder durch Einfügen je eines Leiters in die Durchbrüche hergestellt. Das Aufbringen des Elektrodenmaterials kann mittels Tampondruck oder mittels eines siebdruckartigen Verfahrens erfolgen. Beide Techniken sind prinzipiel zur Herstellung von Elektroden bekannt. Sie ermöglichen hier eine besonders kostengünstige und exakte Fertigung der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Beim Tampondruck wird ein pastöses Elektrodenmaterial, welches in einem Muster angeordnet ist, das dem gewünschten Elektrodenmuster entspricht, von einem Tampon aufgenommen. Das Elektrodenmaterial wird dann durch Aufdrücken des Tampons in Form des vorgegebenen Musters auf die elektrisch nicht leitende
Platte aufgebracht. Die mittels des siebdruckartigen Verfahrens hergestellten Elektroden werden als "Screen-Print-Elek- troden" bezeichnet.
Auf das Elektrodenmaterial kann eine, insbesondere Analyt- spezifische, Beschichtung aufgebracht werden. Es können auch Analyt-spezifische Moleküle in das Elektrodenmaterial eingebracht werden. Beide Vorgänge können vor, nach oder während jedem der genannten Schritte durchgeführt werden. Elektroden- material im Sinne der Erfindung umfasst sowohl das zur Herstellung der Elektroden dienende Material als auch die daraus gebildeten Elektroden. Als Beschichtung oder Analyt-spezifische Moleküle können, insbesondere elektrochemisch inerte, Fänger-Moleküle aufgebracht oder in das Elektrodenmaterial eingebracht werden. Auf die Elektroden bzw. das Elektrodenma- terial können jeweils unterschiedliche Beschichtungen aufgebracht werden. In das Elektrodenmaterial können jeweils unterschiedliche Analyt-spezifische Moleküle eingebracht werden. Als Fänger-Moleküle können insbesondere einzelsträngige, Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Analoga, Liganden, Haptene, Pep- tide, Proteine, Zucker, Lipide oder Ionenaustauscher verwendet werden. Die Fänger-Moleküle können kovalent und/oder gerichtet an das Elektrodenmaterial gebunden oder auf dem Elektrodenmaterial synthetisiert oder elektrochemisch abgeschie- den werden. Bevorzugt werden die Fänger-Moleküle, zumindest teilweise, über eine, insbesondere elektrochemisch weit gehend inerte, Zwischenschicht an das Elektrodenmaterial gebunden oder auf der Zwischenschicht synthetisiert. Vorzugsweise wird die Zwischenschicht aus Silan gebildet. Das Elektroden- material kann mit mindestens einem semipermeablen Überzug beschichtet werden. Das kann auch zusätzlich zur Beschichtung mit Fänger-Molekülen erfolgen. Das Elektrodenmaterial bzw. die Elektroden können jeweils mit unterschiedlich durchlässigen semipermeablen Überzügen beschichtet werden. Jede aus dem Elektrodenmaterial gebildete Elektrode kann einen anderen Überzug aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum elektrischen Kontaktieren einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei eine Mehrzahl einzeln ableitbarer elektrischer Leiter mit der zweiten Seite der Platte der Vorrichtung so in Kontakt gebracht werden, dass die Leiter dabei, zumindest teilweise, die Elektroden derart kontaktieren, dass die Elektroden einzeln elektrisch ableitbar sind. Bevorzugt sind die Leiter einfederbar gelagert und werden mit der zweiten Seite der
Platte so in Kontakt gebracht, dass sie dabei Einfedern. Dazu kann z. B. eine Kontaktplatte mit Federstiften dienen. Das elektrische Kontaktieren kann auch über einen Elastomer-Verbinder, insbesondere einen ZEBRA®-Elastomer-Verbinder, erfol- gen. Elastomer-Verbinder bestehen aus sich abwechselnden Schichten von elektrisch leitendem und elektrisch nicht leitendem Elastomer, insbesondere Silikon-Elastomer. Die Elastomer-Verbinder können flächig ausgebildet sein, wobei die Schichten senkrecht zu einer Oberfläche verlaufen. Die elek- trisch leitende Schicht ist mit leitfähigen Fasern oder Partikeln, z. B. aus Silber, Gold oder Kohlenstoff, versetzt. ZEBRA®-Elastomer-Verbinder werden von der Firma Fujipoly America Corporation, 900 Milik Street P.O. Box 119, Carteret, NJ 07008, USA vertrieben. Durch Anlegen des ZEBRA®-Elastomer- Verbinders an der zweiten Seite der Platte und Ausüben eines leichten Drucks auf die Kontaktfläche zwischen der Platte und dem ZEBRA®-Elastomer-Verbinder kommen die Elektroden mit den leitfähigen Schichten in Kontakt. Die elektrische Ableitung der Elektroden kann durch die Kontaktierung der leitfähigen Schichten mit einer elektrischen Auswerteeinheit erfolgen.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Flüssigkeit, wobei die Flüssigkeit mit Elektro- den auf der ersten Seite der Platte der Vorrichtung in Kontakt gebracht wird und die Elektroden von deren zweiter Seite her elektrisch kontaktiert werden. Die Flüssigkeit wird dabei vorzugsweise unter Bedingungen mit den Elektroden in Kontakt gebracht, unter denen der Analyt oder eine infolge der Anwe- senheit des Analyten gebildete Substanz, z. B. ein Abbauprodukt des Analyten, an an den Elektroden vorhandene Fänger- Moleküle bindet. Der Nachweis des an die Fänger-Moleküle gebundenen Analyten oder der Substanz kann elektrisch, z. B. durch Leitfähigkeitsmessung, elektrochemisch, optisch, photo- elektrisch, enzymatisch, mittels Elektrolumineszenz oder mittels Chemilumineszenz erfolgen. Der Nachweis kann auch mittels einer Kombination der genannten Nachweismethoden erfolgen. Beim elektrochemischen Nachweis ist es vorteilhaft, wenn ein direkter Kontakt des Analyten oder der Substanz mit der Elektrode ermöglicht wird. Beim optischen Nachweis kann ein optisches Signal, wie z. B. Fluoreszenz, an den Elektroden gemessen werden. Die Identifizierung des Analyten oder der Substanz erfolgt dabei beispielsweise dadurch, dass diejenige Elektrode durch optische Detektion identifiziert wird, an welche ein fluoreszierender Analyt oder eine fluoreszierende Substanz spezifisch über die Fänger-Moleküle gebunden ist. Dadurch, dass die Elektrode einem spezifischen Fänger-Molekül zugeordnet werden kann, kann der Analyt oder die Substanz identifiziert werden. Die Elektroden dienen bei diesem Nach- weisverfahren der elektrischen Anziehung und/oder Abstossung von geladenen Analyten oder Substanzen. Durch das Anlegen eines entsprechenden Potenzials an eine Elektrode können die geladenen Analyten oder die geladenen Substanzen elektrisch in den Bereich der Fänger-Moleküle transportiert werden. Durch eine erhöhte Konzentration der Analyten oder Substanzen im Bereich der Fänger-Moleküle kann die Bindung der Analyten oder Substanzen daran beschleunigt werden. Nicht oder schwach und unspezifisch gebundene Analyten oder Substanzen können durch das Anlegen eines abstoßenden Potenzials an die Elek- trode davon entfernt werden. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Fänger-Moleküle über eine Analyt- oder Substanz-undurchlässige Zwischenschicht an den Elektroden immobilisiert sind. Dadurch wird verhindert, dass der Analyt oder die Substanz bei einem direkten Kontakt mit der Elektrode elektrochemisch umgesetzt wird. Dies ermöglicht das Anlegen von hohen Potenzialen für einen schnellen Transport der Analyten oder der Substanzen zu den Fänger-Molekülen.
Die Elektroden können mit einem semipermeablen Überzug be- schichtet sein. Dadurch kann es ermöglicht werden, dass selektiv nur die Analyten, Abbauprodukte der Analyten oder die Substanzen nachgewiesen werden, welche den Überzug durchdringen. Der Nachweis kann elektrisch, elektrochemisch, optisch, photoelektrisch, enzymatisch, mittels Elektrolumineszenz oder mittels Chemilumineszenz erfolgen. Er kann auch mittels einer Kombination dieser Nachweismethoden erfolgen. Vorzugsweise sind die Elektroden jeweils mit unterschiedlich durchlässigen semipermeablen Überzügen beschichtet.
Der Analyt kann ein Biomolekül, insbesondere eine Nukleinsäu- re, ein Protein, ein Antigen, ein Zucker, ein Lipid, eine Zelle oder ein Virus, sein. Er kann eine Markierungssubstanz aufweisen. Bei der Markierungssubstanz kann es sich z. B. um ein Enzym oder um eine redoxaktive Markierung handeln. Bei der Verwendung der Vorrichtung kann eine Redox-Reaktion oder eine katalytische Wasserstoff-Entwicklung elektrochemisch de- tektiert werden. Das elektrochemische Detektieren kann z. B. mittels Differenzieller Puls-Voltammetrie (DPV) , Chronopoten- tiometrischer Stripping-Analyse (CPSA) oder des Nachweises einer Widerstands- oder Impedanzänderung erfolgen.
Das elektrochemische Detektieren kann folgende Schritte umfassen:
a) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die Vorrichtung mindestens eine Gegen- und eine Referenzelektrode sowie eine Vielzahl von Arbeitselektroden aufweist,
b) Inkontaktbringen der Flüssigkeit mit den Arbeits-, Ge- gen- und Referenzelektroden,
c) gleichzeitiges Anlegen eines vorgegebenen Spannungsverlaufs zwischen den Arbeitselektroden und der Referenzelektrode und
d) Messen der durch die Arbeitselektroden fließenden Ströme, wobei während der Messung sämtliche Arbeitselektroden auf demselben Potenzial gehalten werden. Zum elektrochemischen Detektieren wird vorzugsweise ein Potenzialintervall zur Messung gewählt, in welchem im Wesentlichen nur der Analyt oder die Substanz ein Signal verursacht.
Bevorzugt werden die, insbesondere Kohlenstoff enthaltenden, Elektroden vor dem Nachweisen des Analyten mit einem Deter- genz behandelt. Das kann bevor oder während die den Analyten enthaltende Flüssigkeit mit den Elektroden in Kontakt steht erfolgen. Die Behandlung mit Detergenz kann eine elektroche- mische Konditionierung ersetzen. Sie ist einfacher, schneller und kostengünstiger als eine elektrochemische Konditionierung. Die Elektroden können in einer Detergenz enthaltenden Flüssigkeit aufbewahrt und darin z. B. vertrieben werden. Vorzugsweise ist das Detergenz ein ionisches Detergenz. Gün- stigerweise liegt das Detergenz in einer Konzentration von 0,1 % bis 10 % vor. Bevorzugt weist das Detergenz in Wasser eine kritische mizellare Konzentration unter 10 mmol/1, insbesondere unter 5 mmol/1, vorzugsweise unter 3 mmol/1, auf. Das Detergenz kann Natriumdodezylsulfat sein.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden anhand der Zeichnung näher erläutert. Hierin zeigen:
Fig. la - e eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 2a - b eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vor- richtung mittels Durchtrennen eines Verbunds aus Elektrodenmaterial und Isoliermaterial,
Fig. 3a - d eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Herstellen eines Verbunds aus parallel an- geordnetem länglichem Elektrodenmaterial und Isoliermaterial ,
Fig. 4a - d eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Detektion mittels Extrusion und Durchtrennen eines dadurch hergestellten Verbunds ,
Fig. 5a - c eine Grundplatte zur Herstellung einer Vorrichtung zur Detektion,
Fig. 6a - d eine schematische Darstellung eines siebdruckartigen Verfahrens zur Herstellung einer er- findungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 7a - b eine schematische Darstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum elektrischen Kontaktieren der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Detektion,
Fig. 8a - b eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Chips mit 4x4 Elektroden,
Fig. 9 eine Abbildung des Chips,
Fig. 10 das Ergebnis zweier parallel mit dem Chip durchgeführter DPV-Messungen von Heringssper- ma-DNA und
Fig. 11a - c eine schematische Darstellung einer Mikro- fluidkammer mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Detektion. Fig. la zeigt einen plastisch verformbaren elektrisch isolierenden Grundkörper 10 mit einer ersten Seite 12 und einer zweiten Seite 14. Fig. lb zeigt vier aus Bleistiftminen gebildete Elektroden 15. In Fig. lc ist der Grundkörper 10 mit darin durch mechanischen Druck eingeführten Elektroden 15 dargestellt. Das Einführen der Elektroden erfolgt dabei derart, dass jede Elektrode auf der ersten Seite 12 und der zweiten Seite 14 herausragt. Nach dem Einführen der Elektroden 15 kann der Grundkörper 10 ausgehärtet werden. Fig. ld zeigt die entstandene Vorrichtung zur Detektion 17 in der Aufsicht, Fig. le in der Seitenansicht. Die Vorrichtung 17 kann, wie in Fig. 2a dargestellt, senkrecht entlang der Linien 16 mehrfach durchtrennt und dadurch in die in Fig. 2b dargestellten scheibenförmigen erfindungsgemäßen Vorrichtungen 17 zerlegt werden. Jede der Elektroden 15 besitzt dabei Kontakt zur jeweiligen Ober- und Unterseite der Scheiben.
Eine Elektrode 15 mit einer aus Isoliermaterial bestehenden Ummantelung 18 ist in Fig. 3a im Querschnitt und in Fig. 3b in der Aufsicht dargestellt. Fig. 3c und Fig. 3d zeigen einen durch Verbinden der Ummantelungen 18 entstandenen Verbund solcher Elektroden im Querschnitt und in der Aufsicht. Die Pfeile 20 zeigen Positionen an, an denen der Verbund durchtrennt werden kann, um daraus scheibenförmige erfindungsgemä- ße Vorrichtungen 17 herzustellen.
Fig. 4a zeigt einen elektrisch isolierenden Grundkörper 10 mit vier parallelen ersten Durchbrüchen 22. Der Grundkörper 10 kann beispielsweise aus einem Kunststoff bestehen und durch ein Spritzguss-Verfahren hergestellt sein. In die ersten Durchbrüche 22 des Grundkörpers 10 kann eine Masse aus einem elektrisch leitfähigen Elektrodenmaterial 15 einge- presst werden. Das kann beispielsweise durch ein Extrusions- verfahren erfolgen, wie es üblicherweise zur Herstellung von Bleistiftminen verwendet wird. Bei dem Elektrodenmaterial 15 kann es sich um ein Material zur Herstellung von Bleistiftminen handeln. Der Grundkörper 10 kann, auch schon vor einer Aushärtung des Elektrodenmaterials 15, an den durch die Pfeile 20 angedeuteten Stellen senkrecht zu den mit Elektrodenma- terial 15 verfüllten ersten Durchbrüchen 22 durchtrennt werden. Dadurch entstehen die in Fig. 4c perspektivisch und in Fig. 4d in der Aufsicht dargestellten scheibenförmigen erfindungsgemäßen Vorrichtungen 17. Alternativ zu dem mechanischen Durchtrennen des Verbunds aus Elektrodenmaterial 15 und Grundkörper 10 kann ein Stapel scheibenförmiger Grundkörper 10 mit ersten Durchbrüchen so übereinander gestapelt werden, dass sich die ersten Durchbrüche 22 decken. Beim Einfüllen des Elektrodenmaterials 15 an einem Ende des Stapels werden dann sämtliche der ersten Durchbrüche 22 der scheibenförmigen Grundkörper 10 gefüllt. Danach kann der Stapel noch vor einem Aushärten des Elektrodenmaterials auseinandergenommen werden.
Fig. 5c zeigt einen plattenförmigen Grundkörper 10 mit einer ersten Seite 12 und einer zweiten Seite 14 im Querschnitt. Fig. 5b zeigt diesen Grundkörper 10 in der Aufsicht von der zweiten Seite 14 und Fig. 5a in der Aufsicht von der ersten Seite 12. Der Grundkörper 10 weist konische sich von der ersten Seite 12 zu der zweiten Seite 14 erweiternde Durchbrüche 22 auf. In Fig. 6a ist der plattenförmige Grundkörper 10 auf der ersten Seite 12 mit einer Lochmaske 24 belegt, welche Löcher 26 aufweist, die sich mit den Durchbrüchen 22 auf der ersten Seite 12 decken. Fig. 6b zeigt auf die Lochmaske 24 aufgebrachtes elektrisch leitfähiges pastöses Elektrodenmaterial 15. Fig. 6c zeigt das Elektrodenmaterial 15 nachdem es in einem siebdruckartigen Verfahren in die Löcher 26 und die
Durchbrüche 22 hinein gepresst worden ist. In Fig. 6d ist die erfindungsgemäße Vorrichtung 17 nach Entfernen der Lochmaske 24 dargestellt. Fig. 7a und 7b zeigen eine Vorrichtung zum elektrischen Kontaktieren 36 einer Vorrichtung zur Detektion 17. Die Vorrichtung zum elektrischen Kontaktieren 36 besteht dabei aus einer elastischen Matrix 28 aus einem elektrisch isolierenden Mate- rial. In dieser Matrix 28 sind parallel elektrisch leitfähige Stifte 30 angeordnet, welche elektrisch mit Kontakten 34 auf der Unterseite der Matrix verbunden sind. Die Stifte werden durch eine Feder 32 aus der elastischen Matrix herausgedrückt. Bevorzugt sind die Stifte 30 an der zur Kontaktierung vorgesehenen Seite spitz zulaufend. Das in Fig. 7b dargestellte Kontaktieren der Vorrichtung zur Detektion 17 durch die Vorrichtung zum elektrischen Kontaktieren 36 erfolgt durch Aneinanderdrücken der beiden Vorrichtungen 17, 36. Dabei kommen die Stifte 30 mit den Elektroden 15 in Kontakt. Die elastische Matrix 28 wird dabei gestaucht. Dadurch können die Stifte 30 in die sich zur ersten Seite 12 hin verjüngenden Durchbrüche 22 der Vorrichtung 17 zum Detektieren eindringen und dabei die Elektroden 15 kontaktieren. Durch die spitz zulaufende Form der Stifte 30, die sich verjüngenden Durchbrüche 22 und die Form der Elektroden 15 wird eine vergrößerte Kontaktfläche der Stifte 30 mit den Elektroden 15 bereitgestellt .
Eine Anordnung von Verschalungen 39 und einer Elektrodenhal- terung 40 zum Umgießen der Elektroden 15 mit einem isolierenden Material, wie beispielsweise Epoxydharz, ist in Fig. 8a vor und in Fig. 8b nach dem Zusammenbau schematisch dargestellt. Eine der Verschalungen 39 weist eine Öffnung 41 zum Einfüllen des isolierenden Materials auf. Der durch die Poly- merisation des Isoliermaterials entstehende Verbund aus Elektroden und Isoliermaterial kann durchtrennt werden, so dass scheibenförmige Vorrichtungen 17 zur Detektion als Chips mit 4 x 4 Elektroden entstehen. Eine solche Vorrichtung 17 ist in Fig. 9 gezeigt. Dabei dienen Bleistiftminen als Elektrodenma- terial. Die Elektroden eines der Chips sind elektrochemisch für 1 min mit 1,2 V in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 behandelt bzw. konditioniert worden. Die Elektroden eines anderen der Chips sind für 1 min mit 10% SDS behandelt worden. Zur Silanisierung der Elektroden wurden die Chips für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in einer Lösung aus 1% (v/v) 3- (Glycidyloxypropyl) -trimethoxysilan (Fa. Flu- ka) , 1% (v/v) entionisiertem Wasser (Fa. Millipore) und 98% (v/v) Ethanol (Fa. Merck) inkubiert. Anschließend wurden sie für 30 min bei 80 °C getrocknet.
Das Oligonukleotids TNF2 mit der Sequenz 5 ' cct icc cca atc cct tta tt 3' - Aminolink (SEQ ID NO: 1 - Aminolink) , wobei i einen Inosin-Rest darstellt, wurde als Fänger-Molekül an die silanisierten Elektroden gekoppelt. Bei dem Oligonukleotid handelt es sich um eine mit einem Aminolink versehene Sequenz aus der c-DNA des humanen Tumor Nekrose Faktor α-Gens . Zur Kopplung wurde je ein Tropfen einer 150 p ol/ml Oligonukleotid in 0,1 M Na2C03, pH 9,5 enthaltenden Lösung auf jede der Elektroden der Chips gesetzt. Die Chips wurden dann für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert.
Dabei gehen die freien Aminogruppen der Oligonukleotide mit dem Silan eine kovalente Bindung ein. Zur Abtrennung nicht kovalent gebundener Oligonukleotide wurden die Chips für eine Stunde in 2 ml 10% SDS bei RT inkubiert. Zur Absättigung noch vorhandener Bindungsstellen wurden die Chips eine Stunde bei RT in 1% Rinder-Serum-Albumin (BSA) oder Ethanolamin in Phosphat-gepufferter-Saline (PBS) inkubiert.
Um den Einfluss einer Elektrodenbehandlung auf die Sensitivi- tat und Reproduzierbarkeit der elektrochemischen Nukleinsäu- redetektion zu untersuchen, sind die Chips in einer Lösung von 10 nmol/ml der komplementären Nukleinsäure TNF2k (SEQ ID NO: 2) in Detergenz-haltigem Hybridisierungs-Puffer (Fa. Röche) inkubiert und die gebundene Nukleinsäure TNF2k mittels DPV bestimmt worden. Jeweils zehn Messungen wurden mit den elektrochemisch bzw. mit Detergenz behandelten Elektroden durchgeführt. Die Detergenz-Behandlung führte zu einer Sensitiv!tätssteigerung von mehr als 10% gegenüber der elektrochemischen Behandlung. Weiterhin war die Reproduzierbarkeit der Messungen mit Detergenz-behandelten Elektroden verbessert. Die Standardabweichung der Messungen Detergenz-behandelter Elektroden war um Faktor 3 geringer als bei einer elektrochemischen Behandlung.
Fig. 10 zeigt zwei Voltammogramme, welche mittels parallel mit der in Fig. 9 gezeigten Vorrichtung 17 durchgeführten DPV-Messungen von Heringssperma-DNA ermittelt worden sind. Dazu wurde das Elektrodenmaterial der Vorrichtung 17 von dessen zweiter Seite mittels Federkontaktstiften mit einer elek- tronischen Auswerteeinheit verbunden. Eine der Elektroden ist als Referenzelektrode geschaltet worden. Auf die erste Seite der Vorrichtung wurden 100 μl einer 2 μg/μl Heringssperma- DNA-Lösung in TE-Puffer (10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8) aufgebracht und für 10 min inkubiert. Die DNA wurde parallel an mehreren Elektroden mittels DPV anhand der Oxidation von Gua- nin und Adenin nachgewiesen. Dabei sind in ihrer Position deckungsgleiche signifikante Guanin- und Adenin-Oxidations- Peaks gemessen worden.
Fig. 11a zeigt schematisch eine Aufsicht auf eine zusammengesetzte Mikrofluidkammer 42 mit einer Vielzahl von Elektroden 15 und der Ausnehmung 46 für den Flüssigkeitsdurchtritt. Fig. 11b zeigt eine Aufsicht auf den Oberteil 44 der Mikrofluid- kammer 42 und Fig. 11c auf den durch die erfindungsgemäße Vorrichtung 17 gebildeten Unterteil dieser Kammer.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung (17) zur Detektion eines Analyten in einer Flüssigkeit mit einer Vielzahl von auf einer ersten Seite (12) einer elektrisch nicht leitenden und für die Flüssigkeit undurchlässigen Platte (10) angeordneten voneinander isolierten Elektroden (15), wobei die Elektroden (15) zumindest teilweise eine Analyt-spezifische Beschichtung oder Analyt- spezifische Moleküle aufweisen und über die Platte (10) durchspannende elektrische Leiter von einer zweiten Seite
(14) der Platte her elektrisch kontaktierbar und einzeln ableitbar sind, wobei die Beschichtung oder die Moleküle Analyt-spezifisch ist/sind, indem sie eine spezifische Affinität für den Analyten oder eine infolge der Anwesenheit des Analy- ten gebildete Substanz aufweist/aufweisen und wobei die Vorrichtung keine Ableitungen aufweist.
2. Vorrichtung (17) nach Anspruch 1, wobei die elektrischen Leiter zusammen mit den Elektroden (15) einstückig ausgebil- det sind.
3. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beschichtung oder die Analyt-spezifischen Moleküle an den Elektroden (15) jeweils unterschiedlich ist/sind.
4. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beschichtung oder die Analyt-spezifischen Moleküle, insbesondere elektrochemisch inerte, Fänger-Moleküle umfassen.
5. Vorrichtung (17) nach Anspruch 4, wobei die Fänger-Moleküle, insbesondere einzelsträngige, Nukleinsäuren, Nuklein- säure-Analoga, Liganden, Haptene, Peptide, Proteine, Zucker, Lipide oder Ionenaustauscher sind.
6. Vorrichtung (17) nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Fänger-Moleküle kovalent und/oder gerichtet an die Elektroden (15) gebunden sind.
7. Vorrichtung (17) nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Fänger-Moleküle, zumindest teilweise, über eine, insbesondere elektrochemisch weit gehend inerte, Zwischenschicht an die Elektroden (15) gebunden sind.
8. Vorrichtung (17) nach Anspruch 7, wobei die Zwischenschicht aus Silan gebildet ist.
9. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beschichtung mindestens einen semipermeablen Über- zug der Elektroden (15) umfasst.
10. Vorrichtung (17) nach Anspruch 9, wobei die semipermeablen Überzüge jeweils eine unterschiedliche Durchlässigkeit aufweisen.
11. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die elektrischen Leiter in Durchbrüche (22) der Platte
(10) angeordnet sind, welche sich von der zweiten Seite (14) der Platte (10) her, insbesondere konisch, zur ersten Seite (12) hin verjüngen.
12. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Platte (10) auf dem Boden einer Mikrofluidkammer
(42) angeordnet ist oder den Boden einer Mikrofluidkammer bildet.
13. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Platte (10) ein Chip ist.
14. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Platte (10) mehr als 10, vorzugsweise mehr als 20, 40, 80, 100 oder 160, besonders bevorzugt mehr als 1000, insbesondere mehr als 10000, Elektroden pro cm2 aufweist.
15. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektroden (15) , zumindest teilweise, aus Partikeln gebildet sind.
16. Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektroden (15), zumindest teilweise, aus einem nichtmetallischen Leiter, insbesondere Kohlenstoff, gebildet sind.
17. Vorrichtung (17) nach Anspruch 16, wobei die Elektroden (15), zumindest teilweise, Pencil-, Glassy-Carbon- , Kohlenstofffasern enthaltende, Kohlenstoff-Paste- oder Kunststoff- Composit-Elektroden, vorzugsweise elementaren Kohlenstoff, insbesondere in Form von Grafit oder Ruß, enthaltende Poly- carbonat-Elektroden, sind.
18. Meßvorrichtung, umfassend eine Vorrichtung (17) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Elektroden (15) mindestens eine Referenz- und mindestens eine Gegenelektrode sowie eine Vielzahl an Arbeitselektroden umfassen, wobei die Meßvorrichtung Strom-Spannungskonverter, einen Potentiostaten und ein Mittel zum Messen der durch die Arbeitselektroden fließenden Ströme enthält und wobei die Elektroden (15) elektrisch mit dem Potentiostaten zur Erzeugung eines vorgegebe- nen Spannungsverlaufs zwischen den Arbeitselektroden und der
Referenzelektrode verbunden sind, wobei jeder der Arbeitselektroden einer der Strom-Spannungskonverter nachgeschaltet ist, um sämtliche Arbeitselektroden auf demselben Potenzial zu halten.
19. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung (17) nach einem der Ansprüche 1 bis 17 mit folgenden Schritten:
a) Herstellen eines Verbunds von im Wesentlichen parallel angeordnetem länglichem Elektrodenmaterial (15) und das Elektrodenmaterial (15) umgebendem Isoliermaterial wobei der Verbund hergestellt wird mittels
Umgießen eines festen Elektrodenmaterials (15) mit einem aushärtenden Isoliermaterial,
Einführen eines festen Elektrodenmaterials (15) in im Wesentlichen parallele Ausnehmungen oder Durchbrüche (22) eines festen Isoliermaterials oder in ein plastisch verformba- res Isoliermaterial,
Einfüllen von pastösem oder flüssigem aushärtendem Elektrodenmaterial (15) in im Wesentlichen parallele Ausnehmungen oder Durchbrüche (22) eines festen einstückigen Isoliermate- rials oder eines gestapelten plattenförmigen Isoliermaterials mit sich deckend angeordneten Durchbrüchen (22),
Verbinden von Elektrodenmaterial (15) , welches eine aus Isoliermaterial bestehende Ummantelung (18) aufweist, durch Verschmelzen, Vergießen oder Verkleben der Ummantelung (18) oder
Extrudieren eines Verbunds aus von Isoliermaterial (18) umgebenem Elektrodenmaterial (15) und
b) Trennen des Verbunds im Wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung des Elektrodenmaterials (15) durch Schneiden, Sägen oder mittels einer Trennscheibe oder durch Auseinander- nehmen des gestapelten plattenförmigen Isoliermaterials.
20. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung (17) nach einem der Ansprüche 1 bis 17 mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen einer elektrisch nicht leitenden Platte (10) mit Durchbrüchen (22),
b) Aufbringen eines pastösen aushärtenden Elektrodenmaterials (15) auf eine erste Seite (12) der Platte (10),
c) Hineindrücken des Elektrodenmaterials (15) in die Durchbrüche (22) und
d) Entfernen des zwischen den Durchbrüchen (22) vorhandenen Elektrodenmaterials (15) so weit dieses Elektrodenmaterial
(15) das in den Durchbrüchen vorhandene Elektrodenmaterial (15) elektrisch leitend verbindet.
21. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung (17) nach ei- nem der Ansprüche 1 bis 17 mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen einer elektrisch nicht leitenden Platte (10) mit Durchbrüchen (22),
b) Auflegen einer Lochmaske (24) mit den Durchbrüchen (22), zumindest teilweise, entsprechenden Löchern (26) oder einer Siebdruckmaske mit den Durchbrüchen, zumindest teilweise, entsprechenden durchlässigen Flächen auf die erste Seite (12) der Platte (10) so, dass sich die Löcher (26) oder die Flä- chen mit den Durchbrüchen (22) der Platte (10), zumindest teilweise, decken,
c) Aufbringen eines pastösen aushärtenden Elektrodenmaterials (15) auf die Lochmaske (24) oder Siebdruckmaske, d) Hineindrücken des Elektrodenmaterials (15) über die Löcher oder durchlässigen Flächen in die Durchbrüche (22) und
e) Abnehmen der Lochmaske (24) oder Siebdruckmaske von der Platte (10) .
22. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung (17) nach einem der Ansprüche 1 bis 17 mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen einer elektrisch nicht leitenden Platte (10) ,
b) Herstellen von Durchbrüchen in der Platte (10),
c) Herstellen von Vias in den Durchbrüchen zur Herstellung des die Platte (10) durchspannenden elektrischen Leiters und
d) Aufbringen eines pastösen aushärtenden Elektrodenmaterials (15) auf die Vias auf der ersten Seite (12) der Platte (10) .
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Durchbrüche beim Schritt lit. b durch Bohren, insbesondere mittels eines Laserstrahls, hergestellt werden.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Vias beim Schritt lit. c durch galvanisches Abscheiden in den Durchbrüchen oder durch Einführen je eines Leiters in die Durchbrüche hergestellt werden.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei das Aufbringen des Elektrodenmaterials mittels Tampondruck oder eines siebdruckartigen Verfahrens erfolgt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, wobei auf das Elektrodenmaterial (15) eine Analyt-spezifische Beschichtung aufgebracht wird oder Analyt-spezifische Moleküle in das Elektrodenmaterial (15) eingebracht werden.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei als Beschichtung oder Analyt-spezifische Moleküle, insbesondere elektrochemisch inerte, Fänger-Moleküle aufgebracht oder eingebracht werden.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei auf das Elektrodenmaterial (15) jeweils unterschiedliche Beschichtungen aufgebracht oder in das Elektrodenmaterial (15) jeweils unterschiedliche Analyt-spezifische Moleküle eingebracht werden.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei als Fänger-Moleküle, insbesondere einzelsträngige, Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Analoga, Liganden, Haptene, Peptide, Proteine, Zucker, Lipide oder Ionenaustauscher verwendet werden.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, wobei die Fänger-Moleküle kovalent und/oder gerichtet an das Elektrodenmaterial (15) gebunden oder auf dem Elektrodenmaterial (15) synthetisiert oder elektrochemisch abgeschieden werden.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, wobei die Fänger-Moleküle, zumindest teilweise, über eine, insbesondere elektrochemisch weit gehend inerte, Zwischenschicht an das Elektrodenmaterial (15) gebunden oder auf der Zwischenschicht synthetisiert werden.
32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Zwischenschicht aus Silan gebildet wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 32, wobei das Elektrodenmaterial (15) mit mindestens einem semipermeablen Überzug beschichtet wird.
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Elektrodenmaterial (15) jeweils mit unterschiedlich durchlässigen semipermeablen Überzügen beschichtet wird.
35. Verfahren zum elektrischen Kontaktieren einer Vorrichtung (17) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei eine Mehrzahl einzeln ableitbarer elektrischer Leiter (30) mit der zweiten Seite (14) der Platte (10) der Vorrichtung (17) so in Kontakt gebracht werden, dass die Leiter (30) dabei, zumindest teil- weise, die Elektroden (15) so kontaktieren, dass die Elektroden (15) einzeln elektrisch ableitbar sind.
36. Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Leiter (30) einfe- derbar gelagert sind und mit der zweiten Seite (14) der Plat- te (10) so in Kontakt gebracht werden, dass sie dabei einfedern .
37. Verfahren nach Anspruch 35, wobei das elektrische Kontaktieren über einen Elastomer-Verbinder, insbesondere einen ZE- BRA -Elastomer-Verbinder, erfolgt.
38. Verwendung einer Vorrichtung (17) nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Flüssigkeit, wobei die Flüssigkeit mit Elektroden (15) auf der ersten Seite (12) der Platte (10) der Vorrichtung (17) in Kontakt gebracht wird und die Elektroden (15) von deren zweiter Seite (14) her elektrisch kontaktiert werden.
39. Verwendung nach Anspruch 38, wobei die Flüssigkeit unter Bedingungen mit den Elektroden (15) in Kontakt gebracht wird, unter denen der Analyt oder eine infolge der Anwesenheit des Analyten gebildete Substanz an an den Elektroden (15) vorhandene Fänger-Moleküle bindet und der an die Fänger-Moleküle gebundene Analyt oder die daran gebundene Substanz elek- trisch, elektrochemisch, optisch, photoelektrisch, enzyma- tisch, mittels Elektrolumineszenz oder mittels Chemilumines- zenz oder mittels einer Kombination davon nachgewiesen wird.
40. Verwendung nach Anspruch 38 oder 39, wobei mindestens ei- ne Elektrode (15) mit einem semipermeablen Überzug beschichtet ist und selektiv nur solche Analyten, Abbauprodukte von Analyten oder Substanzen elektrisch, elektrochemisch, optisch, photoelektrisch, enzymatisch, mittels Elektrolumineszenz oder mittels Chemilumineszenz oder mittels einer Kombi- nation davon nachgewiesen werden, welche den Überzug durchdringen.
41. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 40, wobei der Analyt ein Biomolekül, insbesondere eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Antigen, ein Zucker, ein Lipid, eine Zelle oder ein Virus , ist .
42. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 41, wobei der Analyt eine Markierungssubstanz aufweist.
43. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 42, wobei eine Redox-Reaktion oder eine katalytische Wasserstoffentwicklung elektrochemisch detektiert wird.
44. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 43, wobei das elektrochemische Detektieren mittels Differenzieller Puls- Voltammetrie (DPV) , Chronopotentiometrischer Stripping Analyse (CPSA) oder des Nachweises einer Widerstands- oder Impedanzänderung erfolgt .
45. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 44, wobei das elektrochemische Detektieren folgende Schritte umfasst :
a) Bereitstellen einer Vorrichtung (17) nach einem der An- Sprüche 1 bis 17, wobei die Vorrichtung (17) mindestens eine
Gegen- und eine Referenzelektrode sowie eine Vielzahl von Arbeitselektroden aufweist,
b) Inkontaktbringen der Flüssigkeit mit den Arbeits-, Ge- gen- und Referenzelektroden,
c) gleichzeitiges Anlegen eines vorgegebenen Spannungsverlaufs zwischen den Arbeitselektroden und der Referenzelektrode und
d) Messen der durch die Arbeitselektroden fließenden Ströme, wobei während der Messung sämtliche Arbeitselektroden auf demselben Potenzial gehalten werden.
46. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 45, wobei zum elektrochemischen Detektieren ein Potenzialintervall zur Messung gewählt wird, in welchem im Wesentlichen nur der Analyt oder die Substanz ein Signal verursacht.
47. Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 46, wobei die, insbesondere Kohlenstoff enthaltenden, Elektroden (15) vor dem Nachweisen des Analyten mit einem Detergenz behandelt werden .
48. Verwendung nach Anspruch 47, wobei das Detergenz ein ionisches Detergenz ist.
49. Verwendung nach Anspruch 47 oder 48, wobei das Detergenz in einer Konzentration von 0,1% w/v bis 10% w/v vorliegt.
50. Verwendung nach einem der Ansprüche 47 bis 49, wobei das Detergenz in Wasser eine kritische mizellare Konzentration unter 10 mmol/1, insbesondere unter 5 mmol/1, vorzugsweise unter 3 mmol/1, aufweist.
51. Verwendung nach einem der Ansprüche 47 bis 50, wobei das Detergenz Natriumdodezylsulfat ist.
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