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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Offenbarung liegt
auf dem Gebiet der Biosensoren für
die Analyse von Körperflüssigkeiten.
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Hintergrund der Erfindung
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Ein Verfahren zum Messen der Konzentration
von Glucose im Blut besteht darin, eine Reaktion zwischen der Glucose
und dem Enzym Glucose-Oxidase zu bewirken. Die Reaktion produziert
Wasserstoffperoxid, das bei positiven Spannungen elektrochemisch
oxidiert werden kann. Der durch die Oxidation des Peroxids produzierte
Strom wird gemessen und steht in direktem Verhältnis zur Glucosekonzentration
im Blut. Ein ähnliches
Schema kann zum Messen von anderen Analyten von Interesse verwendet
werden, durch die Auswahl eines geeigneten Enzyms, welches Wasserstoffperoxid
proportional zur Konzentration des Analyten produziert, z. B.: Lactat
kann in ähnlicher
Weise mit Hilfe des Enzyms Lactat-Oxidase gemessen werden.
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Ein seit langem bestehendes Problem
bezüglich
dieser Meßtechniken
ist die durch andere Substanzen verursachte Störung. Das Blut kann andere
Komponenten enthalten, die bei demselben Potential wie Wasserstoffperoxid
oxidieren können;
unter diesen kommen am häufigsten
Urat und Acetaminophen vor. Da diese störenden Substanzen oxidieren,
addiert sich der Strom, der durch ihre Oxidation resultiert, zum
Strom der durch die Oxidation von Wasserstoffperoxid resultiert
und ist von diesem nicht zu unterscheiden. Somit resultiert ein
Fehler in der Quantifizierung des Peroxids und folglich des Blut-Analyten.
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Zur Verringerung oder Eliminierung
dieser Störungen
wurden viele Verfahren ausprobiert. Acetaminophen war besonders
schwer zu eliminieren weil es, im Gegensatz zu Urat, nicht geladen
ist. Eine im Stand der Technik offenbarte Methodologie (siehe, z.
B., Sittampalam, G., and Wilson, G. S., Analytical Chemistry, 55:1608–1610, 1983,
and Geise, R. J., et al., Biosensors and Bioelectronics, 6:151–160, 1991)
war die Verwendung von einer oder mehreren selektiv permeablen Membranen,
um die störenden
Substanzen daran zu hindern mit der Elektrode in Kontakt zu kommen,
obwohl dieses Verfahren nicht ausreichend effizient ist, um die
Störung
vollständig
zu verhindern.
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Ein alternatives Verfahren zur Verhinderung
der Störung
wird in den U.S. Patenten 5.225.064 und 5.334.296 offenbart. Dieses
Verfahren verringert das elektrische Potential der Reaktion auf
einen Status, bei dem Urat und Acetaminophen nicht oxidiert werden.
Dieses kann durch die Verwendung eines Enzyms erreicht werden, das
Wasserstoffperoxid in der Elektrode reduziert, wie beispielsweise
eine Form von Peroxidase. In dieser Art von System reagiert das
Wasserstoffperoxid mit der Peroxidase, wobei in der Reaktion das
Wasserstoffperoxid reduziert wird und die Peroxidase oxidiert. Falls
die Peroxidase in engem Kontakt mit der Oberfläche einer Elektrode steht,
kann die Peroxidase an der Elektrode reduziert werden, durch die
Anlegung einer elektrischen Spannung. Die Größe des Stroms der notwendig
ist, um die Peroxidase zu reduzieren, ist zur Konzentration des
Wasserstoffperoxids proportional und somit proportional zur Konzentration
der Glucose oder anderer Analyten von Interesse. Außerdem finden
die Reaktionen bei Potentialen statt, bei denen Urat und Acetaminophen
nicht oxidieren und somit nicht stören.
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Der Stand der Technik erkennt die
Verwendung von Meerrettichperoxidase oder Pilzperoxidase an, die an
eine Gold- oder
Kohlenstoffoberfläche
adsorbiert sind, im Versuch der Störung vorzubeugen (siehe, z.
B., die U.S. Patente 5.225.064 und 5.334.296; Ho, W. O., et al.,
J. Electroanal. Chem., 351:187-197,
1993; Wollenberger, U., et al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics,
26:287–296,
1991; Csoregi, E., et al., Anal. Chem. 66:3604–3610, 1994), an. Diese Berichte
zeigen aber, dass eine derartige Verwendung keine zufriedenstellende
Ergebnisse ergab, weil die Größe des elektrischen
Stromes, der in diesen Anwendungen die Signale bildet, ziemlich
klein ist und die Linearität
bei hohen Konzentrationen an Peroxidase gering ist.
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Deshalb ist es von großem Nutzen,
ein Elektroden-System zu entwickeln, in dem Wasserstoffperoxid in
einer meßbaren
Weise reagiert und Signalströme
von verwendbarer Größe generiert,
die bis zu hohen Konzentrationen linear sind, die aber nicht den
Störungen
unterworfen sind, welche durch die Oxidation von interferierenden
Substanzen, wie Urat oder Acetaminophen, verursacht werden.
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Als weiteren Stand der Technik offenbaren
Csoregi, E. et al., Analytica Chimica Acta, 273 (1993) 59–70, die
Verwendung von Kohlenstofffasern, die kovalent an Peroxidase gebunden
sind, als Elektrodenmaterial in einem Biosensor zur Messung eines
Analyten. Das U.S. Patent No. 5.231.028 offenbart Enzym-Elektroden, die platinierte
Kohlenstoffmikropartikel enthalten, an die das Enzym kovalent gebunden
werden kann.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 zeigt
eine analytische Elektrode, die den störungsfreien Biosensor der Erfindung
enthält.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
eine Zusammensetzung bereit, die kovalent an Peroxidase gebundene
Mikropartikel umfaßt,
worin die besagten Mikropartikel gewählt sind aus der Gruppe bestehend
aus Mikropartikeln aus nativem Kohlenstoff, Mikropartikeln aus derivatisiertem
Kohlenstoff und Mikropartikeln aus Polypyrrol oder Polyanilin. Vorzugsweise
ist der Mikropartikel-Kohlenstoff nativer Mikropartikel-Kohlenstoff,
der über
ein bifunktionelles Reagens mit Mikroperoxidase konjugiert ist.
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Die vorliegende Erfindung stellt
auch eine Elektrode bereit für
die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, die kovalent an Peroxidase
gebundene Mikropartikel umfaßt,
um ein Konjugat zu bilden, worin die Mikropartikel gewählt sind
aus der Gruppe bestehend aus Mikropartikeln aus nativem Kohlenstoff,
Mikropartikeln aus derivatisiertem Kohlenstoff und Mikropartikeln
aus Polypyrrol oder Polyanilin, wobei das Konjugat begrenzt ist
auf eine elektrisch leitende Oberfläche. Die bevorzugte Elektrode
umfaßt
Mikropartikel aus nativem Kohlenstoff, der in einer Harz-Matrix
kovalent an Mikroperoxidase gebunden ist.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die Ausführungsformen der Erfindung
umfassen im allgemeinen eine Elektrode, die zur elektrochemischen
Messung der Konzentration eines Analyten von Interesse in einer
Lösung
verwendet wird. Der Biosensor oder die Elektrode enthält ein Peroxidase
Enzym, das kovalent an den Mikropartikel-Kohlenstoff gebunden ist
und in einer Matrix in engem Kontakt mit der Elektrode gehalten
wird.
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Wie hierin verwendet bezieht sich
der Ausdruck „Mikropartikel-Kohlenstoff" auf feine Partikel
aus Kohlenstoff und Polypyrrol oder Polyanilin. Im Stand der Technik
ist Mikropartikel-Kohlenstoff in einer Vielfalt an Formen bekannt
und kann mit Leichtigkeit von kommerziellen Anbietern erworben werden.
Zur Anwender- und Bedienerfreundlichkeit ist der Mikropartikel-Kohlenstoff
vorzugsweise kleiner als 1000 Nanometer (1 Mikron) im Durchmesser,
am besten im Bereich von 5-50
nm. In den weiter unten beschriebenen Experimenten wird ein feiner
(30 nm) Partikel-Kohlenstoff (Vulcan XC72R; E-TEk, Natick MA) verwendet.
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Der Mikropartikel-Kohlenstoff kann
in seiner natürlichen
Form („nativ") verwendet werden
oder es können
verschiedene funktionelle Gruppen an den Kohlenstoff gebunden sein
(„derivatisiert"), anhand von im Stand
der Technik bekannten Techniken. Um derivatisierten Kohlenstoff
zu erhalten reagiert das Kohlenstoff-Mikropartikel mit einem bifunktionellen
Reagens, vorzugsweise mit einem bifunktionellen Agens das Amin-enthaltende Funktionsgruppen
hat. Weil die bifunktionellen Reagenzien mit einer großen Vielfalt
an Linkern unterschiedlicher Länge
verfügbar
sind, die sich zwischen den zwei funktionellen Enden befinden, kann man
schnell und mit Leichtigkeit jene Reagenzien bestimmen, die zur
Verwendung mit einer Vielfalt an Enzymen und für eine Vielfalt an Anwendungen
geeignet sind. Die resultierenden derivatisierten Kohlenstoffpartikel können gleich
an das Enzym gekoppelt werden oder sie können vor der Kopplung an das
Enzym auf Lager gehalten werden.
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Die derivatisierten oder nativen
Partikel werden kovalent an das Enzym gebunden, wiederum gemäß im Fachgebiet
bekannten Techniken, wie weiter unten im Detail beschrieben.
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Für
den störungsfreien
Biosensor ist Peroxidase jeden Ursprungs nützlich. Die Peroxidase wird
durch im Fachgebiet bekannte Techniken leicht erhalten, oder sie
kann, alternativ, von kommerziellen Anbietern bezogen werden. In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Peroxidase Mikroperoxidase, wie sie in der Europäischen Patentveröffentlichung
0 195 320 beschrieben wird.
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Weil der Mikropartikel-Kohlenstoff
mit angeheftetem Enzym selbst nicht mit Leichtigkeit für die Detektion
eines Analyten von Interesse verwendet werden kann, sollte der Kohlenstoff
physikalisch derart begrenzt werden, dass der Analyt mit dem Kohlenstoff:Enzym-Konjugat
in Kontakt gebracht werden kann. Jedes der im Fachgebiet bekannten
Begrenzungsmittel, z. B. Gold:Peroxidase-Konjugate, sind ebenfalls
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Zum Beispiel
kann, durch die Verwendung von semi- oder selektiv-permeablen Membranen,
der Kohlenstoff physikalisch begrenzt werden, während der Analyt von Interesse in
engen Kontakt mit dem Peroxidase Enzym kommen kann. In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird das Mikropartikel-Kohlenstoff:Enzym-Konjugat
für die
Konstruktion einer Elektrode verwendet. In dieser bestimmten Ausführungsform
ist das Mikropartikel-Kohlenstoff:Enzym-Konjugat auf eine elektrisch
leitende Oberfläche begrenzt,
um eine Elektrode zu bilden. Von allen im Stand der Technik bekannten
Arten ein Kohlenstoff-Enzym-Mikropartikel
auf eine Oberfläche
zu begrenzen, wird das in der Internationalen Patentveröffentlichung WO
95/22057 beschriebene Verfahren bevorzugt. Das darin beschriebene
Verfahren schließt
die Partikel in eine Harz-Matrix ein (auch als „Farbstoff" bezeichnet) und hat die Vorteile wasserbasiert zu
sein, um die Enzymaktivität
zu erhalten. Es liefert auch eine Flüssigkeit, was die Verteilung
fördert
und die Herstellung der Elektroden erleichtert. Wie dort offenbart,
trocknet das flüssige
Harz mit den enthaltenen Kohlenstoffpartikeln, um einen wasserunlöslichen
Film zu bilden, der mit Blut kompatibel ist.
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Der Enzym: Mikropartikel-Kohlenstoff
der Erfindung ist in jeder Anwendung verwendbar, in der die katalytischen
Eigenschaften der Peroxidase sich als vorteilhaft erweisen. Signifikanter
Weise stellt der Enzym: Mikropartikel-Kohlenstoff der Erfindung
eine Zusammensetzung zur Verfügung,
die im wesentlichen störungsfrei
ist gegenüber
Verbindungen die normalerweise mit den Bestimmungen von Peroxid
interferieren. Somit können
die Enzym: Mikropartikel-Kohlenstoff-enthaltenden Zusammensetzungen
der Erfindung, in auf Instrumente basierende Systeme (in vitro)
oder in Vorrichtungen für
die direkte Messung von Blutanalyten in vivo verwendet werden.
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Beispiel 1 – Kovalente
Bindung der Mikroperoxidase an Kohlenstoffpartikel
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In diesem Experiment werden die nativen
und zwei derivatisierte Formen von Kohlenstoffpartikeln kovalent
an Mikroperoxidase gebunden.
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Die erste Form von derivatisiertem
Kohlenstoff verwendet die funktionelle Gruppe Ethylendiamin (Aldrich,
Milwakee WI), die an den Kohlenstoff gebunden wird, durch Mischen
von 100 mg Kohlenstoff mit 27 mg Ethylendiamin in 5 ml eines 50
mM 2[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES)
(Sigma, ST. Louis MO) Puffers bei einem pH-Wert von 5,5. Dann wird
50 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC)
(Pierce, Rockford IL) hinzugefügt,
um die Kopplung zu initiieren und dann 1 Stunde reagieren gelassen. Der
derivatisierte Kohlenstoff wird mittels Zentrifugation entfernt
und drei Mal mit Wasser gewaschen.
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Bei einer zweiten Form von derivatisiertem
Kohlenstoff wird ein Poly(oxyalkylen)diamin (JEFFAMINE® ED-600;
Texaco, Houston TX) als funktionelles Reagens verwendet und wird
an den Kohlenstoff gebunden, durch Mischen von 100 mg Kohlenstoff
mit 240 mg Diamin in 5 ml einer 4%igen Pyridin/Wasser Lösung bei einem
pH-Wert von 5,5. Dann werden 4 mg EDC hinzugefügt, um die Kopplung zu initiieren,
und über
Nacht regieren gelassen. Der derivatisierte Kohlenstoff wird mittels
Zentrifugation entfernt und drei Mal mit Wasser gewaschen.
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Das Peroxidase Enzym wird mit Hilfe
von EDC an den nativen oder derivatisierten Mikropartikel-Kohlenstoff
gebunden. Es werden 100 mg Kohlenstoff mit 20 mg Peroxidase Enzym
(zum Beispiel MP-11 Mikroperoxidase von Sigma Chemical, ST. Louis,
MO) in 5 ml eines 50 mM MES Puffers, pH 5,5, gemischt. Alternativ,
und vorzugsweise, kann der Puffer eine 4%ige Pyridin/Wasser Lösung mit
pH 5.5 sein. Es werden 10 mg EDC hinzugefügt und die Lösung wird
eine Stunde lang verrührt.
Der kovalent an das Peroxidase Enzym gebundene Kohlenstoff wird
mittels Zentrifugation entfernt und mit Wasser gewaschen. Der an
das Enzym gebundene Kohlenstoff wird naß gelagert.
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Um einen Vergleich zur kovalenten
Bindung bereitzustellen wird die Enzym-Adsorption durchgeführt, in
einer Lösung
mit folgender Zusammensetzung: 50 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA,
100 mM Natriumchlorid und 0,05% antimikrobielle (Kathon CG; Rohm
and Haas, Philadelphia PA) Lösung,
bei einem pH-Wert von 7,5. Diese Lösung wird als PESK 7,5 bezeichnet.
125 mg Kohlenstoff werden mit 25 mg Enzym in 5 ml PESK 7,5 über Nacht
gerührt.
Der Kohlenstoff wird mittels Zentrifugation entfernt und drei Mal
mit PESK 7,5 gewaschen.
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Beispiel 2 – Herstellung
des Farbstoffs
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Eine Harz-Matrix für die Retention
des Kohlenstoffs auf einer leitfähigen
Oberfläche,
als F133 Harz bezeichnet, wird durch die Kombination folgender Mengen
von jeder Komponente hergestellt:
| Joncryl
537 (Johnson Wax, Racine WI) | 65,04
mg |
| NH4OH, 10% in Wasser | 8,91
mg |
| 2-Ethoxyethanol
(Aldrich, Milwakee WI) | 20,94
mg |
| Dibutylphtalat
(Fluka, Ronkonkoma, NY) | 7,93
mg |
| Surfynol
104H (Air Products, Allentown, PA) | 2,50
mg |
| Surfynol
695 (Air Products) | 5,0
mg |
| Acrysol
275 (Rohm and Haas, Philadelphia PA) | 30,6
mg |
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72 mg des Harzes, eine Flüssigkeit,
wird dann mit 160 mg des im nassen Zustand kompaktierten Kohlenstoff:Enzym-Konjugats, 262 mg
0,085 M Trehalose (Sigma, St. Louis MO) in Wasser vereint. Ein kräftiges Vermischen
der drei Komponenten wird mit Hilfe eines Amalgamators (WIG-L-BUG;
Crescent Dental Co., Lyons IL) 3 Minuten lang durchgeführt, wobei
eine flüssige
Suspension entsteht. Diese Suspension oder der Farbstoff kann dann
auf eine Elektrode aufgebracht werden.
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Beispiel 3 – Konstruktion
der Elektrode
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Die Kohlenstoff:Enzym-Konjugate werden
in einer analytischen Elektrode verwendet, vom Typ derer, die in
der Internationalen Patentveröffentlichung
WO 95/22057 beschrieben wird.
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Kurzum, in 1 wird ein Zusammenbau einer analytischen
Elektrode gezeigt, zum Testen der Kohlenstoff:Enzym -Konjugate der
Erfindung. Der Elektrodenzusammenbau 10 besteht aus einem
oder mehreren (in dieser Figur, 4) Biosensoren 12, die
auf einem Polyesterblatt 32 angebracht sind. Die Biosensoren 12 werden
gebaut, indem man elektrische Verbindungen 20 aus Silber/Slilberchlorid
(Acheson SS24540) auf das Polyesterblatt 32 druckt. Am
Standort des elektrischen Kontakts mit dem Instrument 21 und
am Ende der elektrischen Verbindung 20 wird eine elektrisch leitende
Spur gebildet, durch Siebdruck von Kohlenstofftinte (Acheson 423SS) über die
elektrische Verbindung 20. Die Kohlenstoffoberfläche ist
durch die Aufbringung eines siebgedruckten Dielektrikums (Acheson
ML 25208) abgedeckt, wobei 0,013 cm2 Kohlenstoff
exponiert bleiben, für
die Aufbringung des Farbstoffs an 12. Es werden 0,2 bis 1,0 ul Kohlenstoff:Enzym-Konjugat-Farbstoff
auf die exponierte Oberfläche
der Kohlenstoffspur mit Hilfe eines Handspenders aufgetragen. Die
Referenz-Elektrode 14 wird mit Hilfe von Silber/Slilberchlorid
(Acheson SS24540) gedruckt. Eine zusätzliche Zähler-Elektrode (in 1 nicht gezeigt) wird auf
die Frontplatte 18 gebildet, auf die Seite gegenüber der
Dichtung 16. Die Zähler-Elektrode
wird mit Hilfe von Kohlenstoff, wie oben beschrieben, gedruckt,
es wird aber kein Farbstoff aufgetragen. Wenn sie zwischen dem Polyesterblatt 32 und
der Frontplatte 18 eingebettet ist, dann stellt die Dichtung 16 einen
Strömungskanal 34 zur
Verfügung.
Die Flüssigkeiten
können
dann über
die Biosensoren 12, die Referenz-Elektrode 14 und
die Zähler-Elektrode
(nicht gezeigt) von der Eingangsöffnung 24 über die Ausgangsöffnung 26 fließen. Die
Rückplatte 22 kann
an der Frontplatte 18 befestigt sein, über Befestigungsmittel, wie
eine Schraubenmutter 28, die durch ein Befestigungsloch 42 eingeführt wird,
an eine Schraube 30. Wahlweise können Mittel zur Alignierung
zur Verfügung
gestellt werden, um das geeignete Register der Komponenten über die
Löcher 44 und
die Stifte 46 zu gewährleisten.
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Beispiel 4 – Nachweis
der Empfindlichkeit
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a. Es werden mehrere Elektroden hergestellt,
wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben, mit Hilfe verschiedener
Enzyme (Meerrettichperoxidase, Sojabohnenperoxidase und Mikroperoxidase),
verschiedener Verfahren zur Anheftung von Kohlenstoff (Adsorption
oder kovalente Bindung) und verschiedener Kohlenstoff-Behandlungen
(nativ, Ethylendiamin oder JEFFAMINE ED-600). Eine Testlösung von
etwa 0,1 mM Wasserstoffperoxid bei 37°C wird über die Kohlenstoffspur, die
Referenz-Elektrode und die Zähler-Elektrode
geleitet. Eine feste elektrische Spannung von 100 mV wird an die
Elektrode angelegt und der resultierende elektrische Strom wird
für verschiedene
Elektroden-Typen aufgezeichnet, mit Hilfe einer Standard-Dreielektrodenschaltung.
Die für
die verschiedenen Kombinationen von Enzym, Kohlenstoffaufbringungs-Technik
und Kohlenstoffbehandlung gemessenen Stromstärken sind wie folgt:
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Wie aus dem Vorhergehenden ersichtlich,
zeigt die kovalent gebundene Mikroperoxidase viel höhere Stromstärken als
die konventionelle Technik der Adsorption. Die kovalent gebundene
Mikroperoxidase (MP-11, Sigma, St. Louis MO) ergibt viel höhere Stromstärken als
andere Peroxidase-Enzyme, wie die Meerrettichperoxidase (Type II,
Sigma) und die Sojabohnenperoxidase (Enzymol International, Inc.,
Bexley OH).
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b. Das Kaliumcyanoferrat(III) wird
ebenfalls in einer reversiblen Reaktion reduziert, die ähnlich verläuft wie
die mit Peroxidase. Im Stand der Technik wird sehr wohl davon Notiz
genommen, siehe, z. B., Csoregi E., et al., dass wenn gleiche Konzentrationen
an Peroxid und Cyanoferrat(III) verwendet werden, der von der Peroxidase
produzierte Strom 30–60X
schwächer
ist als der Strom, der durch Cyanoferrat(III) produziert wird. Um die
Empfindlichkeit der vorliegenden Erfindung zu bewerten, wird der
Strom, der durch die Reduktion von Peroxid an den vorhandenen Elektroden
entsteht, mit dem Strom verglichen, der durch die Reduktion von
Kaliumcyanoferrat entsteht. Es werden Wasserstoffperoxid und Cyanoferrat(III)
in wesentlich gleichen Konzentrationen von etwa 0,05 mM bei etwa
37°C über eine
Ausführungsform
der hier beschriebenen Elektrode geleitet, wobei die Mikroperoxidase
kovalent an den nativen Kohlenstoff gebunden ist. Überraschender
Weise war der Strom bei der Reduktion von Peroxid doppelt so stark
wie der bei der Cyanoferrat(III) Reduktion (siehe folgende Tabelle).
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Weil die Reduktion des Peroxids zwei
Elektronen involviert, im Gegensatz zu einem für das Cyanoferrat(III), zeigt
ein durch die vorliegende Erfindung produziertes Signal, welches
das Doppelte dessen, das durch Cyanoferrat(III) produziert wird
ist, einen besonders schnellen Elektronentransfer vom Kohlenstoff
zum Mikroperoxidase Enzym (mindestens so schnell wie derjenige für die reversible
Cyanoferrat(III)/Cyanoferrat (II)-Reaktion). Dieses wurde bisher
noch nie erreicht und demonstriert die Empfindlichkeit der Erfindung.
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Beispiel 5 – Nachweis
der Linearität
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Die Elektroden werden mit Sojabohnen-
und Meerrettichperoxidase hergestellt, die kovalent an mit Ethylendiamin
derivatisierten Kohlenstoff gebunden sind und kovalent an nativen
Kohlenstoff gebundene Mikroperoxidase. Es werden die Antwort der
Elektroden auf unterschiedliche Niveaus an Wasserstoffperoxid bei 37°C und eine
Elektroden-Spannung von 100 mV gemessen, mit folgenden Ergebnissen:
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Wie ersichtlich ist, sind weder Sojabohnen-
noch Meerrettichperoxidase über
den getesteten Bereich linear. Es erfolgten keine Ablesungen bei
höheren
Konzentrationen, weil die Antwort wesentlich vermindert wird und
die Information somit nicht aussagekräftig ist. Andererseits zeigt
die Mikroperoxidase bis mindestens 0,3 mM Wasserstoffperoxid, Linearität.
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In der bisherigen Literatur wurde
die Meerrettich- oder die Pilzperoxidase, der Mikroperoxidase gegenüber, bei
der Detektion von Peroxid bevorzugt. Die Mikroperoxidase verwendenden
Ausführungsformen
dieser Erfindung aber, haben die Anwendungen mit anderen Peroxidase-
Enzymen nicht nur in Signalstärke,
sondern auch bezüglich
der Linearität, übertroffen.
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Beispiel 6 – Messen
der Glucosekonzentrationen
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In diesem Beispiel wird die Glucose
mit Hilfe eines kommerziellen Instruments gemessen (Nova Biomedical
Stat Profile 10), in dem der Farbstoff der vorliegenden Erfindung
in kommerziellen Elektroden, die vom Hersteller geliefert werden,
verwendet wird.
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Die Mikroperoxidase ist kovalent
an den nativen Kohlenstoff gebunden, wie in Beispiel 1 beschrieben, und
der Farbstoff wird wie in Beispiel 2 hergestellt. Der Farbstoff
wird in die Mitte der Innenoberfläche eines Nova Biomedical Glucose-Enzym-Hütchens aufgebracht,
so dass die Farbe mit der Platin-Versuchselektrode des
Elektrodenkörpers
aligniert ist. Die Farbe wird trocknen gelassen und das Hütchen wird
dann auf den Elektrodenkörper
platziert. Die Kontroll-Elektrode ist eine nichtmodifizierte Glucose-Elektrode,
d. h., wie vom Hersteller geliefert, und wird entsprechend den Anleitungen
des Herstellers betrieben. Die modifizierte Elektrode wird in eine
Durchflußzelle
platziert und es werden Glucoselösungen,
mit unterschiedlichen Niveaus an störenden Substanzen, über die
Elektrode geleitet, wobei der Fluß für Messungen angehalten wird.
Der Strom wird mit Hilfe eines Potentiostats gemessen, bei etwa
100 mV angelegter Spannung. Das Glucoseniveau wird bei etwa 2 mM
konstant gehalten, bei einer Temperatur von etwa 37°C, um eine
hypoglykämische
diabetische Probe zu simulieren. Das Acetaminophen wird bis auf
die toxische Konzentration von 2 mM variiert. Es wird die prozentuale
Veränderung
des Signals der Elektrode quantitativ bestimmt, in Abwesenheit oder
beim Vorhandensein von Acetaminophen, wobei die weiter unten gezeigten
Ergebnisse bestimmt wurden.
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%
Veränderung
des Glucose-Signals vs
Acetaminophen Konzentration. 2 mM Glucose-Lösung.
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Die Ergebnisse zeigen, dass es im
wesentlichen keine Auswirkung von Acetaminophen auf die Glucosemessung
der hier beschriebenen Elektrodenausführungsform gibt.
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Beispiel 7 – Messung
der Lactatkonzentration
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Es wird ein dem in Beispiel 6 ähnliches
Experiment durchgeführt,
wobei ein Nova Biomedical Lactat-Enzym-Hütchen verwendet wird. Weil
Lactat im Blut in einer niedrigeren Konzentration als Glucose vorzufinden
ist, wird eine 0,3 mM Lactatlösung
verwendet. Erneut beseitigt, wie weiter unten gezeigt wird, die
Verwendung der Mikroperoxidase der vorliegenden Erfindung die Störungen der
Lactatmessung, die durch das Acetaminophen hervorgerufen werden.
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Veränderung
des Lactat-Signals vs
Acetaminophen Konzentration. 0,3 mM Lactat-Lösung.
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Beispiel 8 – Vergleich
der Mikroperoxidase mit Porphyrinen
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Im Fachbereich ist es bekannt, dass
Porphyrine als Katalysatoren agieren können. Weil die Mikroperoxidase
im wesentlichen eine kurze Polypeptidkette ist, 11 Aminosäuren lang,
die kovalent an einen Porphyrinring gebunden ist, wodurch zwischen
Porphyrinen und Mikroperoxidase viele Ähnlichkeiten bezüglich der chemischen
Struktur existieren, bewertet das folgende Experiment die Erforderlichkeit
der Peptidkette für
die katalytische Reduktion von Peroxid.
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Mit Hilfe folgendes Verfahrens wird
Cobalt in Protoporphyrin IX – Dimethylester
(Sigma) eingeführt.
50 mg Porphyrin werden in 25 ml DMF in einem 100 ml Rundkolben gelöst. Es werden
50 mg Cobaltchlorid (Sigma) hinzugefügt und unter Rückfluß erhitzt
bis die Fluoreszenz gelöscht
ist. Die Lösung
wird dann gekühlt
und es wird kaltes Wasser hinzugefügt, um das Cobalt-Porphyrin
zu rekristallisieren. Nach Waschen und Trocknen wird das Cobalt-Porphyrin
auf 250 mg nassem Kohlenstoff adsorbiert. Die Adsorption wird durchgeführt, indem man
10 mg trockenes Porphyrin mit Kohlenstoff in 5 ml Chloroform mischt.
Nach der Entfernung des Chloroforms, durch Waschen mit Aceton und
Wasser, wird das Cobalt-Porphyrin in einen Farbstoff verarbeitet,
durch Mischen von etwa 160 mg Kohlenstoff:adsorbiertes Porphyrin,
72 mg F133 Harz und 262 mg 0,085 M Trehalose in Wasser. Der Farbstoff
wird auf die in Beispiel 3 beschriebene siebgedruckte Elektrode
verteilt. Die Reduktion von 0,1 mM Wasserstoffperoxid wird für Cobalt-Porphyrin-Elektroden
und Mikroperoxidase (kovalent an nativen Kohlenstoff gebunden)-Elektroden
bei verschiedenen Spannungen aufgezeichnet.
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REDUKTION
VON 0,1 mM WASSERSTOFFPEROXID ALS EINE FUNKTION DER SPANNUNG
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Diese Ergebnisse zeigen, dass ein
Mikroperoxidase enthaltender Farbstoff der vorliegenden Erfindung bei
Spannungen von etwa 400 mV in der Lage ist, leichter als Cobalt-Porphyrin
Peroxid zu reduzieren. Dieses zeigt, dass bei der katalytischen
Reduktion von Peroxid, Mikroperoxidase eine wesentlich bessere Leistung erbringt
als Porphyrin.
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Beispiel 9 – Synthese
von alternativen Mikroperoxidase – Enzymen
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Das folgende Experiment ist so entworfen,
dass es die Erforderlichkeit von Eisen für die katalytischen Eigenschaften der
Mikroperoxidase untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Metallkomponente
für die
katalytische Aktivität
notwendig ist und dass überraschender
Weise die Aktivität
erhalten bleibt, wenn das native Eisen entfernt wird und durch andere
Metalle ersetzt wird.
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- a. Eisen wird aus der Mikroperoxidase durch
Zugabe von 800 mg Eisensulfat in 4 ml konzentrierter HCl auf 2000
mg Enzym, das in 14 ml Eisessig gelöst ist, entfernt. Dieses Reaktionsgemisch
wird 10 Minuten lang unter Stickstoff rühren gelassen, während dessen
die kastanienbraune Farbe der Lösung
in Purpur umschlug. Zur Lösung
wird Aceton hinzugefügt,
bis die Mikroperoxidase ausfällt.
Dieser Feststoff wird dann aufgefangen, durch Zentrifugation mit
Aceton gewaschen und getrocknet.
- b. Um die verschiedenen Metalle einzufügen, werden 20 mg Mikroperoxidase
von Beispiel 9a (die hiernach als „enteisente" Peroxidase bezeichnet
wird) in 4 ml einer 1 : 3 Pyridin: Essigsäure-Lösung gelöst. Die Lösung wird unter Stickstoff
auf 80°C
erhitzt und 20 mg Metall (d. h. Eisen, Zink, Kupfer, Nickel) in
Form von Sulfat oder Chlorid werden in 1 ml Wasser hinzugefügt. Das
Gemisch wird unter Stickstoff bei 80°C, 10 Min. lang reagieren gelassen,
gefolgt von 10 Min. Kühlung
an der Luft. Es wird Aceton hinzugefügt, um die Mikroperoxidase
auszufällen,
und die Feststoffe werden mit Aceton gewaschen.
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Jede Mikroperoxidase, die ein unterschiedliches
Metall enthält,
wird vor der kovalenten Bindung an Kohlenstoff auf Aktivität getestet.
Die Aktivität
wird gemessen, indem man die Geschwindigkeit der Bildung des Chinoniminfarbstoffs
beobachtet, aus 4-Aminoantipyrin und 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzensulfonsäure, bei
550 nm, beim Vorhandensein eines Überschusses an Wasserstoffperoxid.
Es werden folgende Ergebnisse bezüglich der relativen Aktivität bestimmt.
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Diese Ergebnisse zeigen einen ungefähr 25%igen
Verlust an Aktivität
nach der Entfernung und des Ersatzes von Eisen. Die Zink- und Nickel-Mikroperoxidasen
zeigen einen ungefähr
50%igen Verlust an Aktivität.
Kupfer-Mikroperoxidase ist nicht sehr aktiv.
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Die Mikroperoxidase-Enzyme, die verschiedene
Metallionen enthalten, werden kovalent an nativen Kohlenstoff gebunden,
mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens. Die Farbstoffe
werden hergestellt, indem man etwa 160 mg Kohlenstoff:Enzym Konjugat,
72 mg F133 Harz und 262 mg 0,085 M Trehalose in Wasser verwendet,
wonach diese zum Testen auf Kohlenstoffspuren verteilt werden, wie
in Beispiel 3 beschrieben. Die Elektroden werden bei 100 mV auf
die Reduktion von Wasserstoffperoxid getestet.
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Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Mikroperoxidase durch die Insertion eines unterschiedlichen Metallions
modifiziert werden kann und in einem Sensor zur Detektion von Peroxid
verwendet werden kann.
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Die vorliegende Erfindung wurde sowohl
im allgemeinen als auch in Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen
beschrieben. Jemand, der im Fachgebiet bewandert ist, wird mit Leichtigkeit
erkennen, dass diese bevorzugten Ausführungsformen abgeändert, verändert und
modifiziert werden können,
ohne sich vom wahren Schutzumfang der Erfindung, so wie er durch
die angehängten
Ansprüche
definiert ist, zu entfernen.
