DE60114016T2

DE60114016T2 - Elektrochemischer immunoassay mit kolloidalem metall

Info

Publication number: DE60114016T2
Application number: DE60114016T
Authority: DE
Inventors: Benoît LIMOGES; Laurent Authier; Murielle Dequaire
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2000-06-26
Filing date: 2001-06-25
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2021-06-26
Also published as: CA2413929C; US20030186274A1; JP2004512496A; ATE306670T1; WO2002001178A2; FR2810739B1; FR2810739A1; EP1303759B1; CA2413929A1; JP4768202B2; WO2002001178A3; US20060228814A1; EP1303759A2; AU2001269256A1; DE60114016D1; US7045364B2

Description

Der Nachweis und die Quantifizierung biologischer Substanzen anhand von Immunoassay-Verfahren oder Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNA-Fragmenten mittels Nukleinsäurehybridisierung sind in zahlreichen Bereichen der klinischen Biologie (medizinische und biologische Forschung, Diagnostik, Genetik, Nachweis von unerlaubten Substanzen in Spuren usw.) oder sogar im Bereich der Umwelt (Nachweis von Verunreinigungen wie Pestiziden oder Bakterien) von äußerster Bedeutung. Diese Verfahren erlauben es, das doppele Kriterium der Selektivität und der Empfindlichkeit zu erfüllen. Darunter ist die Immunoanalyse mit Marker, die auf einer affinen Antigen/Antikörper-Erkennung beruht, besonders leistungsfähig und hat sich dank der Entwicklung eines breiten Spektrums nicht radioaktiver Marker, wie der Enzym-, Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Marker allgemein in Verbindung mit einem spektroskopischen Nachweis verbreitet. Jedoch hat jeder Marker seine eigenen Vor- und Nachteile. So muß ein idealer Marker bestimmten Anforderungen gerecht werden; er muß:

1) durch kostengünstige und einfach zu bedienende Analysegeräte empfindlich nachweisbar sein,
2) es dem markierten Molekül (Tracer) erlauben, in dem Assay-Medium löslich und stabil zu bleiben,
3) eine einfache und wirksame Markierung zu einem angemessenen Preis zulassen,
4) eine hohe Lebensdauer haben,
5) keine Gefahr für die Gesundheit des Bedienungspersonals darstellen,
6) einen Tracer mit einer Reaktivität ergeben, die annähernd der des unmarkierten Moleküls ist,
7) einen minimalen Hintergrund ergeben.

Unter den im Handel befindlichen Markern weisen die Fluoreszenz- und Lumineszenz-Marker, die Anfang der 70-er Jahre entwickelt wurden, zahlreiche Vorteile auf: sie sind im Allgemeinen nicht toxisch und stabil, und ihr Nachweis ist sehr empfindlich. Jedoch erfordern sie ein relativ ausgereiftes und kostspieliges Gerät, und die Messung ist oft durch eine endogene Fluoreszenz beeinträchtigt, die mit Matrixeffekten der Probe einhergeht.
Die zur gleichen Zeit wie die Fluoreszenzmarker erschienenen Enzymmarker sind heute wahrscheinlich die gefragtesten aufgrund ihrer bemerkenswerten katalytischen Eigenschaft, aber auch durch ihre Fähigkeit, bei bestimmten Substraten Farbreaktionen auszulösen, die den Gebrauch eines sehr einfachen Detektors, wie eines Kolorimeters oder sogar des Auges des Bedienungspersonals, zulassen. Die Enzymmarker liegen den sogenannten ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent-Assay)-Verfahren zugrunde. Auch sie haben jedoch ihre eigenen Nachteile. Bestimmte, in der Probe vorhandene Substanzen können das Enzym hemmen. Darüber hinaus sind sie relativ empfindlich und von beschränkter Lebensdauer. Außerdem kann der Hintergrund hoch sein.
Die Marker auf Metallbasis wurden gegen Ende der 70-er Jahre eingeführt, teilweise mit dem Ziel, einigen der zuvor genannten Nachteilen abzuhelfen. Die Marker auf Metallbasis unterscheiden sich nach ihrer chemischen Natur, nämlich die kolloidalen Metallteilchen, die Metallionen, die Koordinationskomplexe, die metallorganischen Verbindungen oder die Metalloproteine. Entsprechend ihrer Natur können mit ihnen verschiedene analytische Techniken verbunden werden, wie die zeitaufgelöste Fluoreszenz, die Atomabsorptionsspektroskopie, die Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie, oder auch elektrochemische Techniken, wie die Polarographie oder die Voltammetrie.
Die elektrochemischen Techniken weisen im Vergleich zu den spektrophotometrischen Methoden zahlreiche Vorteile auf: die Messungen können in sehr geringen Flüssigkeitsvolumina (unter einem Mikroliter) in gegebenenfalls trübem Medium (der Fall bei Seren) durchgeführt werden, mit der Möglichkeit, eine gute Empfindlichkeit bei einem kostengünstiges Gerät, das gegebenenfalls tragbar (von geringer Größe) ist, zu bieten. Obwohl es die elektrochemischen Methoden ermöglichen, metallorganische Marker oder Metallionen bis zu nanomolaren Konzentrationen (10^–9 M) nachzuweisen, bleibt dies jedoch oft unzureichend im Vergleich zu den Fluoreszenzmarkern, die ihrerseits bis zu pikomolaren Grenzwerten (10^–12 M) nachgewiesen werden können. Die in der vorliegenden Erfindung entwickelte Strategie des elektrochemischen Nachweises zeigt, dass es möglich ist, Konzentrationen eines metallischen Markers in der Größenordnung von 10^–12 M zu erreichen.
Die Erfindung betrifft genauer genommen ein Verfahren zum elektrochemischen Nachweis eines kolloidalen Metallteilchens, das in einem Immunoassay als Marker verwendet wird. Die Erfindung betrifft auch die quantitative oder qualitative Bestimmung von Verbindungen, bei welchen es sich um Haptene, Antigene, Antikörper, aber auch um Verbindungen wie DNA- oder RNA-Fragmente handeln kann. Die Erfindung kann allgemein auf alle Analysenmethoden ausgedehnt werden, die eine spezifische und affine Wechselwirkung zwischen einem Liganden und einem Wirtsmolekül zum Einsatz bringen und bei welchen die Zugabe eines Markers erforderlich ist, der es ermöglicht, diese Wechselwirkung empfindlich zu quantifizieren. Außerdem können zahlreiche Immunoassay-Formate, ob kompetitiv oder nichtkompetitiv, oder Nukleinsäurehybridisierungsverfahren, bevorzugt in heterogener Phase, angewandt werden.
Die Verwendung kolloidaler Metallteilchen als Marker ist nicht neu. So werden diese sehr geläufig als Kontrastmittel in elektronenmikroskopischen Techniken, insbesondere in Form von Antikörper-gekoppelten Goldkolloiden, verwendet, um zum Beispiel die Verteilung eines Antigens auf der Oberfläche einer Zelle zu bestimmen (Beesley, Proceedings RMS, 1985, 20, 187–196). Hingegen ist der Gebrauch eines kolloidalen Metallteilchens als Marker im Zusammenhang mit einer quantitativen Bestimmung durch Affinität wenig geläufig. In diesem Zusammenhang kann auf die Existenz eines Patents ( US 4313734 ) und einer Veröffentlichung (Leuvering et al., J. Immunoassay 1980, 1, 71-91) hingewiesen werden, welche die Verwendung eines Markers auf Basis von kolloidalem Gold oder Silber in Zusammenhang mit einem Immunoassay mit Nachweis durch Atomabsorption oder mit kolorimetrischem Nachweis schildern. Weitere, recht ähnliche Patente schildern ebenfalls die Verwendung von Goldkolloiden als Marker in Immunoassays mit kolorimetrischem Nachweis (US 4853335, EP0310872, EP0258963). Ein ebenfalls kolorimetrischer Nachweis wurde kürzlich für die Analyse von DNA-Fragmenten durch Hybridisierung mit einem Marker aus kolloidalem Gold beschrieben (Storhoff et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1959–1964).
Was einen elektrochemischen Nachweis betrifft, scheint bislang kein Verfahren zur Immunoanalyse oder zur quantitativen Bestimmung von DNA durch Hybridisierung beschrieben worden zu sein, welches den elektrochemischen Nachweis oder die elektrochemische Quantifizierung eines kolloidalen metallischen Markers einschließt. Man kann jedoch auf die Existenz eines Artikels hinweisen, der den direkten Nachweis eines Goldkolloids betrifft, das mit Antikörpern beschichtet ist und auf der Oberfläche einer Kohlepaste-Elektrode adsorbiert wird (Gonzalez-Garcia und Costa-Garcia, Bioelectrochem. Bioenerg. 1995, 38, 389–395). Die Anwendung auf einen Immunoassay wurde jedoch, obwohl sie in Betracht gezogen wurde, nicht demonstriert. Die WO9704313 beschreibt die Anwendung dieses Verfahrens auf einen Immunoassay, ohne experimentelle Ergebnisse zu liefern.
Die Erfinder haben versucht nachzuweisen, ob es möglich ist oder nicht, einen Immonoassay durchzuführen, wie er von den Autoren in Betracht gezogen wurde, das heißt einen Immunoassay, der auf der Oberfläche der Elektrode selbst erfolgt und bei dem nach der Immunreaktion der Marker aus kolloidalem Gold, der nahe der Oberfläche der Elektrode reagiert hat, direkt nachgewiesen wird. Aus dem Ergebnis dieses Versuchs konnte geschlossen werden, dass es nicht möglich war, das Goldkolloid auf diese Weise nachzuweisen, womöglich weil dieses nicht mehr in unmittelbarem Kontakt mit der Oberfläche der Elektrode steht. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, diesem Problem anhand eines indirekten Nachweises des kolloidalen metallischen Markers zu entgehen, indem sie bei demselben die Verwendung einer festen Phase zuläßt, die eine andere als die Oberfläche der Elektrode sein kann.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit den Nachweis oder die Quantifizierung einer an ein kolloidales Metallteilchen gekoppelten biologischen Substanz durch elektrochemischen Nachweis, wobei das kolloidale Metallteilchen gelöst wird und durch Elektrochemie nachgewiesen wird, nachdem es auf der Oberfläche der Elektrode wieder ausgefällt wurde. Dies erlaubt es, die lokale Konzentration und die Empfindlichkeitsschwelle zu erhöhen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung einer an ein kolloidales Metallteilchen gekoppelten biologischen Substanz durch elektrochemischen Nachweis, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt des Lösens dieses kolloidalen Metallteilchens umfaßt.
Das in der vorliegenden Erfindung entwickelte elektrochemische Immunoassay-Verfahren kann nicht nur empfindlicher sein als die aktuellen enzymatischen Immunoassay-Techniken, sondern auch die Möglichkeit bieten, mehrere Verbindungen gleichzeitig zu bestimmen und/oder zu quantifizieren, wenn man mehrere kolloidale metallische Marker unterschiedlicher Natur verwendet. So lassen die elektrochemischen Verfahren den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Metalle im Laufe einer einzigen Messung zu. Außerdem bieten die kolloidalen metallischen Marker den Vorteil, sehr viel stabiler zu sein als die radioaktiven oder enzymatischen Marker, und sie erlauben eine einfache Markierung von zahlreichen Substanzen bei geringem Kostenaufwand, ohne Aktivitätsverlust derselben.
Die chemische Behandlung, die es ermöglicht, das kolloidale Metallteilchen zu lösen, erfolgt in einem sauren Medium, das ein Oxidationsmittel enthält. Die Konzentration des Oxidationsmittels wird so gewählt, dass es in ausreichendem Überschuss vorliegt, um die höchsten Konzentrationen an kolloidalem metallischem Marker zu lösen. Als Oxidationsmittel wird eine Lösung von Brom (Br₂) enthaltender Bromwasserstoffsäure, hypobromige Säure (HBrO) oder eine Mischung von beiden bevorzugt (zum Beispiel: 10^–4 M Br₂ in 0,1 oder 1 M HBr), insbesondere wenn ein Goldkolloid gelöst werden soll. Eine Chlorwasserstoffsäurelösung (zum Beispiel 0,1 M), die ein Bromsalz (Konzentration ≥ 0,1 M) und Brom enthält, kann ebenfalls geeignet sein. Entsprechend der Natur des zu lösenden Metallkolloids können andere saure Lösungsmedien (H₂SO₄, HClO₄, HF, ...) und Oxidationsmittel (I₂, Cl₂, HClO, HIO, H₂O₂, HNO₃, CN^–, Cr₂O₄ ^–, MnO₄ ^–, ...) in Betracht gezogen werden.
Nach dem Lösen kann sich eine zusätzliche Behandlung als nötig erweisen, um den Überschuss an Oxidationsmittel, wie Brom, zu entfernen. Hierfür kann dem Medium ein Überschuss an Phenol, Anilin, Hydrazin, Oxin oder eines von deren Derivaten, oder auch bevorzugt ein Überschuss an 3-Phenoxyessigsäure zugesetzt werden. Letztere ist aufgrund einer geringeren Toxizität zu bevorzugen. Eine Konzentration von 5 × 10^–4 M ist im Allgemeinen ausreichend. Brom kann auch durch Entgasen entfernt werden.
Es kann von Vorteil sein, in Lösung ein Reagenz zuzugeben, welches das Metallion komplexieren kann, um dessen Nachweis zu erleichtern. So kann die Komplexierung ein nicht elektroaktives Metallion in eine nachweisbare elektroaktive Verbindung umwandeln. Außerdem kann das komplexierte Metallion aufgrund eines ausgeprägteren hydrophoben Charakters an der Elektrode adsorbiert und auf diese Weise mittels adsorptiver kathodischer Stripping-Voltammetrie empfindlicher nachgewiesen werden (van den Berg, Anal. Chim. Acta 1991, 250, 265–276).
Nach Lösen des Metalls wird dieses auf der Oberfläche der Elektrode, bevorzugt durch Anlegen eines sehr negativen Potentials, reduziert. Das Potential wird dann variiert, um das Metall zu reoxidieren, welches dann in Lösung geht. Die Intensität des voltammetrischen Peaks (Fläche) spiegelt die an der Elektrode abgeschiedene Metallmenge, also die Menge der anfänglich in der Lösung vorhandenen kolloidalen Teilchen, wider. Dies ermöglich es somit, die quantitative Bestimmung vorzunehmen. Werden Teilchen verwendet, die aus verschiedenen Metallen bestehen, so ist ein gleichzeitiger Nachweis aufgrund der unterschiedlichen Reoxidationspotentiale der verschiedenen Metalle möglich.
Auf diese Weise kann aus der Anwesenheit und/oder der Menge des auf der Oberfläche der Elektrode elektrochemisch abgeschiedenen Metalls auf die Anwesenheit und/oder die Menge der anfänglich an das kolloidale Teilchen gekoppelten biologischen Substanz geschlossen werden.
Die kolloidalen Metallteilchen können aus Metall, wie Gold-, Silber-, Kupfer-, Platin-, Rhodium-, Palladium-, Iridium-, Nickel-, Eisen-Kolloiden, oder auch aus metallischen Verbindungen, wie beispielsweise Metalloxiden, -halogeniden oder -chalkogeniden, wie Ag₂O, AgI, Bi₂O₅, Cd₃P₂, CdS, CdSe, CdTe, Co₂O₃, CrO₃, Cu₂S, HgI₂, MnO₂, PbS, PbO₂, SnO₂, TiO₂, RuO₂, ZnO, ZnS, ZnO₂, oder Metallhydroxiden bestehen. Allgemein kann jedes Metall oder jede metallische Verbindung in Betracht gezogen werden, die elektrochemisch nachgewiesen werden kann, bevorzugt Übergangsmetalle (van den Berg, Anal. Chim. Acta 1991, 250, 265–276). Aus praktischen Gründen bevorzugt man die Verwendung von Metallen oder metallischen Verbindungen, die nur sehr wenig oder nicht im Assay-Medium vorliegen, und insbesondere diejenigen, welche die besten Nachweisgrenzen bezüglich der angewandten elektrochemischen Techniken bieten. Die Erfindung wurde insbesondere für ein Goldkolloid demonstriert.
Die kolloidalen Teilchen auf Metallbasis können anhand eines der zahlreichen in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Verfahren gewonnen werden (Hayat, Verl., Colloidal gold: principles, methods, and applications; Academic Press: San Diego, CA, 1991 – Mackay und Texter, Hsg., Electrochemistry in colloids and dispersions, VCH Publishers: New York, 1992 – Murray et al., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 8706–8715 – Frens, Nat. Phys. Sci. 1973, 241, 20–22 – US5637508 – Weller, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1993, 32, 41–43 – Wang und Herron, J. Phys. Chem: 1991, 95, 525–532). Die Teilchen können entsprechend dem Herstellungsverfahren eine Größe zwischen 1 und 200 nm einschließlich aufweisen, bei einer sehr geringen Streuung. In der vorliegenden Erfindung werden Metallkolloide mit einer Größe zwischen 5 und 100 nm einschließlich bevorzugt. Die Verwendung eines Teilchens mit einer bedeutenden Größe kann die Empfindlichkeit der quantitativen Bestimmung verbessern.
Je nach Format und Art der quantitativen Bestimmung kann das kolloidale Metallteilchen an einen Antikörper, einen Proteinrezeptor, ein Antigen, ein Hapten, ein Protein, ein Peptid, ein Oligonukleotid, ein Nukleinsäure-(insbesondere DNA- oder RNA-)Fragment gekuppelt sein. Unter Kupplung versteht man jede Art der chemischen oder physikalischen, direkten oder indirekten Bindung an die Oberfläche des Teilchens, wie eine kovalente Bindung oder eine Adsorption durch elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken, usw. Zahlreiche Kupplungsprotokolle sind beschrieben worden (Beesley, Proceedings RMS, 1985, 20, 187–196 – Oliver, Methods in molecular biology, 1999, 115, 331–334). Die durch das Metallteilchen markierte Spezies wird dann als Reagenz verwendet, das es in Verbindung mit immunochemischen Reagenzien auf der Basis von Antikörpern, Proteinrezeptoren, Haptenen, Antigenen, Proteinen, Peptiden, Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Fragmenten, Pufferlösungen, anderen chemischen Reagenzien und einem elektrochemischen, aus Elektroden aufgebauten Nachweissystem ermöglichen wird, die quantitative Bestimmung einer gegebenen Substanz vorzunehmen.
Das Prinzip der Erfindung wird als Beispiel in 1 am Fall eines nichtkompetitiven Sandwich-Immunoassays (1A) sowie für einen kompetitiven Immunoassay (1B) veranschaulicht.
Bei der ersten Vorgehensweise (1A) wird die zu bestimmende Verbindung (der Analyt) zunächst mit einem ersten Liganden (im vorliegenden Fall einem Antikörper, bei einem Hybridisierungstest wäre dies ein Oligonukleotid) eingefangen, der auf einer festen Phase immobilisiert ist. Die feste Phase zur Immobilisierung des Liganden kann zum Beispiel der Boden einer Mikroküvette (Fall der 1), die Oberfläche eines (gegebenenfalls magnetischen) Mikrokügelchens, die Oberfläche einer Membran oder auch die Oberfläche der Elektrode sein. Nach einer gegebenen Inkubationszeit, gegebenenfalls gefolgt von einem Waschschritt, wird ein zweiter, mit einem Metallkolloid markierter Ligand (hier ein Antikörper) so zugegeben, dass er mit dem zuvor auf der festen Phase extrahierten Analyt reagiert. Die auf diese Weise gebildete feste Phase wird dann gewaschen und mit einem ausreichenden Volumen einer Reagenzlösung behandelt, die in der Lage ist, den kolloidalen metallischen Marker, der mit der festen Phase reagiert hat, zu lösen. Das auf diese Weise als Ionen gelöste Metall wird dann anhand einer Elektrode, die entweder in die Lösung eintaucht (in-situ-Methode 1A), oder nach Überführung der Lösung (ex-situ-Methode) nachgewiesen und quantifiziert. Die elektrochemische Antwort kann dann qualitativ oder quantitativ mit der zu bestimmenden Substanz in Verbindung gebracht werden.
Im Fall der zweiten Vorgehensweise (1B) besteht das Verfahren darin, eine die zu bestimmende Substanz enthaltende Probe in Kontakt mit einer bekannten Menge derselben, mit einem Metallkolloid markierten Substanz sowie einer bestimmten Menge an Ligand (Antikörper) zu bringen, der auf einer festen Phase immobilisiert ist und gegen diese Substanz gerichtet ist. Nach einer gegebenen Reaktionszeit werden nach einem eventuellen Waschschritt die Natur und die Menge des in der gebundenen Fraktion vorhandenen Metallkolloids nach Lösen und elektrochemischem Nachweis, wie vorstehend angegeben, bestimmt.
Die Verwendung einer festen Phase aus Mikrokügelchen, zum Beispiel aus Latex oder auch aus ferromagnetischem Oxid, kann besonders vorteilhaft sein, um die Empfindlichkeit zu verbessern und die Nachweisgrenze herabzusetzen. So können die Mikrokügelchen nach dem Immunreaktionsschritt auf einer kleinen Fläche, wie zum Beispiel der Oberfläche einer Filtermembran ( US 4853335 – Tu et al., Anal. Chem. 1993, 65, 3631–3665) oder auch dem Boden eines konischen Röhrchens konzentriert werden und bieten so die Möglichkeit, das Metallkolloid in einem Flüssigkeitsvolumen zu lösen, das kleiner ist als jenes, in dem die Immunreaktion erfolgt ist.
Die Verfahren, die auf der Agglutination und/oder der Präzipitation des kolloidalen metallischen Markers in homogener Phase im Laufe einer Immunreaktion oder Oligonukleotid-Hybridisierung beruhen, können ebenfalls in Betracht gezogen werden ( US 5851777 ). In diesem Fall werden die gebildeten Aggregate isoliert und wie zuvor gelöst und nachgewiesen.
Was die Art der Elektroden betrifft, werden Elektroden auf Kohlenstoffbasis bevorzugt, insbesondere Scheibenelektroden (2A) und Mikrobandelektroden (2B), die durch Siebdruck einer Druckfarbe auf Kohlenstoffbasis erhalten wurden. Diese Elektroden sind tatsächlich besonders gut geeignet, da sie zu geringen Kosten in Massen hergestellt werden können und daher gegebenenfalls für den einmaligen Gebrauch bestimmt sein können. Außerdem können ihre geometrische Form sowie ihre Größe leicht angepasst werden. Es können jedoch auch andere Arten von Elektroden verwendet werden, wie Elektroden aus glasartigem Kohlenstoff, Graphit, Kohlenstoff enthaltenden Verbundmaterialien, Kohlenstofffasern, Kohlepaste. Außerdem kann die Oberfläche der Elektrode elektrochemisch oder chemisch behandelt werden, um die Empfindlichkeit des Nachweises des gelösten Metalls zu verbessern (Kalcher, Electroanalysis, 1992, 2, 419–433 – Kalcher et al., Electroanalysis, 1995, 7, 5–22 – Ugo und Moretto, Electroanalysis, 1995, 7, 1105–1113). Das kann zum Beispiel eine Modifikation der Elektrodenoberfläche oder der Zusammensetzung der Druckfarbe mit einem Polymer, das die Metallionen über eine elektrostatische oder Komplexbildungs-Wechselwirkung anziehen kann, oder auch eine elektrochemische Vorbehandlung der Elektrodenoberfläche sein. Die Aufbringung eines Quecksilberfilms kann sich ebenfalls als vorteilhaft für bestimmte Metallionen erweisen, die schwer auf einer Kohlenstoffelektrode nachweisbar sind. Was die Herstellungsart der Elektroden betrifft, ist das Siebdruckverfahren zu bevorzugen, selbst wenn andere Verfahren zur industriellen Herstellung, wie der Rotationstiefdruck, der Tintenstrahldruck, gegebenenfalls die Photolitographie, auch geeignet sein können.
Gemäß den Merkmalen der Erfindung ist die Verwendung von Mikroelektroden, bevorzugt von Mikrobandelektroden, die durch Siebdruck erhalten wurden, besonders vorteilhaft, da sie die Möglichkeit bieten, die Messungen in sehr kleinen Volumina (in der Größenordnung von einigen Mikrolitern) bei im Allgemeinen verbesserten analytischen Leistungen hinsichtlich der Empfindlichkeit und der Nachweisgrenze für Metallionen vorzunehmen (Wong und Ewing, Anal. Chem. 1990, 62, 2697–2702 – Wang et al., J. Electroanal. Chem, 1993, 361, 77–83 – Wang und Armalis, Electroanalysis, 1995, 7, 958–961 – Alarnes-Varela und Costa-Garcia, Electroanalysis, 1997, 9, 1262–1266).
3, welche die Kalibrierungskurven (Stromdichten) von AuBr₄ ^– in 0,1 M HBr vergleicht, die auf einer Siebdruck-Mikrobandelektrode der Fläche S = 1,7 × 10^–4 cm² (Kurve 1) und auf einer Siebdruck-Makroscheibenelektrode der Fläche S = 0,0962 cm² (Kurve 2) erhalten wurden, bestätigt eine bessere Empfindlichkeit im Fall der Mikrobandelektrode. Diese Kurven wurden auf folgende Weise durch lineare anodische Stripping-Voltammetrie erhalten: (i) elektrolytische Abscheidung des Goldes bei einer konstanten Spannung von E = –0.3 V während 300 s, (ii) lineare Spannungsabtastung von 0.2 V bis 1.1 V mit einer Geschwindigkeit von 50 mV s^–1. Der mit der Oxidation des Goldes verbundene Peakstrom (i_p), der bei etwa 1,0 V auftritt, wird als analytische Antwort aufgefasst.
Die Verwendung von Mikroelektroden scheint es zu ermöglichen, eine wirksamere Abscheidung des Metalls zu erreichen als mit einer Makroelektrode. So erfordert die Verwendung von Makroelektroden ein Schütteln der Lösung, um sicherzustellen, dass sich eine ausreichende Menge Metall an der Oberfläche der Elektrode ablagert. Überraschenderweise haben die Erfinder beobachtet, dass es die Verwendung von Mikroelektroden erlaubt, sich diesen Schüttelschrittes zu entledigen. Dies könnte den beobachteten Gewinn an Empfindlichkeit erklären, obwohl aufgrund der Natur der Mikroelektrode selbst (sehr kleine Größe) auch andere Hypothesen in Betracht gezogen werden können.
Es können diverse elektrochemische Analysetechniken verwendet werden, um die gelösten Metallionen quantitativ zu bestimmen. Es handelt sich bevorzugt um die anodische Stripping-Voltammetrie (oder Polarographie) mit einer Spannungsabtastung, die linear, zyklisch, rechteckförmig, eine Normal-Puls-, eine Differenz-Puls-Abtastung oder eine Abtastung mit überlagerter Sinusspannung sein kann, oder auch um die anodische Stripping-Chronopotentiometrie. Es können jedoch auch andere Techniken verwendet werden, wie die Ionenaustausch-Voltammetrie, die kathodische Adsorptions-Stripping-Voltammetrie (oder Polarographie) mit einer Abtastung, die linear, zyklisch, rechteckförmig, eine Normal-Puls-, eine Differenz-Puls-Abtastung oder eine Abtastung mit überlagerter Sinusspannung sein kann, oder auch die Chronoamperometrie, die Chronocoulometrie, die lineare, zyklische, Rechteckwellen-, Normal-Puls-, Differenz-Puls-Voltammetrie (oder Polarographie) oder die Voltammetrie (oder Polarographie) mit überlagerter Sinusspannung. Diese Techniken erfordern einen Aufbau, der aus zwei oder sogar drei Elektroden bestehen kann, das heißt einen Aufbau, der die zuvor erwähnte Messelektrode, eine Referenzelektrode und gegebenenfalls eine Hilfselektrode umfasst. Um eine Kontamination des Assay-Mediums durch das Metall oder den Elektrolyt der Referenzelektrode zu vermeiden, ist es vorteilhaft, diese durch ein Verlängerungsteil abzutrennen, das an seinem Ende aus einem Diaphragma besteht und mit einem Elektrolyt gefüllt ist. Es kann auch eine durch Siebdruck einer Druckfarbe auf der Basis von Silber und Silberchlorid gedruckte Referenzelektrode in Betracht gezogen werden. Auch hier kann es nützlich sein, diese durch eine Elektrolytbrücke, wie zum Beispiel ein ionenleitendes Gel oder ein ionenleitendes Polymer, abzutrennen, um die störende Einwirkung von Silberionen im Verlauf einer Messung zu verhindern.
Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Kit zur quantitativen Bestimmung von mindestens einer biologischen Verbindung. Gemäß den Merkmalen der Erfindung umfasst dieser Kit mindestens ein mit einem kolloidalen Metallteilchen markiertes Reagenz und mindestens eine Elektrode. Der erfindungsgemässe Kit kann außerdem mindestens ein Reagenz enthalten, welches das Lösen des kolloidalen Metallteilchens ermöglicht, und gegebenenfalls ein Reagenz, um den Überschuss an Oxidationsmittel zu entfernen. Der Kit kann auch ein Reagenz enthalten, welches das Metallion komplexieren kann, um dessen Nachweis zu erleichtern. Schließlich kann der Kit auch eine Anleitung enthalten, um die Durchführung des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Merkmale der Erfindung, dürfen aber nicht als die Erfindung einschränkend aufgefasst werden.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN:
1. Schematische Darstellung des Prinzips der Erfindung, veranschaulicht am Fall (A) eines nicht-kompetitiven und (B) eines kompetitiven Immunoassays.
2. Schematische Darstellung einer (A) Siebdruck-Scheibenelektrode und (B) Siebdruck-Mikrobandelektrode.
3. Kalibrierungskurven von ionischem Gold, die mit (1) einer Mikrobandelektrode und (2) einer Scheibenelektrode erhalten wurden.
4. Schematische Darstellung der Messvorrichtung, die für den Nachweis des Goldes verwendet wird, das in einem geringen Volumen eines Lösungstropfens gelöst ist.
5. Kalibrierungskurven von zwei mit Streptavidin beschichteten Goldkolloiden.
6. (A) log-log-Kalibrierungskurve des nicht-kompetitiven Immunoassays von IgG. (B) Für unterschiedliche IgG-Konzentrationen erhaltene Kurven der anodischen Stripping-Voltammetrie. Die Kurven sind mit Buchstaben gekennzeichnet, um sie den Konzentrationen zuzuordnen, die durch die gleichen Buchstaben auf der Kalibrierungskurve von IgG angegeben sind.
7. log-log-Kalibrierungskurve des nicht-kompetitiven Immunoassays von α-Fetoprotein.
BEISPIELE
Beispiel 1: Nachweis von mit einem Goldkolloid markiertem Streptavidin nach spezifischer Fixierung am Boden einer Mikrotiterplattenvertiefung.
Die Versuche werden bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
Das Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V), das BSA-gekuppelte Biotinamidocaproyl (B-BSA, Biotingehalt: 8–12 Mol/Mol BSA), das mit kolloidalem Gold von 20 nm Durchmesser markierte Streptavidin (S-Au) sowie das Albumin-gekoppelte Streptavidin, an das kolloidale Goldteilchen von 10 nm Größe adsorbiert sind (SA-Au), stammen von Sigma Chemical Co.
100 μl B-BSA zu 10 μg ml^–1 in Bicarbonatpuffer (15 mM Na₂Co₃; pH 9,6) werden auf den Boden einer Polystyrol-Mikrotiterplattenvertiefung (Nunc) pipettiert und 2 Stunden inkubiert. Nach Leeren der Mikrotiterplattenvertiefung und Waschen mit 110 μl Phosphatpuffer (PBS: 4,3 mM NaH₂PO₄, 15,1 mM Na₂HPO₄ und 50 mM NaCl; pH 7,4), werden 100 μl PBS mit 0,1% BSA (PBS-BSA) zugegeben und 2 Stunden inkubiert. Die Mikrotiterplattenvertiefung wird dann geleert und dreimal mit 110 μl reinem Wasser gewaschen. Dann werden 35 μl einer S-Au- oder SA-Au-Lösung zu x μg ml^–1 (0,003 < x < 3) in PBS-BSA-Puffer mit 0,05% Tween 20 (PBS-BSA-T) in die Mikrotiterplattenvertiefung gegeben und 3 Stunden reagieren gelassen. Nach Leeren der Mikrotiterplattenvertiefung wird diese mit 3 × 110 μl PBS-BSA-T, dann mit 2 × 110 μl PBS gründlich gewaschen. Das Goldkolloid, das an den Wänden der Mikrotiterplattenvertiefung fixiert ist, wird dann durch Zugabe von 40 μl einer Br₂-Lösung der Konzentration 10^–4 M in 1 M HBr gelöst. Nach 5 Minuten wird der Mikrotiterplattenvertiefung ein Volumen von 35 μl entnommen und auf die Oberfläche einer Siebdruck-Kohlenstoff-Scheibenelektrode (S = 0,0962 cm², gemäss dem in der Ref. "Bagel et al., Anal. Chem. 1997, 69, 4688–1694" beschriebenen Verfahren hergestellte Elektrode) überführt, dem 5 μl einer frischen 4 × 10^–3 M 3-Phenoxypropionsäurelösung in 1 M HBr zugegeben werden. Eine Referenzelektrode (Ag/AgBr, NaBr_ges.), die durch ein eine gesättigte NaBr-Lösung enthaltendes Verlängerungsteil verlängert ist, und eine Hilfselektrode werden dann, wie es das Schema der 4 zeigt, in die 40 μl Lösung getaucht, die zuvor auf der Oberfläche der Siebdruck-Kohlenstoffelektrode abgeschieden wurden. Die Messungen durch lineare anodische Stripping-Voltammetrie werden dann durchgeführt, indem folgenderweise vorgegangen wird:

1) elektrolytische Abscheidung des Goldes bei einer konstanten Spannung von E = –0.3 V während 300 s,
2) lineare Spannungsabtastung von 0.2 V bis 1.1 V mit einer Geschwindigkeit von 50 mV s^–1.

Der mit der Oxidation des Goldes verbundene Peakstrom (i_p), der bei etwa 1,0 V auftritt, wird als analytische Antwort aufgefasst. Die Messung kann auch das Integral des Peaks sein, was dann einer Coulombmenge (Q_p) entspricht. Die Kalibrierungskurven sind für jedes der mit Gold markierten Streptavidine in 5 mit logarithmischer Skala dargestellt. Es kann eine bessere Empfindlichkeit mit dem SA-Au (Kurve 1) als mit dem S-Au (Kurve 2) festgestellt werden.
Beispiel 2: "Sandwich"-Immunoassay eines Immunglobulins.
Das Ovalbumin (OA, Grad III) und das Ziegen-Immunglobulin G (IgG) werden von Sigma Chemical Co vermarktet. Das mit einem Goldkolloid von 18 nm Größe markierte sowie der unmarkierte Anti-Ziegen-IgG sind polyklonale Antikörper, die von den Jackson Immunoresearch Laboratories stammen.
60 μl einer Anti-IgG-Lösung zu 24 μg ml^–1 in PBS-Puffer werden in eine Mikrotiterplattenvertiefung pipettiert und 1 Stunde inkubiert. Nach Leeren und Waschen der Mikrotiterplattenvertiefung mit 2 × 100 μl PBS-Puffer mit 0,5% Ovalbumin und 0,1% Tween 20 (PBS-OA-T) werden 100 μl desselben Puffers zugegeben und 1 Stunde inkubiert. Die Lösung wird dann abgesaugt, und 35 μl einer Ziegen-IgG-Lösung zu x ng ml^–1 (0,5 < x < 1000), in einem PBS-Puffer mit 0,1% Tween 20 verdünnt, werden eingebracht und 40 Minuten inkubiert. Nach Leeren und Waschen der Mikrotiterplattenvertiefung mit 2 × 100 μl PBS-OA-T werden 100 μl PBS-OA-T eingebracht. Nach 30 Minuten wird die Flüssigkeit durch 35 μl einer verdünnten Lösung von mit kolloidalem Gold markiertem Anti-IgG ersetzt (45-fache Verdünnung der vermarkteten Lösung in PBS-OA-T) und 3 Stunden inkubiert. Es wird ein letzter Waschzyklus durchgeführt, indem die Mikrotiterplattenvertiefung 3-mal mit 200 μl PBS-OA-T, gefolgt von 2 × 200 μl PBS, gewaschen wird. Die Flüssigkeit wird dann gründlich abgesaugt, und das an den Wänden der Mikrotiterplattenvertiefung fixierte Goldkolloid wird daraufhin wie in Beispiel 1 angegeben gelöst und nachgewiesen.
Einige Beispiele für Messungen, die durch lineare anodische Stripping-Voltammetrie erhalten wurden, sind in 6A angegeben, während die entsprechende Kalibrierungskurve des Ziegen-IgG in 6B dargestellt ist. Jeder Punkt stellt den Mittelwert aus zwei Messungen dar, und jede Messung wurde an einer anderen Elektrode erhalten (zum einmaligen Gebrauch bestimmte Elektrode). Es konnte eine IgG-Konzentration von ungefähr 3 × 10^–12 M ermittelt werden.
Beispiel 3: Nicht-kompetitiver Immunoassay von humanem α-Fetoprotein.
80 μl einer Lösung von monoklonalem Anti-α-Fetoprotein (Maus-Antikörper) zu 24 μg ml^–1 in Carbonatpuffer (15 mM, pH 9,6) werden in eine Mikrotiterplattenvertiefung pipettiert und 1 Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Leeren und Waschen der Mikrotiterplattenvertiefung mit 2 × 250 μl PBS-OA-T-Puffer werden 250 μl desselben Puffers zugegeben und 40 min inkubiert. Die Lösung wird dann abgesaugt, und 80 μl einer α-Fetoprotein-Lösung zu x ng ml^–1 (0,05 < x < 20), die in PBS-Puffer mit 0,1% Tween 20 verdünnt ist, werden eingebracht und 2 Stunden inkubiert. Nach Leeren und Waschen der Mikrotiterplattenvertiefung mit 2 × 250 μl PBS-OA-T werden 250 μl PBS-OA-T eingebracht. Nach 30 Minuten wird die Flüssigkeit durch 80 μl einer Lösung von polyklonalem Anti-α-Fetoprotein (Ziegen-Antikörper) ersetzt, die in PBS-OA-T auf 5 μg ml^–1 verdünnt wurde, und 1 Stunde inkubiert. Nach Waschen mit 2 × 250 μl PBS-OA-T-Puffer werden 50 μl einer Lösung von mit kolloidalem Gold markiertem Anti-Ziegen-IgG (45-fache Verdünnung der vermarkteten Lösung in PBS-OA-T) eingebracht und 1 Stunde 30 min inkubiert. Es wird ein letzter Waschzyklus durchgeführt, indem die Mikrotiterplattenvertiefung 3-mal mit 250 μl PBS-OA-T, gefolgt von 2 × 250 μl PBS-T und 2 × 250 μl PBS, gewaschen wird. Die Flüssigkeit wird dann gründlich abgesaugt, und das an den Wänden der Mikrotiterplattenvertiefung fixierte Goldkolloid wird gelöst und mit Mikrobandelektroden folgenderweise nachgewiesen: 50 μl einer 0,1 mM Br₂-Lösung in 0,1 N HBr werden für 30 Minuten den Mikrotiterplattenvertiefungen zugegeben; dann werden 40 μl in neue Mikrotiterplattenvertiefungen überführt, welche 10 μl einer 2 × 10^–3 M 3-Phenoxypropionsäurelösung in 0,1 M HBr enthalten. Der Nachweis des gelösten Goldes erfolgt daraufhin, wie in Beispiel 1 angegeben.
Herstellung von Siebdruck-Mikrobandelektroden
Die Druckfarbe auf Kohlenstoffbasis, die für die Herstellung der Mikrobandelektroden verwendet wird, ist eine von Acheson Colloid hergestellte handelsübliche Druckfarbe (Minico^®-Druckfarben der Serie M3000-1RS oder Electrodag^®-Druckfarben, wie 423 SS oder PF 407A). Die Druckfarbe wird mittels Siebdruck auf eine feste oder nachgiebige Unterlage, bevorzugt aus teilkristallinem oder schlagfestem Polystyrol (Platten, deren Dicke zwischen 0,1 und 2 mm einschließlich betragen kann), gedruckt. Die Feinheit der Siebdruckmaske, die auf einem in einen Rahmen gespannten Gewebe erhalten wird, sowie die Art, die Vernetzung des Gewebes, bestimmen größtenteils die Qualität des Farbauftrags sowie seine Dicke. In der vorliegenden Erfindung konnten auf Siebdruckrahmen, die 77 oder 120 Fäden pro cm aufweisen, Farbdicken zwischen 5 und 50 μm erhalten werden.
Nach dem Siebdruck wird die Druckfarbe in einem Trockenschrank zwischen 60 und 100°C getrocknet. Anschließend wird eine Isolierschicht auf Polystyrolbasis derart aufgetragen oder mittels Siebdruck aufgedruckt, dass sie einen Teil der zuvor siebgedruckten Kohlenstoff-Druckfarbe abdeckt (2). Nach dem Trocknen wird die derart aufgebaute Elektrode in der Dicke derart quer auseinandergeschnitten, dass auf der Schnittfläche eine mikrometerdicke (abhängig von der Dicke der anfangs siebgedruckten Kohlenstoff-Druckfarbe) und millimeterlange (abhängig von der Breite des Druckmusters der anfangs gewählten Elektrode) Kohlenstoffbande auftritt (2B).

Claims

Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung einer an ein kolloidales metallisches Teilchen gekuppelten biologischen Substanz durch elektrochemischen Nachweis, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: – Lösen des kolloidalen metallischen Teilchens durch chemische Behandlung in einem sauren Medium, das ein oxidierendes Reagenz enthält; – Reduktion und/oder Fällung des Metalls auf der Oberfläche einer Elektrode; – Messen der Quantität des auf der Oberfläche der Elektrode gefällten Metalls durch Variation des Potentials der Elektrode und Analyse des voltametrischen Peaks, der nach Reoxidation des Metalls und seiner Wiederauflösung erscheint; – Nachweis und/oder Quantifizierung der anfänglich an das kolloidale metallische Teilchen gekuppelten biologischen Substanz, als Funktion der Anwesenheit und/oder Quantität von Metall, das auf der Oberfläche der Elektrode elektrochemisch abgeschieden wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Schritt des Lösens des kolloidalen metallischen Teilchens eine ergänzende Behandlung folgt, die dazu bestimmt ist, das Produkt zu beseitigen, das das Lösen herbeiführt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man in Lösung ein Reagenz dazugibt, welches das Metallion komplexieren kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Reduktion und/oder Fällung des Metalls auf der Elektrode durch Verwendung eines geeigneten negativen Potentials bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das kolloidale Teilchen ausgewählt ist aus den Teilchen, die aus Metall oder metallischen Verbindungen bestehen.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das kolloidale Teilchen aus Gold besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das kolloidale Teilchen eine Größe zwischen 1 und 200 nm einschließlich aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das saure Medium, welches ein oxidierendes Reagenz enthält, eine Lösung von Brom enthaltender Bromwasserstoffsäure, hypobromiger Säure oder eine Mischung dieser zwei Verbindungen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Elektrode eine durch Siebdruck hergestellte Elektrode, insbesondere eine Mikrobandelektrode ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der Elektrode elektrochemisch oder chemisch behandelt ist, um die Empfindlichkeit des Nachweises des gelösten Metalls zu verbessern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die in Lösung vorhandenen kolloidalen Teilchen nach der biologischen Reaktion vor dem Lösen konzentriert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die an das kolloidale Teilchen gekuppelte biologische Substanz in der Gruppe eingeschlossen ist, die aus Antikörpern, Protein-Rezeptoren, Antigenen, Haptenen, Proteinen, Peptiden, Oligonukleotiden, Nukleinsäure-Fragmenten besteht.
Diagnosekit, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein mit einem kolloidalen metallischen Teilchen markiertes Reagenz und mindestens eine Elektrode sowie ein oxidierendes Reagenz umfasst, welches das Lösen des kolloidalen metallischen Teilchens auf chemischem Weg ermöglicht.