DE10211741A1 - Verfahren zur Behandlung einer Kohlenstoff-Elektrode - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer Kohlenstoff-Elektrode zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlestoff-Elektrode mit einem ionischen Detergens behandelt wird.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer Kohlenstoff-Elektrode für ein elektrochemisches Detektieren eines Analyten. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Kohlenstoff-Elektrode sowie eine Verwendung dieser Kohlenstoff- Elektrode. Unter einer Kohlenstoff-Elektrode ist hierbei jede Elektrode zu verstehen, welche elementaren Kohlenstoff enthält. Der Analyt ist im Allgemeinen ein Biomolekül, insbesondere eine Nukleinsäure.
- Mit elektrochemischen Verfahren können redoxaktive Analyte untersucht und spezifiziert werden. Die Umsetzung der Analyte findet an einer Arbeitselektrode statt. Zur stromlosen Messung der Spannung wird eine Referenzelektrode verwendet. Der über die Arbeitselektrode fließende Strom oder die Spannung, welche zwischen der Arbeits- und der Referenzelektrode abfällt, wird über eine Gegenelektrode gesteuert. Die elektrochemische Detektion von Analyten kann potentiometrisch oder amperometrisch erfolgen. In einem potentiometrischen Messprotokoll wird die über der Arbeits- und Referenzelektrode abfallende Spannung zeitabhängig gemessen. Während dieser Messung kann ein kontrollierter Stromverlauf angelegt werden. Im Falle eines konstanten Stroms wird diese Messung als Konstantstrom-Chronopotentiometrie bezeichnet. Die Untersuchung von an einer Arbeitselektrode adsorbierten oder komplexierten Analyten mittels Konstantstrom-Chronopotentiometrie wird auch als Konstantstrom-Chronopotentiometrische-Stripping-Analyse oder häufig nur als Chronopotentiometrische-Stripping-Analyse (CPSA) bezeichnet. Die Kathodische-Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren in dem durch das Anlegen eines positiven Stromes sukzessive Analyte oxidiert werden. Aus diesen spannungsabhängigen Oxidationsreaktionen können Rückschlüsse auf oxidierbare Analyte gezogen werden. Die Anodische-Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren, bei dem ein negativer Strom angelegt wird, um aus dem erhaltenen Spannungsverlauf Rückschlüsse auf reduzierbare Analyte schließen zu können.
- In einem amperometrischen Messprotokoll wird die Spannung, welche zwischen der Referenz- und der Arbeitelektrode abfällt, über eine Gegenelektrode nach einem vorgegebenen Protokoll verändert. Gleichzeitig wird der Strom gemessen, welcher über die Arbeitselektrode fließt. Je nach angelegter Spannung können redoxaktive Analyte reduziert oder oxidiert werden. Durch eine Auswertung des Stromverlaufs können Rückschlüsse auf die Analyte gezogen werden. Ein elektrochemisches Messverfahren mit einer stationären Arbeitselektrode, in welchem eine Strom-Spannungskennlinie aufgenommen wird, wird auch als Voltammetrie und die zugehörige grafische Darstellung als Voltammogramm bezeichnet. Für sehr sensitive Messungen von Redoxprozessen wurden spezielle Messprotokolle entwickelt, bei welchen neben den Redoxprozessen stattfindende die Messung beeinflussende kapazitive Prozesse weit gehend unterdrückt werden. Ein sehr effizientes Messprotokoll ist die Differenzielle-Puls-Voltammetrie (DPV).
- Aus Wang, J. et al. (1998) Analytica Chimica Acta, Seiten 197 bis 203 ist ein elektrochemischer Nachweis von DNA-Hybridisierung bekannt. Dabei wird an einer Kohlenstoffpaste-Elektrode eine Inosin-subsituierte, Guanin-freie DNA-Sonde immobilisiert. Die Bildung von DNA-Hybriden mit der immobilisierten DNA-Sonde wird chronopotentiometrisch durch die Bildung eines Guanin-Oxidationspeaks der hybridisierten DNA detektiert. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass für jede Detektion die Elektrodenoberfläche erneuert werden muss, d. h. es muss eine erneute Immobilisierung der DNA-Sonde vorgenommen werden. Das führt zu einer mangelhaften Reproduzierbarkeit der damit erzielbaren Ergebnisse. Bei diesem Verfahren erfolgt die Immobilisierung der DNA-Sonde durch unspezifische Bindung an der Elektrode. Die Bindungskapazität der DNA-Sonden geht dadurch nachteiligerweise zum Teil verloren. Ein weiterer Nachteil des Verfahrens besteht darin, dass auf Grund der Empfindlichkeit der Elektrode keine stringenten Hybridisierungsbedingungen gewählt werden können, so dass es zu einem hohen Anteil unspezifischer Hybridisierungen kommt.
- Weiterhin ist es aus Ontko, A. C., et al. (1999) Inorg. Chem. Seiten 1842 bis 1846 bekannt, eine so genannte Glassy-Carbon- Elektrode oberflächlich mit einem dünnen Film zu beschichten. Dieser Film enthält Rubidium-Bipyridin-Komplexe als Mediatoren. Diese bewirken eine katalytische Verstärkung des durch die Oxidation von Guanin-Resten in DNA bewirkten Stroms. Nachteilig an derartigen Mediatoren ist, dass sie bei einem elektrochemischen Nachweis einer DNA ein starkes Hintergrundsignal erzeugen. Vor dem Auftragen des Films wird die Elektrode zunächst gründlich poliert. Die Rubidium-Bipyridyn- Komplexe werden dann durch mehrfache Elektropolymerisation aufgetragen. Die Bindung von DNA an die beschichtete Elektrode erfolgt über eine Carbodiimid-Bindung. Dabei werden die auf der Oberfläche vorhandenen Carboxylgruppen aktiviert, um anschließend mit einer Aminogruppe der DNA zu reagieren. Die Aminogruppe ist bevorzugt eine Aminogruppe eines Linkers einer einzelsträngigen DNA. Es gehen jedoch auch die Aminogruppen der Nukleotide Carbodiimid-Bindungen ein. Diese Nukleotide stehen dann für eine spätere Hybridisierung nicht mehr zur Verfügung.
- Üblicherweise werden Kohlenstoff-Elektroden vor einer elektrochemischen Detektion vorbehandelt, um die Sensitivität der Elektroden und die Reproduzierbarkeit der Detektion zu erhöhen. Dazu kann die Elektrodenoberfläche mechanisch poliert werden. Das ist jedoch ausgeschlossen, wenn die Elektroden mit einem für die Detektion erforderliche Molekül beschichtet sind. Weiterhin werden die Elektroden üblicherweise elektrochemische konditioniert. Dabei werden an den Elektroden befindliche redoxaktive Substanzen oxidiert, um den späteren elektrochemischen Nachweis nicht zu stören. Gleichzeitig werden die Oberflächen der Elektroden hydrophilisiert, so dass die Elektroden von Flüssigkeit benetzt werden können. Das Verfahren ist aufwändig und nur schwer zu automatisieren. Nachteilig ist auch, dass an der Elektrode immobilisierte Moleküle, welche mit einer zu analysierenden Substanz reagieren sollen, dabei ebenfalls oxidiert werden können. Beispielsweise werden in einer immobilisierten DNA vorhandene Guanin-Reste oxidiert. Das verschlechtert die Hybridisierungseigenschaften dieser DNA.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Behandlung einer Kohlenstoff-Elektrode bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile vermeidet. Insbesondere soll weder ein mechanisches Polieren noch ein elektrochemisches Konditionieren erforderlich sein. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine entsprechend behandelte Kohlenstoff-Elektrode sowie eine Verwendung der Kohlenstoff- Elektrode bereitzustellen.
- Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 19 und 20 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18 und 21 bis 31.
- Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung einer Kohlenstoff-Elektrode zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten vorgesehen, wobei die Kohlenstoff-Elektrode mit einem ionischen Detergenz behandelt wird. Die Kohlenstoff-Elektrode ist nach dem Behandeln zumindest für ein einmaliges elektrochemisches Detektieren des Analyten geeignet. Die Funktionsfähigkeit der Kohlenstoff-Elektrode wird durch das Behandeln erst hergestellt oder bleibt beim Behandeln erhalten. Um die Funktionsfähigkeit zu erhalten kann die Kohlenstoff-Elektrode so ausgewählt werden, dass sie durch das Detergenz in ihrer Substanz nicht angegriffen wird. Es ist aber auch möglich, die Dauer des Behandelns, die Konzentration und/oder das Detergenz derart zu wählen, dass mit der Kohlenstoff-Elektrode nach dem Behandeln zumindest noch ein einmaliges elektrochemisches Detektieren des Analyten möglich ist. Unter dem Detektieren im Sinne der Erfindung wird auch ein Quantifizieren verstanden.
- Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass es durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich ist, die Sensitivität der Kohlenstoff-Elektrode und die Reproduzierbarkeit der Detektion auf ein Maß zu erhöhen, wie es bisher nur mit der elektrochemischen Konditionierung bzw. dem Polieren der Kohlenstoff- Elektrode möglich war. Mit den erfindungsgemäß behandelten Kohlenstoff-Elektroden kann bei mehreren unabhängigen Messungen sogar eine geringere Standardabweichung erreicht werden, als mit elektrochemisch konditionierten Kohlenstoff-Elektroden. Bei Kunststoff-Composit-Elektroden, insbesondere Graphit enthaltenden Polycarbonat-Elektroden, wurde außerdem festgestellt, dass es nur durch das Behandeln mit dem ionischen Detergenz, nicht aber durch elektrochemische Konditionierung möglich war, eine für das Detektieren von DNA ausreichende Sensitivität zu erreichen.
- Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass an die Kohlenstoff-Elektrode gebundene Moleküle, wie z. B. DNA, funktionell voll erhalten bleiben können und nicht durch eine Oxidation beispielsweise an Bindungsfähigkeit verlieren.
- Bisher wurde der Einsatz von Detergenzien bei Kohlenstoff- Elektroden vermieden, weil befürchtet worden ist, dass die Elektroden dadurch für erwünschte Bindungen blockiert werden könnten. Weiterhin wurde bei Wang, J. et al. (1998) Analytical Chimica Acta, Seite 201, linke Spalte berichtet, dass ein Detergenz wie Tween 20 als Blockierungsagens die Reproduzierbarkeit eines Hybridisierungssignals beeinträchtigt. Elektrochemische Nachweisverfahren sind grundsätzlich sehr sensitiv gegenüber zusätzlichen, insbesondere ionischen, Bestandteilen der Lösung, in welcher das Detektieren stattfindet. Es ist z. B. bekannt, dass das ionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) eine Quecksilberelektrode derart blockieren kann, dass damit ein elektrochemisches Detektieren nicht mehr möglich ist. Auf Grund der einem Detergenz innewohnenden Eigenschaft, sowohl an hydrophobe als auch an hydrophile Oberflächen zu binden, würde der Fachmann befürchten, dass ein Detergenz auch an die Oberfläche einer Kohlenstoff-Elektrode bindet und den elektrochemischen Nachweis stört. Bei einer Behandlung der Elektrode mit dem Detergenz vor dem elektrochemischen Detektieren ist zu befürchten, dass das Detergenz so fest an der Oberfläche haftet, dass es davon auch durch einen Waschschritt nicht zu entfernen ist. Der Fachmann wird deshalb auch bei einer Vorbehandlung von der Gefahr einer Störung des elektrochemischen Detektierens ausgehen. Es hat sich jedoch überaschenderweise gezeigt, dass ein derartiger negativer Einfluss nicht vorhanden ist.
- Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Detergenz eine Konzentration von 0,1% bis 20%, insbesondere 1% bis 15%, aufweist. Das Detergenz befindet sich dabei vorzugsweise in wässriger Lösung und das Behandeln der Kohlenstoff-Elektrode erfolgt durch Eintauchen in die Lösung und anschließende Inkubation.
- Als günstig hat sich ein Detergenz erwiesen, welches in Wasser eine kritische mizellare Konzentration unter 11 mmol/l, insbesondere unter 5 mmol/l, vorzugsweise unter 3 mmol/l, aufweist. Bevorzugt handelt es sich bei dem Detergenz um Natriumdodecylsulfat (SDS).
- Bei einem Ausführungsbeispiel wird die Kohlenstoff-Elektrode mit einem, insbesondere elektrochemischen weit gehend inerten, Stoff beschichtet. Unter einem inerten Stoff wird hier ein Stoff verstanden, welcher keine elektrochemisch aktiven Gruppen, wie z. B. Mediatoren, enthält, welche in einem für das Detektieren des Analyten relevanten Messbereich ein elektrochemisches Signal erzeugen. Eine Beschichtung mit einem solchen Stoff verursacht im Gegensatz zu einer Beschichtung mit einem elektrochemisch aktive Gruppen enthaltenden Stoff, keine Hintergrundsignale, welche das Detektieren eines für den Analyten spezifischen Signals erschweren. Der allgemeine Vorteil einer Beschichtung besteht darin, dass dadurch spezifische chemische Gruppen auf der Oberfläche der Kohlenstoff- Elektrode bereitgestellt werden können, an welche wiederum andere Moleküle gebunden werden können. Besonders vorteilhaft für die späteren Eigenschaften der Kohlenstoff-Elektrode ist es, wenn das Behandeln mit dem ionischen Detergenz vor dem Beschichten mit dem Stoff erfolgt. Bevorzugt handelt es sich bei dem Stoff um ein Silan, insbesondere 3-(Glycidyloxypropyl)-trimethoxysilan.
- Bei einer besonderen Ausgestaltung wird ein Molekül an die Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere an den Stoff gebunden. Die Behandlung mit dem Detergenz kann dabei vor, während und/oder nach dem das Molekül an den Stoff gebunden worden ist erfolgen. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Kohlenstoff-Elektrode nach dem Binden des Moleküls bis zum Detektieren in einer das Detergenz enthaltenden Lösung aufbewahrt wird. Dadurch kann mit der Kohlenstoff-Elektrode jederzeit sofort detektiert werden, ohne dass sie direkt vor dem Detektieren einer zusätzlichen Behandlung unterzogen werden muss. Durch ein Aufbewahren der Kohlenstoff-Elektrode in einer das Detergenz enthaltenden Lösung nach dem Detektieren bleibt die Kohlenstoff-Elektrode wiederverwendbar.
- Vorzugsweise wird das Molekül gerichtet gebunden, insbesondere an einem seiner Enden. Durch das endständige Binden kann es erreicht werden, dass das Molekül seine volle Funktionsfähigkeit, insbesondere seine Bindungsfähigkeit, beibehält. So kann z. B. eine endständig gebundene DNA oder ein am Ende des Fc-Anteils gebundener Antikörper seine spezifische Bindungsfähigkeit beibehalten. Das Molekül kann kovalent an die Kohlenstoff-Elektrode oder den Stoff gebunden werden. Dadurch kann die Kohlenstoff-Elektrode mit sehr starken Detergenzien behandelt werden, ohne das sich das Molekül von der Kohlenstoff-Elektrode ablöst.
- Vorteilhaft ist es, wenn der Quotient aus der Menge der Moleküle, die gerichtet, insbesondere kovalent, an die Kohlenstoff-Elektrode oder den Stoff gebunden werden, und der Menge der Moleküle, die anders an die Kohlenstoff-Elektrode oder den Stoff gebunden werden, größer als 1, vorzugsweise größer als 3, ist. Das zu erreichen ist häufig schwierig. Erfolgt beispielsweise die kovalente Bindung über eine Carbodiimid- Bindung, so können kovalente Bindungen nicht nur mit einer dafür vorgesehenen, insbesondere terminalen Aminogruppe zustande kommen, sondern auch über die Aminogruppen der Basen der Nukleinsäure, insbesondere von Guanin. Die unerwünschte kovalente Bindung lässt sich jedoch zurück drängen, indem das Molekül in Gegenwart eines Kompetitors, insbesondere eines Proteins oder einer Aminosäure, gebunden wird. Dabei ist der Kompetitor so zu wählen das seine Reaktivität beim Ausbilden einer kovalenten Bindung geringer ist als diejenige der chemischen Gruppe, deren kovalente Bindung gewünscht wird. Gleichzeitig sollte seine Reaktivität aber höher sein als diejenige der chemischen Gruppe, deren kovalente Bindung unerwünscht ist.
- Bevorzugt handelt es sich bei dem Molekül um ein den Analyten spezifisch bindendes Fänger-Molekül. Das Fänger-Molekül kann eine, insbesondere einzelsträngige, Nukleinsäure, ein Nukleinsäure-Analogon, ein Ligand, ein Hapten, ein Peptid, ein Protein, ein Zucker oder ein Lipid sein. Vorzugsweise ist in der einzelsträngigen Nukleinsäure mindestens ein Nukleotid mit einer modifizierten Base, insbesondere Inosin oder 8- Oxoguanin, enthalten, welches beim elektrochemischen Detektieren ein anderes Signal erzeugt als Nukleotide des Analyten. Dadurch kann vermieden werden, dass durch das Fänger- Molekül Basen bereitgestellt werden, welche beim elektrochemischen Detektieren von Basen einer durch das Fänger-Molekül gebundenen Nukleinsäure selbst ein elektrochemisches Signal in dem für diese Basen relevanten Meßbereich erzeugen. 8- Oxoguanin bildet bevorzugt mit Adenin eine Basenpaarung aus. Es kann daher anstelle von Thymin in der Nukleinsäure vorhanden sein. Inosin, welches unter anderem mit Cytosin eine Basenpaarung ausbilden kann, kann anstelle von Guanin in der Nukleinsäure vorhanden sein. Dadurch bleibt die Bindungsfähigkeit der Nukleinsäure auch unter oxidierenden Bedingungen erhalten. Das von Inosin erzeugte Oxidationssignal ist deutlich von demjenigen von Guanin zu unterscheiden. Da vorzugsweise Adenin- und/oder Guanin-Reste elektrochemisch detektiert werden, ist es besonders vorteilhaft, wenn die einzelsträngige Nukleinsäure keine Guanin- und/oder Adenin-Reste aufweist.
- In einem Ausführungsbeispiel wird der Analyt an das Fänger- Molekül gebunden und die Kohlenstoff-Elektrode wird davor, dabei oder danach mit dem Detergenz behandelt. Durch das Behandeln mit dem Detergenz kann eine unspezifische Bindung von die Detektion des Analyten störenden Stoffen vermieden und/oder gelöst werden. Es ist auch möglich das Detektieren in Gegenwart des Detergenz durchzuführen. Bisher ist angenommen worden, dass die Anwesenheit des Detergenz beim Detektieren stört und die Reproduzierbarkeit der Messung beeinträchtigt.
- Die Kohlenstoff-Elektrode kann eine Pencil-, eine Glassy-Carbon-, eine Pyrolytic-Graphit- oder eine Kunststoff-Composit- Elektrode, insbesondere eine Graphit enthaltende Polycarbonat-Elektrode, sein. Bei einer Pencil-Elektrode handelt es sich um eine herkömmliche Bleistiftmine. Die Graphit enthaltende Polycarbonat-Elektrode wird auch als Polycarbonat/Graphit-Elektrode bezeichnet. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn die Kohlenstoff-Elektrode zusätzlich mit einem chaotropen Agens, insbesondere Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, behandelt wird.
- Die Erfindung betrifft weiterhin eine Kohlenstoff-Elektrode für ein elektrochemisches Verfahren zur Detektion eines Analyten, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt worden ist. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer solchen Kohlenstoff-Elektrode in einem Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten. Der Analyt kann ein Biomolekül, insbesondere eine Nukleinsäure, sein. Der Analyt kann eine Markierungssubstanz aufweisen. Dabei kann es sich um ein Enzym handeln, welches sich durch eine enzymatische Reaktion elektrochemisch nachweisen lässt, oder um eine redoxaktive Substanz. Vorteilhaft ist es, wenn der Analyt beim Detektieren an die Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere an ein an der Kohlenstoff-Elektrode gebundenes Fänger-Molekül, gebunden ist. Das elektrochemische Detektieren kann z. B. mittels Differenzieller-Puls-Voltammetrie (DPV) oder Chronopotentiometrischer-Stripping-Analyse (CPSA) erfolgen.
- Bevorzugt steht die Kohlenstoff-Elektrode beim Detektieren gleichzeitig mit einem Detergenz und mit dem Analyten in Kontakt. Das Detergenz sollte dabei selbst kein Signal im für den Analyten relevanten Messbereich erzeugen. Das Detergenz kann, insbesondere zur Unterdrückung und/oder Lösung unspezifischer Bindungen an der Kohlenstoff-Elektrode, vor, nach oder während der Analyt mit der Kohlenstoff-Elektrode in Kontakt gebracht wird zugesetzt werden. Der Vorteil ist dabei, dass durch das Detergenz für die Bindung des Analyten an das Fänger-Molekül stringente Bedingungen geschaffen werden können, welche eine unspezifische Bindung an die Kohlenstoff- Elektrode nahezu ausschließen. Besonders vorteilhaft ist dies, wenn es sich bei dem Analyten um eine Nukleinsäure handelt, welche mit dem Fänger-Molekül hybridisiert.
- Vorzugsweise ist das Detergenz ein ionisches Detergenz. Es hat sich als günstig erwiesen, wenn das Detergenz in einer Konzentration von 0,1% bis 20%, insbesondere 1% bis 15%, vorliegt. Bevorzugt weist das Detergenz in Wasser eine kritische mizellare Konzentration unter 11 mmol/l, insbesondere unter 5 mmol/l, vorzugsweise unter 3 mmol/l, auf. Das Detergenz kann Natriumdodecylsulfat sein. Vorteilhafterweise wird die Kohlenstoff-Elektrode vor dem Detektieren in einer das Detergenz enthaltenden Lösung aufbewahrt. Dadurch kann die Kohlenstoff- Elektrode jederzeit sofort zum Detektieren verwendet werden. Bei mehrfacher Verwendung der Elektrode wird die Elektrode zwischen den Verwendungen bevorzugt in der das Detergenz enthaltenden Lösung aufbewahrt.
- Vorzugsweise wird zum elektrochemischen Nachweis ein Potential-Intervall zur Messung gewählt, in welchem im Wesentlichen nur der Analyt ein Signal verursacht. Insbesondere sollte vermieden werden, dass der Stoff, das Fänger-Molekül und/oder das Detergenz in dem Potential-Intervall ein elektrochemisches Signal erzeugen.
- Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen
- Fig. 1 das Verhältnis von aminoterminal gebundener zu undefiniert-gebundener Nukleinsäure,
- Fig. 2 eine mittels DPV bestimmte Menge unspezifisch gebundener Nukleinsäuren an unbeschichtete Pencil- Elektroden,
- Fig. 3 ein DPV-Voltammogramm einer silanisierten und einer nicht silanisierten Elektrode,
- Fig. 4 eine mittels DPV bestimmte Menge von an Elektroden adsorbierter Nukleinsäure nach einer Nachbehandlung mit 10%, 5% und 1% SDS,
- Fig. 5 ein DPV-Voltammogramm von Polyinosin,
- Fig. 6 ein DPV-Voltammogramm der Guanin-Oxidation von mittels Fänger-Molekülen gebundenen komplementären Nukleinsäuren,
- Fig. 7a mit Polycarbonat/Graphit-Elektroden vor und nach einer Behandlung mit 10% SDS aufgenommene Cyclovoltammogramme,
- Fig. 7b eine mit einer Polycarbonat/Graphit-Elektrode nach deren Behandlung mit SDS durchgeführte CPSA einer Heringssperma-DNA-Lösung und
- Fig. 8a, b einen Vergleich von mit Polycarbonat/Graphit- und Pyrolytic-Graphit-Elektroden erzeugten CPSA-Signalen.
- Bleistiftminen (Fa. Pentel, C525-HB/Hi-Polymere, extra strong) einer Länge von 60 mm wurden in etwa 1 cm lange Stücke geschnitten. Die Minenstücke wurden 1 h bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Schütteln in einer Lösung aus 1% (v/v) 3-(Glycidyloxypropyl)-trimethoxysilan (Fa. Fluka), 1% (v/v) entionisiertem Wasser (Fa. Millipore) und 98% (v/v) Ethanol (Fa. Merck) inkubiert. Anschließend wurden die Stücke 30 min bei 80°C getrocknet.
- Die silanisierten Bleistift-Elektroden wurden in 1 ml einer 150 µmol/ml Oligonukleotid in 0,1 M Na2CO3, pH 9,5 enthaltenden Lösung überführt und eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Dabei gehen die freien Aminogruppen der Oligonukleotide mit dem Silan eine kovalente Bindung ein. Zur Abtrennung nicht kovalent gebundener Oligonukleotide wurden die Elektroden eine Stunde in 2 ml 10% SDS bei RT inkubiert. Zur Absättigung noch vorhandener Bindungsstellen wurden die Elektroden eine Stunde bei RT in 1% Rinder-Serum-Albumin (BSA) oder Ethanolamin in Phosphate-gepufferter-Saline (PBS) inkubiert.
- Als Oligonukleotide wurden verwendet:
N-T1k-Biotin (Biotin - SEQ ID NO: 1 - Aminolink):
Biotin - 5' gca aca aga cca cca ctt cga aac c 3' - Aminolink
T1k-Biotin (Biotin - SEQ ID NO: 1):
Biotin - 5' gca aca aga cca cca ctt cga aac c 3'
TNF2 (SEQ ID NO: 2 - Aminolink):
5' cct icc cca atc cct tta tt 3' - Aminolink
(i = Inosin) - Bei TNF2 handelt es sich um eine mit einem Aminolink versehene Sequenz aus der c-DNA des humanen Tumor Nekrose Faktor α-Gens.
- Pencil-Elektroden wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Silan beschichtet. Zur Kopplung der Oligonukleotide wurden die silanisierten Elektroden jeweils mit biotinylierten Oligonukleotiden mit (Bio-T1k-N) und ohne (Bio-T1k) endständiger Aminogruppe inkubiert. Die Inkubation erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben mit dem Unterschied, dass sie jeweils in Gegenwart und Abwesenheit von Histidin als Kompetitor in einem 100-fachen molaren Überschuss gegenüber den Oligonukleotiden durchgeführt wurde. Nicht kovalent gebundene Nukleinsäuren wurden durch Inkubation für 1 h in 10% SDS bei 42°C entfernt. Zum Nachweis der kovalent gebundener Oligonukleotide wurden die Elektroden zunächst in 1% BSA in PBS inkubiert. Anschließend wurden sie für 30 min bei Raumtemperatur in einer 200 ng/ml Horse-Radish-Peroxidase-(HPR)-Streptavidin-Lösung in PBS, 0,05% Tween 20 inkubiert. Die Elektroden wurden zweimal für 5 min in 6 M Harnstoff, 0,4% SDS, 0,5 × SSC (Standard Saline Citrate) und zweimal in 2 × SSC inkubiert. Darauf wurden die Elektroden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte überführt und mit 200 µl TMB-Lösung (Fa. Pierce) unter leichten Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 20 min wurde die Farbentwicklung durch Zugabe von 50 µl 1 M Schwefelsäure gestoppt. Die Absorption in den Vertiefungen wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm bestimmt. Die Absorption jeder Konzentration wurden im Dreifachansatz ermittelt.
- Oligonukleotide ohne endständige Aminogruppe konnten jeweils nur undefinierte kovalente Bindungen über die in den Basen vorhandenen Aminogruppen eingehen. Dagegen können Oligonukleotide mit endständiger Aminogruppe auch über diese Aminogruppe kovalent binden. Wie aus Fig. 1 zu ersehen ist, konnte durch die Anwesenheit des Kompetitors das Verhältnis von Aminoterminal-gebundener zu undefiniert-gebundener Nukleinsäure um einen Faktor größer als 2 gesteigert werden. Das bedeutet, dass der Kompetitor Histidin stärker die undefinierten kovalenten Bindungen als die kovalente Bindung der endständigen Aminogruppe hemmt.
- Eine unbeschichtete Pencil-Elektrode wurde an ein Autolab-Gerät (Firma: Eco Chemie, Niederlande) angeschlossen und eine Minute bei 1,4 V in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 inkubiert. Anschließend wurde die Elektrode 5 Minuten mit verschiedenen Konzentrationen Polyguanin inkubiert. Folgende Konzentrationen wurden verwendet: 5000 µg/ml, 10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,5 µg/ml und 0,1 µg/ml. Adsorbiertes Polyguanin wurde in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 mittels DPV in einem Potential-Intervall von 0,6 V-1,2 V bestimmt. Die DPV wurde mit folgenden Einstellungen durchgeführt: Modulationszeit: 0,05 s; Intervall-Zeit: 0,5 s; Potential-Stufe: 0,00795 V; Modulations-Amplitude: 0,05055 V. Die Oxidation des Guanins erfolgte bei ca. 1,05 V. Polyguanin war bis zu einer Konzentration von 0,1 µg/ml nachweisbar. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt.
- Eine Pencil-Elektrode wurde vor und nach der Silanisierung an ein Autolab-Gerät angeschlossen und eine Minute bei 1,4 V in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 inkubiert. Anschließend wurde eine DPV in dem Potential-Intervall 0,6 V-1,2 V mit den in Beispiel 3 beschriebenen Einstellungen durchgeführt. Selbst bei einer Empfindlichkeit kleiner 0,1 nA war in dem Bereich des Oxidationspotentials der Guanine (1 V) kein Signal erkennbar. Die Silanisierung erzeugt somit kein Hintergrund-Signal im Bereich des Oxidationspotentials von Guanin. In Fig. 3 zeigt die Kurve a das Ergebnis vor und die Kurve b das Ergebnis nach der Silanisierung.
- Pencil-Elektroden wurden durch Inkubation für 1 min in 10% SDS vorbehandelt. Zur Adsorption von Nukleinsäure wurden die Elektroden für 1 h in 1 nmol/ml des Oligonukleotids TNF2k mit der Sequenz 5' aat aaa ggg att ggg gca gg 3' (SEQ ID NO: 3) enthaltendem 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5 bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Entfernung unspezifisch gebundener Nukleinsäure wurden die Elektroden in einer 1%, 5% oder 10% SDS enthaltenden Lösung inkubiert und daraus jeweils nach 0,5 min, 1 min, 5 min, 10 min, 15 min und 20 min entnommen. Die Menge der adsorbiert verbleibenden Nukleinsäure ist mittels DPV anhand der Guanin-Oxidation bestimmt worden. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, konnte durch die Behandlung mit SDS die Menge der adsorbierten Nukleinsäure effektiv verringert werden. Kurve 10 wurde mit der in 10% SDS, Kurve 12 mit der in 5% SDS und Kurve 14 mit der in 1% SDS inkubierten Elektrode ermittelt. Bei der Behandlung mit 10% SDS sank die Menge der adsorbierten Nukleinsäure bereits nach einer Minute unter die Nachweisgrenze.
- Zur Bestimmung des Oxidationspotentials von Inosin wurden Pencil-Elektroden für eine Minute in 10% SDS behandelt und für 5 min in 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1250 und 2500 µg/ml Polyinosin in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6 inkubiert. Die Elektroden wurden in entionisiertem Wasser gespült und mittels DPV im Potentialbreich von 0-1,5 V gemessen. Wie aus Fig. 5 zu ersehen ist, liegt das Oxidationssignal von Inosin bei 1,3 V und ist damit von dem bei 1,0 V liegenden Oxidationssignal von Guanin deutlich zu unterscheiden.
- Pencil-Elektroden mit als Fänger-Molekül immobilisierter Nukleinsäure TNF2 wurden eine Minute in 5% SDS vorinkubiert. Die Elektroden wurden in Detergenz-haltigem Hybridisierungs- Puffer (Fa. Roche) mit 0,7 µg/ml, 3 µg/ml, 7 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml und 30 µg/ml der komplementären Nukleinsäure TNF2k (SEQ ID NO: 3) für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Elektroden mittels DPV unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen analysiert. Die Bindung der komplementären Nukleinsäure konnte anhand der Guanin-Oxidation nachgewiesen werden. Wie aus Fig. 6 zu ersehen ist, nimmt die Signalintensität der Guanin-Oxidation bei 1 V mit steigender Konzentration der komplementären Nukleinsäure zu. Die Kurven 16, 18, 20, 22, 24, 26 und 28 entsprechen jeweils 0,7 µg/ml, 3 µg/ml, 7 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml und 30 µg/ml der komplementären Nukleinsäure TNF2k.
- Silanisierte Pencil-Elektroden mit als Fänger-Molekül immobilisierter Nukleinsäure TNF2 wurden wie in Experiment 2 beschrieben hergestellt. Abweichend von Experiment 2 wurden die Elektroden vor der Silanisierung elektrochemisch (1 min, 1,2 V in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6) bzw. durch 1 min. 10% SDS-Behandlung behandelt. Nach der Kopplung der Nukleinsäure TNF2 wurden die Elektroden in einer Lösung von 10 nmol/ml der komplementären Nukleinsäure TNF2k (SEQ ID NO: 3) in Detergenz-haltigem Hybridisierungs-Puffer (Fa. Roche) inkubiert und die gebundene Nukleinsäure TNF2k mittels DPV bestimmt. Jeweils zehn Messungen wurden mit elektrochemisch bzw. mit Detergenz behandelten Elektroden durchgeführt. Die Detergenz-Behandlung führte zu einer Sensitivitätssteigerung von mehr als 10% gegenüber der elektrochemischen Behandlung. Weiterhin war die Reproduzierbarkeit der Messungen mit Detergenz-behandelten Elektroden verbessert. Die Standardabweichung der Messungen Detergenz-behandelter Elektroden war um Faktor 3 geringer als bei einer elektrochemischen Behandlung.
- In Fig. 7a zeigt die gestrichelte Linie ein vor und die durchgezogene Linie ein nach einer Behandlung einer Polycarbonat/Graphit-Elektrode aufgenommenes Cyclovoltammogramm. Die Behandlung erfolgte durch eine Inkubation in 10% SDS bei 80°C für 30 min. Das nach der Behandlung aufgenommene Cyclovoltammogramm zeigt durch einen verstärkten kapazitiven Strom, dass eine deutlich größere elektroaktive Oberfläche zur Verfügung steht als ohne die Behandlung.
- Fig. 7b zeigt das Ergebnis einer CPSA von 200 µg/ml Heringssperma-DNA-Lösung in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,7. Die CPSA ist mit einer zuvor für 30 min mit 10% SDS bei 80°C behandelten Polycarbonat/Graphit-Elektrode unter den folgenden Bedingungen durchgeführt worden: 30 s Akkumulation, 30 µA konstanter Oxidationsstrom in 1 M Natriumacetat-Puffer, pH 6,0. Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, konnte nach der Behandlung ein deutliches Signal der Guanin-Oxidation bei 0,8 V (mit G gekennzeichneter Peak) und der Adenin-Oxidation (mit A gekennzeichneter Peak) bei 1,1 V gemessen werden. Mit einer stattdessen elektrochemisch vorbehandelten Polycarbonat/Graphit- Elektrode war ein Oxidationssignal nicht messbar.
- Eine Konzentrationsreihe von 1, 10 und 100 µg/ml Heringssperma-DNA wurde mittels CPSA anhand des Guanin-Oxidationssignals analysiert. Als Elektroden wurden eine 60 s bei 1,7 V elektrochemisch behandelte Pyrolic-Graphit-Elektrode und eine mit 10% SDS bei 80°C behandelte Polycarbonat/Graphit-Elektrode verwendet. In den Fig. 8a und 8b entsprechen die Kurven 30 und 36 jeweils 1 µg/ml, die Kurven 32 und 38 jeweils 10 µg/ml und die Kurven 34 und 40 jeweils 100 µg/ml Heringssperma-DNA. Die Signalhöhe ist proportional zu der Menge an DNA. Die Empfindlichkeit der mit SDS behandelten Polycarbonat/Graphit- Elektrode ist gegenüber derjenigen der elektrochemisch behandelten Pyrolytic-Graphit-Elektrode erhöht. SEQUENZPROTOKOLL
Claims (31)
1. Verfahren zur Behandlung einer Kohlenstoff-Elektrode zum
elektrochemischen Detektieren eines Analyten, dadurch
gekennzeichnet, dass die Kohlenstoff-Elektrode mit einem
ionischen Detergenz behandelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
das Detergenz eine Konzentration von 0,1% bis 20%,
insbesondere 1% bis 15%, aufweist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz in Wasser eine
kritische mizellare Konzentration unter 11 mmol/l,
insbesondere unter 5 mmol/l, vorzugsweise unter 3 mmol/l,
aufweist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das Detergenz
Natriumdodecylsulfat ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoff-Elektrode mit
einem, insbesondere elektrochemisch weit gehend inerten,
Stoff beschichtet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass
der Stoff ein Silan, insbesondere 3-(Glycidyloxypropyl)-
trimethoxysilan, ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass ein Molekül an die
Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere an den Stoff, gebunden
wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass
das Molekül gerichtet, insbesondere an einem seiner
Enden, gebunden wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet,
dass das Molekül kovalent gebunden wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekennzeichnet,
dass der Quotient aus der Menge der Moleküle, die
gerichtet, insbesondere kovalent, an die Kohlenstoff-Elektrode
oder den Stoff gebunden werden, und der Menge der
Moleküle, die anders an die Kohlenstoff-Elektrode oder den
Stoff gebunden werden, größer als 1, vorzugsweise größer
als 3, ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass das Molekül in Gegenwart eines
Kompetitors, insbesondere eine Proteins oder einer Aminosäure,
gebunden wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, dass das Molekül ein den Analyten
spezifisch bindendes Fänger-Molekül ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass
das Fänger-Molekül eine, insbesondere einzelsträngige,
Nukleinsäure, ein Nukleinsäure-Analogon, ein Ligand, ein
Hapten, ein Peptid, ein Protein, ein Zucker oder ein
Lipid ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass
in der einzelsträngigen Nukleinsäure mindestens ein
Nukleotid mit einer modifizierten Base, insbesondere Inosin
oder 8-Oxoguanin, enthalten ist, welches beim
elektrochemischen Detektieren ein anderes Signal erzeugt als
Nukleotide des Analyten.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch
gekennzeichnet, dass die einzelsträngige Nukleinsäure keine Guanin-
und/oder Adenin-Reste aufweist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt an das
Fänger-Molekül gebunden wird und die Kohlenstoff-Elektrode davor,
dabei oder danach mit dem Detergenz behandelt wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoff-Elektrode eine
Pencil-, eine Glassy-Carbon-, eine Pyrolytic-Graphit-
oder eine Kunststoff-Composit-Elektrode, insbesondere
eine Graphit enthaltende Polycarbonat-Elektrode, ist.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoff-Elektrode
zusätzlich mit einem chaotropen Agens, insbesondere
Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, behandelt wird.
19. Kohlenstoff-Elektrode für ein elektrochemisches Verfahren
zur Detektion eines Analyten, dadurch gekennzeichnet,
dass sie nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1
bis 18 behandelt worden ist.
20. Verwendung einer Kohlenstoff-Elektrode nach Anspruch 19
in einem Verfahren zum elektrochemischen Detektieren
eines Analyten.
21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass
der Analyt ein Biomolekül, insbesondere eine
Nukleinsäure, ist.
22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch
gekennzeichnet, dass der Analyt eine Markierungssubstanz aufweist.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch
gekennzeichnet, dass der Analyt beim Detektieren an die
Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere an ein an der
Kohlenstoff-Elektrode gebundenes Fänger-Molekül, gebunden ist.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch
gekennzeichnet, dass das elektrochemische Detektieren
mittels Differenzieller-Puls-Voltammetrie (DPV) oder
Chronopotentiometrischer-Stripping-Analyse (CPSA)
erfolgt.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch
gekennzeichnet, dass die Kohlenstoff-Elektrode beim
Detektieren gleichzeitig mit einem Detergenz und mit dem
Analyten in Kontakt steht.
26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass
das Detergenz ein ionisches Detergenz ist.
27. Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, dadurch
gekennzeichnet, dass das Detergenz in einer Konzentration von 0,1%
bis 20%, insbesondere 1% bis 15%, vorliegt.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch
gekennzeichnet, dass das Detergenz in Wasser eine
kritische mizellare Konzentration unter 11 mmol/l,
insbesondere unter 5 mmol/l, vorzugsweise unter 3 mmol/l, aufweist.
29. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch
gekennzeichnet, dass das Detergenz Natriumdodecylsulfat
ist.
30. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch
gekennzeichnet, dass die Kohlenstoff-Elektrode vor dem
Detektieren in einer das Detergenz enthaltenden Lösung
aufbewahrt wird.
31. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 30, dadurch
gekennzeichnet, dass zum elektrochemischen Detektieren
ein Potential-Intervall zur Messung gewählt wird, in
welchem im Wesentlichen nur der Analyt ein Signal
verursacht.
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