CN1159578C - 生物传感器及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种即使对于含有高浓度底物的试样液、其反应试剂系也能容易地溶解、从而迅速且高精度地进行测定的生物传感器的制造方法。在该制造方法中,将形成反应层的材料溶解在由升华性物质组成的溶剂中,将所得溶液配置在反应层形成位置上,将其冷冻后,减压下将上述冷冻的溶液的固态物中的溶剂通过升华而除去,由此形成反应层。用该方法形成的反应层的表面积大,能容易地溶解在试样液中,从而可迅速地进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及可对试样中的特定成分进行迅速、高精度且简便的定量的生物传感器,具体地说,涉及其反应层的形成方法。
背景技术
以往,作为无需将试样液稀释、搅拌等即可对试样中的特定成分进行简易定量的方式,日本特许公开公报1990年第062952号公开了下述生物传感器。
该生物传感器系在绝缘性基板上用丝网印刷等方法形成由测定电极、对应电极和参比电极组成的电极系,并在该电极系上形成含亲水性高分子、氧化还原酶和电子介体的酶反应层。根据需要,可在该酶反应层中添加缓冲剂。
在这样制成的生物传感器的酶反应层上滴加含有底物的试样液,则酶反应层溶解,酶与底物反应,电子介体随之被还原。酶反应结束后,由将该被还原的电子介体电化学氧化的氧化电流值,可求出试样液中的底物浓度。
作为生物传感器的一个例子,下面对葡萄糖传感器进行说明。
一般已知的葡萄糖定量方法有将葡萄糖氧化酶与氧电极或过氧化氢电极组合的方式。
葡萄糖氧化酶以氧为电子介体,将底物β-D-葡萄糖选择性地氧化成D-葡糖酸-δ-内酯。伴随着该反应,氧被还原成过氧化氢。通过用氧电极测定此时的氧消耗量或通过使用铂电极等的过氧化氢电极测定过氧化氢生成量,可进行葡萄糖定量。
但随着测定对象的不同,上述方法会受到溶解氧浓度的很大影响,在无氧条件下无法进行测定。为此,开发出了以铁氰化钾、二茂铁衍生物、醌衍生物等金属配合物、有机化合物而不是以氧为电子介体的新型的葡萄糖传感器。
在此类传感器中,可将由于酶反应而生成的电子介体的还原体在电极氧化,由其氧化电流值求出葡萄糖浓度。
这样的生物传感器使用以测定对象物质为底物的酶,因此,原理上可测定各种物质。
例如,使用胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶和胆固醇酯酶作为氧化还原酶,可测定在各种医疗机构中用作诊断指征的血清中的胆固醇值。
由于胆固醇酯酶的酶反应进行得非常慢,因此,添加合适的表面活性剂,可提高胆固醇酯酶的活性,缩短整个反应所需时间。
若将上述电子介体之一的铁氰化钾单独或与其他反应层构成成分一起溶解在溶剂中,将所得溶液滴加在基板的形成反应层的位置上,温风干燥,形成层,则铁氰化钾呈长1mm以上的针状析出。由此,使得所得反应层的形状变得不均一,从而降低了传感器的测定精度。
此外,与葡萄糖传感器相比,胆固醇传感器的反应层含有高浓度的酶,由此,在将用于形成反应层的溶液温风干燥等而形成反应层时,酶在试样液中的溶解缓慢,从而影响应答性。
发明内容
鉴于上述问题,本发明的目的是提供一种精度高、且在高浓度区域的底物的应答性优异的生物传感器。
本发明者发现,在形成含有铁氰化钾之类的将其水溶液干燥时会作为结晶析出等的试剂或高浓度酶的反应层时,将形成该反应层的材料溶解在由升华性物质组成的溶剂中,将所得溶液配置在反应层形成位置上、冷冻,然后减压下将上述冷冻的溶液的固态物中的溶剂通过升华而除去,由此可得到表面积大、容易溶解在试样液中的反应层,在此基础上完成了本发明。
本发明是生物传感器的制造方法,它是一种具有绝缘性基板、设在上述基板上的包括测定电极和对应电极的电极系、以及至少含有氧化还原酶和电子介体的反应试剂系、构成上述反应试剂系的试剂在上述电极系上或其近旁单独地或作为多个反应层而形成的生物传感器的制造方法,其形成含有上述试剂系中特定的至少一种试剂的反应层的工序由以下步骤组成:
a)将形成该特定反应层的试剂溶解在由升华性物质组成的溶剂中的步骤、
b)将所得溶液配置在上述反应层的形成位置上的步骤、
c)将上述溶液冷冻的步骤、
d)减压下将上述冷冻的溶液的固态物中的溶剂通过升华而除去的步骤。
在本发明的较佳实施方式中,上述特定的反应层含有构成上述反应试剂系的所有试剂。
在本发明的另一较佳实施方式中,生物传感器具有多个反应层,仅其中的特定反应层含有上述试剂系中的特定的至少一种试剂。
在本发明的又一较佳实施方式中,上述试剂系中的特定的至少一种试剂仅含于层积成多层的反应层的最上层,形成上述层积成多层的反应层的工序由除去上述最上层、形成至其下层的步骤、将上述特定的试剂溶解在由升华性物质组成的溶剂中、将所得溶液配置在上述步骤中形成的层上的步骤、将上述溶液冷冻的步骤和减压下将上述冷冻的溶液的固态物中的溶剂通过升华而除去的步骤组成。
这里,较好的是,在上述基板上具有在与基板之间形成将试样液导入上述电极系的试样液供给通路的盖件,所形成的上述反应层露出于上述试样液供给通路且反应层中的至少一层形成于上述盖件一侧。
当上述氧化还原酶为催化胆固醇氧化反应的酶时,上述电子介体最好含于与含有上述酶的层不同的层中。
上述反应层中的至少最下层最好含有亲水性高分子。
在本发明的另一较佳实施方式中,上述氧化还原酶是催化胆固醇氧化反应的酶,上述电子介体含于与含有上述酶的层不同的层中。
在本发明的又一较佳实施方式中,上述氧化还原酶是催化胆固醇氧化反应的酶,含有上述酶的层还含有表面活性剂。
在本发明的较佳实施方式中,上述特定的试剂是氧化还原酶和作为电子介体的铁氰化钾中的至少一种。
附图说明
图1是本发明的实施例中除去了反应层的的生物传感器的分解立体图。
图2是同一主要部分的垂直剖面图。
图3是本发明的另一实施例的生物传感器的主要部分的垂直剖面图。
图4是显示实施例和比较例中的胆固醇传感器的应答特性的图。
具体实施方式
如上所述,在本发明中,含有特定试剂的反应层或层积成多层的反应层的最上层的形成方法是:将用于形成含有上述特定试剂的层的材料溶解在升华性物质中,将所得溶液冷冻后,通过使冷冻的溶液的固态物中的溶剂升华而将其除去。用该方法,可得到由基本均匀的微粉构成的且表面积大的多孔结构的层。由此,可提高反应层在试样液中的溶解性、缩短测定所需时间。尤其在试样液含有高浓度底物时有效。即,若试样液中的底物浓度高,则试样液粘度大,在以往的反应层中难以溶解,但在本发明中,即使底物浓度高,底物也能很好地溶解在试样液中。
在构成反应试剂系的试剂中,该方法尤其对电子介体有效。作为电子介体,除铁氰化钾之外,可选用能与胆固醇氧化酶等氧化还原酶进行电子传递的氧化还原化合物。为增大电子介体的表面积、提高溶解性,最好将电子介体单独加载在传感器上。
本发明中使用的由升华性物质组成的溶剂最好呈电化学惰性,或者其自身是氧化体,不会使电子介体和酶还原,且不会使它们改性。水最便于使用,但作为电子介体的溶剂,也可使用例如二甲基甲酰胺、二甲亚砜或对苯醌等醌类等。酶的溶剂最好是水或缓冲液。也可使用二甲基甲酰胺的40%左右的水溶液或乙醇的20%左右的水溶液等。
所用的氧化还原酶是以测定对象物质为底物的酶,在以葡萄糖为测定对象的传感器中,使用葡萄糖氧化酶。测定用作诊断指征的血清中的胆固醇值时,使用催化胆固醇氧化反应的酶(胆固醇氧化酶)或胆固醇脱氢酶和催化使胆固醇酯转化成胆固醇的过程的酶(胆固醇酯酶)。胆固醇酯酶的酶反应进行得非常缓慢,因此,添加合适的表面活性剂,可提高胆固醇酯酶活性、缩短整个反应所需时间。
在本发明中,胆固醇传感器的反应层可形成为含有亲水性高分子的层、含有催化胆固醇氧化反应的层、含有表面活性剂的层、含有胆固醇酯酶的层、含有电子介体的层等多个层。此外,表面活性剂、催化胆固醇氧化反应的酶和胆固醇酯酶可作为混合层而形成为一个层。这些反应层可将相同构成的物质分开,或者将构成成分分开,形成多个层面。这些层配置在传感器内的电极系上或其近旁的位置。在具有与设有电极系的基板组合的、在与基板之间形成向电极系供给试样液的试样液供给通路的盖件的传感器中,可设置在露出于上述试样液供给通路的部分和试样液供给通路的开口部等处。在任一位置,反应试剂层最好容易被导入的试样液溶解而到达电极系。为保护电极、抑制形成的反应层的剥离,最好在与电极系接近处形成亲水性高分子层。此外,除了电极系之外,最好形成亲水性高分子层作为形成反应层时的基底,或者在最下层的反应层中含有亲水性高分子。
为提高溶解性,含有电子介体的层最好与表面活性剂分离。此外,考虑到保存稳定性,最好与催化胆固醇氧化反应的酶(胆固醇酯酶)分离。
有在测定血糖值的生物传感器中形成含有脂质的层、使其包覆形成于电极系之上的层等、以使试样液容易导入反应层中的例子(例如日本特许公开公报1990年第062952号)。在本发明的测定胆固醇的生物传感器中由于含有表面活性剂、且其也能起到与脂质同样的作用,因此,也可没有脂质层。
作为亲水性高分子,除了水溶性纤维素衍生物(尤其是乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)之外,可使用聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、明胶、聚丙烯酸及其盐、淀粉及其衍生物、马来酸酐聚合物及其盐、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯树脂、聚甲基丙烯酸2-羟乙酯等。
表面活性剂可从正辛基-β-D-硫葡糖苷、聚乙二醇单月桂基醚、胆酸钠、月桂基-β-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、N,N-二(3-D-葡糖酰胺基丙基)脱氧胆酰胺和聚氧乙烯(10)辛基苯基醚中选用。
作为脂质,以卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等亲水亲油性磷脂质为佳。
氧化电流的测定方式有仅测定电极和对应电极的二极电极方式、加入了参比电极的三极方式,三极方式可更正确地进行测定。
下面通过具体实施例对本发明作详细说明。
图1是除去了反应层的生物传感器的分解立体图。
1是由聚对苯二甲酸乙二醇酯制成的绝缘性基板。在该基板1上,用网板印刷法印刷银膏,形成导线2、3。然后,将含有树脂粘合剂的导电性碳糊印刷在基板1上,形成包含测定电极4和对应电极5的电极系,再印刷绝缘性膏,形成绝缘层6。绝缘层6使测定电极4和对应电极5的露出部分的面积保持恒定,并部分覆盖导线。
按图1中点划线所示位置关系将具有空气孔14的盖板12和隔板11接合在该绝缘性基板1上,制成胆固醇传感器。在隔板11上设有用于在基板1与盖板12之间形成试样液供给通路的隙缝15。13相当于该试样液供给通路的开口部。
图2是第1实施方式的传感器的垂直剖面图。在绝缘性基板1上的电极系上形成有亲水性高分子层7。该亲水性高分子层7可通过滴加亲水性高分子的水溶液、温风干燥而形成。在该亲水性高分子层7上,形成有含有反应试剂的反应层8。在胆固醇传感器中,反应层8含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、表面活性剂和电子介体。将含有这些试剂的水溶液滴加在亲水性高分子层7上,冷冻后,通过减压下干燥而使水分升华,由此形成反应层8。
图3是第2实施方式的传感器的垂直剖面图。在绝缘性基板1上的电极系上,与上述同样,形成有亲水性高分子层7。在该亲水性高分子层7上和盖板12的露出于试样液供给通路的表面,分别形成有反应层8a和8b。这些反应层8a和8b通过将形成各个层的材料的水溶液滴加在规定的位置上、冷冻后通过减压下干燥、使水分升华而形成。
在胆固醇传感器中,反应层8a含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和表面活性剂,反应层8b含有电子介体。在另一实施方式中,反应层8a含有胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶,反应层8b含有表面活性剂和电子介体。
在又一实施方式中,将上述反应层8、8a或8b作为多层的层积体构成,该层积体的至少最上层经过将其所含的试剂的水溶液冷冻和通过升华而除去水分的步骤而制作。该最上层中所含的试剂例如选用通过水溶液的温风干燥而析出粗结晶的铁氰化钾。最好在反应层8b中加入亲水性高分子或者在形成亲水性高分子层之后形成反应层8b,以防止层剥离。
实施例1
在本实施例中,按以下步骤制作具有图3所示结构的胆固醇传感器。在该传感器中,反应层8a含有电子介体,反应层8b含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和表面活性剂。
首先,在基板1的电极系上,滴加羧甲基纤维素钠盐(以下简称“CMC”)的0.5重量%水溶液5μL,在50℃的温风干燥器中干燥10分钟,形成CMC层7。然后,在CMC层7上滴加1M铁氰化钾水溶液1μL,在50℃的温风干燥器中干燥10分钟,形成含有铁氰化钾的反应层8a。
在溶解了源自诺卡氏菌的胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6,以下简称“ChOD”)和源自假单胞菌的胆固醇酯酶(EC.3.1.1.1 3,以下简称“ChE”)的水溶液中添加表面活性剂聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(TritonX-100)。将该混合水溶液2.5μL滴加在由将盖板12和隔板11组成而成的盖件的隙缝15形成的凹部中,用-196℃的液氮冷冻后,放入梨形烧瓶内,在冷冻干燥器中干燥3小时,形成含有4单位(U)的胆固醇氧化酶、10U的胆固醇酯酶和3重量%的表面活性剂的反应层8b。该层8b呈原样保持了刚滴加混合水溶液2.5μL后的外形的状态,具有多孔质和表面积非常大的结构。
此后,将上述盖件接合在基板上,制成胆固醇传感器。
在这样制成的胆固醇传感器中,由试样液供给通路的开口部13供给作为试样液的含有胆固醇和为胆固醇酯的一种的亚油酸胆固醇的胆固醇标准液1μL,3分钟后,以对应电极为基准,在测定电极上向正极方向施加+0.5V的脉冲电压,5秒钟后测定电流值。结果见图4。
实施例2
在本实施例中,按以下步骤制作具有图3所示结构的胆固醇传感器。在该传感器中,反应层8a含有电子介体,反应层8b含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、表面活性剂和0.125重量%的CMC。
与实施例1同样,在绝缘性基板1上的电极系上形成CMC层7。然后,在CMC层7上滴加铁氰化钾水溶液1μL,在50℃的温风干燥器中干燥10分钟,形成含有铁氰化钾的层8a。另一方面,将ChOD、ChE、表面活性剂和CMC溶解在水中,配制混合水溶液。将上述混合水溶液2.5μL滴加在由将盖板和隔板组成而成的盖件的隙缝15形成的凹部中,用-135℃的液氮冷冻后,放入梨形烧瓶内,在冷冻干燥器中干燥3小时,形成含有ChOD、ChE、表面活性剂和CMC的反应层8b。这里使用的铁氰化钾、表面活性剂、ChOD和ChE的量与实施例1中的相同,在下面的实施例3、4和比较例中也相同。
这样,按与实施例1相同的方法制成胆固醇传感器,将从供给试样液至施加电压之间的时间进行变化,测定对应于各试样浓度的应答电流值。结果见图4。
实施例3
在本实施例中,按以下步骤制作具有图3所示结构的胆固醇传感器。在该传感器中,反应层8b含有电子介体,反应层8a含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和表面活性剂。
与实施例1同样,在绝缘性基板1上的电极系上形成CMC层7。然后,将ChOD、ChE和表面活性剂溶解在水中,配制混合水溶液,将上述混合水溶液2.5μL滴加在CMC层7上,用-135℃的液氮冷冻后,放入梨形烧瓶内,在冷冻干燥器中干燥3小时,形成含有ChOD、ChE和表面活性剂的反应层8a。另一方面,将铁氰化钾水溶液1μL滴加在由将盖板和隔板组成而成的盖件的隙缝15形成的凹部中,用液氮冷冻后,放入梨形烧瓶内,在冷冻干燥器中干燥3小时,形成含有铁氰化钾的反应层8b。
这样,按与实施例1相同的方法制成胆固醇传感器,将从供给试样液至施加电压之间的时间进行变化,测定对应于各试样浓度的应答电流值。结果见图4。
实施例4
在本实施例中,按以下步骤制作具有图3所示结构的胆固醇传感器。在该传感器中,反应层8a含有电子介体,反应层8b含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和表面活性剂。
与实施例1同样,在绝缘性基板1上的电极系上形成CMC层7。然后,在CMC层7上滴加铁氰化钾水溶液1μL,用液氮冷冻后,放入梨形烧瓶内,在冷冻干燥器中干燥3小时,形成层8a。另一方面,将ChOD、ChE和表面活性剂溶解在水中,配制混合水溶液。将该混合水溶液2.5μL滴加在由将盖板和隔板组成而成的盖件的隙缝15形成的凹部中,用-135℃的液氮冷冻后,放入梨形烧瓶内,在冷冻干燥器中干燥3小时,形成含有ChOD、ChE和表面活性剂的层8b。
这样,按与实施例1相同的方法制成胆固醇传感器,将从供给试样液至施加电压之间的时间进行变化,测定对应于各试样浓度的应答电流值。结果见图4。
比较例
与实施例1同样,在绝缘性基板1上的电极系上形成CMC层。然后,将铁氰化钾、表面活性剂、ChOD和ChE溶解在水中,配制混合水溶液。将该混合水溶液4.5μL滴加CMC层上,在50℃温风干燥15分钟,形成含有铁氰化钾、表面活性剂、ChOD和ChE的反应层。
这样,按与实施例1相同的方法制成胆固醇传感器,将从供给试样液至施加电压之间的时间进行变化,测定对应子各试样浓度的应答电流值。结果见图4。
根据本发明,可得到表面积大的反应层,使得反应层能够迅速溶解,具有这样的反应层的生物传感器即使在底物浓度高的区域,其应答特性也优异。
Claims (11)
1.生物传感器的制造方法,所述生物传感器具有绝缘性基板、设在上述基板上的包括测定电极和对应电极的电极系、以及至少含有氧化还原酶和电子介体的反应试剂系,构成上述反应试剂系的试剂在上述电极系上或其近旁单独地或作为多个反应层而形成,在该生物传感器的制造方法中,含有上述试剂系中特定的至少一种试剂的反应层的形成工序由以下步骤组成:
a)将形成该特定反应层的试剂溶解在由升华性物质组成的溶剂中的步骤、
b)将所得溶液配置在上述反应层的形成位置上的步骤、
c)将上述溶液冷冻的步骤、
d)减压下将上述冷冻的溶液的固态物中的溶剂通过升华而除去的步骤。
2.如权利要求1所述的生物传感器的制造方法,其中,所述特定反应层具有构成反应试剂系的所有试剂。
3.如权利要求1所述的生物传感器的制造方法,其中,所述生物传感器具有多个反应层,仅其中的特定反应层含有上述试剂系中的特定的至少一种试剂。
4.如权利要求1所述的生物传感器的制造方法,其中,上述试剂系中的特定的至少一种试剂仅含于层积成多层的反应层的最上层,形成上述层积成多层的反应层的工序由以下步骤组成:
除去上述最上层、形成至其下层的步骤、
将上述特定的试剂溶解在由升华性物质组成的溶剂中、将所得溶液配置在上述步骤中形成的层上的步骤、
将上述溶液冷冻的步骤、
减压下将上述冷冻的溶液的固态物中的溶剂通过升华而除去的步骤。
5.如权利要求1所述的生物传感器的制造方法,其中,所述生物传感器在上述基板上具有在与基板之间形成将试样液导入上述电极系的试样液供给通路的盖件,使形成的上述反应层露出于上述试样液供给通路且反应层中的至少一层形成于上述盖件一侧。
6.如权利要求1所述的生物传感器的制造方法,其中,所述反应层中至少最下层含有亲水性高分子。
7.如权利要求2-4中任一项所述的生物传感器的制造方法,其中,所述氧化还原酶是催化胆固醇氧化反应的酶,所述电子介体含于与含有上述酶的层不同的层中。
8.如权利要求2-5中任一项所述的生物传感器的制造方法,其中,所述氧化还原酶是催化胆固醇氧化反应的酶,含有上述酶的层还含有表面活性剂。
9.如权利要求1所述的生物传感器的制造方法,其中,所述电子介体是铁氰化钾。
10.如权利要求2-4中任一项所述的生物传感器的制造方法,其中,所述特定的试剂是氧化还原酶和作为电子介体的铁氰化钾中的至少一种。
11.用权利要求1的生物传感器的制造方法制得的生物传感器。
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1064739 Country of ref document: HK |
|
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20040728 Termination date: 20100131 |