KR920000058B1 - 가수분해효소 활성을 갖는 물질들의 검출방법 및 약품 - Google Patents

가수분해효소 활성을 갖는 물질들의 검출방법 및 약품 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

가수분해효소 활성을 갖는 물질들의 검출방법 및 약품
제1도 및 제2도는 테스트 담체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
3,5,6,7,13,14,15,16 : 직물 4 : 막
본 발명은 가수분해효소 활성을 가진 물질들을 검출하기 위한 방법 및 본 방법을 수행하는데 적절한 약품, 및 신규 가수분해효소 기질들 및 그들을 제조하는 방법에 관한 것이다.
가수분해효소들은 최근 큰 관심을 모으는 효소들이다. 한편으로, 가수분해효소들은 식물 및 동물 그리고 또한 인간의 물질대사에 중요한 역활을 한다. 이들 생물학적 계중의 어느 하나에서 가수분해 효소의 농도가 그안에 정상적으로 존재하는 농도로부터 벗어나는 경우에는, 이것이 질병의 원인이 될 수 있다. 따라서, 질병이 존재하는 경우에는, 체액(body fluids)에서의 가수분해효소 농도를 측정하므로서 정상치에서 가능한 편차들을 알아내는 것이 임상진단의 임무이다. 바람직하게도, 이것은 지시약 반응에 의해 가수분해효소활성을 측정하므로서 알 수 있다. 상기의 목적을 위해, 조사될 시료를 문제의 가수분해효소에 대한 기질과 혼합한다. 이 기질에서 생성된 생성물의 양은 현존의 가수분해효소에 대한 측정치를 나타낸다.
다른 한편으로, 가수분해효소는 종종 면역학적으로 활성인 화합물들을 표지하는 효소로서 사용된다. 예컨대, β-갈락토시드효소는 면역학적 테스트에서 항체를 표지하는데 특히 다양하게 사용된다(참조. Annals of Clinical Biochemistry, 16, 221/1979). 이러한 종류의 테스트들은 시료중에서 면역학적으로 활성인 검체의 함량을 측정하는데 사용된다. 상기 테스트들은 검체의 농도가 표지물로서 β-갈락토시드 효소와 공유결합을 이루는 적당한 면역성분에 의해 측정되도록 연구되었다. 상기의 테스트를 수행하므로서, 면역상대자의 농도가 측정될 검체의 농도에 직접 좌우됨을 알 수 있었다. 또한 β-갈락토시드 효소로 표지된 면역성분을 β-갈락토시드 효소에 대한 기질과 반응시키는 지시약 반응에 의해 표지된 면역성분의 농도도 볼 수 있게 만들었다.
형성된 생성물의 양은 면역성분의 농도에 비례한다. 공지된 분석물의 농도 및 시료들을 사용하여 생성한 보정곡선의 값과 비교하므로서 시료중의 미지분석물의 농도를 측정할 수 있다.
또한 가수분해효소는 헥산의 검출을 위한 방법에서 헥산을 표지하는 효소로도 사용된다. 표지효소로서 β-갈락토시드 효소를 사용하는 이러한 방법은 독일연방공화국 특허명세서 제29 15 082호에 제시되어 있다. 여기서, 또한, 표지물의 양은 지시약 반응동안에 측정된다.
더욱더, 가수분해효소들은 연구를 위한 약품으로 사용된다. 여기서는 효소의 농도를 신속하고 정확하게 측정할 수 있게 하는 것이 중요하다. 상기의 목적을 위해, 일반적으로 임상진단에서 사용한 방법과 유사한 방법이 사용된다.
통상적으로, 기질은 시료액에서 가용성인 화합물이다. 가수분해효소와의 반응의 경우에, 특성중의 어느 하나 예컨대, 특질적인 광흡수성, 광방출(형광)등이 기질과 다른 생성물이 생성되고, 상기 반응에 의해 측정될 수 있다.
면역학적으로 활성인 물질의 테스트방법의 경우에는, 두가지 기술적인 구현간에 차이가 생기게 된다. 자주 사용되는 구현의 경우에는, 일반적으로 측광조사를 위해 사용되는 크벳에서 검출반응이 일어난다. 그다음 지시약 반응의 평가는 적당한 장치에서 흡수, 방출, 또는 방사능을 측정하므로서 수행된다.
다른 구현의 경우에는, 필요시약들을 처리하였으며 테스트 담체의 일부분들인 하나이상의 직물 또는 막에서 반응이 일어난다. 그다음 지시약 반응동안에 가수분해효소 기질로부터 가수분해효소 활성에 의해 유리된 생성물의 양은 상기와 같은 직물 또는 막에서 직접 측정될 수 있다. 이러한 구현예의 잇점은 상당히 간소화된 단일용액, 즉 시료액만을 사용하여도 본 방법이 수행될 수 있다는 것이다. 형성된 생성물의 양은 특정파장에서의 광흡수를 측정하므로서 비교적 간단히 검출될 수 있다.
본 발명의 목적에 적합한 기질들로는 유럽특허 명세서 제01 46 866호에 제시된 페닐-술포프탈레인일-β-D-갈락토시드들 및 그들의 유도체들이 있는데, 이러한 페놀술포프탈레인 유도체들은 β-D-갈락토시드 효소와의 반응에 의해 유리된다. 기질이 노란색을 갖는 반면에, 생성물은 붉은색을 띤다. 따라서 지시약반응동안, 노란색에서 오렌지색을 거쳐 붉은색 까지의 점차적인 색변화가 일어난다. 색변화가 육안으로는 매우 부정확하게 평가될 수 있으므로, 상기의 측정에 대해서는 적당한 광도계를 사용해야만 한다.
유럽특허 명세서 제0 156 347호에 제시된 레소루핀-β-D-글리코시드들도 또한 기질인데, 상기의 기질과 글리코시드 효소와의 반응의 경우에는 노란색에서 붉은색으로의 색변화가 일어난다. 노란색과 붉은색 사이의 전이영역에서, 특히, 낮은 β-글리코시드 효소활성의 경우에는 육안평가가 주관적인 결과를 야기시키므로 여기서도 역시 평가를 위해 장치를 사용해야 한다. 그러나, 이러한 기구는 매우 복잡하고 값이 비싸다. 레소루핀 글리코시드들부터 형성된 레소루핀은 테스트 스트립으로부터 쉽게 유출되기 때문에, 테스트담체에서 기질로 사용하는 것이 매우 부적합하다.
또한, 단지 형광성의 변화만을 일으키는 가수분해의 경우에는, 가수분해효소 기질, 예컨대, 메틸움벨리페도 갈락토시드도 육안평가에 대해 부적합하다. 메틸움벨리페론 갈락토시드는 테스트 스트립으로부터 쉽게 유출되는 물질을 제공한다.
더욱더, 가수분해효소 활성을 가지는 물질들의 검출방법이 제시되었는데, 여기서, 무색의 가수분해효소기질들을 가수분해효소와 반응시키는 경우에는, 기질이 유색의 생성물로 전환된다. 결과적으로, 이러한 검출반응의 경우에는, 색변화 보다는 색의 형성을 검정하는 것이다. 이는 색 척도인 명암과 더불어 색 세기를 비교하는 간단한 방법으로 알 수 있다. 색맹인 사람들 조차도 이러한 테스트를 평가할 수 있다.
5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-갈락토시드가 그러한 기질이다. 이 기질은 생성물을 산화 및 분해한 후에 생성되고, 테스트 담체로부터 많이 유출되지 않는다. 그러나, 기질 그 자체는 낮은 수용성을 갖으며, β-갈락토시드 효소에 의해서만 서서히 분해된다. 따라서, 그 결과되는 색의 형성은 그다지 강하지 못하다. 그러므로, 상기에 의해 시행한 테스트는 신속한 육안 평가에 대해 부적합하다.(참고문헌, Biochem. Z., 333, 209/1960)에서의 화합물들은 기질로 제시되었고. 이들의 가수분해는 페놀들을 유리시킨다. 그러나, 이들은 테스트 담체로 부터 쉽게 유출된다. 니트로페놀의 경우에는, 다소 진한 노란색이 지시약 반응동안 전개된다. 또한 이러한 파장의 경우에서는, 적은 농도범위의 육안 평가가 그다지 바람직하지 못하다.
잘 볼수 있게 만들기 위해, 추가적인 반응에서 유리된 페놀들을 아미노안티피린 또는 메틸벤조티아조리논히드라존(참고문헌, Anal. Hiochem., 40, f81/1971), 또는 아조늄염들과 산화적으로 결합시켜 착색된 아조물질들을 수득한다; (참고문헌, 예컨대, Histochemie 37 89/1973). 일반적으로, 착색된 물질의 일부는 그다지 쉽게 유출되지 않기 때문에, 테스트 담체내에서 사용하는 것이 적절하지만, 결합반응의 사용이 기타 다른 이유들로 인해 불리해진다. 따라서, 직물 또는 막에서 테스트를 수행하기 위해서는 이러한 추가반응동안 필요한 모든 시약들을 직물에 처리하거나 막에 혼입시켜야 한다. 많은 시약들, 예를들면 결합성분들은 테스트를 수행하는 것을 복잡하게 하고 수많은 단점과 난점을 야기한다. 따라서. 각각의 경우에, 시약들이 시료용액의 다른 성분과 서로 너무 이르게 또는 비특이적으로 반응하지 않게 주의해야만 한다. 따라서, 아미노안티피린 또는 메틸벤조티아조리논 히드라존을 조사할 요중에 존재하는 성분들과 반응시킨 결과 상기 측정이 왜곡된다. 디아조늄염들과 같은 다른 결합성분들은 저장 안정성을 감소시킨다. 시약들을 선택하는 경우에는, 이들이 고유의 색을 미리 갖지 않도록 고려해야 한다.
얼마간의 염료들이 형성되는 경우에, 테스트 담체상에서 생기는 유출 현상은 색이 세기가 직물 또는 막위의 모든 위치에서 같지않은 결과를 제공하는데, 이는 평가에 불리점을 제공한다. 따라서, 측정값들이 왜곡된다.
그러므로, 상기에서 기술된 불리점을 제거하고, 가수분해효소 활성을 갖는 물질을 테스트 담체위에서 간단하고, 신속하며 보다 신뢰성이 있는 방법으로 측정할 수 있게 하는 방법이 요구된다.
본 발명의 목적은 상기의 요구를 충족시키기 위한 것이다.
따라서 본 발명에 따라, 시료를 가수분해효소 기질 및 산화제와 혼합하고, 얻어진 색의 세기를 평가하므로서, 시료중에서 가수분해효소 활성을 가진 물질들을 검출하는 방법이 제공된다; 여기서, 가수분해효소기질로서는 하나이상의 다음일반식(Ⅰ)의 화합물이 사용된다.
Figure kpo00001
상기식에서, R1은 수소원자 또는 알콕시기이고, R2는 수소원자, 할로겐원자, 알콕시기, 아랄콕시기 또는 아미노그룹이고, R3, R4, R5및 R6은 같거나 다르며, 수소원자, 할로겐원자, 알킬기, 알콕시기, 아랄콕시기, 알콕시카르보닐기, 알킬카르보닐기, 카르복시그룹, 카르바모일그룹, 술포그룹 또는 아미노그룹이고, X는 글리코실, 인산염 또는 아실기이며, R2와 R3, R3와 R4, R4와 R5, 및 R5와 R6은 각각 서로 연결되어 고리구조를 형성하지만, 단, R1및 R2기들중 최소한 한기는 수소원자이고, R1, R2및 R3중 최소한 한기는 수소원자가 아니다.
알콕시기 R1, R2, R3, R4, R5및 R6들로는, 바람직하게는 직쇄 또는 측쇄된 C4이하의 알콕시, 특히 바람직하게는 메톡시, 이소프로폭시, n-프로폭시 및 n-부톡시들이 있다.
알콕시기 R1, R2, R3, R4, R5및 R6들은 비치환되거나 한번이상 치환될 수 있다. 바람직한 치환체들로는 할로겐원자들 및 아미노그룹들이 있다. 바람직하게 치환된 기로는 1,1,1-트리플루오로-2-에톡시 및 1-브로모-2-에톡시기들이 있다. 또한, 알콕시기들은 -O- (CH2.CH2O)n-R7기, 또는 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물을 나타낼 수 있는데, 여기서 n은 1 내지 3이고, R7은 수소 또는 C4이하의 알킬기, 바람직하게는 메틸기이다.
알킬기 R3, R4, R5및 R6들로는, 바람직하게는 C4이하의 탄화수소기들, 특히 바람직하게는 메틸기가 있다.
아르알콕시기 R2, R3, R4, R5및 R6들로는, 바람직하게는 알킬부가 C4이하이고 아릴부가 C6-C10인 탄화수소, 특히 바람직하게는 벤질옥시기가 있다.
R2, R3, R4, R5및 R6들이 할로겐으로 정의될 때, 할로겐으로는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 염소가 있다.
알킬카르보닐기들중의 알킬부들은 C4이하의 알킬이고, 또한, 알콕시카르보닐기들중의 알콕시부들은 C4이하의 알킬인 것이 바람직하다.
카르바모일기들 뿐만 아니라 아미노기 R2, R3, R4, R5및 R6들은 비치환되거나 1 내지 2 치환될 수 있다. 바람직한 치환체들로는 아실기들 및 비치환되거나 치환된 알킬기들이 있고, 아실기로서 특히 바람직한 것은 아세틸기들이다.
글리코실기 X들로는 헥소오스피라노오시드 계열들의 단당류, 올리고당류 및 다당류가 있고, 단당류기들이 바람직하다. 헥소오스피라노기드들로는 바람직하게 글루코시드 및 갈락토시드기들이 있다. 이들중 β-글리코시드들이 특히 바람직한 것으로 입증되었다.
아실기 X들로, 바람직한것은, 직쇄 또는 측쇄된, 치환되거나 비치환될 수 있는 C20이하의 탄화수소가 있고, 특히 바람직한 것은 아세틸기이다. 또한, 아실기들로는 아미노아실기들이 있고, 바람직한 아미노아실기들로는 카르보닐작용기에 의해 결합되는 천연적으로 존재하는 α-L-아미노산들의 잔기들이 있다. 아미노산들의 유리된 극성잔기, 예컨대, 아미노 작용기들은 적당한 보호기들로 보호될 수 있다. 특히 바람직한 아미노산 잔기로는 아미노 작용기상에 토실기가 치환된 알라닐 잔기가 있다.
인산염기로는 -PO3H2기와 그것의 염들이 있다. 양이온으로 하전된 모든 이온들은 상기 염들에서 양이온으로서 작용할 수 있다. 바람직한 것으로는 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄이온들이 있고, 특히 바람직한 것으로는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘이온들이 있다.
R2와 R3가 연결되어 고리구조를 형성하는 경우에는, 6원자고리가 얻어지도록 R2및 R3기들의 산소원자들 또는 아미노그룹들을 결합하는 화합물들이 바람직하다. 이렇게 형성된 바람직한 고리들로는, 특히, 2,2-디메틸-1,3-디옥신 및 2,2-디메틸-3-옥사진고리들이 있다.
R3와 R4또는 R5와 R6이 연결되어 고리구조를 형성하는 경우에, 고리구조로서 바람직한 것은 방향족 구조이고, 특히 바람직한 것은 벤젠화된 화합물이다.
R4와 R5가 연결되어 고리구조를 형성하는 경우에는, 5원자 또는 6원자 고리구조가 바람직하다.
상기의 일반식(Ⅰ)의 화합물들은 다음 일반식(Ⅱ)의 화합물과 다음 일반식(Ⅲ)의 화합물을 반응시켜 제조할 수 있다;
Figure kpo00002
상기식에서, R1내지 R6및 X는 상기에서 정의된 의미를 갖고, Y는 반응그룹이다.
X가 글리코실기인 경우에는, 반응동판 산화반응에 매우 민감한 아글리콘성분(Ⅱ)의 산화반응을 제거하는 방법이 사용되어져야 한다. 은염 또는 산화제로 작용하는 중금속염들을 사용하는 쾨니히-노르반응과 같은 종래의 방법과 거기서부터 유도된 유사한 방법은 사용된 나프톨유도체들은 착색된 물질로 즉시 산화시킬 수 있기 때문에 본 경우에서는 사용될 수 없다.
수산화 알칼리금속 수용액내에서 상기 일반식(Ⅱ)의 나프톨들을 일반식(Ⅲ)의 활성화된 당과 반응시킨다. Y로는 특히 잘 제거되는 친핵성 그룹, 예컨대, 할로겐, 특히 불소, 염소 또는 브롬, 또는 술포닐옥시기, 특히 톨루엔 술포닐옥시 또는 메탄술포닐옥시기인 화합물들이 특히 적합하다는 것이 증명되었다. 따라서, 반응동안에 적절한 보호기로 보호된 나프틸기상의 아미노그룹들 또는 당의 유리된 히드록실 그룹들을 유지하도록 하는 것이 바람직하다는 것이 증명되었다.
X가 아실기인 경우에는, 특유의 페놀들을 유기 카르복실산들과 반응시키는 방법, 및 알코올들로부터 에스테르들을 제조하는 방법에 대해 공지된 방법들이 사용될 수 있다. 에스테르화(반응)전에, 아미노산들의 작용기를 적절한 보호그룹들에 의해 보호하는 것이 바람직하다. 반응후, 보호그룹들은 다시 분리시킬 수 있다. 반응기 Y로는 특히 잘 제거되는 친핵성그룹들이 바람직한데, 할로겐, 알코올레이트 및 카르복실레이트가 특히 유리하다. 이러한 제법은, 예컨대, (참고문헌, Liebigs Ann. Chem., 1984, 319-339) 및 유럽특허 명세서 제0,039,880호에 제시되어 있다.
X가 인산염 잔기인 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물들의 제조를 위해서는 상기 일반식(Ⅲ)의 화합물들이 특히 바람직한데, 여기서, X는 -POZ2또는 -PZ2기 (여기서, Z는 쉽게 제거될 수 있는 그룹이다), 특히 C4이하의 알코올레이트 또는 염소, 브롬 또는 요오드이고, Y는 할리드잔기, 특히 염소, 브롬 또는 요오드, 또는 알코올레이트이다. 일반식 X-Y의 화합물로는 옥시염화인이 특히 바람직하다. 일반식(Ⅱ)의 화합물의 유리된 아미노그룹들은 보호그룹들에 의해 바람직하게 보호되고, 보호그룹은 반응후에 분리시킬 수 있다.
공지된 가수분해법으로, X가 -POZ2또는 -PZ2그룹인 화합물들을 인산염들로 전환할 수 있다.
인산염들의 염들은 통상적인 방법, 예컨대, 이온교환에 의해 산들로부터 제조될 수 있다.
일반식(Ⅱ) 및 (Ⅲ)의 화합물들은 공지된 화합물이거나 유기합성의 통상적인 방법들에서 유사하게 제조될 수 있는 화합물들이다(참고문헌, Liebigs Ann. Chem., 319/1984; 2420/1985; 1847/1985: 251/1985; 140/1980; 297/1987; 1321/1980; Z. Natruforsch., 40b, 534/1985; 41b, 377/1986). 특히, 4-메톡시-1-나프톨은(참고문헌, J. prakt. Chem., 62, 30/1900)에서 공지되었고, 이는 산화반응에 의해 푸른 착색물질(이른바, Russig′s 인디고에)로 전환될 수 있다. 이러한 산화반응은(참고문헌, 분석화학, 36, 2494/1964)에서 과산화효소의 검출을 위해 사용된다.
따라서, 비록 4-메톡시-1-나프톨이 산화적으로 착색된 물질로 전환되는 가능성뿐만 아니라 얼마간의 4-메톡시-1-나프톨 유도체들이 수년동안 공지되었다하더라도, 가수분해효소 활성을 가진 화합물들을 검출하기 위해, 그 이상의 짝지움 원소의 첨가없이 착색된 물질의 형성을 거의 산화적으로 일어나게 하는 방법들에서는 가수분해효소 기질들로서 메톡시나프톨 유도체들이 사용될 수 없었다.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 신규화합물들은 가수분해효소 기질로서 아주 적합하다. 상기 화합물들은 수용성, 무색이고 가수분해효소와 접촉하지 않는한 안정하다. 비이상적인 수 용해도가 바람직하다면, 하나 또는 그 이상의 잔기 R3, R4, R5및 R6가 극성그룹, 예컨대, 카르복시 또는 술포그룹인, 일반식(Ⅰ)의 화합물들을 사용하는 것이 바람직하다.
용매의 극성을 낮추므로 단점이 기인되는 경우에, 친지성 잔기들을 축적하므로서 기질의 수-용해도가 크게 감소되는 화합물들도 가수분해효소 기질들로서 사용될 수 있는데, 적절한 유기용매 또는 세제를 첨가하므로서 일어나는 반응은 용해도를 다시 증가시킨다.
화합물이 가수분해효소 활성을 갖는 문제의 물질과 반응할 때, 물을 흡수하면서 기질로부터 형성된 두개의 생성물들은 가수분해효소 기질로서 설명한다. 따라서, 상기 반응은 효소반응 속도론에서 알려진 법칙을 따른다. 기질들은 가수분해효소 활성을 갖는 물질을 포함하는 용액에서 반이상이 용해되어야 한다는 것이 필수적이다.
본 발명에 따른 방법에서 가수분해효소 기질로서는, 분자성분 X가 대응하는 가수분해효소의 고유기질의 분자성분과 유사한 일반식(Ⅰ)의 화합물들이 특히 바람직하다. 따라서, 예컨대, β-갈락토시드효소 기질들로서는 X가 β-갈락토시드잔기인 일반식(Ⅰ)의 화합물들, 에스테르 가수분해효소 기질들로서는 X가 아실기인 일반식(Ⅰ)의 화합물들, 포스파티드 가수분해효소 기질들로서는, X가 인산염 잔기인 일반식(Ⅰ)의 화합물들이 특히 바람직하다.
가수분해효소 활성을 갖는 기질들은 물을 소비하면서 화합물들을 두개의 생성물들로 분해할 수 있는 것들이다. 천연적으로 존재하며 인공적으로 생산된 가수분해효소들은 여기에선 주요효소 3급에 속한다.
본 발명에 따른 방법들은 특히, 글리코시다아제, 바람직하게는 갈락토시다아제 및 에스테르 가수분해효소, 지방분해효소, 포스파티드 가수분해효소의 검출에 대해 유용하다는 것이 입증되었다.
가수분해효소 활성을 갖는 기질들은 이들 가수분해효소들과 함께 다른 화합물들, 예컨대, 면역학적으로 활성인 화합물들 또는 헥산들을 의미하는 것이다. 면역학적으로 활성인 화합물들에는, 예컨대, 헵텐들, 항원들, 항체들 및 면역복합체들 뿐만아니라, Feb 및 F(ab′)2단편들과 같은 항체들의 단편들도 속한다. 면역학적으로 활성인 화합물들을 가진 가수분해효소들의 화합물들은 가수분해효소 접합물로서 언급되고, 그것에 의해 가수분해효소는 면역학적으로 활성인 화합물을 표지하는데 사용된다. 본 발명에 따른 방법은 표지물인 알칼리 또는 산성 포스파티드 가수분해효소 또는 β-갈락토시다아제로 면역학적으로 활성인 화합물들을 검출하는데 특히 적합하다.
시료는 고체 흑은 액체 시료인 것이 바람직하다.
고체 시료의 경우에는, 가용성 시료와 실제로 불용성인 시료간에 차이가 있다.
가용성 시료는 검출동안 액체 시료로 바람직하게 전환된다.
실제로 불용성인 시료는 가수분해효소 활성을 갖는 물질을 결합한 외면 또는 내면상의 고체물질을 바람직하게 의미하는 것이다. 결합성분은 본 발명에 따른 방법에 대해 중요하지 않다. 결합성분은 예컨대, 공유결합 뿐만아니라 이온결합 또는 흡착결합 또는 생체 특이 결합일 수 있다. 생체 특이결합들은 생물학적 결합성분들 사이의 결합들, 예컨대 당원 또는 합텐과 항체, 비오틴과 애비딘 또는 스트렙타비딘과 보조 헥산들로서 작용하는 기질들 사이의 결합들이다.
검출하고자 하는 가수분해효소를 갖는 기질들의 액체시료는 실제로 수용액들임을 의미하는 것이다. 이러한 용액들은, 예컨대, 물에 용해된 가수분해효소 또는 가수분해효소 접합물의 용액들 일 수 있다. 저장 안정성을 증가시키기 위해 종종 염들, 세제들등과 같은 혼합물(제)를 상기의 용액에 가한다. 본 발명을 따르는 방법들로 이러한 용액들을 사용할 수 있다. 액체 시료는 성분의 첨가 또는 분리에 의해 얻어지는 체액 또는 액체일 수 있다. 이들 액체로는, 예컨대, 혈액, 혈장, 혈청, 요가있다.
바람직하게는, 액체시료가 면역학적 테스트 방법동안의 결과물들과 같은 액체일 수도 있다. 예컨대, 이러한 것들은(참고문헌, Annals of Clinical Biochemistry, 16, 221/1979)에 제시되어 있고, 그들의 더욱더 유리한 개발들은 면역검정의 분야에서의 당업자에게 잘 알려졌다. 가수분해효소 활성을 가지는 기질들도 본 발명에 따르는 방법으로 상기의 액체들에서 검출될 수 있다. 완충물질들, 안정화제, 적심제등을 포함하는 이들 용액들은 검출을 결정적으로 방해하지 못한다.
가수분해효소 활성을 갖는 물질들의 농도는 10-6내지 10-15몰/리터, 특히 바람직하게는 10-6내지 10-12몰/리터에서 유리하게 측정될 수 있다.
본 방법은 pH값이 5 내지 11, 바람직하게는 6 내지 10인 시료용액에 대해 사용될 수 있다. 본 방법에서 최적 pH값은 사용된 가수분해효소에 좌우되어 수행된다. 본 방법을 신속히 수행하기 위해서는, 가수분해효소가 최대 활성을 나타내는 pH값에서 또는 그 근처에서 사용되는 것이 바람직하다. 상기의 pH범위 밖에서는, 현저한 비-효소적 가수분해 또는 가수분해효소의 불활성화가 일어날 수 있다.
검출반응은 흡수 또는 팽윤할 수 있는 담체에서 바람직하게 수행된다. 이러한 담체들로는, 예컨대, 직물 또는 막들이 있는데, 직물이 바람직하다. 직물은 섬유로 만들어진 종이와 같은 물질을 의미하는 것이다. 섬유물질들로서는, 셀룰로오스, 합성수지들 또는 그들의 혼합물들이 바람직하게 사용된다. 스폰지와 같은 담체 및/또는 다공성 담체들도 사용된다.
그러나, 본 발명은 바람직한 어떤 형태의 용기, 예컨대, 크벳에서 수행된다. 반응과정이 흡수 광도계에 의해 측정되는 경우에는, 형성된 생성물이 반응매질내에서 수용성인 일반식(Ⅰ)의 화합물들이 특히 바람직하다. 한가지 가능성은 하나이상의 R4, R5및 R6잔기가 극성그룹, 예컨대 카르복시 또는 술포그룹인 일반식(Ⅰ)의 화합물들을 사용하는 것이다. 용액에서 가수분해효소 활성을 갖는 물질들을 검출하는 또다른 가능성은 반응매질의 극성을 갖추는 용매들, 예컨대 유기용매들 또는 세제들을 첨가하는 것이다. 이들 추가적인 성분들의 단점을 고려한다면, 가수분해효소 생성물들의 용해도가 증가된다.
지시약 반응동안의 색의 전개를 위해, 산화제의 존재가 필요하다. 산화제로서는 특히 유리하다는 것이 입증된 유리된 나프톨, 시안화 제2칼륨, 퍼보레이트/퍼옥시다아제, 퍼옥사이드/퍼옥시다아제, 테트라아조리움염들 및 산소/빌리루빈 옥시다아제에 대해 상기의 pH값에 존재하는 산화전위물질들 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해, 적절한 가수분해효소 기질 및 산화제를 시료와 혼합했다.
가수분해효소와 시료의 혼합은 다양한 방법으로 생길 수 있다.
가수분해효소 기질 및 산화제와 시료의 혼합은 동시에 또는 연속적으로 일어날 수 있다.
액체시료, 예컨대 가수분해효소 활성을 갖는 물질의 용액의 경우에는, 가수분해효소 기질 또는 산화제가 고체물질, 예컨대, 분말, 정, 동결건조염의 형태로, 또는 용액으로 시료에 첨가될 수 있다.
검출반응이 흡수 또는 팽윤할 수 있는 담체에서 수행된다면, 가수분해효소 기질 뿐만아니라 산화제 및 추가적인 물질들이 침투된 담체에 시료를 처리하는 것이 실제로 바람직함을 입증하였다. 침투를 위해, 상기의 물질과 함께 침투된 담체물질의 용액을 제조하였는데, 침투된 담체물질은 차후에 건조된다.
담체가 막인 경우에는, 막의 생성동안 가수분해효소 기질뿐만 아니라 산화제 및 추가적인 물질들을 미리 주입한다.
산화제가 가수분해효소 기질과 함께 존재하지 않는다면, 가수분해효소 기질과 시료를 혼합하기에 앞서 또는 혼합한 후에 시료와 산화제를 혼합한다.
검출반응이 용기내에서 일어난다면, 가수분해효소 기질을 고체형태로 또는 산화제 및 추가적인 물질들과 함께 혼합된 용액으로서 사용하는 것이 실제 바람직함을 입증하였다. 또한, 여기서 산화제 및 추가적인 물질은 따로따로 가해질 수 있다.
고체시료의 경우, 예컨대 가수분해효소 활성을 갖는 물질이 담체에 결합되는 경우에는, 가수분해효소 기질 및/또는 산화제를 용액의 형태로 시료에 가하는 것이 바람직하다. 그러나, 먼저 성분들을 혼합한 다음용액을 제조하기 위해 액제를 가할 수도 있다
성공적인 검출반응을 위해 중요한 것은 효소반응이 일어날 수 있도록 가수분해효소 기질과 시료내에 존재하는 가수분해효소활성을 갖는 물질을 접촉시키는 것이다.
지시약 반응동안, 치환체의 성질에 좌우하여 강한 착색이 형성되는데, 이는 붉은색에서 푸른색을 거쳐 청록색에 이른다. 색세기는 광도계로 통상적인 방법에 따라 측정될 수 있지만, 실제로는 반사 광도계로 측정될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 지시약 반응의 생성물이 흡수될 수 있는 파장의 빛을 조사한다. 550 내지 750nm, 특히 600 내지 700nm의 파장이 바람직하다.
가수분해효소활성을 갖는 물질들의 공지된 농도 및 시료들에 대한 측정값으로 얻어진 보정곡선의 값들과 특정농도와 관련시킨 색세기를 비교한다. 이러한 비교는 계산기를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.
색의 변화보다는 색의 전개를 관찰해야만 한다면, 육안평가도 가능하다. 이는 장치가 사용될 필요가 없다는 잇점을 갖는다. 따라서, 장치의 오용등과 같은 가능한 오차 원인들이 나타나지 않는다.
본 발명에 따른 이러한 방법은 가수분해효소활성을 갖는 물질들의 정량적인 검출뿐만 아니라 정성적인 검출을 위해 사용할 수 있다. 정량분석을 위해서는, 색변화가 일어나는지를 관찰한다. 정성분석을 위해서는, 한정된 농도와 관련시킨 색척도와 고정된 시간에서의 색을 육안으로 비교한다.
본 발명에 따른 방법은 시험담체상에서 특별한 잇점들을 가지고 사용될 수 있다. 그러한 잇점들은, 예컨대 방법이 간단하고 값이 싸다는 것이지만, 그럼에도 불구하고 신빙성있는 결과들을 제공한다. 육안으로 평가될 수도 있는 이러한 방법은 간단하므로 값비싼 장치가 필요하지 않는다. 이는 테스트 담체들상에 유출현상이 일어나지 않기때문에 특히 신빙성이 있고, 많은 잇점을 갖는다.
테스트 담체들은 테스트를 수행하므로서 물질들을 검출하는 약품들을 의미하는 것이다. 일반적으로, 그들은 테스트동안 필요한 시약들을 처리한 기저판 또는 막, 보통 직물 또는 막들로 이루어졌다.
본 발명에 따른 방법에서는 추가의 결합성분들, 예컨대 디아조늄염들 없이 사용할 수 있는데, 그 이유는 이들이 부반응 또는 안정성의 감소를 야기시키기 때문이다.
면역학적 테스트 방법들의 경우에는, 가수분해효소 활성을 갖는 물질들 및 특히, 가수분해효소접합물의 함량에 대해 조사되는 시료들이 얻어진다.
따라서, 가수분해효소활성을 갖는 물질의 검출을 위한 본 발명에 따른 방법으로, 예컨대 검체의 검출을 위한 면역학적 방법들과 같은 특유의 용도를 알 수 있다. 이러한 방법들은 면역검정 분야의 당업자에게 공지되어 있다.(참고문헌, 예컨대, Annals of clinical chemistry, 16, 221/1979). 가수분해효소가 표지된 면역학적으로 활성인 화합물들의 필요한 측정이 본 발명에 따른 방법으로 수행되도록 상기 방법들을 변경시킨다. 예를들어, 다음을 언급할 수 있다:검체가 항원 또는 합텐인 경우에는 다음 방법들이 유용하다는 것이 입증된다:검체에 대한 항체와 가수분해 효소의 접합물 초과량을 검체를 함유하는 시료용액과 혼합하여, 검체와 접합물로 이루어진 면역착물을 형성한다. 면역반응으로 초과량의 접합물을 초과량의 검체 또는 검체동등물과 결합된 담체에 결합시킨다. 가수분해효소의 접합물과 면역복합체를 함유하는 용액을 담체로부터 분리하고, 본 발명의 방법에 따라 처리한다. 가수분해효소 접합물에 대해 얻어진 실험결과를 기초로하여 검체의 존재 또는 양을 알아낼 수 있다. 또다른 가능성은 담체에 결합한 가수분해효소 접합물과 항체의 검출이다. 이것도 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 가능하다.
검체에 대한 항체와 가수분해효소의 접합물 초과량을 검체를 함유하는 시료용액과 혼합하여, 검체와 접합물의 면역착물을 형성한다. 면역반응으로 초과량의 접합물을 초과량의 또다른 검체에 대한 항체에 결합시킨다. 초과량의 가수분해효소와 항체의 접합물을 함유하는 용액을 담체로부터 분리하고, 본 발명에 따른 방법에 따라, 담체에 결합한 가수분해효소와 면역착물의 접합물, 또는 용액내에 포함된 가수분해효소와 항체의 접합물이 측정된다.
검체를 함유한 시료용액을 공지된 양의 검체 또는 검체 유사물 및 가수분해효소의 접합물과 혼합한다. 검체 및 접합물의 합으로 언급되는 검체동등물 및 검체에 대한 항체를 불충분하게 결합한 담체에 상기 화합물을 처리한다.
검체와 접합물의 일부가 담체에 결합된다. 본 발명의 방법에 따라, 용액의 분리후에 담체에 결합한 접합물 또는 용액중에 존재하는 접합물을 검출할 수 있다.
검체가 항체인 경우, 상기와 동일한 원리를 사용할 수 있지만, 항체대신에, 상기의 방법에서 항체에 대해 지시된 항원 또는 항체를 사용해야만 한다.
검체의 검출을 위한 면역학적 방법에서, 본 발명의 방법에 따르는 가수분해효소 접합물의 검출을 한 다음, 평가를 한다. 정량적인 평가의 경우에, 검출된 가수분해효소 접합물의 존재 또는 양으로부터, 각각, 즉 최초에 사용된 시료중에서 검체의 존재 또는 양을 감소시킬 수 있다. 이것은, 예컨대, 보정곡선에 의해 일어날 수 있다.
더구나, 본 발명에 따르는 방법을 헥산의 검출시 가수분해효소에 대하여 활성을 가지는 물질의 검출을 위해 사용할 수 있다. 이러한 방법들을 헥산혼성화 테스트의 분야에서 사용함이 공지되어 있다. 이들 테스트에서, 효소표지물로서 가수분해효소에 결합되는 단일-가닥 또는 이중-가닥 헥산들, 특히 DNA 또는 RNA 또는 이들의 단편들이 검출되는데, 이들의 양은 검출될 헥산의 농도에 대한 척도가 된다. 이러한 가수분해효소가 표지된 헥산의 검출은 가수분해효소에 대하여 환성을 가지는 물질을 검출을 위한 본 발명의 방법에 따라 유리한 방식으로 일어난다.
이러한 신규의 면역학적방법 및 헥산의 검출을 위한 신규방법의 잇점은 가수분해효소에 대하여 활성을 가지는 물길의 검출을 위한 본 발명에 따르는 방법의 잇점으로부터 나타난다.
또한, 본 발명은 가수분해효소에 대하여 활성을 가지는 물질의 검출을 위한 약품을 제공한다. 이러한 약품은 산화제가 먼저, 동시에 또는 차후에 부가되는 시료중에서 가수분해효소에 대하여 활성을 가지는 물질의 검출을 위하여 사용할 수 있다.
적어도 하나의 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 산화제를 함유하는 것이 가수분해효소에 대하여 활성을 가지는 물질의 검출용 약품으로서 바람직하다.
더구나, 상기의 약품은 실제의 검출반응을 위하여 반드시 필요하지는 않지만 유리한 작용을 미치는 첨가제를 함유할 수 있다. 이러한 것들은 특히 검출반응을 일정한 pH 값에서 수행시키는 완충제를 함유한다. 또한, 상기의 약품은 담체물질에 대하여 균일한 습윤을 일으키는 적심제 및 세제를 함유한다.
본 발명에 따르는 약품은 하나이상의 흡수성 담체 또는 팽윤할 수 있는 담체로 바람직하게 이루어진다. 이러한 담체들로는, 예컨대, 직물 또는 막이 있는데 직물이 바람직하다. 외과용 살균가제 유사담체 또는 다공성 담체도 사용할 수 있다.
이러한 약품들은 가수분해효소 기질 및 산화제가 단독으로 또는 배합되어 침투되거나, 막인 경우에, 이들속으로 투입되는 하나이상의 흡수성 담체 또는 팽윤할 수 있는 담체를 바람직하게 함유한다. 이러한 약품은 공지방법에 따라 제조된다.
임의로 존재할 수 있는 첨가제, 및 가수분해효소 기질 및 산화제는 차치하고, 본 발명에 따르는 약제는 용매 역시 함유할 수 있으며, 바람직한 용매는 물이다. 여기에서도, 역시, 가수분해효소 기질 및 산화제는 단독으로 또는 배합되어 용액으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 약품은 하나이상의 분말 또는 분말혼합물의 형태로 존재할 수 있다. 가수분해효소 기질 및 산화제는 차치하고, 이러한 약품은 불활성이며 가용성인 추출충전 물질. 예컨대 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콘 및 유사물을 바람직하게 함유할 수도 있다. 상기의 분말 또는 분말혼합물을 타블렛으로 압입할 수도 있다.
이러한 약품을 가수분해효소에 대하여 활성을 나타내는 물질의 검출을 위한 방법에서 사용할 수 있다.
β-갈락토시드분해효소에 대하여 활성을 나타내는 물질의 검출을 위하여, 다음 일반식(Ⅳ)의 화합물(여기서 X′는 β-갈락토시드잔기임)이 특히 바람직하며, 이들은 신규의 화합물이다.
그러므로, 본 발명은 다음 일반식(Ⅳ)의 화합물들도 제공한다:
Figure kpo00003
상기식에서, R1, R2, R3, R4, R5및 R6는 상기와 같은 의미를 가지며 X′는 β-갈락토시드잔기이다.
상기 화합물은 이들이 β-갈락토시드 분해효소의 기질이 되기 때문에, β-갈락토시드 분해효소에 대하여 활성을 나타내는 물질의 검출을 의한 본 발명에 따르는 방법에서 유리하게 사용될 수 있다는 특성을 갖는다.
또한, 본 발명은 다음 일반식(Ⅱ)의 화합물을 다음 일반식(Ⅴ)의 화합물과 반응시키는 것으로 이루어지는 일반식(Ⅳ)의 화합물의 제조방법을 제공한다:
Figure kpo00004
상기식에서 R1내지 R6은 상기 같은 의미를 가지고, X′는 β-갈락노실잔기이며, Y는 아미도 보호기의 용도를 가지는 반응성이 큰 기이다.
또한 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 화합물(여기서, R1, R2, R3, R4, R5, R6및 X는 상기와 같은 의미를 가짐)을 가수분해효소 활성을 갖는 물질치 검출방법에 사용하는 방법에 관한 것이다.
다음 실시예들은 본 발명을 예시하는 목적을 위해 제시된다.
[실시예 1]
a) 4-메톡시-1-나프틸-2,3,4,6-테트라-0-아세틸-β-D-갈락토피라시드
200ml 아세톤에 96.1g(233.6mMole) 아세토브로모 갈락토오스(1-브로모-2,3,4,6-테트라-0-아세틸-α-D-갈락토피라노오스:Fluka)를 용해했고, 질소에 통과시켜 환원시켰다. 용액을 연속적으로 저으면서 끓을 때까지 가열한 다음, 매경우 10분내에 먼저 13ml물에 녹인 14.3g(254.9mMole) 수산화칼륨을 용액을, 후에 200ml 아세톤에 녹인 18.5g(106.2mMole) 4-메톡시-1-나프톨용액을 한방울씩 가했다; [참조. Liebigs Ann. Chem., 140/1980]. 가하는 동안, 반응 혼합물은 연속적으로 끓여 환류시켰다. 그 다음 같은 온도에서 4시간 동안 교반을 계속했고, 냉각시켰고, 불용성 잔류물들을 걸러냈고, 거른액을 고진공하에서 증류했다. 시럽과 같은 잔류물을 매경우 100ml물로 3회 침지하고, 그 이상의 정제없이 합성의 다음 단계에서 조생성물로 사용했다. TLC(실리카겔 60(Merck)용리제 클로로포름/에틸 아세테이트 20:1 부피비), R4=0.40
b) 4-메톡시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드
반응혼합물의 pH 값이 약 13으로 유지되도록, 무수 메탄올에 녹인 25ml의 0.5M 소디움 메탄올레이트 용액을 한시간 내에, 수분을 제거하면서 150ml 무수 에탄올에 녹인 실시예 1 a) 화합물의 현탁액에 가했다. 반응의 종료 후(TLC로 감지), 실라카겔상에서 컬럼 크로마토그래피하여 생성물을 분리했다. 수득률 10g. TLC(실리카겔 60, 용리제 클로로포름/메탄올 3:3 부피비), R4=0.40.
Figure kpo00005
[실시예 2]
4-클로로-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드
실시예 1 a) 및 1 b)의 과정과 유사하게 4-클로로-1-나프톨(Aldrich)과 아세토브로모갈락토오스로부터 4-클로로-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드를 제조했다. TLC(실리카겔 60, 용리제 클로로포름/메탄올 7:5 부피부), RF=0.57.
Figure kpo00006
[실시예 3]
4-프로폭시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드
실시예 1 a) 및 1 b)에 따른 방법과 유사하게 4-프로폭시-1-나프톨과 아세토브로모갈락토오스로부터 4-프로폭시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드를 제조했다. TLC(실라카겔 60) 용리제 클로로포름/메탄올 3:1 부피비), R4=0.42.
Figure kpo00007
[실시예 4]
4-이소프로폭시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드
실시예 1a) 및 1b)의 과정과 유사하게, 4-이소프로폭시-1-나프톨과 아세토브로모갈락토오스로부터 4-이소프로폭시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드를 제조했다. TLC(실리카겔 60, 용리제 클로로포름/메탄올 3:1 부피비) RF=0.53.
MS((meg.FAB)4유도체):m/e=363.
[실시예 5]
4-벤질옥시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드
실시예 1a) 및 1b)의 과정과 유사하게 4-벤질옥시-1-나프톨과 아세토브로모 갈락토오스로부터 4-벤질옥시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드를 제조했다. TLC(실리칼겔 60, 용리제 클로로포름/메탄올 3:1 부피비), RF=0.46
MS((TMS)4유도체):m/e=700.
[실시예 6]
4-트리플루오로에톡시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드
실시예 1a) 및 1b)의 과정과 유사하게 4-트리플루오로에톡시-1-나프톨(Z.Naturforsch., 40b, 534/1985)과 아세토브로모갈락토오스로부터 4-트리플루오로에톡시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드를 제조했다. TLC(실리카겔 60, 용리제 클로로포름/메탄올 3:1 부피부), RF=0.42.
Figure kpo00008
[실시예 7]
2-메톡시-1-나프틸 디히드록겐 포스페이트
젓개, 온도계 및 적하 깔대기를 구비한 500ml 삼각플라스크에 150ml 피리딘에 녹인 13.07g(0.075몰) 2-메톡시-1-나프톨(J.Chem.Soc., 2316/1967)을 장입하면서 0 내지 5℃까지 냉각시키고, 11.5g(6.9ml,0.075몰) 옥시염화인을 그안에 한방울씩 가하면서 교반했다. 2시간 후, 감압장치로 잔류물을 걸러냈고, 그 거른액을 200g 얼음에 부었다. 5시간 교반후, 농축된 수산화나트륨 수용액으로 pH 값을 8까지 조정했고, 노란색 용액을 진공 증발시켰다. 아세톤과 함께 담황색 잔류물을 교반했고, 감압장치로 걸러냈다. 얻어진 조생성물을 200ml 뜨거운 물에 녹였고, 불용성 성분들을 여과장치로 걸러냈고, 인산에테르가 침전될 때까지 모액을 진한 염산과 혼합했고, 진공장치로 침전물을 걸러냈고, 오산화인 위에서 반응생성물을 일정한 중량까지 진공 건조했다. 16g의 무색 2-메톡시-1-나프틸 디히드로겐 포스페이트의 결정을 얻었다; m.p.171℃., MS:m/e=254.18. TLC(실리카겔 60 Merck, 용리제 이소프로판/부틸 아세테이트/물 50:30:20 부피비), RF=0.38.
Figure kpo00009
[실시예 8]
4-메톡시-1-나프틸 인산염의 이나트륨염
200ml 피리딘에 14.72g(0.1몰) 4-메톡시-1-나프톨을 용해시켰고, 교반하면서 그안에 15.35g(9.16ml,0.1몰) 옥시염화인을 한방울씩 가한다음 3℃에서 빙염조로 냉각시켰다. 2시간동안 교반한 후에, 형성된 결정성 잔류물을 진공장치로 여과했고, 오렌지색 거른액을 400ml 얼음물에 한방울씩 가했다. 유리 전극과 pH미터를 사용하여, 진한 수산화나트륨 수용액을 한방울씩 가하여 pH를 8까지 조절했고. 그 다음 50℃에서 반응혼합물을 증발하여 건조시켰다. 100ml의 뜨거운 이소프로판올에 용해되는 18g의 브라운색 수지를 얻은 다음 300ml 디메틸에테르를 부가하여 생성물을 침전시켰다. 16.8g의 4-메톡시-1-나프틸 인산염의 이나트륨염을 얻었다.
Figure kpo00010
[실시예 9]
1-아세톡시-4-메톡시 나프탈렌
18ml의 아세트산 무수물에 1.75g(10mMole)의 4-메톡시-1-나프톨을 2.5 시간동안 끓여 환류시켰다. 그런다음, 용액을 진공하에서 증발시켰고, 유상잔류물을 컬럼 크로마토그래피 정제했다(실리카겔; 톨루엔/에틸 아세테이트 40:1 부피비). 적절한 분액들을 증발시킨 후에, 조생성물을 석유에테르(b.p. 90-110℃)에서 재결정했다. 1.27g(이론치의 58%)의 무색결정들을 수득하였다.
m.p. 51-53℃
[실시예 10]
시료중에서 인간의 융모막 고나도트로핀(hCG)의 검출
A) 테스트담체의 제조(제1도)
a) 직물 3의 제조
한쪽의 종잇조각(굳은 Kalff의 단입 4210)을 스트립(길이 2.6cm; 넓이 0.6cm)으로 잘랐다. 디메틸 술폭시드에 녹인 40mg/ml 4-메톡시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드(갈락토시다아제의 기질)의 20μl의 용액을 물에 녹인 24% 폴리비닐알코올 20μl 용액과 혼합했다. 상기의 혼합물을 스트립의 중간부분에 가했다.
b) 직물 5의 제조
한쪽의 종잇조각(굳은 Kalff의 타입 4210)을 스트립(길이 2.6cm; 넓이 0.6cm)으로 잘랐다. 한쪽단부에 100μl의 PRS 완충용액(염수로 완충된 인산염. pH 7.0, 1% 소과 동물의 혈청, 0.1% Tween
Figure kpo00011
20)을 침투시켰다. 스트립의 중간 부분에 hCG 및 β-갈락토시다아제(갈락토시다아제에 대하여 활성을 나타내는 물질)에 저항하는 20U/ml의 단일클론항체 Fab 단편 접합물, hCG의 β-사슬에 저항하는 100mg/ml의 단일클론 쥐의 항체 및 7.5mg/ml의 4-아미노 벤질-1-티오-β-D-갈락토피라노시드를 함유한 7.5μl의 용액을 부가했다. 완충용액이 투입된 단부와 반대로 놓여있는 다른쪽 단부에 물에 녹인 10μl의 5% 폴리비닐알코올 용액을 투입했다.
c) 직물 6의 제조
한쪽의 종잇조각(굳은 Schleicher ＆amp; Schull 타입 3521)위에, 브롬화시아노겐을 사용하여 활성시킨 후, 쥐항체의 Fc 부분에 저항하는 양의 항체를 고정시켰다. 한쪽의 상기 물질을 스트립(길이 1.1cml 넓이 0.6cm)으로 잘랐다.
d) 직물 7의 제조
한쪽의 종잇조각(굳은 Whatman의 타입 D-28)을 5×0.6cm의 크기로 잘랐다.
e) 직물 3과 직물 5를 플라스틱 막 4의 의해 서로 단리시켰다.
0.6cm의 넓이를 가지는 하지막 2위에 건조된 직물을 고정하므로써, 제1도에서 설명된 테스트담체 1를 제조했다. 직물 5를 유사한 방식으로 고정시켜, 폴리비닐 알코올로 주입된 단부가 테스트담체 단부 8의 방향에서 나타나도록 했다.
B) 테스트 수행
a) 시료의 제조
0.5ml의 시료를 4mMole/l 과붕소산나타륨 및 인산염 완충용액(pH 7)에 녹인 10mg/l의 호오스래디시 과산화효소(산화제)를 함유한 0.5ml의 용액과 혼합했다.
테스트 스트립 1의 단부 8를 용액속으로 옮겼다. hCG를 함유하는 용액이 직물 5 및 직물 3에 스며들었고, 그후 즉시 용액속에 존재하는 물질을 용해시켰다. hCG에 저항하는 단일클론항체 및 hCG의 β사슬에 저항하는 단일 클론항체의 β-갈락토시다아제가 표지된 면역착물을 형성했다. 상기 면역착물(이 경우에 가수분해효소에 대하여 활성을 나타내는 물질을 나타냄)을 직물 6에서 본 발명에 따르는 방법에 의해 검출했다. 면역착물과 함께 용액은 마치 용액과 같이 기질과 더불어 직물 3에서 직물 6으로 침투했으며, 거기에서 상기의 기질 용액과 혼합되었다. 직물 6에서, β사슬에 저항하는 초과량의 단일클론항체 뿐만 아니라, 형성된 면역착물을 고정된 양의 항체를 통하여 직물 6에 결합시켰다. 가능한 초과량의 β-갈락토시다아제가 표지된 Fab 단편이 계속하여 직물 7로 흘러 들어갔다. 결합된 면역착물이 β-갈락토시다아제 표지물 및 산화제 때문에, 10분동안 직물 6에서 푸른색이 형성되었다.
시료중에 hCG가 존재하지 않았을 경우에, β-갈락토다아제가 표지된 면역착물을 형성할 수 없었다. 그러므로, 가수분해효소에 대하여 활성을 나타내는 물질이 직물 6에 결합하지 않았으며, 그 결과 착색이 일어나지 않았다. 다른 한편으로, β-갈락토시다아제가 표지된 Fab 조각의 전체양이 여전히 용액중에 함유되어있고, 이것은 직물 7로 스며든다. 그러므로, 색의 발생은 직물 7에서 관찰되며, 이 현상은 가수분해효소에 대하여 활성을 나타내는 물질이기도한 β-갈락톡시다아제가 표지된 Fab 단편이 반응에 기인한다. 따라서, 조절테스트는 본 발명에 따르는 방법을 직물 7에서 수행하여, 상기에 의해서 또한 일어난다. 이 시험은 시료중에 hCG가 존재하지 않는 경우에 특히 중요하다.
상기의 테스트를 정량적으로 평가할 수 있는데, 그 이유는 시료중에 hCG가 존재하여 결합된 β-갈락토시다아제가 표지된 면역착물이 직물 6에 더 많이 존재할수록, 10분의 만기후에 직물 6의 착색은 더 짙어지기 때문이다.
[실시예 11]
티록신(T4)의 검출
A) 테스트 스트립 11(제2도)의 제조
a) 직물 14
직물 14에 T4에 저항하는 항체와 β-갈락토시드 가수분해효소의 접합체를 주입한다.
b) 직물 15
한쪽의 종잇조각(Schleicher ＆amp; SchuⅡ 3512)을 브롬화시아노겐 및 게다가 T4 숙신이미드에스테르로 활성화시켰다.
c) 직물 16
직물 16은 4-메톡시-1-나프틸-β-D-갈락토피라노시드로 주입되어진 직물이다.
d) 직물 13은 시료의 도포를 위해 사용된다.
담체 11의 제조를 위하여, 상기의 직물들을 제2도에 보여진 바와 같이 하지막 12위에 고정시킨다.
B) 테스트 수행
a) 시료의 제조
시료를 실시예 10과 유사한 방법에 따라 제조했다.
b) 수행
테스트 스트립을 용액중에서 단부 17과 함께 옮겼다. T4를 함유하는 시료가 직물 13으로 스며들었다. 직물 13에서, 상기의 시료는 직물 14로 계속하여 흘러 들어갔고, 이것으로부터 β-칼락토시다아제접화물을 용해시켜 제거했다. T4와 항체의 면역 반응에의해 β-갈락토시다아제가 표지된 면역착물을 형성했다. 면역착물이외에, 또한 초과량의 β-갈락토시드 가수분해효소 접합물을 함유한 용액이 직물 15로 스며들었다. 이 초과량은 직물 15에서 결합된 T4를 통하여 종이위에 결합되었다.
여전히 면역착물을 함유하는 용액이 직물 16으로 스며들었다. β-갈락토시다아제가 표지된 면역착물(이는 가수분해효소환성을 갖는 물질을 의미한다)의 검출을 위한 본 발명에 따르는 방법은 직물 16에서 일어난다. 이러한 직물이 많아짐에 따라 용액에 존재된 T4가 많아질수록 10분후에 직물 16이 더 진하게 푸른색으로 착색된다. T4가 부재하는 경우에는, 직물 16이 흰색으로 남아있었다.

Claims (7)

  1. 시료를 가수분해효소 기질 및 산화제와 혼합하고, 얻어진 색세기를 평가하므로서 시료중에서 가수분해효소 활성을 갖는 물질들을 검출하는 방법으로서, 가수분해효소 기질로서 하나이상의 다음 일반식(Ⅰ)의 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 가수분해효소 활성을 갖는 물질들의 검출방법:
    Figure kpo00012
    상기식에서, R1은 수소원자 또는 알콕시기이고, R2는 수소원자, 할로겐원자, 아미노그룹, 알콕시기 또는 아랄콕시기이고, R3,R4,R5및 R6은 같거나 다르며, 수소원자, 할로겐원자, 카르복시그룹, 카르바모일그룹, 술포그룹, 아미노그룹, 알킬기, 알콕시기, 아랄콕시기, 알킬카르보닐기 또는 알콕시 카르보닐기이고, X는 글리코실, 인산염 또는 아실기이며, R2와 R3, R3와 R4, R4와 R5, 및 R5와 R6은 각각 서로 연결되어 고리구조를 형성하지만, 단, R1및 R2기들중 최소한 한기는 수소원자이고, R1,R2및 R3기들중 최소한 한기는 수소원자가 아니다.
  2. 제1항에 있어서, 평가가 흡수 또는 팽윤할 수 있는 담체 위에서 육안으로 보이도록 일어남을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항의 일반식(Ⅰ)의 화합물을 하나이상 함유함을 특징으로 하는, 시료중에서 가수분해효소 활성을 가지는 물질들의 검출을 위한 약품.
  4. 제3항에 있어서, 검출약품이 하나이상의 흡수 또는 팽윤할 수 있는 담체를 함유함을 특징으로 하는 약품.
  5. 다음 일반식(Ⅳ)의 화합물;
    Figure kpo00013
    상기식에서, R1은 수소원자 또는 알콕시기이고, R2는 수소원자, 할로겐원자, 아미노그룹, 알콕시기 또는 아랄콕시기이고, R3, R4, R5및 R6은 같거나 다르며, 수소원자, 할로겐원자, 카르복시그룹, 카르바모일그룹, 술포그룹, 아미노그룹, 알킬기, 알콕시기, 아랄콕시기, 알킬 카르보닐기 또는 알콕시카르보닐기이고, X′는 β-갈락토실기이며, R2와 R3, R3와 R4, R4와 R5, 및 R5와 R6은 각각 서로 연결되어 고리구조를 형성하진만, 단, R1및 R2기들중 최소한 한기는 수소원자이고, R1, R2및 R3기들중 최소한 한기는 수소원자가 아니다.
  6. 임의로 보호그룹들을 사용하여 다음 일반식(Ⅱ)의 화합물을 다음 일반식(Ⅴ)의 화합물과 반응시켜 다음일반식(Ⅳ)의 화합물들을 제조하기 위한 방법:
    Figure kpo00014
    X′-Y (V)
    상기식에서, R1은 수소원자 또는 알콕시기이고, R2는 수소원자, 할로겐원자, 아미노그룹, 알콕시기 또는 아랄콕시기이고, R3,R4,R5및 R6은 같거나 다르며, 수소원자, 할로겐원자, 카르복시그룹, 카르바모일그룹, 술포그룹, 아미노그룹, 알킬기, 알콕시기, 알랄콕시기, 알킬카르보닐기 또는 알콕시카르보닐기이고, X′는 β-갈락토실기이고, Y는 반응그룹이며, R2와 R3, R3와 R4, R4와 R5, 및 R5와 R6은 각각 서로 연결되어 고리구조를 형성하지만, 단 R1및 R2기들중 최소한 한기는 수소원자이고, R1,R2및 R3, 기들중 최소한 한기는 수소원자가 아니다.
  7. 가수분해효소활성을 가지는 물질들의 검출방법에 다음 일반식(Ⅰ)의 화합물을 이용하는 방법:
    Figure kpo00015
    상기식에서 R1은 수소원자 또는 알콕시그룹이고, R2는 수소원자, 할로겐원자, 아미노그룹, 알콕시기, 또는 아랄콕시기이고, R3,R4,R5및 R6은 같거나 다르며, 수소원자, 할로겐원자, 카르복시그룹, 카르바모일그룹, 술포그룹, 아미노그룹, 알킬기, 알콕시기, 아랄콕시기, 알킬카르보닐기 또는 알콕시카르보닐기이고, X는 글리코실, 인산염 또는 아실기이다.
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