WO2002012550A1

WO2002012550A1 - Biosensor amperometrico composito par la determinacion de colesterol en alimentos

Info

Publication number: WO2002012550A1
Application number: PCT/ES2001/000304
Authority: WO
Inventors: José Manuel PINGARRON CARRAZON; Angel Julio Reviejo Garcia; Nuria PEÑA GARCIA
Original assignee: Universidad Complutense De Madrid
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2002-02-14
Also published as: ES2167258B2; ES2167258A1; AU2001282142A1

Abstract

El biosensor amperométrico compósito para la determinación de colesterol en alimentos consiste en una matriz electródica rígida y renovable por pulido fabricada con grafito y Teflón en polvo (70 %) en la que se inmovilizan mediante simple inclusión física las enzimas colesterol oxidasa y peroxidasa junto con el mediador ferrocianuro potásico. El electrodo bienzimático compósito es compatible en medios predominantemente no acuosos como son las micelas inversas constituidas por un disolvente orgánico (acetato de etilo) como fase continua, una pequeña cantidad de una disolución acuosa de un electrólito apropiado (4 % de una disolución reguladora de fosfato de pH 7,4), como fase dispersa y un tensoactivo (dioctilsulfosuccinato de sodio 0,1 M) como agente emulsificante. Esto permite la determinación directa del colesterol en estos medios una vez que se ha extraído del alimento utilizando como disolvente extractante el mismo disolvente con el que se forman las micelas inversas (acetato de etilo).

Description

TÍTULO:

Biosensor amperométrico compósito para la deteπninación de colesterol en alimentos

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un electrodo enzimático compósito para la determinación de colesterol, tanto libre como total , en alimentos. De forma más concreta, el biosensor consiste en una matriz electródica rígida construida con grafito y Teflón en la que se inmovilizan por simple atrapamiento físico dos enzimas, colesterol oxidasa y peroxidasa, junto con el mediador redox, ferrocianuro potásico. Este tipo de matriz electródica aporta una serie de ventajas relevantes desde un punto de vista práctico con respecto a otros diseños electródicos. Además de algunas características generales, que se comentarán mas adelante, una de las ventajas más interesantes de la incorporación de enzimas en matrices compósitas de grafito y Teflón es la compatibilidad con disolventes orgánicos o predominantemente orgánicos. Esta cualidad es aprovechable para la deteπninación de colesterol en alimentos. Dado que esta determinación implica su extracción de la muestra con disolventes orgánicos, la implementación de metodologías analíticas capaces de ser aplicadas en medios no acuosos es de especial interés en este caso.

En la presente invención se hace uso de un medio de trabajo formado por micelas inversas. Estas micelas están constituidas por un disolvente orgánico (el mismo utilizado para la extracción del colesterol del alimento) como fase continua, una pequeña cantidad de una disolución acuosa de un electrólito soporte adecuado, como fase dispersa, y un tensoactivo como agente emulsificante. Estos medios permiten la determinación enzimática de sustancias escasamente solubles en agua (como el colesterol), y permiten un sencillo control y optimización de la cantidad de agua que se necesita para la hidratación, y por consiguiente, para el funcionamiento de las enzimas implicadas. ESTADO DE LA TÉCNICA

En la bibliografía científica se describe una amplia variedad de métodos analíticos para la determinación de colesterol en alimentos. Estos métodos incluyen gravimetría, espectrofotometría y cromatografía (Official Methods of Analysis of AOAC International, 16th. De., Arlington, 1999). Estos métodos resultan largos y laboriosos o implican el empleo de reactivos y equipamiento costosos. Por ello, el empleo de ensayos enzimáticos rápidos, fiables y baratos constituye una interesante estrategia a seguir. Entre ellos cabe destacar el kit para ensayo colorimétrico comercializado por Boehringer (Cat. No. 139 050), que implica la incubación de 1 muestra en una disolución de la enzima colesterol oxidasa (COD) durante una hora. Además, la determinación de colesterol total necesita un tratamiento de la muestra del alimento en el que se realiza la liidrólisis metanólica de los esteres de colesterol antes de proceder a la incubación. En la bibliografía científica aparecen también diversos desarrollos de biosensores utilizables para la determinación de colesterol, que emplean COD para catalizar la oxidación de colesterol por el oxígeno molecular, originando peróxido de hidrógeno como producto de la reacción. La formación de H₂O₂ se monitoriza bien espectrofotométricamente o bien electroquímicamente, para lo que se han desarrollado un gran número de procedimientos más o menos sofisticados que pueden implicar la coinmovilización de otras enzimas junto con COD. Desde un punto de vista electroquímico, uno de los diseños más útiles consiste en coinmovilizar COD con peroxidasa y un mediador apropiado (véase, por ejemplo, L. Charpentier and N. El Murr, Anal. Chim. Acta, 318 (1994) 89), lo que permite utilizar un potencial bajo para la detección de H₂O₂ y minimizar así muchas interferencias potenciales por parte de sustancias electroactivas presentes comúnmente en muestras que contienen colesterol. Sin embargo, muchos de los biosensores que se han reportado son demasiado complejos, o no presentan una buena estabilidad, o requiren tratamientos complicados de la muestra , o no son aplicables directamente en los disolventes utilizados para extraer el colesterol de los alimentos, lo que lleva a que su implementación comercial sea difícil cuando no imposible. Estos inconvenientes prácticos son los que se resuelven con la invención que se presenta en la que se ha desarrollado un biosensor compósito amperométrico bienzdmático para la determinación de colesterol libre y total en alimentos. Las enzimas COD y peroxidasa, junto con el mediador ferrocianuro potásico se incorporan en la matriz de grafito y Teflón y se emplea como medio de trabajo micelas inversas formadas con acetato de etüo como disolvente orgánico, en el cual el colesterol es soluble.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Para conseguir las características ventajosas preconizadas y eliminar los inconvenientes reflejados en el apartado anterior, la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar electrodos bienzimáticos compósitos rígidos a base de grafito y Teflón, compatibles en medios predominantemente no acuosos. El procedimiento se caracteriza por preparar los bioelectrodos en forma de pastillas según la meto dología que se expone a continuación.

El grafito en polvo, las enzimas COD y peroxidasa y el mediador ferroceno, cuyos contenidos han sido previamente optimizados, se mezclan mediante agitación mecánica durante 3 horas en un pequeño volumen de una disolución reguladora de fosfato de pH 7,4 a 4° C. Tras evaporar el agua mediante el paso de una corriente de Ar, se añade la cantidad optimizada de Teflón en polvo, mezclándose vigorosamente. La mezcla, que contiene un porcentaje de Teflón del 70%, se prensa en forma de pastillas con un prensa de IR a 5.000 kg cm^"2 durante 10 minutos. Se taladran porciones cilindricas de la pastilla de 3.0 mm de diámetro y cada porción, que constituye el electrodo enzimático, es insertada mediante presión en un tubo de Teflón. El contacto eléctrico se realiza con un tornillo de acero inoxidable de punta plana.

Mediante este procedimiento el biosensor enzimático se fabrica por simple atrapamiento físico de las enzimas en la matriz del electrodo, sin necesidad de llevar a cabo uniones covalentes de la enzima al grafito. Esta metodología es diferente de otros procedimientos de fabricación de biosensores compósitos y hace que el proceso de fabricación sea más sencillo, más rápido y más barato. Además, presenta una serie de importantes ventajas prácticas con respecto a otros diseños. Así, se obtienen depósitos tridimensionales de biocomponente(s) cuya superficie puede ser fácilmente regenerada por pulido, cuando sea necesario hacerlo. Así mismo, la posibilidad de incorporar en el seno de la matriz electródica otros componentes (mediadores, cofactores u otras biomoléculas), como ocurre en este caso, permite la fabricación de biosensores versátiles.

Las medidas de colesterol con el biosensor se llevan cabo mediante amperometría, midiendo la corriente, cuando se alcanza el estado estacionario, a un potencial constante de + 0,10 V frente a Ag/AgCl, en disoluciones formadas por las micelas inversas constituidas por acetato de etilo como disolvente orgánico, un 4% de disolución reguladora de fosfato de pH 7,4, como fase acuosa dispersa, y una concentración 0,1 M de dioctilsulfosuccinato de sodio (AOT), como agente emulsifícante. La medida en este tipo de medio predominantemente no acuoso es otra característica distintiva de la invención que se presenta con respecto a las existentes. La estabilidad del electrodo compósito bienzimático en el medio mencionado es buena, como se pone de manifiesto cuando se consideran diferentes aspectos:

1) Repetibilidad de la respuesta amperométrica sin regeneración de la superficie electródica.

2) Repetibilidad de la respuesta amperométrica cuando la superficie del electrodo se regenera por pulido.

3) Tiempo de vida útil de un biosensor individual. En la Figura 2 se muestra el gráfico de control construido, llevando a cabo cada día tres medidas de colesterol 5,0 x 10^"4 M. Cuando un valor medio queda fuera del límite de control inferior, el pulido de la superficie electródica durante 5 segundos permite restaurar la señal analítica dentro de los límites de control. A partir de aproximadamente 30 días, la respuesta amperométrica no puede ser recuperada por pulido, siendo éste por tanto el periodo de vida útil del biosensor enzimático compósito.

4) Reproducibilidad en la fabricación de diferentes electrodos fabricados a partir de la misma pastilla madre y a partir de diferentes pastillas. El calibrado para colesterol en las micelas inversas presenta un intervalo de linealidad entre 1.0 x 10^"5 y 3.0 x 10^"3 M (r = 0.9983), con una endiente de (269+4) μA mol^"1 L. El límite de detección, calculado según el criterio 3s_b/m, es de 6.2 x lCήvl, el cual es comparable a los reportados en la bibliografía para biosensores amperométricos en medio acuoso.

El biosensor bienzimático compósito se emplea para realizar el análisis de colesterol libre y total en alimentos, aprovechando las ventajas que ofrece su compatibilidad con un medio predominantemente no acuoso, como es las micelas inversas. En este medio, ni los componentes habituales del alimento, ni aditivos, conservantes o colorantes a los niveles de concentración usuales en que pueden estar presentes en las muestras originan interferencias significativas sobre la señal del analito. Como se especifica mas adelante, el empleo del biosensor en el medio micelar inverso facilita enormemente el tratamiento de la muestra, especialmente cuando se trata de la determinación de colesterol libre. En este caso, el procedimiento es extremadamente simple, implicando solamente la extracción del colesterol con el disolvente orgánico que se emplea para preparar las micelas inversas. En el caso de la determinación de colesterol total, el tratamiento de la muestra es más complejo, ya que, dependiendo del tipo de muestra a analizar, puede implicar diversas etapas (hidrólisis, precipitación y extracción) previas a la formación de la micela inversa De todos modos, como también se pondrá de manifiesto mas adelante, estas etapas son similares, o incluso más sencillas, que las que se deben utilizar con los métodos oficiales o con métodos alternativos existentes en el mercado.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Se acompañan dos figuras que representan lo siguiente:

La Figura 1 muestra un esquema de un electrodo compósito utilizable para la deteπninación de colesterol en alimentos en el medio de micelas inversas. (1) Contacto eléctrico; (2) cuerpo de Teflón; (3) matriz electródica compósita de grafito- Teflón-COD-peroxidasa-mediador

La Figura 2 muestra el gráfico de control construido para el seguimiento de la respuesta amperométrica del biosensor con el tiempo para una disolución de colesterol 5.0 x 10^"4 M en el medio de micelas inversas. Los límites de control superior (1) e inferior (2) se consideran como +3 x la desviación estándar del valor medio de 10 medidas sucesivas llevadas a cabo sin regeneración de la superficie electródica (valor central). (O) media de las medidas realizadas diariamente sin pulir; (D) medida realizada después de pulir la superficie electródica

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN.

La presente invención, biosensor amperométrico compósito para la deteπninación de colesterol en alimentos, se ilustra mediante los siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de su alcance.

Ejemplo 1. Deteπninación de colesterol en mantequilla a) Análisis de colesterol libre.

Se pesan con exactitud 1,75 g de mantequilla y se disuelven en 2,5 mL de acetato de etilo mediante agitación mecánica durante 5 minutos. Se deja decantar el residuo insoluble, y se lleva a cabo la determinación de colesterol libre por amperometría a + 0,1 V, transfiriendo una alícuota de 100 μL del extracto a la célula elec oquímica que contiene la trúcela inversa empleada como medio de trabajo. La determinación se realiza aplicando el método de adiciones estándar, lo que implica la adición de alícuotas sucesivas de 50 μL de una disolución patrón de colesterol 5.0 x 10^"3 M en la micela inversa. b) Análisis de colesterol total.

Se pesan con exactitud aproximadamente 7.5 g de la muestra y se añaden 20 mL de una disolución 1 M de KOH en metanol y 10 L de acetato de etilo. La mezcla se hierve a reflujo durante 30 minutos y, después de centrifugar a 4.000 rpm durante 5 minutos, el extracto se transfiere a un matraz aforado de 50 mL enrasando con acetato de etilo. Se transfiere entonces una alícuota de 200 μL a la célula electroquímica, siguiéndose el mismo procedimiento comentado anteriormente para la determinación amperométrica de colesterol. Ejemplo 2. Determinación de colesterol en manteca de cerdo a) Análisis de colesterol libre.

Se emplea el mismo procedimiento que para la mantequilla, con la modificación de que se lleva a cabo una separación del residuo insoluble mediante centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos. b) Análisis de colesterol total

Se pesan 3,75 gramos de manteca y se añaden 10 mL de una disolución reciente de KOH 1 M en metano! Tras hervir a reflujo durante 30 minutos, se añaden 15 mL de una disolución de HC1 8 M y se extrae el colesterol en tres porciones de 10 mL de n-hexano. Se mezclan los extractos y se evapora el disolvente orgánico en un rotavapor. Finalmente el residuo sólido se disuelve en 10 mL de la disolución de micelas inversas. Se transfiere una alícuota de 50 μL a la célula electroquímica, y se usa el método de adiciones estándar para la deteπrtinación de colesterol.

Ejemplo 3. Determinación de colesterol en yema de huevo a) Análisis de colesterol libre

Se pesan 4,84 gramos de yema de huevo y se disuelven en 25 mL de acetato de etilo. La mezcla se agita mecánicamente durante 5 minutos. Se transfiriere una alícuota de 50 μL a la célula electroquímica y se sigue el mismo procedimiento que para la muestra de mantequilla. b) Análisis de colesterol total

Se pesan con exactitud 0.5 gramos de yema de huevo y se hierve a reflujo durante 30 minutos con 10 mL de una disolución 1 M de KOH en metanol. Después de enfriar, se añaden 15 mL de una disolución de ácido tricloroacético al 20%. A continuación, se llevan a cabo tres extracciones sucesivas con 10 mL de n-hexano cada una, siguiéndose después el mismo procedimiento que se ha mencionado para la manteca de cerdo.

En todos los casos se han analizado tres muestras de cada alimento, llevándose a cabo tres determinaciones para cada muestra Los resultados se resumen en la siguiente Tabla, habiéndose comparado con los obtenidos mediante la aplicación del kit de ensayo eiϊ-imático comercializado por Boehringer, que implica una hidrólisis metanólica, la incubación con la enzima (COD) y una medida espectrofotométrica.

Aplicando el test t de Student se puede deducir que no existen diferencias significativas en ningún caso entre los resultados obtenidos por ambos métodos a un nivel de significación de 0.05. Hay que resaltar que no fue posible la deteπrώiación de colesterol libre en yema de huevo utilizando el kit de Boehringer dada la turbidez de las disoluciones que se obtienen empleando isopropanol como disolvente extractante.

De los resultados obtenidos, puede deducirse que, para un determinado tipo de alimento, existe una relación constante entre el colesterol libre y el colesterol total.

Por consiguiente, teniendo en cuenta que el tratamiento de la muestra para el análisis del colesterol libre es muy simple y rápido en todos los casos con la metodología aplicada en esta invención, debe ser posible determinar solamente el colesterol libre para una muestra dada y aplicar entonces el factor correspondiente para obtener el contenido en colesterol total. Esta es una ventaja importante del electrodo compósito bienzimático con respecto al kit enzimático, con el cual (véase por ejemplo los resultados para mantequilla) se obtienen altas desviaciones estándar en el análisis de colesterol libre, probablemente como consecuencia de la pobre solubilidad de la muestra en el disolvente empleado (isopropanol).

Por último señalar que, aunque la hidrólisis metanólica de los esteres de colesterol es similar tanto en el método seguido por nosotros como en el test de Boehringer, el tiempo de incubación al que se someten las muestras en una disolución de COD en el método de Boehringer, origina un tiempo de análisis mucho mayor (aproximadamente 1 hora más), así como un mayor consumo de reactivos cuando se compara con la metodología aplicada utilizando el electrodo bienzimático compósito en las micelas inversas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Biosensor compósito para determinar colesterol en alimentos consistente en una matriz electródica rígida caracterizada por estar fabricada con una mezcla de grafito y Teflόn en la que se coinmovilizan las enzimas colestrol oxidasa y peroxidasa, junto con el mediador.

2. Biosensor compósito para determinar colesterol en alimentos, según la reivindicación 1, caracterizado porque la inmovilización de las enzimas en la matriz electródica se lleva a cabo por simple atrapamiento físico sin realizar ningún tipo de reacción química entre las enzimas y el grafito.

3. Biosensor compósito para determinar colesterol en alimentos, según la reivindicación 1 y 2, caracterizado por estar fabricado con una relación de grafito y Teflón adecuada para permitir la obtención de matrices electródicas rígidas mediante prensado.

4. Biosensor compósito para determinar colesterol en alimentos, según las reivindicaciones 1, 2 y 3 caracterizado por contener en la matriz electródica un mediador redox adecuado para monitorizar electroquímicamente la reacción enzimática

5. Biosensor compósito para determinar colesterol en alimentos, según las reivindicaciones 1,2, 3 y 4 caracterizado porque la medida de la señal analítica se realiza por amperometría en disoluciones con agitación constante, aplicando un potencial constante adecuado.

6. Procedimiento para el análisis de colesterol libre y total en alimentos utilizando el biosensor compósito, según las reividicaciones 1, 2, 3 ,4 y 5, caracterizado por emplear como medio de trabajo micelas inversas.

7. Procedimiento para el análisis de colesterol libre y total en alimentos utilizando el biosensor compósito, según las reividicaciones 1, 2, 3, 4 y 5, caracterizado porque las micelas inversas están formadas por un disolvente orgánico en el que se extrae el colesterol, como fase continua, un porcentaje pequeño de una disolución reguladora de pH, como fase dispersa y una concentración adecuada de un tensoactivo apropiado como agente emulsificante.