DE60132390T2

DE60132390T2 - Biosensor und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE60132390T2
Application number: DE60132390T
Authority: DE
Inventors: Miwa Nara-shi Hasegawa; Tomohiro Hirakata-shi YAMAMOTO; Motokazu Katano-shi WATANABE; Shin Katano-shi Ikeda; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2021-01-26
Also published as: US6451372B2; EP1124131A2; CN1159578C; DE60132390D1; EP1124131A3; US20010020591A1; CN1312469A; EP1124131B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, der eine schnelle und hochgenaue Quantifizierung eines in einer Probe enthaltenden spezifischen Bestandteils durch ein vereinfachtes Vorgehen sicherstellt, und spezifischer auf ein Verfahren für die Bildung einer Reaktionsschicht des Biosensors.
Ein vorgeschlagener Biosensor nutzt die einfache Technik, die einen spezifischen Bestandteil in der Probe ohne Verdünnen oder Rühren einer Probenlösung quantifiziert ( japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. Hei 2-062952 ).
Dieser Biosensor gemäß dem Stand der Technik wird durch Bilden eines Elektrodensystems hergestellt, welches eine Messelektrode, eine Gegenelektrode und eine Referenzelektrode enthält, auf einer elektrisch isolierenden Grundplatte durch ein bekanntes Verfahren wie Siebdruck und ferner Bilden einer Enzymreaktionsschicht, welche ein hydrophiles Polymer, eine Oxidoreduktase und einen Elektronenvermittler (Elektronenmediator) enthält, auf dem Elektrodensystem. Ein Puffer kann zu der Enzymreduktionsschicht gemäß den Erfordernissen hinzugegeben werden.
Wenn eine Probenlösung einschließlich eines Substrats auf die Enzymreaktionsschicht des in der vorher dargestellten Art und Weise hergestellten Biosensors getropft wird, wird die Enzymreaktionsschicht gelöst, um ein Enzym mit dem Substrat reagieren zu lassen und den Elektronenvermittler zu reduzieren. Nach Abschluss der Enzymreaktion wird die Konzentration des in der Probenlösung enthaltenen Substrats auf der Grundlage des beobachteten Oxidationsstromflusses in dem Verfahren der elektrochemischen Oxidation des reduzierten Elektronenvermittlers bestimmt.
Das Folgende beschreibt einen Glucosesensor als ein Beispiel des Biosensors.
Ein allgemein bekanntes Verfahren der Quantifizierung von Glucose kombiniert eine Glucoseoxidase mit entweder einer Sauerstoffelektrode oder einer Wasserstoffperoxidelektrode.
Glucoseoxidase oxidiert selektiv ein Substrat β-D-Glucose zu D-Glucono-δ-lacton mit Sauerstoff als dem Elektronenvermittler. Im Verlauf der Reaktion wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Die Glucose wird durch Messung der Menge des Sauerstoffverbrauchs aufgrund der Reduktion mit der Sauerstoffelektrode oder durch Messung der Menge der Wasserstoffperoxidproduktion mit der Wasserstoffperoixelektrode, wie etwa einer Platinelektrode, quantifiziert.
Die Quantifizierung einiger interessierender Substrate ist jedoch gemäß diesem Verfahren des Stands der Technik signifikant durch die Konzentration des gelösten Sauerstoffs beeinträchtigt. Die Messung ist nicht erhältlich in der Abwesenheit von Sauerstoff. Eine andere Art des Glucosesensors wurde demgemäß entwickelt, welcher nicht Sauerstoff als den Elektronenvermittler verwendet, sondern einen Metallkomplex oder eine organische Verbindung für den Elektronenvermittler nutzt, wie etwa Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat oder ein Chinonderivat.
Der Glucosesensor dieses Typs oxidiert die reduzierte Form des Elektronenvermittlers, welcher aus der Enzymreaktion resultiert auf einer Elektrode und bestimmt die Konzentration an Glucose aus dem beobachteten Oxidationsstrom.
Der Biosensor gemäß dieser Technik ist im Prinzip anwendbar für die Messung verschiedener Substanzen durch Verwendung eines Enzyms, das auf jede interessierende Substanz als das Substrat wirkt.
Zum Beispiel ermöglicht die Anwendung von Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogonase und Cholesterinesterase als die Oxidoreduktase die Messung von Cholesterin im Serum, welches als eine diagnostische Indikation in einer Vielzahl von medizinischen Einrichtungen verwendet wird.
Der Ablauf der Enzymreaktion von Cholesterinesterase ist bemerkenswert langsam. Die Zugabe eines geeigneten oberflächenaktiven Mittels erhöht die Aktivität der Cholesterinesterase und verkürzt die für die Gesamtreaktion erforderliche Zeit.
In diesem Biosensor gemäß dem Stand der Technik wird z. B. eine Reaktionsschicht durch Auflösen von Kaliumferricyanid, welches einer vorher diskutierten Elektronenvermittler ist, alleine oder mit anderen Bestandteilen in einem Lösungsmittel, Auftropfen der Lösung in einer erwünschten Fläche für die Reaktionsschicht auf einer Grundplatte und Trocknen der aufgetropften Lösung mit einem warmen Luftstrom erhalten. In dieser Reaktionsschicht scheidet sich Kaliumferricyanid in der Form von Nadeln mit Längsabmessungen von sogar mehr als 1 mm ab. Die Reaktionsschicht hat demgemäß eine heterogene Konfiguration, welches die Messgenauigkeit eines resultierenden Sensors verschlechtert.
Verglichen mit der in dem Glucosesensor enthält die Reaktionsschicht in dem Cholesterinsensor eine höhere Konzentration des entsprechenden Enzyms. Das Verfahren gemäß dem Stand der Technik, das eine derartige Reaktionsschicht durch Trocken der aufgetropften Lösung mit einem warmen Luftstrom ausbildet, verursacht, dass die resultierende Reaktionsschicht sich langsam in einer Probenlösung auflöst und ein schwaches Ansprechen aufweist.
EP-A-0 795 601 und EP-A-0 969 097 offenbaren Biosensoren, wobei die entsprechenden Reaktionsschichten durch Trocknen einer wässrigen Lösung in einem warmen Trockner hergestellt werden.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, der eine hohe Genauigkeit hat und ein hervorragendes Ansprechen auf ein Substrat zeigt, selbst in einem hohen Konzentrationsbereich des Substrats.
Um eine Reaktionsschicht auszubilden, die ein Reagens wie etwa Kaliumferricyanid enthält, welches dazu neigt sich aus einer wässrigen Lösung in der Form von Kristallen abzuscheiden, oder eine hohe Konzentration eines Enzyms enthält, haben die Erfinder gefunden, dass das geeignete Verfahren, das eine Zielreaktionsschicht bildendes Material in einem Lösungsmittel einer sublimierbaren Substanz auflöst, um eine Lösung zuzubereiten, die Lösung in einer erwünschten Fläche aufträgt, um die Zielreaktionsschichten auszubilden, die aufgetragene Lösung einfriert und das Lösungsmittel, das in einem festen Stoff des gefrorenen Lösungsmittels enthalten ist, unter reduziertem Druck für die Entfernung sublimiert. Dieses Verfahren ergibt die Reaktionsschicht, die eine große Oberfläche hat und einfach in einer Probenlösung aufzulösen ist. Die Technik der vorliegenden Erfindung beruht auf diesen Befunden.
Wenigstens ein Teil der vorhergehenden und anderer verwandter Aufgaben der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren der Herstellung eines Biosensors erzielt, welcher eine elektrisch isolierende Grundplatte, ein Elektrodensystem, einschließlich einer Messelektrode und einer Gegenelektrode, das auf der elektrisch isolierenden Grundplatte vorgesehen wird und ein Reaktionsreagenzsystem enthält, das wenigstens eine Oxidoreduktase und einen Elektronenvermittler als Reagenzien enthält. Die Reagenzien des Reaktionsreagenzsystems sind als eine Reaktionsschichtstruktur vorhanden, die wenigstens eine Reaktionsschicht enthält und auf oder in der Nähe des Elektrodensystems ausgebildet wird. Das Verfahren enthält den Schritt der Ausbildung einer spezifischen Reaktionsschicht der Reaktionsschichtstruktur, die wenigstens ein spezifisches Reagenz des Reaktionsreagenzsystems enthält. Der Schritt umfasst:

(1) Lösen wenigstens eines Reagenz des Reaktionsreagenzsystems in einem Lösungsmittel einer sublimierbaren Substanz, um eine oder mehrere Lösungen herzustellen;
(2) Aufbringen der einen oder mehreren Lösung in einer erwünschten Fläche, um eine oder mehrere Reaktionsschichten auszubilden;
(3) Einfrieren der aufgebrachten Lösung; und
(4) Sublimieren des Lösungsmittels, das in einem Feststoff der gefrorenen Lösung enthalten ist, unter reduziertem Druck für die Entfernung.

In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Anwendung der vorliegenden Erfindung enthält die spezifische Reaktionsschicht alle Reagenzien des Reaktionsreagenzsystems.
In Übereinstimmung mit einer weiteren bevorzugten Anwendung der vorliegenden Erfindung hat die Reaktionsschichtstruktur eine Mehrzahl von Reaktionsschichten und nur die spezifische Reaktionsschicht enthält das wenigstens eine spezifische Reagenz des Reaktionsreagenzsystems.
In Übereinstimmung mit noch einer weiteren Anwendung der vorliegenden Erfindung schließt das Verfahren den Schritt der Ausbildung eines Stapels von mehreren Reaktionsschichten als die Reaktionsschichtstruktur ein, wobei das wenigstens eine Reagenz des Reaktionsreagenzsystems nur in einer obersten Reaktionsschicht des Stapels enthalten ist. Der Schritt schließt die Unterschritte ein von: Vorformen des Stapels der mehreren Reaktionsschichten, ausgenommen die oberste Reaktionsschicht; Lösen des wenigstens einen Reagenz in einem Lösungsmittel einer sublimierbaren Substanz, um eine Lösung zuzubereiten, und Aufbringen der Lösung auf den vor geformten Stapel der mehreren Reaktionsschichten ohne die oberste Reaktionsschicht; Einfrieren der aufgebrachten Lösung; und Sublimieren des in einem Feststoff gefrorenen Lösung enthaltenen Lösungsmittels unter reduzierten Druck für die Entfernung.
Es ist bevorzugt, dass das Verfahren weiterhin die Schritte enthält von: Ausbilden eins Deckelements auf der elektrisch isolierenden Grundplatte, welches mit der Grundplatte verbunden ist, um einen Probenlösungszufuhrpfad zu umgrenzen, durch welchen eine Probenlösung zu dem Elektrodensystem fließt, wobei die Reaktionsschichtstruktur zum Probenlösungszufuhrpfad hin offen ist und wenigstens eine Reaktionsschicht der Reaktionsschichtstruktur auf dem Deckelement ausgebildet wird.
In dem Fall, wo die Oxidoreduktase ein Enzym ist, das als ein Katalysator der Oxidationsreaktion von Cholesterin dient, ist es bevorzugt, dass der Elektronenvermittler in einer anderen Reaktionsschicht unterschiedlich von der das Enzym enthaltenden Reaktionsschicht enthalten ist.
In Übereinstimmung mit einer anderen bevorzugten Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Oxidoreduktase ein Enzym, das als ein Katalysator für die Oxidationsreaktion von Cholesterin fungiert, und der Elektronenvermittler ist in einer anderen Reaktionsschicht enthalten, die unterschiedlich von der Reaktionsschicht ist, die das Enzym enthält.
In Übereinstimmung mit noch einer bevorzugten Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Oxidoreduktase ein Enzym, dass als ein Katalysator der Oxidationsreaktion von Cholesterin fungiert, und die Schicht, die das Enzym enthält, enthält weiterhin ein oberflächenaktives Mittel.
In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Anwendung der vorliegenden Erfindung ist das vorher erwähnte wenigstens eine spezifische Reagenz des Reaktionsreagenzsystems eine Oxidoreduktase oder Kaliumferricyanid, welches ein Elektronenvermittler ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass wenigstens die unterste Reaktionsschicht der Reaktionsschichtstruktur ein hydrophiles Polymer enthält.
Während die neuartigen Merkmale der Erfindung insbesondere in den beigefügten Ansprüchen festgesetzt sind, wird die Erfindung, sowohl hinsichtlich der Organisation als auch des Inhalts, zusammen mit anderen Aufgaben und Merkmalen davon, aus der folgenden ausführlichen Beschreibung zusammengenommen mit den Zeichnungen besser verstanden und geschätzt.
KURZE BESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNG
1 ist eine auseinandergenommene perspektivische Ansicht, die die Struktur eines Biosensors ohne eine Reaktionsschichtstruktur in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
2 ist eine vertikale Schnittansicht, die einen Hauptteil des in 1 gezeigten Biosensors veranschaulicht.
3 ist eine vertikale Schnittansicht, die einen Hauptteil eines anderen Biosensors in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulich.
4 ist eine grafische Darstellung, die die Antworten der als Beispiele hergestellten Cholesterinsensoren der vorliegenden Erfindung und der Vergleichsbeispiele zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf ein gemäß Anspruch 1 definiertes Verfahren gerichtet.
Wie vorher beschrieben, bildet das erfindungsgemäße Verfahren eine spezifische Reaktionsschicht in einem Stapel einer Mehrzahl von Reaktionsschichten aus, welche wenigstens ein spezifisches Reagenz enthält, durch Lösen eines die Reaktionsschicht bildenden Materials, einschließlich des spezifischen Reagenz in einem Lösungsmittel einer sublimierbaren Substanz, um eine Lösung herzustellen, Aufbringen der Lösung in einer erwünschten Fläche, um die Reaktionsschicht auszubilden, Einfrieren der aufgebrachten Lösung und Sublimieren des Lösungsmittels, das in einem Feststoff der gefrorenen Lösung enthalten ist, unter reduziertem Druck für die Entfernung. Dieses Verfahren ergibt die Reaktionsschicht mit einer porösen Struktur, die aus im Wesentlichen gleichmäßig feinen Teilchen besteht und eine große Oberfläche hat. Diese Anordnung erhöht die Löslichkeit der Reaktionsschicht in einer Probenlösung und verkürzt die für die Messung erforderliche Zeit. Diese Technik ist besonders wirkungsvoll in dem Fall, wo die Probenlösung eine hohe Konzentration eines Substrats aufweist. Die hohe Konzentration des Substrats in der Probenlösung resultiert in einer hohen Viskosität der Probenlösung, so dass die Reaktionsschicht des Stands der Technik nicht leicht gelöst wird. Die Anordnung der vorliegenden Erfindung erhöht die Löslichkeit der Reaktionsschicht selbst in der Probenlösung mit einer hohen Konzentration des Substrats.
Dieses Verfahren ist hinsichtlich der verschiedenen Reagenzien des Reaktionsreagenzsystems besonders wirkungsvoll für den Elektronenvermittler. Der Elektronenvermittler kann ein Kaliumferricyanid oder eine geeignete Redoxverbindung ausgewählt aus einer Vielzahl von Redoxverbindungen mit Elektronentransferfähigkeit zu und von einer Oxidoreduktase wie Cholesterinoxidase ausgewählt sein. Es ist bevorzugt, dass der Elektronenvermittler alleine auf dem Biosensor getragen wird, um die Oberfläche des Elektronenvermittlers zu vergrößern und die Löslichkeit davon zu erhöhen.
Das sublimierbare Lösungsmittel, das bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist entweder elektrochemisch inaktiv oder ein Oxidationsmittel und demgemäß reduziert es nicht noch modifiziert es den Elektronenvermittler oder das Enzym. Wasser ist das beste Lösungsmittel für diesen Zweck. Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Chinone wie Para-Benzochinon sind ebenfalls für das Lösungsmittel des Elektronenvermittlers erhältlich. Wasser oder ein Puffer ist für das Lösungsmittel des Enzyms bevorzugt. Andere anwendbare Lösungsmittel enthalten etwa 40% wässrige Lösung Dimethylformamid und etwa 20% wässrige Lösung Ethanol.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Oxidoreduktase ist ein Enzym für einen zu messenden Gegenstand als ein Substrat. Folglich wird eine Glucoseoxidase in dem Glucosesensor verwendet. Um Serum-Cholesterinkonzentrationen als der diagnostische Standard zu messen, werden Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase als das Enzym, das als ein Katalysator für die Oxidationsreaktion von Cholesterin fungiert, verwendet, und Cholesterinesterase als das Enzym, das als ein Katalysator des Verfahrens der Umwandlung von Cholesterinester in Cholesterin fungiert, verwendet. Da die Enzymreaktion der Cholesterinesterase sehr langsam abläuft verbessert die Zugabe eines geeigneten oberflächenaktiven Mittels die Aktivität der Cholesterinesterase, was eine Verkürzung der für die gesamte Reaktion erforderlichen Zeit ermöglicht.
Ein erfindungsgemäßer Cholesterinsensor hat eine Reaktionsschichtstruktur, die eine Vielzahl von Reaktionsschichten enthalten kann, d. h. eine Schicht, die ein hydrophiles Polymer enthält, eine Schicht, die ein Enzym enthält, das als ein Katalysator der Oxidationsreaktion von Cholesterin dient, eine Schicht, die einen oberflächenaktiven Stoff enthält, eine Cholesterinesterase enthaltende Schicht und eine den Elektronenvermittler enthaltende Schicht. Das oberflächenaktive Mittel, das als der Katalysator der Oxidationsreduktion von Cholesterin fungierende Enzym und die Cholesterinesterase können in einer gemischten Reaktionsschicht enthalten sein. Die Reaktionsschichten, die an einer Mehrzahl von verschiedenen Positionen angeordnet sind, können als Abschnitte einer identischen Zusammensetzung ausgebildet werden oder können alternativ verschiedene Zusammensetzung haben. Diese Reaktionsschichten werden auf oder in der Nähe des Elektrodensystems in dem Biosensor angeordnet.
Der Biosensor kann ein Deckelement haben, das mit der Grundplatte mit dem darauf ausgebildeten Elektrodensystem verbunden ist, um einen Probenlösungszuführpfad zu umgrenzen, durch welchen eine Probenlösung zu dem Elektrodensystem fließt. In diesem Fall kann die Reaktionsschicht an einer spezifischen Position ausgebildet werden, die zu dem Probenlösungszufuhrpfad offen ist oder an einer Öffnung des Probenlösungszufuhrpfads. Die Reaktionsschicht kann an jeder geeigneten Position ausgebildet werden, solange die Reaktionsschicht leicht bei einer Zufuhr der Probenlösung gelöst wird und das Elektrodensystem erreicht. Eine hydrophile Polymerschicht wird bevorzugt auf dem Elektrodensystem ausgebildet, um das Elektrodensystem zu schützen und das Ablösen der Reaktionsschicht zu vermeiden. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass eine hydrophile Polymerschicht als die Grundlage der Reaktionsschicht ausgebildet wird, oder das ein hydrophiles Polymer in einer untersten Reaktionsschicht enthalten ist.
Es ist bevorzugt, dass für die erhöhte Löslichkeit die den Elektronenvermittler enthaltende Reaktionsschicht separat von dem oberflächenaktiven Mittel ist, und für die erhöhte Lagerungsstabilität ebenfalls separat von dem Katalysator für die Oxidationsreaktion von Cholesterin, z. B. Cholesterinesterase ist.
In einigen Biosensoren für die Messung des Blutzuckers (siehe z. B. japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. Hei 2-062952 ) wird eine Lipidhaltige Schicht ausgebildet, um die auf dem Elektrodensystem ausgebildete Schicht zu überziehen, um das Einbringen der Probenlösung in die Reaktionsschicht zu erleichtern. Der erfindungsgemäße Biosensor für die Messung von Cholesterin enthält das oberflächenaktive Mittel, welches zu denen des Lipids ähnliche Funktionen hat und demgemäß nicht die Lipidschicht benötigt.
Beispiele des hydrophilen Polymers enthalten wasserlösliche Cellulosederivate insbesondere Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethlcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gelatine, Polyacrylsäure und Salze davon, Stärke und Derivate davon, Polymere von Maleinsäureanhydrid und Salze davon, Polyacrylamid, Methacrylatharz, Poly-2-Hydroxyethylmethacrylat und Ähnliche.
Als das oberflächenaktive Mittel ist es möglich eine zufällige Auswahl von n-Octyl-β-D-thioglukosid, Polyethylenglycolmonododecylether, Natriumcholat, Dodecyl-β-maltosid, Saccharosemonolaurat, Natriumdeoxycholat, Natriumtaurodeoxycholat, N,N-bis(3-D-Gluconamidpropyldeoxycholeamid und Polyoxyethylen(10)octylphenylether zu verwenden.
Wenn ein Lipid verwendet wird, wird bevorzugt ein amphipatisches Phospholipid, wie etwa Lecitin, Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin verwendet.
Als das Messverfahren für den Oxidationsstrom, kann ein Zwei-Elektrodensystem bestehend aus nur einer Messelektrode und einer Gegenelektrode und ein Drei-Elektrodensystem, zusätzlich mit einer Referenzelektrode, angewendet werden, und das Drei-Elektrodensystem kann genauere Messergebnisse ergeben.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlich durch Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben.
1 ist eine auseinander gebaute perspektivische Ansicht, die einen Biosensor ohne eine Reaktionsschicht in einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Silberpaste wird auf eine elektrisch isolierende Grundplatte 1 aus Polyethylenterephtalat durch die Technik des Siebdrucks gedruckt, um Leitungen 2 und 3 auszubilden. Elektrisch leitfähige Kohlenstoffpaste einschließlich eines Harzbinders wird weiterhin auf die Grundplatte 1 gedruckt, um ein Elektrodensystem einschließlich einer Messelektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 auszubilden. Ebenfalls wird eine elektrisch isolierende Paste auf die Grundplatte 1 gedruckt, um eine elektrisch isolierende Schicht 6 auszubilden. Die elektrisch isolierende Schicht 6 bedeckt teilweise die Leitungen 2 und 3 und fixiert eine exponierte Fläche der Messelektrode 4 und der Gegenelektrode 5.
Eine Abdeckung 12 mit einem Luftloch 14 und einem Abstandshalter 11 werden auf die elektrisch isolierende Grundplatte 1 gemäß dem durch die gepunktete Linie in der 1 gezeigten Positionsbeziehung gebunden. Dies vervollständigt einen Cholesterinsensor. Der Abstandshalter 11 hat einen Schlitz 15, welcher mit der Grundplatte 1 der Abdeckung 12 verbunden ist, um einen Probenlösungszufuhrpfad zu umgrenzen. Der Probenlösungszufuhrpfad hat eine Öffnung 13.
2 ist eine vertikale Schnitteinsicht, die den Biosensor der ersten Ausführungsform veranschaulicht. Eine hydrophile Polymerschicht 7 wird auf dem Elektrodensystem auf der elektrisch isolierenden Grundplatte 1 ausgebildet. Die hydrophile Polymerschicht 7 wird durch Auftropfen einer wässrigen Lösung eines hydrophilen Polymers und Trocknen der aufgetropften Lösung mit einem warmen Luftstrom erhalten. Eine Reaktionsschicht 8 die Reaktionsreagenz enthält, wird auf der hydrophilen Polymerschicht 7 gebildet. In dem Fall eines Cholesterinsensors enthält die Reaktionsschicht 8 Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, das oberflächenaktivenaktive Mittel und Elektronenvermittler. Die Reaktionsschicht 8 wird durch Auftropfen einer wässrigen Lösung derartiger Reagenzien auf die hydrophile Polymerschicht 7, Einfrieren der aufgetropften Lösung und Trocknen der gefrorenen Lösung unter reduziertem Druck für die Sublimierung des Wassergehalts hergestellt.
3 ist eine vertikale Schnittansicht, die einen anderen Biosensor in einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Wie die erste Ausführungsform wird die hydrophile Polymerschicht auf dem Elektrodensystem auf der elektrisch isolierenden Grundplatte 1 ausgebildet. In der zweiten Ausführungsform werden Reaktionsschichten 8a und 8b auf hydrophilen Polymerschicht 7 bzw. auf der Oberfläche der Abdeckung 12, die zu dem Probenlösungszuführpfad exponiert ist, ausgebildet. Jede dieser Reaktionsschichten 8a und 8b wird durch Auftropfen einer wässrigen Lösung einschließlich der Bestandteile jeder Schicht einer festgelegten Position, Einfrieren der aufgetropften Lösung und Trocknen der gefrorenen Lösung unter reduziertem Druck für die Sublimation des Wassergehalts hergestellt.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform des Cholesterinsensors enthält die Reaktionsschicht 8a Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und das oberflächenaktive Mittel, während die Reaktionsschicht 8b den Elektronenvermittler enthält. In Übereinstimmung mit einer anderen Ausführungsform enthält die Reaktionsschicht 8a Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase, während die Reaktionsschicht 8b das oberflächenaktive Mittel und den Elektronenvermittler enthält.
In Übereinstimmung mit noch einer weiteren Ausführungsform wird jede der Reaktionsschichten 8, 8a und 8b als ein Stapel von mehreren Reaktionsschichten aufgebaut. Wenigstens eine oberste Schicht des Stapels wird durch die Schritte des Einfrierens einer wässrigen Lösung von wenigstens einem in der obersten Schicht zu enthaltenden Reagenz und Entfernen des Wassergehalts durch Sublimation hergestellt. Das eine, wenigstens in der obersten Schicht enthaltene Reagenz ist z. B.
Kaliumferricyanid, welches grobe Kristalle ausbildet, wenn die wässrige Lösung mit einem warmen Luftstrom getrocknet wird. Es ist bevorzugt, dass die Reaktionsschicht 8b ein hydrophiles Polymer enthält, oder auf einer hydrophilen Polymerschicht ausgebildet ist. Diese Anordnung vermeidet wirkungsvoll das Ablösen der Reaktionsschicht 8b.
Beispiel 1
Beispiel 1 ist ein Cholesterinsensor mit der Struktur der 3, wobei die Reaktionsschicht 8a den Elektronenvermittler und die Reaktionsschicht 8b Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und das oberflächenaktive Mittel enthält. Dieser Cholesterinsensor wurde in der folgenden Art und Weise hergestellt.
Das Verfahren des Beispiels 1 stellt zunächst eine 0,5 Gew.-%-ige wässrige Lösung her, die Natriumcarboxylmethylcellulose (hiernach als CMC bezeichnet) her, tropft 5 μl der wässrigen Lösung auf das Elektrodensystem auf der Grundplatte 1, und trocknete die aufgetropfte Lösung in einem Trockengerät mit einem warmen Luftstrom von 50°C für 10 Minuten. Dies ergab die CMC-Schicht 7. Das Verfahren löste dann Kaliumferricyanid in Wasser, um eine 1 M wässrige Lösung herzustellen, tropfte 1 μl der wässrigen Lösung auf die CMC-Schicht 7 und trocknete die aufgetropfte Lösung in dem Trockengerät mit einem warmen Luftstrom von 50°C für 10 Minuten. Dies ergab die Reaktionsschicht 8a, die Kaliumferricyanid enthält.
Auf der anderen Seite stellte das Verfahren eine gemischte wässrige Lösung durch Lösen von Cholesterinoxidase von Nocardia (EC1.1.3.6, hiernach als ChOD bezeichnet) und Cholesterinesterase von Pseudomonas (EC.3.1.1.13, hiernach als ChE bezeichnet) in Wasser und Zugabe von Polyoxyethylen(10)octylphenylether (Triton X-100) als ein oberflächenaktives Mittel her. Das Verfahren tropfte dann 2,5 μl der gemischten wässrigen Lösung in die Aussparung definiert durch den Schlitz 15 des Deckelements einschließlich der Abdeckung 12 und dem Abstandshalter 11, fror die aufgetropfte Lösung mit flüssigem Stickstoff von –196°C ein und trocknete die gefrorene Lösung in einem Kjeldahl-Kolbensatz in einer Gefriertrockenvorrichtung für 3 Stunden. Dies ergab die Reaktionsschicht 8b, die 4 Einheiten (U) Cholesterinoxidase, 10 U Cholesterinesterase und 3 Gew.-% des oberflächenaktiven Mittels enthält. Die Reaktionsschicht 8b behielt die unmittelbar nach dem Auftropfen von 2,5 μl der gemischten wässrigen Lösung gebildete Kontur und hatte eine poröse Struktur mit einer extrem großen Oberfläche.
Der Cholesterinsensor wurde durch Binden des Deckelements an die Grundplatte vervollständigt.
Das Verfahren führte 1 μl einer Cholesterinstandartlösung mit Cholesterin und Cholesterinlinoleat, welches einer der Cholesterinester ist, durch die Öffnung 13 des Probenlösungszufuhrwegs zu dem auf diese Weise hergestellten Cholesterinsensor, legte eine Pulsspannung von +0,5 V in Richtung der Anode der Messelektrode relativ zu der Gegenelektrode als Referenz 3 Minuten nach der Zufuhr an und maß den elektrischen Strom 5 Sekunden nach der Anlegung. Die Ergebnisse werden in der graphischen Darstellung der 4 gezeigt.
Beispiel 2
Beispiel 2 ist ein Cholesterinsensor mit der Struktur der 3, wobei die Reaktionsschicht 8a den Elektronenvermittler und die Reaktionsschicht 8b Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, das oberflächenaktive Mittel und 0,125 Gew.-% CMC enthält. Dieser Cholesterinsensor wurde in der folgenden Art und Weise hergestellt.
Die CMC-Schicht 7 wurde auf dem Elektrodensystem auf der elektrisch isolierenden Grundplatte 1 in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 diskutiert ausgebildet. Das Verfahren des Beispiels 2 löste Kaliumferricyanid in Wasser, um eine wässrige Lösung herzustellen, tropfte 1 μl der wässrigen Lösung auf die CMC-Schicht 7 und trocknete die aufgetropfte Lösung in der Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrom von 50°C für 10 Minuten. Dies ergab die Reaktionsschicht 8a, die Kaliumferricyanid enthält. Auf der anderen Seite stellte das Verfahren eine gemischte wässrige Lösung durch Lösen von ChOD, ChE, dem oberflächenaktiven Mittel und CMC in Wasser her, tropfte 2,5 μl der gemischten wässrigen Lösung in die durch den Schlitz 15 des Deckelements einschließlich der Abdeckung und dem Abstandshalter definierte Aussparung, fror die aufgetropfte Lösung mit flüssigem Stickstoff ein und trocknete die gefrorene Lösung in einem Kjeldahl-Kolbenset in der Gefriertrockenvorrichtung für 3 Stunden. Dies ergab die Reaktionsschicht 8b einschließlich ChOD, ChE, dem oberflächenaktiven Mittel und CMC. Die Mengen an Kaliumferricyanid, dem oberflächenaktiven Mittel, ChOD und ChE verwendet in Beispiel 2 als auch die in den folgenden diskutierten Beispiele 3 und 4 und des Vergleichsbeispiels waren identisch mit denen des Beispiels 1.
Der Cholesterinsensor wurde dann in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 diskutiert hergestellt. Während der Zeitabstand zwischen einer Zufuhr der Probenlösung und der Anlegung einer Spannung variiert wird, wurde der elektrische Strom als die Antwort hinsichtlich jeder Konzentration der Probenlösung gemessen. Die Ergebnisse werden in der graphischen Darstellung der 4 gezeigt.
Beispiel 3
Beispiel 3 ist ein Cholesterinsensor mit der Struktur der 3, wobei die Reaktionsschicht 8b den Elektronenvermittler und die Reaktionsschicht 8a Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und das oberflächenaktive Mittel enthält. Dieser Cholesterinsensor wurde in der folgenden Art und Weise hergestellt.
Die CMC-Schicht 7 wurde auf dem Elektrodensystem auf der elektrisch isolierenden Grundplatte 1 in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 diskutiert ausgebildet. Das Verfahren des Beispiels 3 stellte eine gemischte wässrige Lösung durch Lösen von ChOD, ChE und dem oberflächenaktiven Mittel in Wasser her, tropfte 2,5 μl der gemischten wässrigen Lösung auf die CMC-Schicht 7, fror die aufgetropfte Lösung mit flüssigem Stickstoff ein und trocknete die gefrorene Lösung in einem Kjeldahl-Kolbenset in der Gefriertrockenvorrichtung für 3 Stunden. Dies ergab die Reaktionsschicht 8b einschließlich ChaD, ChE und dem oberflächenaktiven Mittel. Andererseits löste das Verfahren Kaliumferricyanid im Wasser, um eine wässrige Lösung herzustellen, tropfte 1 μl der wässrigen Lösung in die durch den Schlitz 15 des Deckelements einschließlich der Abdeckung und dem Abstandshalter definierte Aussparung, fror die aufgetropfte Lösung mit flüssigem Stickstoff ein und trocknete die gefrorene Lösung in einem Kjeldahl-Kolbenset in der Gefriertrockenvorrichtung für 3 Stunden. Dies ergab die Reaktionsschicht 8b einschließlich Kaliumferridcyanid.
Der Cholesterinsensor wurde dann in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Während der Zeitabstand zwischen einer Zufuhr der Probenlösung und der Anlegung einer Spannung variiert wird, wurde der elektrische Strom als die Antwort hinsichtlich jeder Konzentration der Probenlösung gemessen. Die Ergebnisse werden in der graphischen Darstellung in der 4 gezeigt.
Beispiel 4
Beispiel 4 ist ein Cholesterinsensor mit der Struktur der 3, wobei die Reaktionsschicht 8a den Elektrodenvermittler und die Reaktionsschicht 8b Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und das oberflächenaktive Mittel enthält. Dieser Cholesterinsensor wurde in der folgenden Art und Weise hergestellt.
Die CMC-Schicht 7 wurde auf dem Elektrodensystem auf der elektrisch isolierenden Grundplatte 1 in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 diskutiert ausgebildet. Das Vorgehen des Beispiels 4 löste Kaliumferricyanid in Wasser, um eine wässrige Lösung herzustellen, tropfte 1 μl der wässrigen Lösung auf die CMC-Schicht 7, fror die aufgetropfte Lösung mit flüssigem Stickstoff ein und trocknete die gefrorene Lösung in einem Kjeldahl-Kolbenset in der Gefriertrockenvorrichtung für 3 Stunden. Dies ergab die Reaktionsschicht 8a. Auf der anderen Seite stellte das Verfahren eine gemischte wässrige Lösung durch Lösen von ChaD, ChE und des oberflächenaktiven Mittels im Wasser her, tropfte 2,5 μl der gemischten wässrigen Lösung in den durch den Schlitz 15 des Abdeckungselements einschließlich der Abdeckung und des Abstandshalters definierte Aussparung, fror die aufgetropfte Lösung mit flüssigem Stickstoff ein und trocknete die gefrorene Lösung in einem Kjeldahl-Kolbenset in der Gefriertrockenvorrichtung für 3 Stunden. Dies ergab die Reaktionsschicht 8b einschließlich ChOD, ChE und dem oberflächenaktiven Mittel.
Der Cholesterinsensor wurde dann in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 diskutiert hergestellt. Während der Zeitabstand zwischen einer Zufuhr der Probenlösung und der Anlegung einer Spannung variiert wird, wurde der elektrische Strom als die Antwort hinsichtlich jeder Konzentration der Probenlösung gemessen. Die Ergebnisse werden in der graphischen Darstellung der 4 gezeigt.
Vergleichsbeispiel
Die CMC-Schicht wurde auf dem Elektrodensystem auf der elektrisch isolierenden Grundplatte 1 in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 diskutiert ausgebildet. Eine gemischte wässrige Lösung wurde durch Lösen von Kaliumferricyanid, dem oberflächenaktiven Mittel, ChOD und ChE in Wasser ausgebildet. Das Verfahren des Vergleichsbeispiels tropfte 4,5 μl der gemischten wässrigen Lösung auf die CMC-Schicht und trocknete die gemischte wässrige Lösung mit einem warmen Luftstrom von 50°C für 15 Minuten. Die ergab eine Reaktionsschicht einschließlich Kaliumferricyanid, dem oberflächenaktiven Mittel, ChOD und ChE.
Ein Cholesterinsensor wurde dann in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 diskutiert hergestellt. Während der Zeitabstand zwischen einer Zufuhr der Probenlösung und der Anlegung einer Spannung variiert wird, wurde der elektrische Strom als die Antwort hinsichtlich jeder Konzentration der Probenlösung gemessen. Die Ergebnisse werden in der graphischen Darstellung der 4 gezeigt.
Die Technik der vorliegenden Erfindung bildet eine Reaktionsschicht mit einer großen Oberfläche aus. Diese Anordnung stellt die rasche Auflösung der Reaktionsschicht in einer Probenlösung sicher und ergibt einen resultierenden Biosensor mit einem hervorragenden Ansprechen auf einen Substrat selbst in einem hohen Konzentrationsbereich des Substrats.
Obwohl die vorliegende Erfindung mit Begriffen der z. Z. bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist zu verstehen, dass eine derartige Offenbarung nicht als beschränkend zu interpretieren ist. Verschiedene Abwandlungen und Modifikationen werden ohne Zweifel für die Fachleute, an welche sich die vorliegende Erfindung richtet, offensichtlich sein, nachdem sie die vorhergehende Offenbarung gelesen haben. Demgemäß ist es beabsichtigt, dass die beigefügten Ansprüche so zu interpretieren sind, dass sie alle Abwandlungen und Modifikationen abdecken, welche in den Umfang der Erfindung fallen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Biosensor bereit, der ein Reaktionsreagenzsystem hat, welches leicht selbst in einer Probenlösung mit einer hohen Konzentration eines Substrats gelöst wird und eine schnell und hochgenaue Messung sicherstellt. Das Verfahren der Ausbildung einer Zielreaktionsschicht gemäß der vorliegenden Erfindung löst ein die Zielreaktionsschicht bildendes Material in einem Lösungsmittel einer sublimierbaren Substanz, um eine Lösung herzustellen, bringt die Lösung in einer erwünschten Fläche auf, um die Zielreaktionsschicht auszubilden, friert die aufgetragene Lösung ein und sublimiert das in einem Feststoff der gefrorenen Lösung enthaltende Lösungsmittel unter reduziertem Druck für die Entfernung. Die resultierende Reaktionsschicht hat eine große Oberfläche und wird leicht in der Probenlösung gelöst, um eine rasche Messung zu ermöglichen.

Claims

Verfahren für die Herstellung eines Biosensors, welcher eine elektrisch isolierende Grundplatte (1), ein Elektrodensystem einschließlich einer Messelektrode (4) und einer auf der Grundplatte (1) gebildeten Gegenelektrode (5), und ein Reaktionsreagenzsystem einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler als Reagenzien umfasst, wobei die Reagenzien des Reaktionsreagenzsystems in einer oder mehreren auf oder in der Nähe des Elektrodensystems ausgebildeten Reaktionsschichten (8, 8a, 8b) enthalten sind, wobei das Verfahren den Schritt der Ausbildung der einen oder mehreren Reaktionsschichten (8, 8a, 8b) umfasst, wobei der Schritt umfasst: Lösen wenigstens eines Reagenz des Reaktionsreagenzsystems in einem sublimierbaren Lösungsmittel, um eine oder mehrere Lösungen herzustellen; Aufbringen der einen oder mehreren Lösungen auf einer erwünschten Fläche, um die eine oder mehreren Reaktionsschichten (8, 8a, 8b) auszubilden; Einfrieren der aufgebrachten einen oder mehreren Lösungen; und Sublimieren des Lösungsmittels, das in einem Feststoff der gefrorenen Lösungen enthalten ist, unter reduziertem Druck für die Entfernung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Reaktionsschicht (8, 8a, 8b) alle Reagenzien des Reaktionsreagenzsystems enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktionsschicht (8, 8a, 8b) -struktur eine Mehrzahl von Reaktionsschichten umfasst und nur eine Reaktionsschicht (8, 8a, 8b) das wenigstens eine Reagenz des Reaktionsreagenzsystems enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren den Schritt der Ausbildung eines Stapels mehrerer Reaktionsschichten (8, 8a, 8b) als die Reaktionsschichtstruktur umfasst, wobei das wenigstens eine Reagenz des Reaktionsreagenzsystems nur in einer obersten Reaktionsschicht des Stapels enthalten ist, wobei der Schritt umfasst: Vorformen des Stapels der mehreren Reaktionsschichten (8, 8a, 8b), ausgenommen die oberste Reaktionsschicht; Lösen des wenigstens einen Reagenz in einem Lösungsmittel einer sublimierbaren Substanz, um eine Lösung zuzubereiten, und Aufbringen der Lösung auf den vorgeformten Stapel der mehreren Reaktionsschichten (8, 8a, 8b) ohne die oberste Reaktionsschicht; Einfrieren der aufgebrachten Lösung; und Sublimieren des in einem Feststoff der gefrorenen Lösung enthaltenen Lösungsmittel unter reduziertem Druck für die Entfernung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Biosensor weiterhin ein Deckelement (12) umfasst, welches mit der Grundplatte (1) verbunden ist, um einen Probenlösungszufuhrpfad zu umgrenzen, durch welchen eine Probenlösung zu dem Elektrodensystem fließt, wobei die Reaktionsschichtstruktur zum Probelösungszufuhrpfad hin offen ist und wenigstens eine Reaktionsschicht (8, 8a, 8b) der Reaktionsschichtstruktur auf dem Deckelement (12) ausgebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenigstens die unterste Reaktionsschicht der Reaktionsschichtstruktur ein hydrophiles Polymer einschließt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Oxidoreduktase ein Enzym ist, das als ein Katalysator für die Oxidationsreaktionen von Cholesterin fungiert, und der Elektronenvermittler in einer anderen Reaktionsschicht (8, 8a, 8b) enthalten ist, die unterschiedlich von einer Reaktionsschicht (8, 8a, 8b) ist, die das Enzym enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Oxidoreduktase ein Enzym ist, das als ein Katalysator der Oxidationsreaktion von Cholesterin fungiert, und die Schicht, die das Enzym enthält, weiterhin ein oberflächenaktives Mittel enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Elektronenvermittler Kaliumferricyanid ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das wenigstens eine Reagenz des Reaktionsreagenzsystems eine Oxidoreduktase oder Kaliumferricyanid ist, welches ein Elektronenvermittler ist.
Biosensor, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 1.