PT663446E - Metodo de doseamento electroquimico e composto novo de p-fenilenodiamina - Google Patents
Metodo de doseamento electroquimico e composto novo de p-fenilenodiamina Download PDFInfo
- Publication number
- PT663446E PT663446E PT94120907T PT94120907T PT663446E PT 663446 E PT663446 E PT 663446E PT 94120907 T PT94120907 T PT 94120907T PT 94120907 T PT94120907 T PT 94120907T PT 663446 E PT663446 E PT 663446E
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- substance
- specific binding
- sample
- oxidation
- electrode
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 28
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 title description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 title description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 200
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 118
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 88
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 claims abstract description 82
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 71
- -1 p-phenylenediamine compound Chemical class 0.000 claims abstract description 71
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 54
- 238000007812 electrochemical assay Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 17
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims abstract description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims abstract description 13
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 9
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims abstract description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 77
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 49
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 claims description 43
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 23
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 22
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 22
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 18
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 claims 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 20
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 19
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 abstract description 13
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 abstract description 5
- 238000007605 air drying Methods 0.000 abstract description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 86
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 80
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 77
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 74
- CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 1,4-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=C(N)C=C1 CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 56
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 150000004989 p-phenylenediamines Chemical class 0.000 description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 45
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 44
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 32
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 24
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 23
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 23
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 17
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 17
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 17
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 17
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 16
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 15
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 14
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 11
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 10
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 125000004066 1-hydroxyethyl group Chemical group [H]OC([H])([*])C([H])([H])[H] 0.000 description 8
- QOXOZONBQWIKDA-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropyl Chemical group [CH2]CCO QOXOZONBQWIKDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 8
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 7
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 6
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 5
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 5
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- SZIFAVKTNFCBPC-UHFFFAOYSA-N 2-chloroethanol Chemical compound OCCCl SZIFAVKTNFCBPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 4
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical class [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 4
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 3
- HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N iodoethane Chemical compound CCI HVTICUPFWKNHNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 3
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CJAOGUFAAWZWNI-UHFFFAOYSA-N 1-n,1-n,4-n,4-n-tetramethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound CN(C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 CJAOGUFAAWZWNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024957 Ascorbate Oxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073450 Lactate 2-monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000004576 Placental Lactogen Human genes 0.000 description 2
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 description 2
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 2
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004780 naphthols Chemical class 0.000 description 2
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229940005267 urate oxidase Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- TUWQMLOKCFVRRV-UHFFFAOYSA-N 1-n,1-n,4-n,4-n-tetraethylbenzene-1,4-diamine;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.CCN(CC)C1=CC=C(N(CC)CC)C=C1 TUWQMLOKCFVRRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIOSCHPMOHHRNY-UHFFFAOYSA-N 1-n,4-n,4-n-triethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound CCNC1=CC=C(N(CC)CC)C=C1 UIOSCHPMOHHRNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBUQOUQQUQCSAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminoanilino)ethanol Chemical compound NC1=CC=C(NCCO)C=C1 RBUQOUQQUQCSAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FCDKGTXZKZEBPA-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethylamino)anilino]ethanol Chemical compound OCCNC1=CC=C(NCCO)C=C1 FCDKGTXZKZEBPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XRKJVJADERFSGD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(diethylamino)-n-(2-hydroxyethyl)anilino]ethanol;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.CCN(CC)C1=CC=C(N(CCO)CCO)C=C1 XRKJVJADERFSGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKXVCWGAZGDEGF-UHFFFAOYSA-N 2-[n-ethyl-4-[ethyl(2-hydroxyethyl)amino]anilino]ethanol;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.OCCN(CC)C1=CC=C(N(CC)CCO)C=C1 PKXVCWGAZGDEGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJCNDNBULVLKSG-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;butane Chemical compound CCCC.CCCC.NCC(O)=O LJCNDNBULVLKSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SSZWWUDQMAHNAQ-UHFFFAOYSA-N 3-chloropropane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)CCl SSZWWUDQMAHNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920000049 Carbon (fiber) Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010000659 Choline oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical class C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 101001056976 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) Catalase-peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108030001010 Nucleoside oxidases Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010027912 Sulfite Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000043440 Sulfite oxidase Human genes 0.000 description 1
- BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N Vinyl chloride Chemical compound ClC=C BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003522 acrylic cement Substances 0.000 description 1
- 229920000122 acrylonitrile butadiene styrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 150000001555 benzenes Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 239000004917 carbon fiber Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940106681 chloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-O cysteaminium Chemical compound [NH3+]CCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 125000005265 dialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000002003 electrode paste Substances 0.000 description 1
- 238000003411 electrode reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- ZYBWTEQKHIADDQ-UHFFFAOYSA-N ethanol;methanol Chemical compound OC.CCO ZYBWTEQKHIADDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;ethyl acetate Chemical compound CCOCC.CCOC(C)=O SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000011810 insulating material Substances 0.000 description 1
- 239000012774 insulation material Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- PODWXQQNRWNDGD-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-]S([S-])(=O)=O PODWXQQNRWNDGD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical compound [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XIUROWKZWPIAIB-UHFFFAOYSA-N sulfotep Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OP(=S)(OCC)OCC XIUROWKZWPIAIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002759 woven fabric Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C215/02—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
- C07C215/04—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated
- C07C215/06—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and acyclic
- C07C215/16—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and acyclic the nitrogen atom of the amino group being further bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/806—Electrical property or magnetic property
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Secondary Cells (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Description
Gb$ kkfa
DESCRIÇÃO
"MÉTODO DE DOSEAMENTO ELECTROQUÍMICO E COMPOSTO NOVO DE p-FENILENODIAMINA"
ÁREA DA INVENÇÃO
Esta invenção relaciona-se com um método de doseamento electroquimico em que é utilizado um mediador de electrões ou mediador de transferência de electrões e com um composto novo de p-fenilenodiamina.
Mais particularmente, relaciona-se com um método de doseamento electroquimico em que uma substância a ser doseada ou um analito numa amostra liquida é doseado utilizando um sistema compreendendo pelo menos uma enzima de oxidação-redução, um eléctrodo e um mediador de electrões especificado, tal como um doseamento com eléctrodo enzimático, um doseamento de ligações especificas ou um método semelhante, e com um composto novo de p-fenilenodiamina que é aplicável no método de doseamento electroquimico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Num doseamento com eléctrodo enzimático, uma substância química de interesse é doseada selectivamente utilizando a capacidade de reconhecimento de moléculas pela enzima correspondente, geralmente utilizando um aparelho compreendendo uma membrana com enzima imobilizada e um eléctrodo. No campo dos métodos de doseamento bioquímicos, foram desenvolvidos métodos simples e rápidos utilizando sensores enzimáticos e outros semelhantes e que já foram descritos por exemplo na JP-B 02-59424 (o termo "JP-B" tal como aqui usado significa "publicação da patente Japonesa examinada"), JP-A 60-17346 (o termo "JP-A" 1 tal como aqui usado significa "publicação da patente Japonesa não examinada"), e JP-A 60-17347.
Existe um número de métodos de doseamento de ligação especifica conhecidos tais como um imunoensaio em que é utilizada uma reacção antigénio-anticorpo, um doseamento de receptores em que é utilizado um receptor e um doseamento com sonda de ácido nucleico em que é utilizada a hibridação de sequências de ácidos nucleicos complementares. Devido à especificidade elevada, estes métodos de doseamento são usados frequentemente em diversos campos incluindo a química clinica e outros semelhantes.
Por outro lado, foram feitas muitas tentativas para aplicar sensores electroquimicos ao doseamnto de ligações específicas. Por exemplo, a JP-A 58-58467 descreve uma reacção de ligação específica à superfície de um eléctrodo ao qual é aplicada uma preparação de enzima (catalase)-anticorpo marcado, a JP-A 2-179461 descreve uma reacção de ligação específica competitiva à superfície de um eléctrodo em que foi aplicada uma enzima (gluxose oxidase)-substância marcada e a JP-A 60-17360 descreve uma reacção de ligação específica que é realizada por utilização de uma enzima de oxidação-redução (glucose oxidase ou outras semelhantes) e um mediador de electrões (um derivado de ferroceno ou outros semelhantes). Técnicas semelhantes foram também descritas por exemplo na JP-A 3-25360, JP-A 60-127450, JP-A 60-242361, JP-A 63-139248, JP-W 61-500706 (o termo "JP-W" tal como aqui usado significa "tradução Japonesa publicada não examinada de pedido de patente internacional PCT"), Patente U.S. 4,963,245, Patente U.S. 5,066,372, Anal. Chem., vol. 56, páginas 2355-2360 (1984) e Clin. Chem., vol. 31, páginas 1449-1452 (1985).
Destes métodos com eléctrodos enzimáticos e métodos de doseamento de ligações específicas, um método com um eléctrodo 2
enzimático amperométrico, ura método de doseamento de ligações específicas auxiliado por um sensor electroquímico ou outros semelhantes utilizam um composto de peso molecular baixo, designado mediador de electrões, gue medeia entre uma reacção biológica de oxidação-redução tal como a de uma enzima e uma reacção num eléctrodo. Por outras palavras, o mediador de electrões é um composto que medeia a transferência de electrões entre uma reacção enzimática e uma reacção num eléctrodo num sistema de doseamento que compreende pelo menos uma enzima de oxidação-redução e um eléctrodo capaz de tranferir electrões para o sistema.
Esse mediador de electrões é "reduzido/oxidado" pela reacção enzimática e "oxidado/reduzido" pela reacção no eléctrodo. Por circulação entre estas duas reacções, medeia a transferência de electrões da reacção enzimática para a reacção no eléctrodo ou da reacção no eléctrodo para a reacção enzimática.
Devido a isto, esse mediador de electrões tem de ser um composto possuindo certas características tais como (1) é eficazmente oxidado ou reduzido pela reacção enzimática, (2) é oxidado ou reduzido pela reacção no eléctrodo e pode voltar a um estado que pode ser utilizado pela reacção enzimática, e (3) é estável quando oxidado ou reduzido pela enzima ou pela reacção no eléctrodo.
Além disso, o mediador de electrões que medeia a transferência de electrões entre as reacções enzimáticas e as reacções no eléctrodo deve ser oxidado ou reduzido a um potencial eléctrico dentro de uma gama mensurável do eléctrodo de trabalho. A gama mensurável de um eléctrodo varia dependendo dos tipos do eléctrodo e condições da solução. No caso de um 3
eléctrodo de carbono, pode ser geralmente desde -1,2 V até +1,0 V (vs. SCE).
Existe um grande número desses mediadores de electrões conhecidos na arte incluindo compostos orgânicos de metais tais como derivados de ferroceno e outros semelhantes (Patente Britânica 8132034), compostos inorgânicos tais como ferri(ou ferro)cianeto de potássio e outros semelhantes e compostos orgânicos tais como derivados de p-fenilenodiamina (PPD) e outros semelhantes.
Por exemplo, sabe-se que um derivado de p-fenilenodiamina (PPD), Ν,Ν,Ν',Ν'' -tetramet il -p- f enilenodiamina (TMPD), medeia a transferência de electrões entre um eléctrodo e sulfito oxidase que catalisa a oxidação de iões sulfito a iões sulfato (Anal. Chem., vol. 65, páginas 242-246, 1993). Além disso, a WO 92/07263 descreve um derivado de benzeno que tem um grupo amina, um grupo alquilamina, um grupo dialquilamina, um grupo morfolinilo ou um grupo piperidilo na posição 1,4, como um mediador de electrões cujo tipo reduzido é ligeiramente solúvel em água.
Por outro lado, a Ν,Ν,Ν',N'-tetraquis-(2'-hidroxietil)-p-fenilenodiamina (THEPD) e a N,N,N',N'-tetraquiscarboximetil-p-fenilenodiamina (TCPD) bem como outros derivados de PPD foram utilizados como materiais foto-sensiveis e agentes quelantes (Photographic Science and Engineering, vol. 6. noi, página 39, 1962; Nature, vol. 204, página 180, 1964; Z. Chem., vol. 4, ns 11, página 436, 1964; Z. Chem., vol. 4, ns 12, página 463, 1964; An. Quin. Ser. B, vol. 59, no 7-8, página 501, 1963; An. Quin. Ser. B, vol. 61, ns 5, página 717, 1965; An. Quin. Ser. B, vol. 61, nQ 5, página 723, 1965; An. Quin. Ser. B, vol. 59, ns 7-8, página 493, 1963; An. Quin. Ser. B, vol. 82, ηδ 2, página 133, 1986; Research Disclosure, vol. 212, página 428, 1981). Também é conhecido que a THEPD pode ser utilizada como agente corante de uma reacção de peroxidase, porque a sua reacção na presença de 4 peroxidase, um derivado de naftol e peróxido de hidrogénio resulta na formação de uma substância corada devida à ligação do seu radical livre ao derivado de naftol (EP 0 504 663). Contudo não se sabe se a THEPD e a TCPD podem funcionar como mediadores de electrões que têm as caracteristicas acima referidas.
Em relação com isto, uma vez que a principal utilização dos mediadores de electrões do estado da técnica é em métodos de doseamento assistidos por mediadores de electrões em eléctrodos enzimáticos, os mediadores de electrões preferidos são aqueles que são insolúveis ou ligeiramente solúveis em água tal como descrito na WO 92/07263 acima referida. Isto é, de forma a obter um sinal electroquimico estável através da mediação de transferência de electrões entre um eléctrodo e uma enzima de oxidação-redução imobilizada ou insolubilizada no eléctrodo, é necessário evitar a efusão do mediador de electrões para uma solução em volume da amostra a dosear, permitindo que o mediador exista próximo do eléctrodo.
Além disso, quando o mediador de electrões é um composto capaz de sofrer a influência de substâncias interferentes contidas nas amostras a dosear, tais como ácido ascórbico, ácido úrico, hemoglobina, oxigénio e outras semelhantes, é necessário evitar o seu contacto com as substâncias interferentes por conversão do mediador de electrões numa forma insolúvel em água e incluindo-o no seio do eléctrodo. Contudo, uma vez que o mediador de electrões está incluído no eléctrodo, este método tem desvantagens porque se o campo de reacção for limitado, só uma enzima capaz de contactar eficazmente com o mediador de electrões incluído dentro do eléctrodo pode participar na reacção e a intensidade do sinal geralmente torna-se fraca.
Recentemente, foram desenvolvidos "chips" de eléctrodos enzimáticos descartáveis em que é utilizado um mediador de electrões solúvel em água tal como ferricianeto de potássio ou outros semelhantes (cf. JP-A 1-156658). Uma vez que um mediador 5
de electrões solúvel em água pode mediar a transferência de electrões entre um eléctrodo e uma enzima localizada a uma certa distância do eléctrodo, aumenta o número de moléculas de enzima eficazes e torna-se possível o melhoramento das caracterlsticas do eléctrodo enzimático.
Outro exemplo deste tipo de mediador está descrito na EP 0 441 222, em que derivados de alanina com um grupo amina ligado a um anel fenilo são utilizados como mediadores de electrões que circulam entre uma enzima redox e um eléctrodo.
No caso desses "chips" de eléctrodos enzimáticos de tipo descartável, é desejável incorporar previamente componentes necessários para o funcionamento do eléctrodo dentro dos "chips" de forma a que a medição possa ser feita simplesmente por adição de uma amostra a dosear ao sistema de ensaio. Devido a isto, é desejável que esse mediador de electrões tenha uma solubilidade elevada em água, possa ser seco facilmente e seja estável no estado seco. Os mediadores de electrões solúveis em água de complexos de metais tais como um derivado de ferroceno, ferricianeto de potássio, um complexo de ósmio e outros semelhantes podem satisfazer estas condições nalguma medida. Contudo, sendo reduzidas na sua velocidade de transferência de electrões para ou da enzima, é necessário utilizar os mediadores de electrões numa grande quantidade. Além disso, uma vez que estes mediadores de electrões solúveis em água reagem nas soluções de amostras a dosear, são capazes de sofrer a influência de substâncias interferentes contidas nas amostras a dosear, tais como ácido ascórbico, ácido úrico, hemoglobina, oxigénio e outras semelhantes. Devido a isto, espera-se que seja desenvolvido um composto que sofra uma inflência menor por parte dessas substâncias interferentes.
Além do que se referiu acima, foi desenvolvido recentemente um método de ligação especifica, especialmente, Imunoensaio Controlado por Difusão de Mediador (daqui em diante 6 <^7
abreviado para método de doseamento MEDIA) em que é utilizada uma enzima de oxidação-redução como a substância marcadora, e as substâncias marcadoras são desenvolvidas numa matriz com uma amostra liquida para formar distribuições tendo distâncias diferentes de cada susbtância marcadora em relação ao eléctrodo através de uma reacção de ligação especifica de um analito na amostra liquida com uma substância de ligação especifica. As substâncias de sinal ou mediadores de electrões delas resultantes difundem-se para o eléctrodo e as difusões são o passo determinante da velocidade neste método de doseamento. As correntes das substâncias de sinal ou dos mediadores de electrões são medidas no eléctrodo para determinar a concentração do analito na amostra líquida. A distribuição de distâncias pode ser detectada pela corrente, e a corrente é correspondente à concentração do analito na amostra (cf. JP-A 5-264552 (EP 0 525 723 A2)). Esse tipo de método de doseamento também requer o desenvolvimento de um mediador de electrões que possa mediar a transferência estável de electrões entre a enzima e o eléctrodo em amostras líquidas tais como sangue, urina e outras semelhantes que contêm substâncias interferentes. É o objecto da presente invenção proporcionar um método de doseamento electroquímico para determinação de substâncias num líquido que ultrapasse os problemas de um campo de reacção limitado, os requisitos de uma concentração muito elevada de mediador e a influência perturbadora de substâncias interferentes. O objectivo é resolvido por um método de doseamento electroquímico que compreende a determinação da substância a ser doseada em amostras líquidas utilizando pelo menos uma enzima de oxidação-redução, em que uma enzima de oxidação-redução, um mediador de electrões e um eléctrodo capaz de realizar a transferência de electrões com o referido mediador de electrões são dispostos no doseamento, e é utilizado um composto 7 representado pela seguinte fórmula (I) ou seu sal como o mediador de electrões:
em que R1, R2, R3 e R4 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros e cada um representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condição de que pelo menos um de R1, R2, R3 e R4 tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo.
Assim, a presente invenção contempla a ultrapassagem dos problemas anteriormente referidos envolvidos no estado da técnica, proporcionando deste modo um método de doseamento electroquimico em que é utilizado um mediador de electrões solúvel em água, tal como um método com eléctrodo enzimático ou um método de doseamento de ligações especificas, por exemplo o método MEDIA, que tem excelente sensibilidade de detecção (responsividade), pode realizar medições de forma estável com reprodutibilidade elevada mesmo no caso de sangue, urina e amostras semelhantes que contêm substâncias interferentes e pode ser adequadamente aplicado para utilização em quimica não em solução, bem como um novo composto de p-fenilenodiamina que é utilizado como um mediador de electrões no método de doseamento.
Num método de doseamento em que é utilizado um mediador de electrões, mais particularmente um método de doseamento em que uma substância a ser doseada numa amostra liquida é determinada quantitivamente utilizando um eléctrodo e pelo menos uma enzima
de oxidação-redução, são utilizadas as seguintes enzimas de oxidação-redução como exemplos tipicos. (1) Oxidases
Estas enzimas contêm uma coenzima flavina, um átomo de metal, um heme ou outro semelhante e utilizam oxigénio como o aceitador de electrões nos organismos vivos.
Exemplos: glucose oxidase, amino-ácido oxidase, lactato oxidase, urato oxidase, xantina oxidase, ascorbato oxidase e outras semelhantes. (2) Hidroperoxidases
Nos organismos vivos, utilizam peróxido de hidrogénio como o aceitador.
Exemplos: peroxidase, catalase e outras semelhantes. (3) Desidrogenases
Nos organismos vivos, utilizam NAD(H) ou NADP(H) como o aceitador (ou doador).
Exemplos: álcool desidrogenase, lactato desidrogenase e outras semelhantes.
Destas enzimas de oxidação-redução, a glucose oxidase (GOD) é utilizada em eléctrodos enzimáticos para a medição do nível de glucose no sangue e a peroxidase de rábano (HRPO) é utilizada como uma enzima marcadora num doseamento de ligações específicas tais como hibridação de DNA, imunoensaio e outros semelhantes. De acordo com experiências realizadas pelos presentes inventores, ambas a glucose oxidase e a peroxidase de rábano mostraram uma resposta de corrente superior num tampão quando se utilizava como mediador de electrões hidroguinona (HQ)/benzoquinona (BQ), em comparação com a utilização de mediadores de electrões convencionais tais como derivados de ferroceno, iões inorgânicos, complexos de metais e outros semelhantes. Contudo estes mediadores de electrões não foram capazes de mostrar uma resposta estável e reprodutível na 9
presença de sangue, urina e outros semelhantes devido às substâncias interferentes neles contidas.
Observou-se interferência semelhante na presença de sangue, urina e outros semelhantes no caso de mediadores derivados de p-f enilenodiamina (PPD) tais como PPD, TMPD, N,N,N',N' -tetraetil-p-fenilenodiamina (TEPD) e outros semelhantes que apresentam resposta excelente em solução tampão.
Além disso, os presentes inventores tentaram preparar "chips" do tipo de química não em solução por impregnação de um pedaço de papel de filtro de celulose ou papel de filtro de fibra de vidro com uma solução de HQ, PPD, TMPD ou TEPD e secando o pedaço resultante num eléctrodo (por liofilização, secagem sob vácuo, secagem ao ar ou outras semelhantes) ou dispondo-o num eléctrodo após secagem de modo a que o mediador de electrões impregnado pudesse dissolver-se numa amostra líquida na altura do doseamento. Estes "chips", contudo, mostraram uma resposta de corrente baixa e características extremamente fracas.
Resultados de estudos aprofundados realizados pelos presentes inventores indicaram os seguintes problemas como a causa principal desses fenómenos: (1) baixa solubilidade em água do tipo oxidado ou reduzido do composto a ser utilizado como o mediador de electrões, (2) fraca estabilidade após secagem do composto a ser utilizado como o mediador de electrões devido à sua tensão de vapor elevada, e (3) fraca estabilidade em amostras biológicas tais como sangue ou urina do tipo oxidado (ou estado radicalar) ou tipo reduzido do composto a ser utilizado como mediador de electrões. 10
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Com o objectivo de ultrapassar os problemas anteriormente referidos envolvidos no estado da técnica, os inventores da presente invenção realizaram estudos aprofundados e verificaram como resultado que um sistema de doseamento consistindo numa enzima de oxidação-redução, um mediador de electrões que transfere electrões produzidos pela enzima de oxidação-redução e um eléctrodo capaz de realizar a transferência de electrões entre a enzima e o mediador de electrões pode ser utilizado adequadamente para o doseamento de vários componentes biológicos quando um composto representado pela seguinte fórmula [I], fórmula [II] ou seus sais é utilizado como o mediador de electrões.
Por outras palavras, os presentes inventores verificaram que como resultado dos estudos aprofundados que o composto de fórmula [I], fórmula [II] ou um sal deles derivado apresenta caracteristicas excelentes em doseamentos electroquimicos tais como um método com eléctrodo enzimático, um método de doseamento de ligações especificas, por exemplo um método MEDIA, e outros semelhantes; por exemplo, actua como um mediador de electrões excelente e é altamente solúvel em água; pode ser seco (por liofilização, secagem sob vácuo, secagem ao ar ou outras semelhantes) facilmente e é estável no estado seco; apresenta uma velocidade de transferência de electrões elevada com enzimas; e actua como um mediador de electrões que praticamente não sofre influência por parte de substâncias interferentes contidas em amostras a dosear tais como sangue, urina e outras semelhantes. A presente invenção foi realizada com base nestas constatações.
Assim, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um método de doseamento electroquimico que compreende medir uma substância a ser doseada em amostras líquidas utilizando pelo menos uma enzima de oxidação-redução, em que uma enzima de 11
oxidação-redução, um mediador de electrões e um eléctrodo capaz de efectuar a transferência de electrões com o mediador de electrões são dispostos num sistema de doseamento, e um composto representado pela seguinte fórmula [I], fórmula [II] ou um sal seu derivado é utilizado como o mediador de electrões: fórmula [I]
R
R \ if'
[I]
em que R3, r2, R3 e R4 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros e cada um representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condições de que pelo menos um de r1, R2, R3 e R4 tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo.
Em que, pelo menos um seleccionado do grupo que consiste em R1, R2, R3 e R4 preferencialmente tem um grupo hidroxilo ou um grupo carboxilo.
Especialmente, o composto representado pela fórmula [I] é pelo menos um composto seleccionado do grupo que consiste em: 12
TCPD
13 [II] fórmula [II] R6 R5> em que R^, r6, r7 e r8 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros e cada um representa um hidrogénio, grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condições de que pelo menos um de R5, R^, r7 e R8 é um grupo alquilo que tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo, e pelo menos um de R^, R8, r7 e R8 é hidrogénio.
Em que, o referido pelo menos um seleccionado do grupo que consiste em R^, r6, r7 e R8 preferencialmente tem um grupo hidroxilo.
Especialmente, o composto representado pela fórmula [II] é pelo menos um composto seleccionado do grupo que consiste em:
BHPD HPPD TRHPPD
Preferencialmente, a substância a ser doseada é um substrato, um inibidor, um cofactor ou um activador da enzima de 14
oxidação-redução, e é detectada uma modulação da reacção enzimática produzida em resposta à quantidade de substrato, de inibidor, de cofactor ou de activador como uma modulação de sinais electroquímicos no eléctrodo. É preferível medir a substância a ser doseada por meio de um doseamento de ligação específica utilizando a enzima de oxidação-redução como um marcador e pelo menos uma substância de ligação específica para a substância a ser doseada.
Também é preferível medir a substância a ser doseada por um método MÍDIA realizando o método de doseamento electroquímico por utilização de um dispositivo compreendendo uma matriz como uma área onde uma amostra líquida presumivelmente contendo a substância a dosear é desenvolvida, um dispositivo para introdução da amostra a partir do qual uma amostra é introduzida na matriz e um eléctrodo adjacente à matriz, introduzindo a amostra no dispositivo para introdução da amostra para permitir que a substância a ser doseada na amostra reaja na matriz com uma primeira substância de ligação específica e uma segunda substância de ligação específica que é marcada com uma enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de transferência de electrões que produz um sinal na porção do eléctrodo, ou introduzindo a amostra na matriz depois de ter permitido que a substância a dosear na amostra reaja numa área exterior da matriz com uma primeira substância de ligação específica e uma segunda substância de ligação específica que é marcada com uma enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de transferência de electrões que produz um sinal na porção do eléctrodo, efectuando assim alterações na distribuição de pelo menos uma espécie molecular entre um complexo da segunda substância de ligação específica marcada com a enzima de oxidação-redução e a substância a ser doseada, um complexo da segunda substância de ligação específica marcada com a enzima de oxidação-redução, a substância a ser doseada e a primeira substância de ligação específica e uma forma livre da segunda 15
substância de ligação especifica marcada com a enzima de oxidação-redução, e detectando as alterações na distribuição em resposta à quantidade da substância a ser doseada na amostra como uma modulação de sinal no eléctrodo, que é limitada pela transferência de massa da espécie de transferência de electrões produzida pela enzima de oxidação-redução.
Também é preferível medir a substância a ser doseada por outro método MÍDIA realizando o método de doseamento electroquímico por utilização de um dispositivo compreendendo uma matriz como uma área em que uma amostra liquida presumivelmente contendo a substância a ser doseada é desenvolvida, um dispositivo para a introdução da amostra a partir do qual a amostra é introduzida na matriz e um eléctrodo adjacente à matriz em que cada uma de uma substância de ligação especifica especifica para a substância a ser doseada e uma substância que compete com a substância a ser doseada pela substância de ligação especifica é marcada com a enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de transferência de electrões que produz um sinal na porção do eléctrodo, introduzindo a amostra no dispositivo para introdução de amostras para permitir que a substância a ser doseada na amostra reaja na matriz de modo competitivo com a substância de ligação específica ou com a substância que compete com a substância a ser doseada para a substância de ligação específica, ou introduzindo uma amostra na matriz depois de deixar que a substância a ser doseada na amostra reaja numa área externa da matriz de modo competitivo com a substância de ligação específica ou com a substância que compete com a substância a ser doseada para a substância de ligação específica, efectuando assim alterações na distribuição de pelo menos uma espécie molecular marcada com enzima de oxidação-redução entre um complexo da substância de ligação específica e a substância a ser doseada, um complexo da substância de ligação específica e a substância que compete com a substância a ser doseada para a substância de ligação específica, uma forma livre da substância 16
de ligação especifica e uma forma livre da substância que compete com a substância a ser doseada para a substância de ligação específica, e detectando as alterações de distribuição em resposta à quantidade da substância a ser doseada na amostra como uma modulação de sinal no eléctrodo, que é limitada pela transferência de massa da espécie de transferência de electrões produzida pela enzima de oxidação-redução.
Outros objectos e vantagens da presente invenção serão evidenciados à medida que prossegue a descrição.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As Fig. 1 (a) e (b) são desenhos conceptuais que ilustram respectivamente acções do mediador de electrões. A Fig. 2 é uma ilustração em perspectiva geral aumentada de um exemplo do dispositivo de doseamento (de ligação específica) para utilização na prática do método de doseamento electroquímico da presente invenção. A Fig. 3 é um desenho conceptual ilustrando uma secção da montagem do dispositivo de doseamento (de ligação específica) ilustrado na Fig. 2. A Fig. 4 é uma ilustração apresentando uma vista geral em planta da porção de eléctrodo do dispositivo de doseamento (de ligação específica) ilustrado na Fig. 2. A Fig. 5 é um gráfico que mostra as tensões de vapor de TEPD e de THEPD. A Fig. 6 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de TEPD. 17 ®~7
A Fig. 7 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de TEPD. A Fig. 8 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de TCPD. A Fig. 9 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de TCPD. A Fig. 10 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de THEPD. A Fig. 11 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de THEPD. A Fig. 12 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de TDHPD. A Fig. 13 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de TDHPD. A Fig. 14 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de TEPD. A Fig. 15 é um gráfico que mostra a actividade de trans ferênc ia de electrões de TCPD. A Fig. 16 é um gráfico que mostra a actividade de trans ferênc ia de electrões de THEPD. A Fig. 17 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de TDHPD. A Fig. 18 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de TEPD. 18
19 é um gráfico que mostra outro exemplo da transferência de electrões de TCPD. 20 é um gráfico que mostra outro exemplo da transferência de electrões de THEPD. 21 é um gráfico que mostra outro exemplo da transferência de electrões de TDHPD. 22 é um gráfico que mostra o resultado do A Fig. actividade de A Fig. actividade de A Fig. actividade de A Fig. doseamento de um exemplo da invenção realizado utilizando o mediador de electrões da presente invenção. A Fig. 23 é um gráfico que mostra o resultado do doseamento de um exemplo comparativo realizado utilizando um mediador de electrões convencional. A Fig. 24 é um gráfico que mostra as tensões de vapor de PPD, THPD, TEPD, TCPD, THEPD e TDHPD a 25°C. A Fig. 25 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de HTEPD. A Fig. 26 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de HTEPD. A Fig. 27 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de N,N-BHDPD. A Fig. 28 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de N,N-BHDPD. 19
A Fig. 29 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de N,N'-BHDPD. A Fig. 30 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de N,N"-BHDPD. A Fig. 31 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo um grupo amina mono-substituído obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD). A Fig. 32 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo um grupo amina mono-substituído obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD). A Fig. 33 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo di-substituído um grupo amina ou dois grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 34 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo di-substituído um grupo amina ou dois grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 35 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo tri-substituído grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. 20
A Fig. 36 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo tri-substituldo grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 37 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de HTEPD. A Fig. 38 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de N,N-BHDPD. A Fig. 39 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de Ν,ΝΓ-BHDPD. A Fig. 40 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina com o grupo amina mono-substituido obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD). A Fig. 41 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina tendo di-substituido um grupo amina ou dois grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 42 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina tendo tri-substituído grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 4 3 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de HTEPD. A Fig. 4 4 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de N,N-BHDPD. 21 A Fig. 45 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de N,N'-BHDPD. A Fig. 4 6 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina com o grupo amina mono-substituido obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD). A Fig. 4 7 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina tendo di-substituido um grupo amina ou dois grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 4 8 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina tendo tri-substituido grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno.
Nestas figuras, as partes do dispositivo de doseamento estão indicadas pelos caracteres seguintes: 10, uma cobertura superior; 10a, um orifício para introdução da amostra; 12, um filtro; 14, um componente impregnado com marcador; 16, um componente impregnado com mediador de electrões; 16a e 24a, dispositivos de selagem; 18, dispositivo de comunicação; 20, uma porção do eléctrodo; 22, uma matriz; 24, dispositivos de absorção; 26, um suporte inferior; 28, um suporte; 30, um orifício de passagem; 32, um eléctrodo de referência; 34, um eléctrodo de trabalho; 36, dispositivos de isolamento; e 38, dispositivos para introdução da amostra.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO O método de doseamento electroquímico da presente invenção e o composto novo de p-fenilenodiamina que pode ser utilizado no método de doseamento são descritos a seguir em pormenor. 22
Como descrito anteriormente, o método de doseamento electroquimico (daqui em diante designado como "método de doseamento") da presente invenção contém no seu sistema de doseamento pelo menos uma enzima de oxidação-redução, um mediador de electrões e um eléctrodo capaz de efectuarem a transferência de electrões com o mediador de electrões, e utiliza como o mediador de electrões um composto representado pela fórmula [I] ou [II] seguinte ou um seu sal:
em que cada de R1, R2, R3 e R4 independentemente representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condição de que pelo menos um de R*, R2, R3 e R4 tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo, em que R5, R6, R7 e R3 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros e cada um representa hidrogénio, um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condição de que pelo menos 23
um de r5, r6, r7 e R^ é um grupo alquilo que tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo, e pelo menos um de R5, R6, R7 e R8 é hidrogénio.
Em resultado dos estudos aprofundados realizados, os presentes inventores verificaram pela primeira vez que o composto representado pela fórmula [I] ou [II] acima funciona excelentemente como um mediador de electrões no método electroquimico. Verificou-se também que, quando pelo menos um de R1 a R8 do composto de fórmula [I] ou [II] tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo, o composto resultante apresenta uma tensão de vapor baixa e torna-se altamente solúvel em água de modo que pode ser seco (por liofilização, por secagem sob vácuo, ao ar ou outras semelhantes) facilmente, torna-se estável em condições secas e dissolve-se rapidamente numa amostra liquida adicionada para exibir uma resposta excelente. Por outras palavras, verificou-se que este composto tem as caracteristicas excelentes requeridas para mediadores de electrões; por exemplo, pode ser aplicado adequadamente em utilizações de química não em solução por impregnação de materiais porosos tais como vários tipos de papel de filtro e outros semelhantes com o composto e secando o material resultante; pode reduzir as interferências provocadas por substâncias interferentes contidas em amostras de ensaio tais como sangue, urina e outras semelhantes; e apresenta uma excelente resposta de corrente eléctrica devido à pequena perturbação na sua reacção electrónica com enzimas.
Em consequência, de acordo com o método de doseamento da presente invenção em que o composto da anteriormente referida fórmula [I] ou [II] é utilizado como o mediador de electrões, a sua sensibilidade à detecção (responsividade) é excelente, pode ser aplicado adequadamente para utilização descartável e podem ser feitas medições constantemente com boa reprodutibilidade 24
mesmo no caso de sangue, urina e amostras semelhantes que contêm substâncias interferentes.
Em relação a R1, R2, R3 e R4 do composto de fórmula [I], podem ser utilizados todos os grupos conhecidos que satisfazem os requisitos anteriormente referidos, incluindo seus exemplos ilustrativos metilo, etilo, propilo, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1,2-dihidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-(l-hidroxi)propilo, 2,3-dihidroxipropilo, 2-(1,3-dihidroxi)propilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, mercaptometilo, carboximetilo, fosfonooximetilo, sulfometilo e grupos semelhantes, de que são particularmente preferidos hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-(1-hidroxi)propilo, 2,3-dihidroxipropilo, carboximetilo, e grupos semelhantes.
Neste caso, os grupos r1, r2, R3 e R4 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros.
Em relação a R^, r6, r7 e R^ do compostos de fórmula [II], podem ser utilizados todos os grupos conhecidos que satisfazem os requisitos anteriormente referidos, incluindo seus exemplos ilustrativos hidrogénio, metilo, etilo, propilo, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1,2-dihidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-(l-hidroxi)propilo, 2,3-dihidroxipropilo, 2-(1,3-dihidroxi)propilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, mercaptometilo, carboximetilo, fosfonooximetilo, sulfometilo e grupos semelhantes, de que são particularmente preferidos hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-(l-hidroxi)propilo, 2,3-dihidroxipropilo, carboximetilo, e grupos semelhantes. 25
Neste caso, os grupos R5, R6, R7 e R8 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros, mas pelo menos um deles é um grupo alquilo e pelo menos um deles é hidrogénio.
Os compostos seguintes são exemplos ilustrativos do composto de fórmula [I] ou [II] a serem utilizados no método de doseamento da presente invenção. / 26 de ligação especifica e uma forma livre da substância que compete com a substância a ser doseada para a substância de ligação específica, e detectando as alterações de distribuição em resposta à quantidade da substância a ser doseada na amostra como uma modulação de sinal no eléctrodo, que é limitada pela transferência de massa da espécie de transferência de electrões produzida pela enzima de oxidação-redução.
Outros objectos e vantagens da presente invenção serão evidenciados à medida que prossegue a descrição.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As Fig. 1 (a) e (b) são desenhos conceptuais que ilustram respectivamente acções do mediador de electrões. A Fig. 2 é uma ilustração em perspectiva geral aumentada de um exemplo do dispositivo de doseamento (de ligação específica) para utilização na prática do método de doseamento electroquímico da presente invenção. A Fig. 3 é um desenho conceptual ilustrando uma secção da montagem do dispositivo de doseamento (de ligação específica) ilustrado na Fig. 2. Â Fig. 4 é uma ilustração apresentando uma vista geral do plano de cima da porção de eléctroso do dispositivo de doseamento (de ligação específica) ilustrado na Fig. 2. A Fig. 5 é um gráfico que mostra as tensões de vapor de TEPD e de THEPD. A Fig. 6 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de TEPD. A Fig. 7 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de TEPD. 17
A Fig. 8 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de TCPD. A Fig. 9 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de TCPD. A Fig. 10 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de THEPD. A Fig. 11 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de THEPD. A Fig. 12 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de TDHPD. A Fig. 13 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de TDHPD. A Fig. 14 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de TEPD. A Fig. 15 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de TCPD. A Fig. 16 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de THEPD. A Fig. 17 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões de TDHPD. A Fig. 18 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de TEPD. A Fig. 19 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de TCPD. 18
ΊίΙ A Fig. 2 0 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de THEPD. A Fig. 21 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de TDHPD. A Fig. 22 é um gráfico que mostra o resultado do doseamento de um exemplo da invenção realizado utilizando o mediador de electrões da presente invenção. A Fig. 23 é um gráfico que mostra o resultado do doseamento de um exemplo comparativo realizado utilizando um mediador de electrões convencional. A Fig. 24 é um gráfico que mostra as tensões de vapor de PPD, THPD, TEPD, TCPD, THEPD e TDHPD a 25°C. A Fig. 25 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de HTEPD. A Fig. 26 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de HTEPD. A Fig. 27 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de N,N-BHDPD. A Fig. 28 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de N,N-BHDPD. A Fig. 29 é um gráfico que mostra a voltametria cíclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) de N,N"-BHDPD. 19 A Fig. 30 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) de N,N BHDPD. A Fig. 31 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo um grupo amina mono-substituido obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD). A Fig. 32 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo um grupo amina mono-substituido obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD). A Fig. 33 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo di-substituido um grupo amina ou dois grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 34 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo di-substituido um grupo amina ou dois grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 35 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -500 mV a +800 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo tri-substituido grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 36 é um gráfico que mostra a voltametria ciclica (gama de varrimento de potencial, -200 mV a +300 mV) do derivado de p-fenilenodiamina tendo tri-substituido grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. 20
a actividade de A Fig. 37 é um gráfico que mostra transferência de electrões de HTEPD. a actividade de A Fig. 38 é um gráfico que mostra transferência de electrões de N,N-BHDPD. a actividade de A Fig. 39 é um gráfico que mostra transferência de electrões de N,N'-BHDPD. a actividade de A Fig. 40 é um gráfico que mostra transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina com o grupo amina mono-substituido obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD). A Fig. 41 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina tendo di-substituido um grupo amina ou dois grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 42 é um gráfico que mostra a actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina tendo tri-substituido grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 43 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de HTEPD. A Fig. 4 4 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de Ν,Ν-BHDPD. A Fig. 45 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões de Ν,Ν'-BHDPD. A Fig. 4 6 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões do derivado de p- 21
fenilenodiamina com o grupo amina mono-substituido obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD). A Fig. 4 7 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina tendo di-substituido um grupo amina ou dois grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. A Fig. 4 8 é um gráfico que mostra outro exemplo da actividade de transferência de electrões do derivado de p-fenilenodiamina tendo tri-substituido grupos amina obtido da reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno.
Nestas figuras, as partes do dispositivo de doseamento estão indicadas pelos caracteres seguintes: 10, uma cobertura superior; 10a, um orifício para introdução da amostra; 12, um filtro; 14, um componente impregnado com marcador; 16, um componente impregnado com mediador de electrões; 16a e 24a, dispositivos de vedação; 18, um dispositivo de comunicação; 20, uma porção do eléctrodo; 22, uma matriz; 24, dispositivos de absorção; 26, um suporte inferior; 28, um suporte; 30, um orifício de passagem; 32, um eléctrodo de referência; 34, um eléctrodo de trabalho; 36, dispositivos de isolamento; e 38, dispositivos para introdução da amostra.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A seguir são descritos em pormenor o método de doseamento electroquimico da presente invenção e o composto novo de p-fenilenodiamina que pode ser utilizado no método de doseamento.
Como descrito anteriormente, o método de doseamento electroquímco (daqui em diante designado como "método de doseamento") da presente invenção contém no seu sistema de doseamento pelo menos uma enzima de oxidação-redução, uma 22
mediador de electrões e um eléctrodo capaz de efectuarem a transferência de electrões com o mediador de electrões, e utiliza como o mediador de electrões um composto representado pela fórmula [I] ou [II] seguinte ou um seu sal:
em que cada de r1, r2, r3 e R4 independentemente representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condição de que pelo menos um de r1, r2, r3 e R4 tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo, em que R^, r6, r7 e r8 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros e cada um representa hidrogénio, um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condição de que pelo menos um de r5, r6, r7 e R^ é um grupo alquilo que tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo, e pelo menos um de R5, R*>, r7 e r8 é hidrogénio. 23
Em resultado dos estudos aprofundados realizados, os presentes inventores verificaram pela primeira vez que o composto representado pela fórmula [I] ou [II] acima funciona excelentemente como um mediador de electrões no método electroquímico. Verificou-se também que, quando pelo menos um de r! a r8 do composto de fórmula [I] ou [II] tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo, o composto resultante apresenta uma tensão de vapor baixa e torna-se altamente solúvel em água de modo que pode ser seco (por liofilização, por secagem sob vácuo, ao ar ou outras semelhantes) facilmente, torna-se estável em condições secas e dissolve-se rapidamente numa amostra liquida adicionada para exibir uma resposta excelente. Por outras palavras, verificou-se que este composto tem as caracteristicas excelentes requeridas para mediadores de electrões; por exemplo, pode ser aplicado adequadamente em utilizações de química não em solução por impregnação de materiais porosos tais como vários tipos de papel de filtro e outros semelhantes com o composto e secando o material resultante; pode reduzir as interferências provocadas por substâncias interferentes contidas em amostras de ensaio tais como sangue, urina e outras semelhantes; e apresenta uma excelente resposta de corrente eléctrica devido à pequena perturbação na sua reacção electrónica com enzimas.
Em consequência, de acordo com o método de doseamento da presente invenção em que o composto da anteriormente referida fórmula [I] ou [II] é utilizado como o mediador de electrões, a sua sensibilidade à detecção (responsividade) é excelente, pode ser aplicado adequadamente para utilização descartável e podem ser feitas medições constantemente com boa reprodutibilidade mesmo no caso de sangue, urina e amostras semelhantes que contêm substâncias interferentes. 24
Em relação a R1, R2, R3 e R4 do composto de fórmula [I], podem ser utilizados todos os grupos conhecidos que satisfazem os requisitos anteriormente referidos, incluindo seus exemplos ilustrativos metilo, etilo, propilo, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1,2-dihidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2 — {1 — hidroxi)propilo, 2,3-dihidroxipropilo, 2-(1,3-dihidroxi)propilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, mercaptometilo, carboximetilo, fosfonooximetilo, sulfometilo e grupos semelhantes, de que são particularmente preferidos hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-(1-hidroxi)propilo, 2,3-dihidroxipropilo, carboximetilo, e grupos semelhantes.
Neste caso, os grupos r1, R2, R3 e R^ podem ser iguais ou diferentes uns dos outros.
Em relação a R5, R6, R7 e R8 do compostos de fórmula [II], podem ser utilizados todos os grupos conhecidos que satisfazem os requisitos anteriormente referidos, incluindo seus exemplos ilustrativos hidrogénio, metilo, etilo, propilo, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1,2-dihidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-(l-hidroxi)propilo, 2,3-dihidroxipropilo, 2-(1,3-dihidroxi)propilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, mercaptometilo, carboximetilo, fosfonooximetilo, sulfometilo e grupos semelhantes, de que são particularmente preferidos hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-(l-hidroxi)propilo, 2,3-dihidroxipropilo, carboximetilo, e grupos semelhantes.
Neste caso, os grupos R5, R6, R7 e R8 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros, mas pelo menos um deles é um grupo alquilo e pelo menos um deles é hidrogénio. 25 \
Os compostos seguintes são exemplos ilustrativos do composto de fórmula [I] ou [II] a serem utilizados no método de doseamento da presente invenção. 26 (2) (1) (3)
H02C^ C02 Η ΗΟ'^ν^ OH λ Λ 0HA oh V V OH V 0H HO'"'*^ OH H02Cvs/N>^.C02H HOs^A^N^^X^OH THEPD TCPD TDHPD (4) (5) (6) HO>. .OH OH OH ho^^oh hO-nA/OT 1 I A fhi [A V kJ v ho/%V'nV^s‘ oh HO^ ΌΗ T T .—.OH .I\L HO ^ HO y oh ΟΗ OH (7) (8) (9) I OH oh HO'^ ΐΆ" OH IST^ j 1 A rii rii V y y HO/Ss|^NvyXN‘ OH HOs^ OH Νγ/ OH OH (10) (11) (12) HQx^n-^°H I 1 A A A V V V ho/Ssv/N's^xoh T T HTEPD Ν,Ν-BHDPD 27 9 9 (13)
(14) (15) H03S^N^S03H (HO)2OPO^N^OPO(OH);
HO^v,___S03H (HO)2OPOsv/Nv^OPO(OH)2 Ν,Ν'-BHDPD (16) (17) (18)
HN'
OH
NH2 HPPD 28
(25) (26) (27)
OH HO' TRHPPD
OH
Dos compostos acima, compostos particularmente úteis incluem Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraquis(2 '-hidroxietil)-p-fenilenodiamina (THEPD) representada pela fórmula (1)/ Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraquiscarboximetil-p-fenilenodiamina (TCPD) representada pela fórmula (2), N,N',N'-tetraquis(2',3'-dihidroxipropil)-p-fenilenodiamina (TDHPD) representada pela fórmula (3), N-2'-hidroxietil-Ν,Ν',N '-trietil-p-fenilenodiamina ( HTEPD) representada pela fórmula (11), N,N-bis-(2'-hidroxietil)-N,N'-dietil-p-fenilenodiamina (N,N-BHPD) representada pela fórmula (12), Ν,Ν'-bis-(2'-hidroxietil)-N,N'-dietil-p-fenilenodiamina (N,N' -BHPD) representada pela fórmula (13), e outras semelhantes. E de entre os referidos acima, compostos particularmente úteis incluem N,N'-bis-(2'-hidroxietil)-p-fenilenodiamina (N,N'~ BHPD) representada pela fórmula (21), N-2'-hidroxipropil-p-fenilenodiamina (HPPD) representada pela fórmula (24) e outras semelhantes.
Além disso, compostos particularmente úteis são representados pelas Fórmulas seguintes. 29
Estes mediadores de electrões representados pela fórmula [I] ou [II] podem ser sintetizados de acordo com vários métodos conhecidos. Por exemplo, um composto de interesse pode ser obtido por dissolução de p-fenilenodiamina e um halogeneto de um composto que corresponde a rI, r2, r3, r4^ r5^ r6, r? e R8 num 30
álcool ou solvente semelhante, aquecendo a solução a refluxo para realizar a reacção, e depois separando e purificando o composto assim obtido por filtração, cromatografia em coluna e outros meios semelhantes. Além disso, um composto com um grupo hidroxilo no átomo de carbono em posição 2 de R1 a R8 pode ser sintetizado por dissolução de p-fenilenodiamina e um derivado de óxido de etileno num solvente, aquecendo a solução a refluxo para realizar a reacção, e depois separando e purificando o composto de interesse assim obtido por filtração, cromatografia em coluna e outros meios semelhantes.
No método de doseamento da presente invenção, também podem ser adequadamente utilizados sais do mediador de electrões de fórmula [I] ou [II]. Exemplos ilustrativos desses sais incluem cloridrato, nitrato, sulfato, perclorato, p-toluenossulfonato e outros semelhantes. Além disso, quando o mediador de electrões de fórmula [I] ou [II] contém um ou mais grupos seleccionados da classe que consiste em grupo carboxilo, grupo fosfonooxi e grupo sulfo, o seu sal de sódio, sal de potássio e outros semelhantes podem ser adequadamente utilizados. Especialmente, podem ser utilizados adequadamente o cloridrato de THEPD, o cloridrato de TCPD, o cloridrato de TDHPH e outros semelhantes. 0 mediador de electrões representado pela fórmula [I] ou [II] é oxidado ou reduzido por uma enzima de oxidação-redução ou um eléctrodo e convertido numa espécie de transferência de electrões de estado oxidado ou reduzido. Quando uma espécie de transferência de electrões de estado oxidado é formada pela reacção de oxidação-redução da enzima de oxidação-redução, a espécie de transferência de electrões de estado oxidado assim formada é novamente transformada no seu estado reduzido por uma reacção no eléctrodo enquanto que a corrente de redução é detectada como um sinal no eléctrodo (cf. Fig. 1 (a)). Por outro lado, quando uma espécie de transferência de electrões de estado reduzido é formada pela reacção de oxidação-redução da enzima de oxidação-redução, a espécie de transferência de electrões de 31
estado reduzido assim formada é novamente transformada no seu estado oxidado por uma reacção no eléctrodo enquanto que a corrente de oxidação é detectada como um sinal no eléctrodo (cf. Fig. 1 (b)). Por outras palavras, pode obter-se um efeito semelhante pelo método de doseamento da presente invenção quando a reacção é iniciada a partir da espécie de transferência de electrões quer no estado oxidado quer no reduzido como ilustrado na Fig. 1 (a) e (b). Em consequência, o mediador de electrões de fórmula [I] ou [II] inclui uma espécie de transferência de electrões que é um estado oxidado do mediador e outra espécie de transferência de electrões que é um estado reduzido do mediador.
Em conformidade com o método de doseamento da presente invenção, a quantidade de mediador de electrões de fórmula [I] ou [II] a ser utilizada não é particularmente limitada e pode ser decidida dependendo do tipo, quantidade e outros factores semelhantes do eléctrodo a ser utilizado, da enzima de oxidação-redução e da substância a ser doseada.
Além disso, em conformidade com o método de doseamento da presente invenção, o mediador de electrões de fórmula [I] ou [II] pode ser utilizado em várias condições. Por exemplo, o mediador pode ser utilizado por um método em que é directamente dissolvido ou misturado com o sistema de dosamento, um método em que é seco ou liofilizado e depois dissolvido na altura da medição, um método em que está contido numa pasta de eléctrodo ou num método em que é dissolvido num tampão e outros semelhantes, embebido num papel de filtro que é subsequentemente seco e depois dissolvido de novo numa solução da amostra ou outro semelhante na altura da medição. Em cada um destes casos, pode ser realizado um doseamento electroquimico excelente devido à excelente solubilidade em água, capacidade de secagem, estabilidade à secura e responsividade de corrente eléctrica do mediador de electrões, bem como à fraca influência de substâncias interferentes nas amostras de teste. 32
No método de doseamento da presente invenção, é realizada uma medição electroguímica utilizando pelo menos uma enzima de oxidação-redução. A enzima de oxidação-redução a ser utilizada na presente invenção não é particularmente limitada e podem ser seleccionadas e utilizadas várias enzimas de oxidação-redução dependendo do tipo de substância a ser doseada e de outras condições. Exemplos ilustrativos dessas enzimas incluem glucose oxidase, peroxidase tal como peroxidase de rábano, galatose oxidase, amino-ácido oxidase, NAD(P) oxidase, lactato oxidase, piruvato oxidase, álcool oxidase, urato oxidase, colesterol oxidase, colina oxidase, xantina oxidase, nucleosido oxidase, ascorbato oxidase, diaforase e outras semelhantes. Destas, são preferencialmente utilizadas a glucose oxidase para utilização na medição do nivel de glucose no sangue e a peroxidase de rábano como enzima de marcação para utilização em doseamentos de ligações especificas. A quantidade da enzima de oxidação-redução a ser utilizada não é particularmente limitada e pode ser decidida à vontade dependendo do tipo, da quantidade e outras semelhantes do eléctrodo utilizado, do mediador de electrões e da substância a ser doseada.
No método de doseamento da presente invenção podem ser utilizados vários eléctrodos correntemente utilizados em doseamentos electroquímicos tais como métodos com eléctrodos enzimáticos, métodos de doseamento de ligações especificas e outros semelhantes. Exemplos ilustrativos desses eléctrodos incluem eléctrodos de carbono tais como eléctrodo de carbono vitreo, eléctrodo de grafite pirolítica, eléctrodo de pasta de carbono, eléctrodo de fibra de carbono e outros semelhantes, eléctrodos condutores transparentes tais como eléctrodo de platina, eléctrodo de ouro, eléctrodo ITO e outros semelhantes, eléctrodos de óxidos tais como os de T1O2 e outros semelhantes, e eléctrodos modificados que são modificados com compostos funcionais. No método de doseamento da presente invenção, um elétrodo produzido por impressão de um padrão num substrato por impressão a tela ou outra semelhante utilizado uma tinta de 33
carbono condutora é utilizado mais preferencialmente devido à sua aplicabilidade alargada. A forma do eléctrodo (eléctrodo plano, eléctrodo poroso ou outros semelhantes) e o seu tamanho não são particularmente limitados e podem ser decididos dependendo por exemplo do tipo e da quantidade de cada substância a ser doseada, quantidade e caracteristicas (viscosidade e outras semelhantes por exemplo) de cada amostra a dosear e objectivo e condições do doseamento. 0 método de doseamento da presente invenção que é realizado utilizando um sistema que consiste numa tal enzima de oxidação-redução, mediador de electrões e eléctrodo pode ser basicamente aplicado adequadamente a vários doseamentos electroquimicos conhecidos tais como métodos com eléctrodo enzimático, métodos de doseamento de ligações especificas e outros semelhantes. Por exemplo, pode ser aplicado a sensores enzimáticos de tipo amperométrico, imunossensores, sensores de ácidos nucleicos e outros semelhantes. Mais particularmente, pode ser aplicado na medição de por exemplo: glucose no sangue, colesterol, ácido úrico, ácido láctico e outros semelhantes utilizando sensores enzimáticos; várias hormonas tais como gonadotropina coriónia humana (hCG), hormona luteinizante (LH), lactogéneo de placenta humana (hPL), estrogénios e outros semelhantes utilizando métodos de doseamento de ligações específicas; vários antigénios e anticorpos relacionados com vírus tais como o anticorpo de HBs, o antigénio de HBs, o anticorpo de HBc, o antigénio de HBe, o anticorpo de HCV, o anticorpo de HIV e outros semelhantes; anticorpos específicos de IgE para vários alergenos; marcadores tumorais de AFP, CEA e outros semelhantes; várias proteínas no sangue e fármacos tais como β2πι, CRP e outros semelhantes e seus produtos metabólicos; e sequências de polinucleotidos relacionadas com vírus e com tumores. 34
De acordo com o método de doseamento da presente invenção, vários doseamentos electroquímicos conhecidos tais como métodos com eléctrodos enzimáticos, métodos de doseamento de ligações especificas e outros semelhantes podem ser realizados da mesma maneira que nos métodos de doseamento convencionais. Tirando partida da propriedade de solubilidade em água excelente, estabilidade no estado seco e outras semelhantes do mediador de electrões de fórmula [I] ou [II], o método de doseamento da presente invenção pode ser aplicado mais adequadamente a um dispositivo de doseamento dè tipo de química não em solução em que um pedaço de papel de filtro de celulose, papel de filtro de fibra de vidro ou outro semelhante é impregnado com uma solução do mediador de electrões e depois seco para preparar uma peça de doseamento, e o mediador de electrões assim impregnado é dissolvido por uma amostra liquida na altura da medição permitindo assim que o mediador se difunda e migre numa matriz de tal modo que actua como uma substância que transfere electrões a serem utilizados como um sinal. A Fig. 2 ilustra o dispositivo de doseamento de ligações específicas do tipo de química não em solução para utilização na prática do método de doseamento da presente invenção, por exemplo um método MEDIA. Em relação com isto, as partes que compõem o dispositivo e os métodos de doseamento que utilizam o dispositivo estão descritos em pormenor na EP 0 525 723 A2 (USSN 243095) que é portanto aqui dada como incorporada por citação. 0 dispostivo de doseamento ilustrado na Fig. 2 é constituído por, a contar da sua parte superior, por uma cobertura superior 10, um filtro 12, um componente impregnado com anticorpo marcado 14, um componente impregnado com mediador de electrões 16, um dispositivo de comunicação 18, uma porção de eléctrodo 20, uma matriz 22, um dispositivo de absorção 24 e um suporte inferior 26, e estas partes estão colocadas umas sobre as outras de forma a constituir uma combinação ilustrada na Fig. 3. O dispositivo para introdução de amostras 38 é construído 35
pelo filtro 12, o componente impregnado com anticorpo marcado 14, o componente impregnado com mediador de electrões 16 e o dispositivo de comunicação 18. Neste contexto, os dispositivos de doseamento para utilização no método de doseamento da presente invenção não estão limitados àqueles que contêm todos estes componentes, e também podem ser utilizadas as construções descritas na EP 0 525 723 A2 (USSN 243095) anteriormente referida, que portanto aqui são dadas como incorporadas por citação. A cobertura superior 10 é formada por várias resinas sintéticas tais como resinas acrílicas, poli(cloreto de vinilo), poliestireno, resina ABS, resina epoxi e outras semelhantes, bem como fibras de vidro, e a sua parte central tem um orifício para introdução da amostra 10a a partir do qual a amostra é injectada. O filtro 12, geralmente formado por tecido tecido ou não-tecido, é utilizado para retirar materiais sólidos desnecessários (substâncias interferentes) contidas nas amostras e simultaneamente realizar a introdução uniforme da amostra. O componente impregnado com anticorpo marcado 14 é preparado por impregnação de um pedaço de papel de filtro de fibra de vidro, papel de filtro de fibra de celulose, tecido não-tecido ou outro semelhante com uma solução de um anticorpo marcado com enzima de oxidação-redução que é um dos elementos componentes da presente invenção, e secando o pedaço impregnado. Isto é, quando a amostra é passada através do componente impregnado com o anticorpo marcado 14, o anticorpo marcado com enzima de oxidação-redução é eluído do componente e mistura-se com a substância a ser doseada, ou a reacção tem início. O componente impregnado com mediador de electrões 16 é preparado por impregnação de um pedaço de papel de filtro de fibra de vidro, papel de filtro de fibra de celulose, tecido 36
não-tecido ou outro semelhante com uma solução de um mediador de electrões que é um elemento característico da presente invenção, e secando o pedaço impregnado. Isto é, quando a amostra é passada através do componente impregnado com o mediador de electrões 16, o mediador de electrões é eluido do componente e mistura-se com a amostra. Tal como descrito anteriormente, uma vez que o composto de fórmula [I] ou [II] é utilizado como o mediador de electrões no método de doseamento da presente invenção, o mediador de electrões tem uma excelente propriedade e estabilidade no estado seco e é eluido e misturado rapidamente.
Como forma preferida do dispositivo de doseamento, é formado na porção central superior do componente impregnado com mediador de electrões 16 um dispositivo de vedação 16a através do qual a água não pode passar. Pela disposição deste dispositivo de vedação 16a, pode ser realizado um doseamento mais exacto, porque o caudal vertical da amostra até ao componente impregnado com anticorpo marcado 14 pode ser alterado para uma direcção horizontal que torna possível um prolongamento do tempo do caudal da amostra para assegurar tempo suficiente para a reacção e o melhoramento da eficácia da reacção pelo efeito de mistura. Os materiais e métodos para a formação do dispositivo de vedação 16a não são particularmente limitados, e pode ser formado por adesão de um pedaço de um material impermeável à água tal como cloreto de vinilo, acetato de celulose ou outro semelhante à porção central do componente impregnado com mediador de electrões 16 através de um agente adesivo tal como um agente adesivo acrílico ou outro semelhante.
No dispositivo de doseamento ilustrado, o componente impregnado com anticorpo marcado 14 que contém um anticorpo marcado com uma enzima de oxidação-redução e o componente impregnado com mediador de electrões 16 que contém um mediador de electrões são formados separadamente, mas o dispositivo de doseamento a ser utilizado na presente invenção também pode 37
compreender, em vez destes componentes, um componente impregnado com reagente que contém ambos o anticorpo marcado com enzima de oxidação-redução e o mediador de electrões. Além disso, embora o mediador de electrões esteja contido no componente impregnado com mediador de electrões 16 no dispositivo de doseamento ilustrado, também podem ser obtidos resultados adequados de medição quando está contido na matriz 22 ou no meio de absorção 24 devido à excelente propriedade no estado seco e solubilidade em água do mediador de electrões representado pela fórmula [I] ou [II]. O dispositivo de comunicação 18 é formado a partir de papel de filtro de fibra de vidro, papel de filtro de fibra de celulose ou outro semelhante e é utilizado para introduzir uma amostra e outras semelhantes passada através do componente impregnado com mediador de electrões 16 para a matriz 22 aatravés de uma área pré-determinada da porção do eléctrodo 20. 0 dispositivo de comunicação 18 é disposto por inserção num orifício 30 da porção do eléctrodo 20. A porção do eléctrodo 20 contém um eléctrodo de trabalho que é um dos elementos componentes da presente invenção. Na porção do eléctrodo 20 do dispositivo de doseamento ilustrado nas Figs. 2 e 4, o orifício circular 30 é formado num suporte isolador 28, um eléctrodo de referência (contra eléctrodo) 32 e o seu terminal 32a são formados na periferia do orifício 30 na superfície superior do suporte 28, e um eléctrodo de trabalho (eléctrodo de detecção) 34 e o seu terminal 34a são formados na periferia do orifício 30 na superfície inferior do suporte 28. Na altura da medição, os terminais de ambos os eléctrodos são ligados a um equipamento de medida externo. Além disso, como ilustrado na Fig. 4 com uma parte sombreada, uma camada isoladora 36 é formada em ambas as superfícies superior e inferior do suporte 28 da porção do eléctrodo 20, onde o componente impregnado com mediador de electrões 16 e a matriz 38
22, excluindo o eléctrodo de referência 34 e o eléctrodo de trabalho 36, são postos em contacto com as superfícies. 0 eléctrodo de trabalho 34 para ser utilizado como um eléctrodo de detecção pode ser formado a partir dos vários materiais anteriormente referidos. O eléctrodo de referência 32 é um eléctrodo de prata/cloreto de prata ou outro semelhante. 0 suporte 28 é formado a partir de vários materiais isoladores conhecidos tais como PET (tereftlato de polietileno), poli(cloreto de vinilo), poliimida, poliéster e outros semelhantes. A camada isoladora 36 é formada a partir de vários materiais isoladores de tinta tais como resina acrílica, poliéster e outros semelhantes.
Neste caso, o eléctrodo de trabalho 34, o eléctrodo de referência 32 e a camada isoladora 36 no dispositivo de doseamento ilustrado podem ser formados por técnicas de formação de películas conhecidas que incluem por exemplo técnicas de formação de películas espessas tais como o processo de impressão a tela, com espátula e outras semelhantes e técnicas de formação de películas finas tais como deposição catódica, CVD e outras semelhantes. A matriz 22 é uma área para utilização na distribuição do corpo marcado com enzima formado por ligação específica de uma substância a ser doseada numa mostra líquida e o anticorpo marcado com enzima de oxidação-redução, e a distribuição da distância do corpo marcado em relação ao eléctrodo de trabalho 34 é medida como um valor de corrente eléctrica através do mediador de electrões anteriormente referido. A matriz 22 é preparada por exemplo por um método em que um anticorpo, antigénio, ácido nucleico ou outro semelhante a ser utilizado na reacção de ligação específica é insolubilizado e seco numa membrana porosa ou outra semelhante. Quando uma amostra flui para a matriz 22, ocorre uma reacção de ligação específica entre o anticorpo insolubilizado e a substância a ser doseada, a 39
fí. distribuição do corpo marcado com enzima altera-se e uma espécie de transferência de electrões formada pela reacção enzimática sofre difusão e migra para ser detectada pelo eléctrodo de trabalho 34 como uma modulação electroquimica em resposta à reacção. Neste caso, uma quantidade em excesso de amostra passa através da matriz 22 e é absorvida pelo dispositivo de absorção 24. O dispositivo de absorção 24 absorve o excesso de amostra passada através da matriz 22 tal como descrito acima e é preparado por exemplo a partir de papel de filtro para cromatografia ou papel de filtro de celulose semelhante ou um polímero com capacidade elevada de absorção de água. No dispositivo de doseamento ilustrado, esse material do dispositivo de absorção 24 retém um substrato da reacção enzimática tal como uma mistura seca de peróxido de hidrogénio-ureia ou outra semelhante de modo que também funciona como uma porção impregnada por substrato da reacção enzimática.
Como um modo preferido do dispositivo de doseamento ilustrado, é formado na porção central superior do dispositivo de absorção 24 um dispositivo de vedação 24a através do qual não pode passar água. Analogamente ao caso do dispositivo de vedação 16a anteriormente referido, pode ser realizado um doseamento mais exacto pelo dispositivo de vedação 24a, porque o caudal vertical da amostra pode ser alterado para uma direcção horizontal que torna possível o prolongamento do tempo do caudal da amostra que resulta no melhoramento da eficácia da reacção de ligação especifica e distribuição clara do corpo marcado na matriz. 0 dispositivo de vedação 24a pode ser preparado do mesmo modo que no caso do dispositivo de vedação 16a referido anteriormente. 0 dispositivo de doseamento ilustrado é construído por sobreposição destes componentes no suporte inferior 26 pela ordem ilustrada nas Figs. 2 e 3. 0 suporte inferior 26 é 40
preparado a partir de várias resinas tais como resina acrílica semelhante ao caso da cobertura superior 10.
Neste tipo de dispositivo de doseamento, cada amostra é injectada através do orifício para injecção de amostras 10a formado na cobertura superior 10. A amostra assim injectada através do orifício para introdução de amostras 10a passa através do filtro 12 onde são removidas substâncias indesejáveis e outras semelhantes e flui para o componente impregnado com anticorpo marcado 14. No componente impregnado com anticorpo marcado 14, o anticorpo marcado com enzima de oxidação-redução seco e retido é eluído pelo fluxo da amostra e misturado com esta ou inicia-se uma reacção de ligação específica com a substância a ser doseada na amostra. A amostra é então transferida para o componente impregnado com mediador de electrões 16. Uma vez que um mediador de electrões é seco e retido no componente impregnado com mediador de electrões 16 tal como descrito anteriormente, o mediador de electrões é eluído pelo fluxo da amostra e mistura-se com ela. Uma vez que o dispositivo de vedação 16a é formado na superfície superior do componente impregnado com mediador de electrões 16 no dispositivo de doseamento ilustrado, o caudal vertical da amostra é alterado para a direcção horizontal para assegurar tempo de reacção suficiente tal como descrito anteriormente. A amostra que passa assim através do componente impregnado com mediador de electrões 16 flui para a matriz 22 através do dispositivo de comunicação 18 e o orifício de passagem 30 da porção de eléctrodo 20. Quando a amostra flui para a matriz 22, a distribuição do corpo marcado com enzima de oxidação-redução na matriz 22 é determinada pela reacção de ligação específica da substância a ser doseada na amostra líquida com o anticorpo insolubilizado, e a espécie de transferência de electrões que é formada pela reacção enzimática do corpo marcado com enzima de oxidação-redução e capaz de sofrer reacção no eléctrodo atinge o 41
eléctrodo de trabalho 34 por difusão. Isto é, a distribuição da substância a ser doseada na direcção radial do eléctrodo de trabalho 34 é detectada pelo eléctrodo de trabalho 34 como uma modulação electroquimica em resposta à reacção enzimática. Uma quantidade em excesso da amostra passa através da matriz 22 e é absorvida pelo dispositivo de absorção 24.
Em consequência, de acordo com o dispositivo de doseamento acima, o resultado da reacção de ligação específica de uma substância a ser doseada com o anticorpo insolubilizado na matriz 22 determina a distribuição na matriz 22 do corpo marcado com enzima formado pela reacção de ligação específica acima em resposta à quantidade da substância a ser doseada na amostra, os electrões são transferidos no eléctrodo de trabalho 34 via migração por difusão da espécie de transferência de electrões formada pelo corpo marcado com enzima acima, e a transferência de electrões provocada pela reacção do eléctrodo é detectada como uma modulação electroquimica. Como resultado, a substância a ser doseada na amostra é determinada por medição da distribuição da reacção de ligação específica na direcção radial da matriz 22.
Assim, o método de doseamento electroquímico utilizando o método MEDIA e o composto de p-fenilenodiamina novo da presente invenção foi descrito em pormenor em relação a vários exemplos que, é claro, não têm a intenção de ser limitantes e podem ser modificados ou melhorados dentro do âmbito da presente invenção.
EXEMPLOS
Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar adicionalmente a presente invenção. Entender-se-á, contudo, que os exemplos são apenas para efeitos ilustrativos e não têm a intenção de constituir uma definição dos limites da invenção. 42 <Exemplo de Síntese 1> (estado da técnica) Síntese de dicloridrato de N,N,N',N'-tetraetil-p-fenilenodiamina (TEPD.2HC1)
Dissolveu-se p-fenilenodiamina (1 g), iodeto de etilo (10,7 g) e carbonato de sódio (4,4 g) era metanol (10 mL) e aqueceu-se a refluxo de um dia para o outro. Após arrefecimento da mistura reaccional até à temperatura ambiente, o solvente foi removido a pressão reduzida, e o resíduo resultante foi misturado com acetona para remover materiais insolúveis por filtração. O solvente foi removido a pressão reduzida do filtrado assim obtido, e o resíduo resultante foi recristalizado de uma solução numa mistura de acetato de etilo-éter para dar 6,8 g de um sal de amónio quaternário.
Em seguida, dissolveu-se 6,8 g do sal de amónio quaternário assim obtido e 12,5 g de tiossulfato de sódio pentahidratado em 50 mL de dimetilformamida e aqueceu-se a refluxo de um dia para o outro. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura reaccional foi diluída com água destilada e extraída com tolueno, a camada extraída foi lavada com água e seca sobre sulfato de sódio anidro, e o solvente foi então removido a pressão reduzida para dar 1,0 g de TEPD. Ao TEPD assim obtido adicionou-se 10 mL de etanol, seguidos pela adição gota a gota de 5 mL de ácido clorídrico/acetato de etilo 4 N enquanto se arrefecia num banho de gelo e subsequentemente agitou-se durante 1 hora a 5°C. O precipitado assim formado foi recolhido por filtração e lavado com etanol e éter para dar 1,3 g de TEPD.2HC1.
Os resultados das seguintes análises por RMN, IV (espectro de absorção no infravermelho) e MS (espectro de massa) confirmaram que o composto assim obtido é o TEPD.2HC1 de interesse. 43
1H RMN: δ 1,2 (12Η, t, J=7 Hz), 3,7 (8H, q, J=7 Hz), 7,9 (4H, s) IV (cm-1): 715, 840, 1020, 1276, 1516, 2420 MS: M+-2HC1+1 221 <Exemplo de Síntese 2> (presente invenção) Síntese de Ν,Ν,N',N"-tetraquiscarboximetil-p-fenilenodiamina (TCPD)
Dissolveu-se p-fenilenodiamina (1 g), ácido cloroacético (3,5 g), hidróxido de sódio (3,1 g) e iodeto de potássio (460 mg) em água destilada (46 mL) e aqueceu-se a refluxo durante 1 hora. Após arrefecimento da mistura reaccional até à temperatura ambiente, adicionou-se gota a gota 3,7 mL de ácido clorídrico concentrado enquanto se arrefecia num banho de gelo. Em seguida, o precipitado assim formado foi recolhido por filtração e recristalizado de uma solução numa mistura de metanol-etanol para dar 700 mg de TCPD.
Os resultados das seguintes análises por 1H RMN, IV e MS confirmaram que o composto assim obtido é o TCPD de interesse. ifí RMN: ô 3,9 (8H, S), 6,3 (4H, s), 11,2 (4H, s) IV (cm"1): 700, 820, 1030, 1514, 1720, 2700, 3300 MS: M++l 341 <Exemplo de Síntese 3> (presente invenção) Síntese de dicloridrato de ν,ν,ν',N'-tetraquis-(2'-hidroxietil)-p-fenilenodiamina (THEPD.2HC1)
Dissolveu-se p-fenilenodiamina (1 g), 2-cloroetanol (3,0 g) e hidróxido de sódio (1,5 g) em água destilada (6 mL) e aqueceu-se a refluxo durante 2 horas. Após arrefecimento da mistura reaccional até à temperatura ambiente, o solvente foi removido a pressão reduzida, e o material resultante foi 44
misturado com etanol para remover os materiais insolúveis por filtração. 0 solvente foi removido a pressão reduzida do filtrado assim obtido, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel usando como solução eluente uma mistura de clorofórmio-metanol, obtendo-se assim 1,5 g de THEPD.
Em seguida, dissolveu-se 1,5 g do THEPD assim obtido em 10 mL de etanol ao qual subsequentemente se adicionou gota a gota 5 mL de ácido clorídrico/acetato de etilo 4 N enquanto se arrefecia num banho de gelo, seguido de agitação durante 1 hora a 5°C. O precipitado assim formado foi recolhido por filtração e lavado com etanol para dar 1,1 g de THEPD.2HC1.
Os resultados das seguintes análises por ^H RMN, IV e MS confirmaram que o composto assim obtido é o THEPD.2HC1 de interesse. !h RMN: ô 3,5 (16H, s), 7,0 (4H, m), 7,1 (4H, s) IV (cm-1): 720, 890, 1020, 1210, 1390, 1500, 2700, 3300 MS: M+-2HC1+1 285 <Exemplo de Síntese 4> (presente invenção) Síntese de dicloridrato de N,N,N',N'-tetraquis-(2 ',3 '-dihidroxipropil)-p-fenilenodiamina (TDHPD.2HC1)
Dissolveu-se p-fenilenodiamina (1 g), 3-cloro-l,2- propanodiol (4,6 g) e hidróxido de sódio (1,64 g) em água destilada (30 mL) e aqueceu-se a refluxo durante 2 horas. Após arrefecimento da mistura reaccional até à temperatura ambiente, o solvente foi removido a pressão reduzida, e o material resultante foi misturado com etanol para remover os materiais insolúveis por filtração. O solvente foi removido a pressão reduzida do filtrado assim obtido, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel usando como 45
solução eluente uma mistura de clorofórmio-metanol, obtendo-se assim 1,1 g de TDHPD.
Em seguida, dissolveu-se 1,1 g do TDHPD assim obtido em 10 mL de etanol ao qual subsequentemente se adicionou gota a gota 5 mL de ácido cloridrico/acetato de etilo 4 N enquanto se arrefecia num banho de gelo, seguido de agitação durante 1 hora a 5°C. O precipitado assim formado foi recolhido por filtração e lavado com etanol para dar 820 mg de TDHPD.2HC1.
Os resultados das seguintes análises por RMN, IV e MS confirmaram que o composto assim obtido é o TDHPD.2HC1 de interesse. ^H RMN: δ 3,7 (20H, m), 7,1 (4H, S) IV (cm"1): 720, 870, 1040, 1260, 1370, 1520, 3300 MS: M+-2HC1+1 405 <Exemplo de Sintese 5> (presente invenção)
Sintese de dicloridrato de N-2'-hidroxietil-Ν,Ν',N'-trietil-p-fenilenodiamina (HTEPD.2HC1)
Adicionou-se uma porção de 12,8 g de carbonato de potássio a 100 mL de uma solução de metanol contendo 5 g de p-fenilenodiamina, e adicionou-se gota a gota 14,4 g de iodeto de etilo à solução resultante deixando durante 10 minutos à temperatura ambiente. A solução reaccional foi agitada a 50°C até desaparecimento do material de partida que foi confirmado por cromatografia em camada fina (clorofórmio:metanol = 10:1) e depois concentrada a pressão reduzida. O residuo concentrado assim obtido foi dissolvido numa mistura de n-hexano:acetato de etilo (1:1), os cristais precipitados foram separados por filtração, e o filtrado resultante foi concentrado a pressão reduzida. O residuo 46
resultante foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (n-hexano:acetato de etilo = 1:1) para dar 1,5 g de Ν,Ν',Ν'-trietil-p-fenilenodiamina.
Em seguida, dissolveu-se 1,5 g de N,N',N'-trietil-p-fenilenodiamina assim obtida em 20 mL de n-butanol a que subsequentemente se adicionou 2,2 g de hidróxido de sódio. À solução resultante adicionou-se gota a gota 4,4 g de 2-cloroetanol deixando-se 5 minutos à temperatura ambiente, seguidos por 1 hora a refluxo. Após confirmação do desaparecimento do material de partida por cromatografia em camada fina (n-hexano:acetato de etilo =1:1), a solução reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente e os cristais precipitados foram separados por filtração. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (n-hexano:acetato de etilo =1:1) para dar HTEPD.
Em seguida, o HTEPD assim obtido foi dissolvido em 15 mL de etanol, adicionou-se gota a gota 2,4 mL de ácido cloridrico/acetato de etilo 4 N à solução resultante que foi arrefecida num banho de gelo, e em seguida os cristais assim formados foram lavados com etanol para dar 1,0 g de HTEPD.2HC1.
Dados espectrais de HTEPD.2HC1 ifí RMN: ô 1,1 (9H, t, J=7 Hz), 3,5 (10H, m), 7,4 (4H, m) IV (cm-1): 700, 830, 1060, 1370, 1450, 1500, 2350, 2900, 3350 MS (M+-2HC1+1): 237 <Exemplo de Síntese 6> (presente invenção) Síntese de dicloridrato de N,N-bis(-2'-hidroxietil)-N',N'-dietil-p-fenilenodiamina (N,N-BHDPD.2HC1)
Adicionou-se uma porção de 3,7 g de hidróxido de sódio a 30 mL de uma solução de n-butanol contendo 5 g de N,N-dietil-p- 47
X
fenilenodiamina, e adicionou-se gota a gota 7,3 g de 2-cloroetanol à solução resultante deixando durante 10 minutos à temperatura ambiente. A solução reaccional foi aquecida a refluxo durante 4 horas. Após confirmação do desaparecimento do material de partida por cromatografia em camada fina (clorofórmio:metanol = 10:1), a solução reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente. Os cristais assim precipitados foram removidos por filtração, o filtrado resultante foi concentrado a pressão reduzida e o resíduo resultante foi então purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (clorofórmio:metanol = 10:1) para dar N,N-BHDPD.
Em seguida, o BHDPD assim obtido foi dissolvido em 20 mL de etanol, adicionou-se gota a gota 2,74 mL de ácido clorídrico/acetato de etilo 4 N à solução resultante que foi arrefecida num banho de gelo, e em seguida os cristais assim formados foram lavados com etanol para dar 1,22 g de BHDPD.2HC1.
Dados espectrais de BHDPD.2HC1 1H RMN: ô 1,0 (6H, t, J=7 Hz), 3,5 (12H, m) , 6,7 (2H, d, J=9 Hz), 7,5 (2H, d, J=9 Hz) IV (cm-1): 700, 830, 1050, 1380, 1450, 1500, 2480, 2900, 3300 MS (M+-2HC1+1): 253 <Exemplo de Síntese 7> (presente invenção) Síntese de N,N'-bis(-2'-hidroxietil)-p-fenilenodiamina (N,N'-BHPD)
Adicionou-se uma porção de 4,4 g de hidróxido de sódio a 100 mL de uma solução de etanol contendo 5 g de p-fenilenodiamina, e aqueceu-se a 55°C. Em seguida, adicionou-se gota a gota 8,9 g de 2-cloroetanol à solução resultante deixando-se durante 10 minutos. A solução reaccional foi aquecida a refluxo de um dia para o outro. Após confirmação do 48
JL
desaparecimento do material de partida por cromatografia em camada fina (clorofórmio:metanol = 10:1), a solução reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente.
Os cristais assim precipitados foram removidos por filtração, e o filtrado resultante foi concentrado a pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (clorofórmio:metanol = 10:1) para dar 5,0 g de Ν,ϋΓ-BHPD purificado. <Exemplo de Síntese 8> (presente invenção) Síntese de dicloridrato de N,N'-bis(-2'-hidroxietil)-N,N'-dietil-p-fenilenodiamina (N,N'-BHDPD)
Adicionou-se uma porção de 8,9 g de carbonato de potássio a 100 mL de uma solução de etanol contendo 4,5 g de BHPD, e adicionou-se 9,5 g de iodeto de etilo à solução resultante. A solução reaccional foi aquecida a refluxo de um dia para o outro. Após confirmação do desaparecimento do material de partida por cromatografia em camada fina (clorofórmio:metanol = 5:1), a solução reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente.
Os cristais precipitados foram removidos por filtração, e o filtrado resultante foi concentrado a pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (100% de acetato de etilo) para dar 223 mg de Ν,Ν'-BHDPD. Em seguida, o N,N'-BHDPD assim obtido foi dissolvido em 5 mL de etanol ao qual subsequentemente se adicionou gota a gota 10% de cloreto de hidrogénio/metanol com arrefecimento em gelo para precipitar os cristais. Os cristais foram separados por filtração para dar 266 mg de Ν,Ν'-BHDPD.2HC1. 49
Dados espectrais de N,N'-BHDPD.2HC1 1H RMN: ô 1,1 (6H, t, J=7 Hz), 3,5 (12H, m), 7,4 (4H, S) IV (cm"1): 670, 830, 1070, 1500, 2500, 2900, 3350 MS (M+-2HC1+1): 253 <Exemplo de Síntese 9> (presente invenção) Síntese de derivados de p-fenilenodiamina tendo um grupo amina substituído por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno
Adicionou-se uma porção de 1,3 g de hidróxido de sódio a 100 mL de uma solução de metanol contendo 5 g de p-fenilenodiamina, e adicionou-se gota a gota 1,1 g de óxido de propileno à solução resultante. A solução reaccional foi agitada de um dia para o outro a 30°C e depois foi concentrada a pressão reduzida. Ao concentrado adicionou-se clorofórmio para se obter 7 g de um produto extraído por clorofórmio. A separação por HPLC do produto extraído com clorofórmio foi realizada por utilização de eluente (acetonitrilo:acetato de amónio 50 mM = 15,6:84,4) e uma coluna ODS (YMC-Pack ODS, 20 mm 0 x 250 mm; produto de YMC Co.), em que o caudal era de 15 mL/min e o comprimento de onda de detecção era 254 nm.
Como resultado, obteve-se derivados de p-fenilenodiamina tendo grupo(s) amina mono-, di e tri-substituído(s). Cada substituição foi confirmada por análises de !h RMN e MS.
Produto mono-substituído ^ RMN: ô 1,1 (3H, d, J=6 Hz), 2,8 (2H, m), 3,8 (1H, m), 4,9 (3H, s largo), 6,4 (4H, m) [MS 167 (M+l)] Produto di-substituído [MS 225 (M+l)]
Produto tri-substituído [MS 283 (M+l)] 50
Ε ο derivado de p-fenileno diamina com grupo amino monossubstituído foi confirmado como N-2'-hidroxipropil-fenilenodiamina (HPPD) pelos resultados acima. <Exemplo de Teste 1>
Medição das tensões de vapor de p-fenilenodiamina (PPD), N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD), TEPD, TCPD, THEPD e TDHPD
Verificou-se a tensão de vapor de PPD (fabricada por wakoh Junyaku K.K.), TMPD (fabricada por Tokyo Kasei K. K.), além de TEPD, TCPD, THEPD e TDHPD obtidos no decurso dos procedimentos dos Exemplos de Síntese 1 a 4.
As densidade de vapor (quantidade de evaporação/volume) das amostras sólidas (PPD, TMPD, TEPD, TCPD, THEPD e TDHPD) foram medidas por contacto de cada amostra aquecida a uma temperatura pré-determinada com um caudal de gás de arraste (azoto) e saturando a amostra com vapor, e as tensões de vapor de TEPD e de THEPD foram calculadas a partir dos resultados com base no pressuposto de que o vapor odebece à lei dos gases ideais (método do caudal de gás). A densidade do vapor foi calculada por medição da velocidade de evaporação (velocidade de perda) de cada amostra utilizando uma balança eléctrica, e o caudal do gás de arraste utilizando um medidor de caudal. A tensão de vapor foi calculada a partir da densidade do vapor com base na fórmula seguinte.
P = (k/vJVx/M
Na fórmula acima, P representa a tensão de vapor (Pa; mmHg), k representa a velocidade de evaporação (mg/min), v representa o caudal do gás de arraste (mL/min), k/v representa a densidade do vapor (mg/mL), M representa o peso molecular de 51
cada amostra, π representa a pressão do sistema (Pa; mmHg) e V representa o volume molar do gás de arraste (L/mol).
Os perfis da tensão de vapor de TEPD e THEPD a cada temperatura estão ilustrados na Fig. 5.
As curvas da tensão de vapor dos compostos a 25°C estão ilustradas na Fig. 24.
Como é evidente das Figs. 5 e 24, as tensões de vapor de TEPD, TCPD, THEPD e TDHPD a 25°C são 5,6 x IO-2 Pa (4,2 x IO”4 mmHg), 1,2 x 10“6 Pa (8,7 x 10“9 mmHg), 1,7 x 10-4 Pa (1,3 x 10“ 6 mmHg) e 1,3 x 10~7 pa (1,0 x 10“9 mmHg), respectivamente, mostrando que as tensões de vapor de TCPD, THEPD e TDHPD são cerca de 50.000 vezes, cerca de 300 vezes, e cerca de 420.000 vezes menores do que a de TEPD, respectivamente. Estes resultados mostram que a propriedade na secagem (liofilização, secagem sob vácuo, secagem ao ar ou outras semelhantes) e a estabilidade dos estados secos de TCPD, THEPD e TDHPD são superiores às de PPD, TMPD e TEPD. <Exemplo de Teste 2>
Medições por voltametria ciclica (CV) de TEPD.2HC1, TCPD, THEPD.2HC1, TDHPD.2HC1, HTEPD.2HC1, N,N-BHPDP.2HC1, N,N'- BHDPD.2HC1, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (a seguir está omitido "2HC1")
Cada um de TEPD, TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHPDP, N,N"-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno obtidos nos Exemplos de Síntese 1 a 9 foi dissolvido em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo 0,1 M de NaCl, e foi medida a CV das soluções 5,0 x 10“4 M assim preparadas. Um eléctrodo de carbono vítreo (MF2012 fabricado por BIOANALYTICAL 52
SYSTEMS) utilizado como eléctrodo de trabalho, um eléctrodo de Ag/AgCl (MF2020 fabricado por BIOANALYTICAL SYSTEMS) utilizado como o eléctrodo de referência e um fio de platina (fabricado por BIOANALYTICAL SYSTEMS) utilizado como o contra eléctrodo foram ligados a um potenciostato HA-150 (fabricado por Hokuto Denko) aos quais foram adicionalmente ligados um gerador de funções HB-104 (fabricado por Hokuto Denko) para utilização na regulação do potencial do eléctrodo e um registador. 0 registador foi ligado a um computador através de uma linha GPIB para realização do registo das medições e o processamento dos resultados. A medição de CV foi realizada regulando o potencial inicial para -500 mV (vs Ag/AgCl, aplicar-se-á o mesmo daqui em diante) e o potencial inverso para +800 mV, ou o potencial inicial para -200 mV e o potencial inverso para +300 mV, e realizando o varrimento de potencial a uma velocidade de 50 mV/s.
Os resultados de -500 mV até +800 mV e -200 mV até +300 mV de TEPD estão ilustrados nas Figs. 6 e 7, respectivamente. Do mesmo modo, os resultados de TCPD estão ilustrados nas Figs. 8 e 9, e os de THEPD nas Figs. 10 e 11 e os de TDHPD nas Figs. 12 e 13. Os resultados de HTEPD estão ilustrados nas Figs. 25 e 26, e os de Ν,Ν-BHDPD nas Figs. 27 e 28 e os de N,N'-BHDPd nas Figs. 29 e 30, e os de derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina mono-substituidos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD) nas Figs. 31 e 32 e os de derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina di-substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno nas Figs. 33 e 34 e os de derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina tri-substituidos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno nas Figs. 35 e 36.
Como é evidente dos resultados de CV ilustrados nas Figs. 8 a 13 e Figs. 25 a 36 analogamente ao caso do anteriormente referido TEDP (Figs. 6 e 7), cada um de TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, Ν,Ν-BHPDP, N,N"-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina 53
tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno é também um composto capaz de sofrer reacção de oxidação-redução num eléctrodo e pode ser adeguadamente utilizado como um mediador de electrões em medições electroquímicas. Além disso, como ilustrado nas Figs. 9, 11, 13, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 pode ser realizada uma reacção de oxidação-redução reversível por estes compostos dentro de uma gama de potencial de -200 mV a +300 mV. <Exemplo de Teste 3>
Medições das actividades de transferência de electrões de TEPD, TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, Ν,Ν'-BHPD, N,N-BHPDP, Ν,Ν'-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno — 1
Dissolveu-se glucose oxidase (GOD, fabricada por Boehringer-Mannheim) em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo 0,1 M de NaCl para preparar soluções de GOD 0 M e 4,0 x 10“^ m. Também se dissolveu glucose (fabricada por Junsei Kagaku) no mesmo tampão para preparar uma solução 1,5 M. Do mesmo modo, cada um de TEPD, TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, Ν,Ν-BHDPD, N,N'-BHPD, Ν,Ν'-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno obtidos nos Exemplos de Síntese 1 a 9 foi dissolvido no mesmo tampão para preparar uma solução 5,0 x 10-3 m.
Cada uma destas soluções foi misturada em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo 0,1 M de NaCl na seguinte proporção de mistura imediatamente antes da medição para preparar soluções com as seguintes composições A e B, e a corrente foi medida continuamente na presença (composição A) ou na ausência (composição B) de GOD. 54
Composição A GOD 4,0 o 1—1 M 100 glucose 1,5 M o i—1 mL solução do composto 5,0 x 10"3 M 1,0 mL tampão* 7,9 mL *: tampão fosfato 0,1 M (PH 6 , 0) contendo 0,1 M de Na
Composição B GOD 0 M 100 pL glucose 1,5 M 1,0 mL solução do composto 5,0 x IO"3 M 1,0 mL tampão* 7,9 mL *: tampão : fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo 0,1 M de Na
Utilizando o mesmo aparelho do Exemplo de Teste 2, mediu-se a corrente eléctrica na presença (composição A) ou na ausência (composição B) de GOD durante 10 minutos com aplicação de um potencial de +300 mV (vs. Ag/AgCl) ao eléctrodo de trabalho.
Os resultados das medições de TEPD (GOD-glucose-TEPD) estão apresentados na Fig. 14, e os de TCPD (GOD-glucose-TCPD) na Fig. 15, de THEPD (GOD-glucose-THEPD) na Fig. 16 e de TDHPD (GOD-glucose-TDHPD) na Fig.17.
Os resultados das medições de HTEPD (GOD-glucose-HTEPD) estão apresentados na Fig. 37, e os de ν,ν-bhdpd (GOD-glucose-Ν,Ν-BHDPD) na Fig. 38, de Ν,Ν'-BHDPD (GOD-glucose-N,N'-BHDPD) na Fig. 39.
Os resultados das medições de derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina mono-substituidos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD) estão apresentados na Fig. 40 e os de derivados de p-fenilenodiamina 55
tendo grupos amina di-substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno na Fig. 41 e os de derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina tri-substituidos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno na Fig. 42.
Como ilustrado nas Figs. 14 a 17 e nas Figs. 37 a 42, a corrente de oxidação aumenta pela medição de qualquer um dos compostos quando está presente GOD no sistema (composição A) em comparação com o caso da sua ausência (composição B). Consequentemente, é evidente que, analogamente ao TEPD do estado da técnica, cada um de TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHPDP, Ν,Ν'-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno da presente invenção está dotado de uma função como mediador de electrões reversível entre GOD e o eléctrodo. E de modo análogo ao caso desses compostos, A Ν,Ν'-BHPD da presente invenção está dotada de uma função como mediador de electrões reversível entre GOD e o eléctrodo. <Exemplo de Teste 4>
Medições das actividades de transferência de electrões de TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHDPD, Ν,Ν'-BHPD, Ν,Ν'-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno — 2
Dissolveu-se peroxidase de rábano (HRPO, fabricada por TOYOBO) em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo 0,1 M de NaCl para preparar soluções de HRPO 0 M e 5,0 x 10“7 M. Também se dissolveu peróxido de hidrogénio (fabricada por Wako Pure Chemical Industries) no mesmo tampão para preparar uma solução 1,0 x 10“1 M. Do mesmo modo, cada um de TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHDPD, Ν,Ν'-BHPD, Ν,Ν'-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno obtidos nos Exemplos de 56
Síntese 1 a 9 foi dissolvido no mesmo tampão para preparar uma solução 5/0 x 10“3 M.
Cada uma destas soluções foi misturada em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo 0,1 M de NaCl na seguinte proporção de mistura imediatamente antes da medição para preparar soluções com as seguintes composições A e B, e a corrente eléctrica foi medida continuamente na presença (composição A) ou na ausência (composição B) de HRPO.
Composição A_
HRPO 5,0 X 10”7 M 100 pL
peróxido de hidrogénio 1,0 x IO”1 M 100 pL
solução do composto 5,0 x 10”3 M 1,0 mL
tampão*_8,8 mL *: tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo 0,1 M de Na Cl
Composição B_ HRPO 0 M 100 μΐι
peróxido de hidrogénio l,0xl0"1M 100 pL
solução do composto 5,0 x 10"3 M 1,0 mL
tampão*_8,8 mL *: tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo 0,1 M de Na Cl
Utilizando o mesmo aparelho do Exemplo de Teste 2, mediu-se a corrente eléctrica na presença (composição A) ou na ausência (composição B) de HRPO durante 5 ou 10 minutos após a aplicação de um potencial de -80 mV (vs. Ag/AgCl, aplicar-se-á o mesmo daqui em diante) no caso de TEPD, THEPD, e TDHPD, ou de -150 mV no caso de TCPD, HTEPD, N,N-BHDPD, Ν,ΙΤ-BHPD, N,N'-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno. 57
Os resultados das medições de TEPD (HRPO-peróxido de hidrogénio-TEPD) estão apresentados na Fig. 18, e os de TCPD (HRPO-peróxido de hidrogénio-TCPD) na Fig. 19, de THEPD (HRPO-peróxido de hidrogénio-THEPD) na Fig. 20 e de TDHPD (HRPO-peróxido de hidrogénio-TDHPD) na Fig.21.
Os resultados das medições de HTEPD (HRPO-peróxido de hidrogénio-HTEPD) estão apresentados na Fig. 43, e os de N,N-BHDPD (HRPO-peróxido de hidrogénio-N,N-BHDPD) na Fig. 44, de Ν,ΙΓ-BHDPD (HRPO-peróxido de hidrogénio-N,N"-BHDPD) na Fig. 45.
Os resultados das medições de derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina mono-substituidos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno (HPPD) estão apresentados na Fig. 46 e os de derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina di-substituidos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno na Fig. 47 e os de derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina tri-substituidos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno na Fig. 48.
Como ilustrado nas Figs. 18 a 21 e nas Figs. 43 a 48, a corrente de redução aumenta pela medição de qualquer um dos compostos quando está presente HRPO no sistema (composição A) em comparação com o caso da sua ausência (composição B). Consequentemente, é evidente que, analogamente ao TEPD do estado da técnica, cada um de TCPD, THEPD, TDHPD, HTEPD, N,N-BHDPD, N,N'-BHDPD, e derivados de p-fenilenodiamina tendo grupos amina substituídos por reacção de p-fenilenodiamina com óxido de propileno da presente invenção está dotado de uma função como mediador de electrões reversível entre HRPO e o eléctrodo. E de modo análogo ao caso desses compostos, a N,N'-BHPD da presente invenção está dotada de uma função como mediador de electrões reversível entre HRPO e o eléctrodo. 58
<Exemplo Inventivo
Foi construído o dispositivo de doseamento de ligações especificas ilustrado nas Figs. 2 e 3, e determinou-se a concentração de hCG em amostras utilizando o dispositivo.
Primeiramente, foram preparados os componentes seguintes para utilização na construção do dispositivo para doseamento de ligações especificas. (1) Preparação de um conjugado de anticorpo anti-hCG e peroxidase de rábano (anticorpo marcado)
Um anticorpo HM81 anti-hCG monoclonal de rato (preparado por Mochida Pharmaceutical) foi dissolvido numa solução tampão de 100 mM de cloreto de sódio/1 mM de EDTA/60 mM de trietanolamina (pH 8,0, tampão TEA) a uma concentração final de 8,3 mg/mL, e a solução resultante foi muito bem dialisada contra tampão TEA que tinha sido purgado com azoto gasoso. Uma porção de 61 pL de solução 50 mM de cloridrato de 2-iminotiolano (fabricado por Pierce Chemical Company) foi adicionada a 1,1 mL da solução de anticorpo assim preparada, e a mistura foi agitada e depois deixada em repouso durante 1,5 horas a 4°C numa atmosfera de azoto gasoso. Em seguida, a solução resultante foi muito bem dialisada contra uma solução tampão de fosfato 100 mM (pH 7,0) contendo 100 mM de cloreto de sódio e 1 mM de EDTA (EDTA-PB) que tinha sido purgada com azoto. Deste modo, obteve-se anticorpo HM81 anti-hCG em que foi introduzido um grupo SH.
Por outro lado, dissolveu-se peroxidase de rábano (HRPO, fabricada por T0Y0B0) em tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) até uma concentração final de 20 mg/mL. Com agitação a 30°C, misturou-se 500 pL da solução de enzima assim preparada com 500 pL de 50 mM de sulfo-SMCC (fabricado por Pierce Chemical Company). Após 20 minutos de reacção a 30°C, a mistura reaccional resultante foi passada através de uma coluna (2,6 0 x 15 cm) empacotada com 59
Sephadex G-25® (fabricada por Pharmacia) que tinha sido equilibrada com antecedência com EDTA-PB purgado com azoto, removendo assim sulfo-SMCC que não reagium e em seguida a solução resultante foi concentrada utilizando um concentrador (CENTRIPREP-10®, fabricado por Amicon Corp.) para obter HRPO malimidado. A concentração de HRPO maleimidado foi determinada com base na absorvância a 403 nm.
Misturou-se solução de HRPO maleimidado (1,25 x 10-^ moles ou 1,56 x 10-8 moles) com uma solução de anticorpo HM81 anti-hCG em que foi introduzido um grupo SH (3 vezes ou 1/3 vezes em proporção molar), e a mistura foi incubada a 4°C durante 12 horas numa atmosfera de azoto gasoso. Após a reacção, adicionou-se 50 pL de solução de cisteamina 50 mM a cada uma das misturas reaccionais, e a reacção foi prosseguida a 4°C durante 60 minutos numa atmosfera de azoto gasoso. Em seguida, a mistura reaccional resultante foi submetida a cromatografia de filtração em gel usando uma coluna ULTROGEL AcA34® (fabricado por IBF Biotechniques) que tinha sido equilibrada com antecedência com EDTA-PB purgado com azoto.
Cada uma das fracções eluidas foi verificada quanto às suas absorvâncias a 280 nm e 403 nm, de forma a recolher e concentrar as fracções contendo o produto conjugado de HM81/HRPO mas não contendo moléculas de enzima livres. Após a confirmação do peso molecular dos conjugados assim concentrados (daqui em diante referidos como "HRP0-HM81"), por um sistema de electroforese Phast® (Pharmacia), as quantidades do anticorpo e da enzima contidas no conjugado foram determinadas com base na absorvância e na actividade enzimática. 0 HRPO-HM81 assim preparado foi utilizado como um anticorpo marcado com enzima de oxidação-redução em experiências de medição. (2) Preparação de um componente liofilizado impregnado com anticorpo anti-hCG marcado com peroxidase de rábano (HRPO-HM81) 60
-5Γ?. Ο HRP0-HM81 obtido no passo (1) acima foi diluido com um tampão fosfato (pH 6,0) contendo 5% de soro normal de coelho (NRS), 10% de sacarose e 0,1 M de NaCl para preparar um solução tendo uma actividade de peroxidase de 0,63 u/mL. Em seguida, aplicou-se 140 pL da solução num pedaço circular de papel de filtro com 12 mm de diâmetro cortado em papel de filtro de fibra de vidro (GA100, fabricado por Advantech Toyo) e depois liofilizou-se para se obter um componente liofilizado com HRPO-HM81 para ser utilizado como o componente impregnado com anticorpo marcado 14. (3) Preparação de um componente liofilizado impregnado com THEPD (um exemplo inventivo) O THEPD obtido no Exemplo de Sintese 3 foi dissolvido num tampão fosfato (pH 6,0) contendo 0,1 M de NaCl para preparar uma solução 5,0 mM. Em seguida, aplicou-se 140 pL da solução num pedaço circular de papel de filtro com 12 mm de diâmetro cortado em papel de filtro de fibra de vidro (GA100, fabricado por Advantech Toyo) e depois liofilizou-se para se obter um componente liofilizado com THEPD para ser utilizado como o componente impregnado com mediador de electrões 16 da presente invenção. (4) Preparação de um componente liofilizado impregnado com TEPD (um exemplo comparativo) O TEPD obtido no Exemplo de Sintese 1 foi dissolvido num tampão fosfato (pH 6,0) contendo 1 M de NaCl para preparar uma solução 5,0 mM. Em seguida, aplicou-se 140 pL da solução num pedaço circular de papel de filtro com 12 mm de diâmetro cortado em papel de filtro de fibra de vidro (GA100, fabricado por Advantech Toyo) e depois liofilizou-se para se obter um componente liofilizado com TEPD para ser utilizado como um componente comparativo impregnado com mediador de electrões 16. 61
(5) Preparação de ura componente liofilizado impregnado com peróxido de hidrogénio
Dissolveu-se peróxido de hidrogénio (Wako Pure Chemical Industries) e ureia (Wako Pure Chemical Industries) em água destilada para se preparar uma solução contendo 0,5 M de peróxido de hidrogénio e 0,5 M de ureia. Em seguida, aplicou-se 120 pL da solução num pedaço circular de papel de filtro com 12 mm de diâmetro cortado em papel de filtro para cromatografia (17 Chr, fabricado por Whatman) e depois liofilizou-se para se obter um componente liofilizado com peróxido de hidrogénio-ureia para ser utilizado como o dispositivo de absorção 24. (6) Preparação de uma película porosa de éster de celulose com anticorpo anti-hCG imobilizado
Colocou-se um total de 200 pedaços circulares (13 mm de diâmetro) de uma membrana porosa de uma mistura de acetato de celulose/nitrato de celulose com um tamanho de poro de 8,0 μιη (Νδ Cat. SCWP01300, fabricado por Nippon Millipore Kogyo) num copo cheio com 200 mL de uma solução de PBS contendo 1,0% (p/v) de γ globulina bovina (NS Cat. G7516, fabricada por Sigma
Chemical) e aqueceu-se a 60°C durante 2 horas com agitação suave.
Após remoção do sobrenadante e remoção adicional do líquido remanescente por sucção, os pedaços circulares assim tratados foram lavados com agitação num volume suficiente de soro fisiológico tamponado com fosfato 0,076 M (pH 6,4, adiante designado por "PBS") e depois removeu-se o PBS usado. O passo de lavagem com PBS foi repetido mais duas vezes, e os pedaços lavados foram de novo lavados 7 vezes com água destilada. Depois de completados os passos de lavagem, os pedaços circulares foram colocados em 200 mL de solução aquosa a 1% de glutaraldeído e incubados a 25°C durante 3 horas com agitação suave. Após a reacção, os pedaços circulares de membrana porosa assim tratados 62
foram lavados 10 vezes com água destilada e depois dispostos numa placa de vidro um a um para secar.
Por outro lado, anticorpo HM 21 anti-hCG monoclonal de murganho (fabricado por Mochida Pharmaceutical) foi dissolvido numa solução consistindo em 0,05 M de bicarbonato de sódio e 0,05 M de cloreto de sódio para uma concentração final de 1,0 mg/mL. Cada pedaço (13 0 de diâmetro) da membrana porosa seca numa placa de vidro foi impregnado com 25 μί da solução de anticorpo acabada de preparar a partir da parte central do pedaço circular. Após 1 hora de reacção à temperatura ambiente, os pedaços circulares de membrana porosa foram colocados em 200 mL de uma solução de 0,2% de albumina de soro bovino (BSA)/PBS e agitadas a 4°C durante 2 dias para efectuar o bloqueamento. Em seguida, os pedaços assim tratados foram lavados três vezes com uma solução de 0,1% de Tween 20/PBS e depois sete vezes com PBS e depois secos para se obter membrana porosa de éster de celulose com anticorpo anti-hCG (HM21) imobilizado para ser utilizado como a matriz 22. (7) Preparação do dispositivo de detecção (eléctrodo) 20
Um padrão tal como ilustrado na Fig. 4 foi impresso por meio de impressão a tela em cada uma da face lateral e face posterior de uma película de PET transparente (50 mm de comprimento, 20 mm de largura e 0,25 mm de espessura) utilizando uma tinta de carbono condutora (400-CT, fabricada por Asahi Kaken). O eléctrodo de referência 32 também foi impresso por impressão a tela na área circular da porção central do lado facial utilizando uma tinta de prata condutora (LS411N, fabricada por Asahi Kaken). Além disso, a camada isolante 36 foi impressa no lado facial e lado posterior do eléctrodo por meio de impressão a tela utilizando uma tinta isoladora (XB-101G, fabricada por Fujikura Kasei). Em seguida, fez-se um orifício com um diâmetro de 3 mm no centro da área circular utilizando um punção para ser utilizado como o orifício de passagem 30, de tal 63
modo gue os eléctrodos em forma de anel permaneceram em ambos o lado facial e o lado posterior do orifico de passagem 30. Após a punção, confirmou-se que os eléctrodos do lado facial e do lado posterior eram electricamente independentes um do outro.
Em seguida, a porção sobreposta de tinta de prata condutora foi submetida durante 10 minutos a electrólise em solução aquosa de cloreto de sódio 0,1 M (+1,0 V vs Ag/AgCl) para formar uma camada de cloreto de prata à superfície. Nas zonas expostas do anel, o lado laminado com uma camada de prata/cloreto de prata foi utilizado como o eléctrodo de referência 32 (e contra eléctrodo), e o outro lado só de carbono condutor foi utilizado como o eléctrodo de trabalho 34 para utilização na detecção.
[Preparação do dispositivo de doseamento para utilização no exemplo inventivo]
Utilizando cada um dos componentes assim preparados, foi construído do modo seguinte o dispositivo de doseamento ilustrado nas Figs. 2 e 3 do método MEDIA para utilização na prática do método de doseamento da presente invenção.
Primeiramente, o dispositivo de absorção 24 preparado no passo (5) acima foi colocado no suporte inferior 26 feito de resina acrílica. À parte central da superfície do dispositivo de absorção aplicou-se um vedante com um diâmetro de 6 mm que tinha sido preparado por punção de uma fita adesiva (fabricada por Sumitomo 3M) para ser utilizado como o dispositivo de vedação 24a. Na superfície superior deste sobrepôs-se a matriz 22 preparada no passo (6) acima de tal modo que o seu ponto central coincidia com o do dispositivo de vedação 24a do dispositivo de absorção 24. Em seguida, a porção de eléctrodo 20 preparada no passo (7) acima, com o seu eléctrodo de referência 32 no lado superior, foi sobreposto à matriz 22 de tal modo que o ponto central do orifício de passagem 30 coincidia com o da matriz 22. 64 t
Cortou-se um pedaço circular com um diâmetro de 3 mm numa folha de papel de filtro de fibra de vidro (GA55, fabricado por Advantech Toyo) e inseriu-se no orifício de passagem 30 para formar o dispositivo de comunição 18. Na porção de eléctrodo 20 sobrepôs-se adicionalmente o componente liofilizado impregnado com mediador de electrões (THEPD) 16 preparado no passo (3) acima de tal modo que o seu ponto central coincidia com o do orifício de passagem 30 da porção de eléctrodo 20. Na porção central superior do componente impregnado em mediador de electrões 16 aplicou-se um vedante de 6 mm de diâmetro preparado por punção de uma fita adesiva e utilizado como o dispositivo de vedação 16a. A este foi sobreposto o componente impregnado com anticorpo marcado 14 preparado no passo (2) acima sobre o qual foi adicionalmente sobreposta uma peça circular de 12 mm de diâmetro para ser utilizada como o filtro 12, que foi preparada por punção de ERUTAS (NQ Cat. A05070, fabricado por Asashi Chemical Industry) tratado com Tween 20. Sobre este foi finalmente sobreposta a cobertura superior 10 feita de uma placa acrílica com 5 mm de espessura tendo um orifício para introdução de amostras 10a (6 mm de diâmetro) de tal modo que o ponto central do orifício para introdução de amostras 10a coincidia com o do filtro 12. Deste modo, foi construído um dispositivo de doseamento de ligações específicas para utilização na medição da concentração de hCG. Neste caso, a distância entre a superfície inferior da placa superior e a superfície superior do suporte inferior foi ajustada para 3.400 μπι.
[Preparação do dispositivo de doseamento para utilização no exemplo comparativo]
Construiu-se um dispositivo para doseamento de ligações específicas para utilização na medição da concentração de hCG do mesmo modo que no caso do dispositivo de doseamento inventivo acima excepto que o componente impregnado com mediador de electrões 16 preparado por impregnação e liofilização de THEPD no passo (3) acima foi substituído por outro componente 65 *
impregnado com mediador de electrões 16 preparado por impregnação e liofilização de TEPD no paso (4) acima.
[Medição de hCG em sangue inteiro]
Cada um dos dispositivos de doseamento de ligações especificas inventivo e comparativo assim construídos para utilização na medição da concentração de hCG foi ligado aos equipamentos de medida necessários tais como um potenciostato e outros semelhantes tal como descrito no Exemplo de Teste 2. Por outro lado, adicionou-se hCG a sangue inteiro heparinizado de voluntários machos saudáveis para preparar as soluções (A) (hCG 0 IU/L de sangue inteiro) e (B) (1.000 UI/L de sangue inteiro). Introduziu-se uma porção de 260 μΐι de cada uma das soluções (A) e (B) (aplicou-se como uma gota) no dispositivo para introdução de amostras 38 através do orifício para introdução de amostras 10a da cobertura superior 10 de cada um dos dispositivos de doseamento de ligações específicas inventivo e comparativo. Após 30 segundos da aplicação da amostras, aplicou-se um potencial de -150 mV ao eléctrodo de trabalho com base no eléctrodo de referência/contra eléctrodo para registar a corrente eléctrica. Os resultados da medição por meio dos dispositivos de doseamento inventivo e comparativo estão ilustrados nas Figs. 22 e 23, respectivamente.
Como ilustrado na Fig. 22, a corrente de redução torna-se elevada em resposta à concentração de hCG no caso do dispositivo de doseamento de ligações específicas inventivo em que se utilizou o componente com THEPD liofilizado como o componente impregnado com mediador de electrões 16. Pelo contrário, como ilustrado na Fig. 23, a corrente eléctrica não aumentou em resposta à concentração de hCG no caso do dispositivo de doseamento de ligações específicas comparativo em que se utilizou o componente com TEPD liofilizado como o componente impregnado com mediador de electrões 16. Estes resultados, bem como os resultados do Exemplo de Teste 1, indicam que a TEPD não 66 pode actuar como um mediador de electrões apropriado na altura da medição neste modo de método de doseamento devido às suas fracas propriedades de secagem e estabilidade no estado seco, à sua tendência para sofrer influência de substâncias interferentes em amostras e à sua fraca estabilidade nas amostras.
Com base nestes resultados, confirmou-se que a determinação quantitativa da concentração de hCG numa amostra de teste pode ser realizada facilmente e rapidamente pela utilização do dispositivo de doseamento em que é utilizado o mediador de electrões da presente invenção.
Assim, tal como foi descrito em pormenor anteriormente, de acordo com o método de doseamento electroquimico e o novo composto de p-fenilenodiamina da presente invenção, a medição de substâncias a serem doseadas por meio de um método com eléctrodo enzimático, métodos de doseamento de ligação especifica tais como o método MEDIA e outros semelhantes podem ser realizados sempre de forma estável com elevada sensibilidade à detecção (reponsividade) e boa reprodutibilidade mesmo no caso de sangue, urina e outras amostras semelhantes que contêm substâncias interferentes, e o método de doseamento também pode ser adequadamente aplicado para utilização descartável.
67
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES 1. Método de doseamento electroqulmico que compreende a determinação da substância a ser doseada em amostras liquidas utilizando pelo menos uma enzima de oxidação-redução, em que uma enzima de oxidação-redução, um mediador de electrões e um eléctrodo capaz de realizar a transferência de electrões com o referido mediador de electrões são dispostos no doseamento, e em que é utilizado um composto representado pela seguinte fórmula [I] ou um seu sal como o mediador de electrões:em que r1, r2, r1 e R2 podem ser iguais ou diferentes uns dos outros e cada um representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condição de que pelo menos um de R1, R2, R1 e R2 tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo.
- 2. Método de doseamento electroquímico de acordo com a reivindicação 1 em que pelo menos um seleccionado do grupo que consiste em R1, R2, R1 e R2 tem um grupo hidroxilo ou um grupo carboxilo. 1 1 Método de doseamento electroquímico de acordo com a 2 reivindicação 1 em que o referido composto representado pela fórmula [I] é pelo menos um composto seleccionado do grupo que consiste em: H02C^N^C02H ho2c^n^.co2hTHEPDTCPD
- 4. Método de doseamento electroquímico de acordo com a reivindicação 1 em que a referida substância a ser doseada é um substrato, um inibidor, um cofactor ou um activador da referida enzima de oxidação-redução, e uma modulação da reacção enzimática gerada em resposta à quantidade do referido substrato, inibidor, cofactor ou activador da referida enzima de oxidação-redução é detectado como uma modulação de sinais electroquimicos no referido eléctrodo.
- 5. Método de doseamento electroquímico de acordo com a reivindicação 1 em que a referida substância a ser doseada é medida por meio de uma reacção de ligação especifica que utiliza pelo menos uma substância de ligação especifica especifica para a substância a ser doseada e utilizando a referida enzima de oxidação-redução como um marcador. 2 ο
- 6. Método de doseamento electroquímico de acordo com a reivindicação 5 em que um dispositivo compreendendo uma matriz como uma área em que é desenvolvida uma amostra liquida presumivelmente contendo a referida substância a ser doseada, um dispositivo para introdução de amostras a partir do qual a amostra é introduzida na referida matriz e um eléctrodo adjacente à referida matriz é utilizado como um dispositivo de doseamento, e a amostra é introduzida no referido dispositivo para introdução de amostras para permitir que a referida substância a ser doseada na amostra reaja na referida matriz com uma primeira substância de ligação especifica e uma segunda substância de ligação especifica que é marcada com uma enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de transferência de electrões que produz um sinal na porção do eléctrodo, ou a referida amostra é introduzida na referida matriz depois de ter permitido que a referida substância a dosear na amostra reaja numa área exterior da referida matriz com uma primeira substância de ligação específica e uma segunda substância de ligação específica que é marcada com uma enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de transferência de electrões que produz um sinal na porção do eléctrodo, efectuando assim alterações na distribuição de pelo menos uma espécie molecular entre um complexo da segunda substância de ligação específica marcada com a enzima de oxidação-redução e a referida substância a ser doseada, um complexo da segunda substância de ligação específica marcada com a referida enzima de oxidação-redução, a referida substância a ser doseada e a primeira substância de ligação específica e uma forma livre da segunda substância de ligação específica marcada com a enzima de oxidação-redução, e detectando as referidas alterações na distribuição ocorridas em resposta à quantidade da referida substância 3a ser doseada na amostra como uma modulação de sinal no eléctrodo, que é limitada pela transferência de massa da espécie de transferência de electrões produzida pela enzima de oxidação-redução. !
- 7. Método de doseamento electroquimico de acordo com a reivindicação 5 em que um dispositivo compreendendo uma matriz como uma área em que é desenvolvida uma amostra liquida presumivelmente contendo a referida substância a ser doseada, um dispositivo para introdução de amostras a partir do qual a amostra é introduzida na referida matriz e um eléctrodo adjacente à referida matriz é utilizado como um dispositivo de doseamento, em que cada uma de uma substância de ligação especifica especifica para a substância a ser doseada e uma substância que compete com a referida substância a ser doseada pela substância de ligação específica é marcada com a enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de transferência de electrões que produz um sinal no referido eléctrodo, e uma amostra é introduzida no referido dispositivo para introdução de amostras para permitir que a referida substância a ser doseada na amostra reaja na referida matriz de modo competitivo com a substância de ligação específica ou com a substância que compete com a referida substância a ser doseada para a referida substância de ligação específica, ou a referida amostra é introduzida na referida matriz depois de deixar que a referida substância a ser doseada na amostra reaja numa área externa da referida matriz de modo competitivo com a substância de ligação específica ou com a substância que compete com a referida substância a ser doseada para a substância de ligação específica, efectuando assim alterações na distribuição de pelo menos uma espécie molecular marcada com enzima de oxidação-redução entre um complexo da substância de ligação específica e a referida substância a ser doseada, um 4 complexo da referida substância de ligação especifica e a substância que compete com a referida substância a ser doseada para a referida substância de ligação especifica, uma forma livre da referida substância de ligação especifica e uma forma livre da referida substância que compete com a referida substância a ser doseada para a referida substância de ligação especifica, e detectando as alterações de distribuição em resposta à quantidade da referida substância a ser doseada na amostra como uma modulação de sinal no eléctrodo, que é limitada pela transferência de massa da espécies de transferência de electrões produzida pela enzima de oxidação-redução.
- 8. Composto representado pela seguinte estrutura quimica ou um sal dele derivado.OH OH
- 9. Composto representado pela seguinte estrutura quimica ou um sal dele derivado.N,N'-BHDPD OH OH
- 10. Método de doseamento electroquimico que compreende a determinação da substância a ser doseada em amostras 5 liquidas utilizando pelo menos uma enzima de oxidação-redução, em que uma enzima de oxidação-redução, um mediador de electrões e um eléctrodo capaz de realizar a transferência de electrões com o referido mediador de electrões são dispostos no sistema de doseamento, e em que é utilizado um composto representado pela seguinte fórmula [II] ou um seu sal como o mediador de electrões: R6 Rl[II] em que R5, R6, R7 e R® podem ser iguais ou diferentes uns dos outros e cada um representa um hidrogénio, grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono, que pode ter um grupo substituinte, com a condição de que pelo menos um de R5, R*>, r7 e R® é um grupo alquilo que tem pelo menos um grupo seleccionado da classe que consiste em hidroxilo, mercapto, carboxilo, fosfonooxi e sulfo, e pelo menos um de R5, R^, r7 e R® é hidrogénio.
- 11. Método de doseamento electroquimico de acordo com a reivindicação 10 em que o referido pelo menos um seleccionado do grupo que consiste em R5, R6, R7 e R® tem um grupo hidroxilo.
- 12. Método de doseamento electroquimico de acordo com a reivindicação 10 em que a referida substância a ser doseada é um substrato, um inibidor, um cofactor ou um activador da referida enzima de oxidação-redução, e uma modulação da reacção enzimática gerada em resposta à 6quantidade do referido substrato, inibidor, cofactor ou activador da referida enzima de oxidação-redução é detectado como uma modulação de sinais electroquimicos no referido eléctrodo.
- 13. Método de doseamento electroquimico de acordo com a reivindicação 10 em que a referida substância a ser doseada é medida por meio de uma reacção de ligação especifica que utiliza pelo menos uma substância de ligação específica especifica para a substância a ser doseada e utilizando a referida enzima de oxidação-redução como um marcador.
- 14. Método de doseamento electroquimico de acordo com a reivindicação 13 em que um dispositivo compreendendo uma matriz como uma área em que é desenvolvida uma amostra líquida presumivelmente contendo a referida substância a ser doseada, um dispositivo para introdução de amostras a partir do qual a amostra é introduzida na referida matriz e um eléctrodo adjacente à referida matriz é utilizado como um dispositivo de doseamento, e a amostra é introduzida no referido dispositivo para introdução de amostras para permitir que a referida substância a ser doseada na amostra reaja na referida matriz com uma primeira substância de ligação específica e uma segunda substância de ligação específica que é marcada com uma enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de transferência de electrões que produz um sinal na porção do eléctrodo, ou a referida amostra é introduzida na referida matriz depois de ter permitido que a substância a dosear na amostra reaja numa área exterior da referida matriz com uma primeira substância de ligação específica e uma segunda substância de ligação específica que é marcada com uma enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de 7transferência de electrões que produz um sinal na porção do eléctrodo, efectuando assim alterações na distribuição de pelo menos uma espécie molecular entre um complexo da segunda substância de ligação especifica marcada com a enzima de oxidação-redução e a referida substância a ser doseada, um complexo da segunda substância de ligação específica marcada com a referida enzima de oxidação-redução, a referida substância a ser doseada e a primeira substância de ligação específica e uma forma livre da segunda substância de ligação específica marcada com a enzima de oxidação-redução, e detectando as referidas alterações na distribuição ocorridas em resposta à quantidade da referida substância a ser doseada na amostra como uma modulação de sinal no eléctrodo, que é limitada pela transferência de massa da espécie de transferência de electrões produzida pela enzima de oxidação-redução.
- 15. Método de doseamento electroquímico de acordo com a reivindicação 13 em que um dispositivo compreendendo uma matriz como uma área em que é desenvolvida uma amostra líquida presumivelmente contendo a referida substância a ser doseada, um dispositivo para introdução de amostras a partir do qual a amostra é introduzida na referida matriz e um eléctrodo adjacente à referida matriz é utilizado como um dispositivo de doseamento, em que cada uma de uma substância de ligação específica específica para a referida substância a ser doseada e uma substância que compete com a substância a ser doseada pela substância de ligação específica é marcada com a enzima de oxidação-redução capaz de formar uma espécie de transferência de electrões que produz um sinal no referido eléctrodo, e uma amostra é introduzida no referido dispositivo para introdução de amostras para permitir que a referida substância a ser doseada na amostra reaja na referida 8 matriz de modo competitivo com a substância de ligação especifica ou com a substância que compete com a referida substância a ser doseada para a referida substância de ligação específica, ou a referida amostra é introduzida na referida matriz depois de deixar que a referida substância a ser doseada na amostra reaja numa área externa da referida matriz de modo competitivo com a substância de ligação específica ou com a substância que compete com a referida substância a ser doseada para a substância de ligação específica, efectuando assim alterações na distribuição de pelo menos uma espécie molecular marcada com enzima de oxidação-redução entre um complexo da substância de ligação específica e a referida substância a ser doseada, um complexo da substância de ligação específica e a substância que compete com a substância a ser doseada para a substância de ligação específica, uma forma livre da substância de ligação específica e uma forma livre da referida substância que compete com a referida substância a ser doseada para a referida substância de ligação específica, e detectando as referidas alterações de distribuição em resposta à quantidade da referida substância a ser doseada na amostra como uma modulação de sinal no eléctrodo, em que a velocidade é limitada pela transferência de massa do mediador de electrões produzido pela enzima de oxidação-redução .9
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35337793 | 1993-12-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT663446E true PT663446E (pt) | 2000-06-30 |
Family
ID=18430431
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT94120907T PT663446E (pt) | 1993-12-29 | 1994-12-29 | Metodo de doseamento electroquimico e composto novo de p-fenilenodiamina |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5609749A (pt) |
| EP (1) | EP0663446B1 (pt) |
| AT (1) | ATE191010T1 (pt) |
| CA (1) | CA2139293A1 (pt) |
| DE (1) | DE69423601T2 (pt) |
| DK (1) | DK0663446T3 (pt) |
| ES (1) | ES2148272T3 (pt) |
| PT (1) | PT663446E (pt) |
Families Citing this family (99)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0781850A3 (en) * | 1995-12-28 | 1998-08-12 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Assay utilizing hydrogen peroxide adduct |
| US6117290A (en) * | 1997-09-26 | 2000-09-12 | Pepex Biomedical, Llc | System and method for measuring a bioanalyte such as lactate |
| US6036924A (en) | 1997-12-04 | 2000-03-14 | Hewlett-Packard Company | Cassette of lancet cartridges for sampling blood |
| US7494816B2 (en) * | 1997-12-22 | 2009-02-24 | Roche Diagnostic Operations, Inc. | System and method for determining a temperature during analyte measurement |
| US6391005B1 (en) | 1998-03-30 | 2002-05-21 | Agilent Technologies, Inc. | Apparatus and method for penetration with shaft having a sensor for sensing penetration depth |
| US6294281B1 (en) | 1998-06-17 | 2001-09-25 | Therasense, Inc. | Biological fuel cell and method |
| US6582583B1 (en) | 1998-11-30 | 2003-06-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Amperometric biomimetic enzyme sensors based on modified cyclodextrin as electrocatalysts |
| GB9905771D0 (en) * | 1999-03-12 | 1999-05-05 | Isis Innovation | Compounds |
| US6464849B1 (en) | 1999-10-07 | 2002-10-15 | Pepex Biomedical, L.L.C. | Sensor for measuring a bioanalyte such as lactate |
| ATE331214T1 (de) * | 1999-10-07 | 2006-07-15 | Pepex Biomedical Llc | Sensor, bestehend aus einer isolierenden ummantelung, enthaltend darin eine vielzahl von leitfähigen fasern, die zumindestens teilweise von einem sensitiven material umgeben sind und hohlräume zwischen den fasern enthalten |
| DE60132390T2 (de) * | 2000-01-27 | 2009-01-15 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma-shi | Biosensor und Verfahren zu seiner Herstellung |
| FR2805545B1 (fr) * | 2000-02-24 | 2002-05-17 | Argene Sa | Procede electrochimique de detection d'acides nucleiques |
| DE10032042A1 (de) * | 2000-07-05 | 2002-01-24 | Inventus Biotec Gesellschaft Fuer Innovative Bioanalytik, Biosensoren Und Diagnostika Mbh & Co. Kg | Elektrochemischer Einwegbiosensor für die quantitative Bestimmung von Analytkonzentrationen in Flüssigkeiten |
| JP4184074B2 (ja) * | 2000-07-31 | 2008-11-19 | 松下電器産業株式会社 | バイオセンサ |
| DE60119133T2 (de) * | 2000-07-31 | 2007-01-25 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma | Biosensor |
| US8641644B2 (en) | 2000-11-21 | 2014-02-04 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Blood testing apparatus having a rotatable cartridge with multiple lancing elements and testing means |
| JP4183902B2 (ja) * | 2000-12-27 | 2008-11-19 | 松下電器産業株式会社 | バイオセンサ |
| US7005273B2 (en) | 2001-05-16 | 2006-02-28 | Therasense, Inc. | Method for the determination of glycated hemoglobin |
| JP4213361B2 (ja) * | 2001-05-22 | 2009-01-21 | パナソニック株式会社 | バイオセンサ |
| US9226699B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-01-05 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Body fluid sampling module with a continuous compression tissue interface surface |
| EP1404235A4 (en) | 2001-06-12 | 2008-08-20 | Pelikan Technologies Inc | METHOD AND DEVICE FOR A LANZETTING DEVICE INTEGRATED ON A BLOOD CARTRIDGE CARTRIDGE |
| US9795747B2 (en) | 2010-06-02 | 2017-10-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Methods and apparatus for lancet actuation |
| AU2002315177A1 (en) | 2001-06-12 | 2002-12-23 | Pelikan Technologies, Inc. | Self optimizing lancing device with adaptation means to temporal variations in cutaneous properties |
| US8337419B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-12-25 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| US9427532B2 (en) | 2001-06-12 | 2016-08-30 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| ES2352998T3 (es) | 2001-06-12 | 2011-02-24 | Pelikan Technologies Inc. | Accionador eléctrico de lanceta. |
| US7025774B2 (en) | 2001-06-12 | 2006-04-11 | Pelikan Technologies, Inc. | Tissue penetration device |
| US7981056B2 (en) * | 2002-04-19 | 2011-07-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Methods and apparatus for lancet actuation |
| US7682318B2 (en) | 2001-06-12 | 2010-03-23 | Pelikan Technologies, Inc. | Blood sampling apparatus and method |
| DE60239132D1 (de) | 2001-06-12 | 2011-03-24 | Pelikan Technologies Inc | Gerät zur erhöhung der erfolgsrate im hinblick auf die durch einen fingerstich erhaltene blutausbeute |
| JPWO2003042680A1 (ja) * | 2001-11-14 | 2005-03-10 | 松下電器産業株式会社 | バイオセンサ |
| EP1452856A4 (en) * | 2001-12-05 | 2006-06-07 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | BIOSENSOR |
| US7331931B2 (en) | 2002-04-19 | 2008-02-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7547287B2 (en) | 2002-04-19 | 2009-06-16 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8267870B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-09-18 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for body fluid sampling with hybrid actuation |
| US7976476B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-07-12 | Pelikan Technologies, Inc. | Device and method for variable speed lancet |
| US7175642B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-02-13 | Pelikan Technologies, Inc. | Methods and apparatus for lancet actuation |
| US8784335B2 (en) | 2002-04-19 | 2014-07-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Body fluid sampling device with a capacitive sensor |
| US7909778B2 (en) * | 2002-04-19 | 2011-03-22 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8702624B2 (en) | 2006-09-29 | 2014-04-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Analyte measurement device with a single shot actuator |
| US7892185B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-02-22 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for body fluid sampling and analyte sensing |
| US8579831B2 (en) | 2002-04-19 | 2013-11-12 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7717863B2 (en) | 2002-04-19 | 2010-05-18 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7297122B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-11-20 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7491178B2 (en) | 2002-04-19 | 2009-02-17 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US9795334B2 (en) | 2002-04-19 | 2017-10-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7198606B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-04-03 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for a multi-use body fluid sampling device with analyte sensing |
| US7371247B2 (en) | 2002-04-19 | 2008-05-13 | Pelikan Technologies, Inc | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8360992B2 (en) | 2002-04-19 | 2013-01-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US9314194B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-04-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| US7648468B2 (en) * | 2002-04-19 | 2010-01-19 | Pelikon Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7232451B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7901362B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-03-08 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7674232B2 (en) | 2002-04-19 | 2010-03-09 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8221334B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-07-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7291117B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-11-06 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7229458B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-12 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US9248267B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-02-02 | Sanofi-Aventis Deustchland Gmbh | Tissue penetration device |
| US7892183B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-02-22 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for body fluid sampling and analyte sensing |
| US7368190B2 (en) * | 2002-05-02 | 2008-05-06 | Abbott Diabetes Care Inc. | Miniature biological fuel cell that is operational under physiological conditions, and associated devices and methods |
| AU2003269635A1 (en) * | 2002-09-20 | 2004-04-08 | Medinnov, Inc. | An analyzer for the simultaneous enzymatic detection of closely related analytes |
| US7265881B2 (en) * | 2002-12-20 | 2007-09-04 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Method and apparatus for measuring assembly and alignment errors in sensor assemblies |
| CA2772050C (en) * | 2002-12-26 | 2016-09-06 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay cartridges and methods of using the same |
| US8574895B2 (en) | 2002-12-30 | 2013-11-05 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus using optical techniques to measure analyte levels |
| US20040211702A1 (en) * | 2003-04-24 | 2004-10-28 | General Electric Company | Water-soluble phenylenediamine compositions and methods for stabilizing ethylenically unsaturated compounds and monomers |
| ES2347248T3 (es) | 2003-05-30 | 2010-10-27 | Pelikan Technologies Inc. | Procedimiento y aparato para la inyeccion de fluido. |
| JP4839569B2 (ja) | 2003-06-05 | 2011-12-21 | ソニー株式会社 | 酵素固定化電極およびその製造方法ならびに電極反応利用装置およびその製造方法 |
| DK1633235T3 (da) | 2003-06-06 | 2014-08-18 | Sanofi Aventis Deutschland | Apparat til udtagelse af legemsvæskeprøver og detektering af analyt |
| WO2006001797A1 (en) | 2004-06-14 | 2006-01-05 | Pelikan Technologies, Inc. | Low pain penetrating |
| JP4611889B2 (ja) * | 2003-06-17 | 2011-01-12 | フアン、アリス・ワイ． | 使い捨て型電気化学センサ・ストリップの構造およびその製造方法 |
| US8282576B2 (en) | 2003-09-29 | 2012-10-09 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for an improved sample capture device |
| WO2005037095A1 (en) | 2003-10-14 | 2005-04-28 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for a variable user interface |
| US7822454B1 (en) | 2005-01-03 | 2010-10-26 | Pelikan Technologies, Inc. | Fluid sampling device with improved analyte detecting member configuration |
| WO2005065414A2 (en) | 2003-12-31 | 2005-07-21 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for improving fluidic flow and sample capture |
| US7780873B2 (en) * | 2004-02-23 | 2010-08-24 | Texas A&M University System | Bioactive complexes compositions and methods of use thereof |
| US8628690B2 (en) * | 2004-02-23 | 2014-01-14 | The Texas A&M University System | Nanoemulsion compositions and methods of use thereof |
| US8828203B2 (en) | 2004-05-20 | 2014-09-09 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Printable hydrogels for biosensors |
| EP1765194A4 (en) | 2004-06-03 | 2010-09-29 | Pelikan Technologies Inc | METHOD AND APPARATUS FOR MANUFACTURING A DEVICE FOR SAMPLING LIQUIDS |
| US9775553B2 (en) * | 2004-06-03 | 2017-10-03 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for a fluid sampling device |
| US8652831B2 (en) | 2004-12-30 | 2014-02-18 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for analyte measurement test time |
| US7885698B2 (en) | 2006-02-28 | 2011-02-08 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and system for providing continuous calibration of implantable analyte sensors |
| WO2009051901A2 (en) | 2007-08-30 | 2009-04-23 | Pepex Biomedical, Llc | Electrochemical sensor and method for manufacturing |
| US8702932B2 (en) | 2007-08-30 | 2014-04-22 | Pepex Biomedical, Inc. | Electrochemical sensor and method for manufacturing |
| WO2009126900A1 (en) | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for analyte detecting device |
| US8506740B2 (en) | 2008-11-14 | 2013-08-13 | Pepex Biomedical, Llc | Manufacturing electrochemical sensor module |
| US8951377B2 (en) | 2008-11-14 | 2015-02-10 | Pepex Biomedical, Inc. | Manufacturing electrochemical sensor module |
| WO2010056878A2 (en) | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Pepex Biomedical, Llc | Electrochemical sensor module |
| US9375169B2 (en) | 2009-01-30 | 2016-06-28 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Cam drive for managing disposable penetrating member actions with a single motor and motor and control system |
| US20100213057A1 (en) * | 2009-02-26 | 2010-08-26 | Benjamin Feldman | Self-Powered Analyte Sensor |
| WO2010116624A1 (ja) | 2009-04-07 | 2010-10-14 | パナソニック株式会社 | センサチップとこれを用いる測定器及び血液検査装置 |
| US8965476B2 (en) | 2010-04-16 | 2015-02-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| US9110053B2 (en) * | 2010-08-20 | 2015-08-18 | Agilent Technologies, Inc. | Dried blood spotting paper device and method |
| US9585605B2 (en) | 2011-05-19 | 2017-03-07 | Pepex Biomedical, Inc. | Fluid management and patient monitoring system |
| WO2012162151A2 (en) | 2011-05-20 | 2012-11-29 | Pepex Biomedical, Inc. | Manufacturing electrochemical sensor modules |
| WO2014089058A1 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Pepex Biomedical, Inc. | Sensor module and method of using a sensor module |
| CN107003264B (zh) | 2014-06-04 | 2020-02-21 | 普佩克斯生物医药有限公司 | 电化学传感器和使用先进印刷技术制造电化学传感器的方法 |
| JP6895139B2 (ja) * | 2016-02-16 | 2021-06-30 | 生化学工業株式会社 | フェニレンジアミン誘導体を用いた電気化学測定 |
| GB2566516A (en) * | 2017-09-15 | 2019-03-20 | Univ Oxford Innovation Ltd | Electrochemical recognition and quantification of cytochrome c oxidase expression in bacteria |
| KR102083421B1 (ko) | 2018-05-04 | 2020-03-02 | 전자부품연구원 | 소변 내 바이오마커의 농도를 전기화학적으로 측정하는 방법 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3921554A1 (de) * | 1989-06-30 | 1991-01-17 | Henkel Kgaa | Klebestift mit verbesserter klebkraft |
| US5286362A (en) * | 1990-02-03 | 1994-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and sensor electrode system for the electrochemical determination of an analyte or an oxidoreductase as well as the use of suitable compounds therefor |
| DE4003194A1 (de) * | 1990-02-03 | 1991-08-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und sensorelektrodensystem zur elektrochemischen bestimmung eines analyts oder einer oxidoreduktase sowie verwendung hierfuer geeigneter verbindungen |
| EP0552223B1 (en) * | 1990-10-10 | 1996-07-17 | Novo Nordisk A/S | Use of benzene derivatives as charge transfer mediators |
| US5182213A (en) * | 1991-03-18 | 1993-01-26 | Miles Inc. | Method for detecting the presence of peroxidatively active substance in basic media |
| DE69219686T2 (de) * | 1991-07-29 | 1997-09-11 | Mochida Pharm Co Ltd | Verfahren und Vorrichtung zur Verwendung in spezifischen Bindungstests |
-
1994
- 1994-12-29 DE DE69423601T patent/DE69423601T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-29 EP EP94120907A patent/EP0663446B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 DK DK94120907T patent/DK0663446T3/da active
- 1994-12-29 ES ES94120907T patent/ES2148272T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 US US08/366,040 patent/US5609749A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-29 AT AT94120907T patent/ATE191010T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-12-29 PT PT94120907T patent/PT663446E/pt unknown
- 1994-12-29 CA CA002139293A patent/CA2139293A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69423601T2 (de) | 2000-07-06 |
| EP0663446A2 (en) | 1995-07-19 |
| EP0663446B1 (en) | 2000-03-22 |
| ES2148272T3 (es) | 2000-10-16 |
| DK0663446T3 (da) | 2000-10-23 |
| DE69423601D1 (de) | 2000-04-27 |
| CA2139293A1 (en) | 1995-06-30 |
| ATE191010T1 (de) | 2000-04-15 |
| EP0663446A3 (pt) | 1995-08-30 |
| US5609749A (en) | 1997-03-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PT663446E (pt) | Metodo de doseamento electroquimico e composto novo de p-fenilenodiamina | |
| US5723345A (en) | Method and device for specific binding assay | |
| CA1296243C (en) | Controlled hue test device | |
| JP2930809B2 (ja) | 特異結合分析方法および装置 | |
| EP0195624B1 (en) | Fluorescent labels and labeled species and their use in analytical elements and determinations | |
| CA1220818A (en) | Assay techniques utilising specific binding agents | |
| MXPA94006538A (en) | Immunoassayo de complementacion enzimaticaelectroquim | |
| ES2224614T3 (es) | Procedimiento de analisis de substrato y biosensor. | |
| US20120325680A1 (en) | Information acquisition apparatus on concentration of thioredoxins in sample, stress level information acquisition apparatus and stress level judging method | |
| JPH07234201A (ja) | 電気化学的測定方法および新規ｐ−フェニレンジアミン化合物 | |
| US4975367A (en) | Catalytic test composition intended to produce a range of colors | |
| WO2018062542A1 (ja) | 電子メディエーター修飾酵素並びにそれを用いた酵素電極、分光学的分析キット及び酵素試験紙 | |
| US9988358B2 (en) | Phenazinium mediators | |
| US20060134608A1 (en) | Chemically amplified electrochemical detection of affinity reaction | |
| KR100869589B1 (ko) | 바이오센서를 이용한 생체 물질의 정량적 측정 방법 | |
| Pace | Surface modification and commercial application | |
| Klingenberg et al. | Interaction of fluorescent adenine nucleotide derivatives with the ADP/ATP carrier in mitochondria. 2.[5-(Dimethylamino)-1-naphthoyl] adenine nucleotides as probes for the transition between c and m states of the ADP/ATP carrier | |
| EP0239926B1 (en) | Rainbow test device | |
| US5041658A (en) | Carboxamido nitrobenzene disulfide compound | |
| US5220035A (en) | Dithiol-(2-nitrobenzoate) indicators | |
| KR920000058B1 (ko) | 가수분해효소 활성을 갖는 물질들의 검출방법 및 약품 | |
| EP0553820A2 (en) | Composition and test strip for measuring peroxidatively active substances | |
| Mosbach et al. | Modulation of the diffusion coefficient of a hapten-modified redox species as a basis for an amplified electrochemical affinity assay | |
| ES2244310B1 (es) | 3-indoxil fosfato como sustrato de las peroxidasas. | |
| JPS62291567A (ja) | 過酸化水素又はそれを生成する被検体の分析に対するメチン染料の使用 |