JP5187759B2 - 被検物質の測定方法 - Google Patents
被検物質の測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5187759B2 JP5187759B2 JP2008509813A JP2008509813A JP5187759B2 JP 5187759 B2 JP5187759 B2 JP 5187759B2 JP 2008509813 A JP2008509813 A JP 2008509813A JP 2008509813 A JP2008509813 A JP 2008509813A JP 5187759 B2 JP5187759 B2 JP 5187759B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- working electrode
- fine particles
- test substance
- metal fine
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 150
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 112
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title claims description 10
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 151
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 151
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 claims description 143
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 63
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 41
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 41
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 37
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 28
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 26
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 23
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 18
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 12
- GTKRFUAGOKINCA-UHFFFAOYSA-M chlorosilver;silver Chemical compound [Ag].[Ag]Cl GTKRFUAGOKINCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 8
- 229910001111 Fine metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 53
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 50
- 230000008859 change Effects 0.000 description 26
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 26
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 19
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 6
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 5
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 240000006829 Ficus sundaica Species 0.000 description 1
- -1 For example Substances 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002715 bioenergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、電気化学的手法を用いた被検物質の測定方法に関する。
試験溶液中の微量物質を簡便且つ高感度に測定する方法の１つとして、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が知られている。免疫測定法としては、酵素で標識した抗体を用い、酵素反応に由来する発色や発光等の信号を得ることにより被検物質の検知や濃度測定を行うＥＬＩＳＡ法が、幅広い分野で採用されている。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法では、発色や発光等の信号検出時に光学系を必要とするため、大型の測定機が必要となる。また、正確な定量を行う場合には、発色等の測定結果を電気的な信号に変換する作業が必要となる等、複雑な処理を行う必要がある。
そこで、発色標識や蛍光標識のような汎用の標識物質を用いた免疫測定法等において、検出に際して電気化学的測定法を利用する方法が提案されている。電気化学的測定に用いる装置はＥＬＩＳＡ等に用いられる機器に比べて小型化が可能であることから、測定機器の小型化と検出感度の向上との両立が期待される。例えば特許文献１においては、金属微粒子を化学的処理によって溶解した後、電気化学的測定を行い、得られた金属微粒子の酸化に伴うピーク電流に基づいて被検物質の定性分析又は定量分析を行っている。
なお、非特許文献１において、溶液中の金コロイド又は金コロイド標識抗体の還元ピーク電流を測定する方法が記載されている。
特表２００４−５１２４９６号公報
Bioelectrochemistry and Bioenergetics 38 (1995) 389-395
しかしながら、特許文献１においては、溶液等を用いた化学的処理により金属微粒子を完全に溶解する工程が電気化学的測定に先立って必要となるため、測定操作が煩雑になるといった不都合がある。また、特許文献１においては、電気化学的測定により金属微粒子の酸化に伴う電流値を測定しているが、得られる酸化電流値には目的とする金属微粒子に由来する電流の他、測定に用いる抗体や測定溶液中の夾雑物に由来する電流のようなノイズも比較的多く含まれているため、誤検出を起こす場合もある。さらに、非特許文献１においては溶液中の金コロイド濃度と還元電流との関係を調べるに留まり、溶液中の被検物質の定量等を行うことについては記載されていない。
本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、測定操作を煩雑とすることなく、高感度且つ正確な測定を行うことが可能な被検物質の測定方法を提供することを目的とする。
前述の目的を達成するために、本発明に係る被検物質の測定方法は、試験溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集め、前記金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べることを特徴とする。
以上のような被検物質の測定方法においては、先ず、例えば抗原抗体反応のような生体物質の相互作用を利用して、作用電極の表面近傍に被検物質量に対応した金属微粒子を集め、金属微粒子を構成する金属を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際の還元電流値を測定する。ここで得られる還元電流強度は、作用電極の近傍に集められた金属量を表すことから、これに基づいて被検物質の定量又は検出が実現される。ここで、金属微粒子の電気化学的酸化は、作用電極の表面近傍に金属微粒子を集めた状態で行うことが重要である。これにより、被検物質との反応に関与した金属微粒子の全てを作用電極表面との電子授受に関与させることができるため、結果として被検物質の高感度な測定が実現される。
なお、測定により得られる還元電流値に含まれるノイズは、従来の電気化学的測定により得られる酸化電流値に比較して少ないことから、本発明によれば被検物質の正確な検出を行うことができる。また、金属微粒子の酸化は作用電極の電位制御により容易に実現することができるため、例えば化学的処理により酸化する場合等に比較して、測定操作の煩雑化は最小限に抑えられる。
本発明によれば、例えばＥＬＩＳＡの検出工程において用いられるような大型の測定機器を必要とすることなく、簡便な操作にて試験溶液中の被検物質の高感度且つ正確な測定を実現することができる。
１ 作用電極、２ 一次抗体、３ 被検物質（抗原）、４ 二次抗体、５ 金属微粒子、１１ 磁性微粒子、１２ 容器、１３ 反応溶液、１４ 磁石、１５ 電気化学的測定用溶液、２１ イムノクロマトグラフィー用ストリップ、２２ メンブレン、２３ 判定部、２４ コントロール部、３１ 対極、３２ 基板、４１ 印刷電極、４２ 作用電極、４３ 対極、４４ 参照電極、４５ 絶縁支持体、４６ 絶縁層、５１ プレナー型印刷電極デバイス、５２ 絶縁被膜、５３ 作用電極、５４ 対極、５５ 参照極、５６ 絶縁支持基板
以下、本発明を適用した被検物質の測定方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。
前述の目的を達成するために、本発明に係る被検物質の測定方法は、被検物質に特異的に結合する抗体である第１の結合物質が固定された作用電極と、当該被検物質に特異的に結合する抗体である第２の結合物質を金属微粒子で標識した標識体とを用意し、前記作用電極の表面に試験溶液と前記標識体とを供給して抗原抗体反応させることにより、試料溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極の表面近傍に集め、前記作用電極の電位制御を行い、前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるとともに、測定に用いる抗体や測定溶液中の夾雑物に由来するノイズの影響を抑えた状態とし、前記ノイズの影響を抑えた状態で酸化した前記金属微粒子を電気化学的に還元させる際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べることを特徴とする。本発明は、前記夾雑物が、チロシン又はトリプトファンを含むことを特徴とする。本発明は、前記金属微粒子が粒径４０ｎｍ〜６０ｎｍの金微粒子であることを特徴とする。本発明は、前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるに際し、濃度が０．１規定〜０．５規定の塩酸水溶液中で銀塩化銀参照電極に対する前記作用電極の電位を＋１．２Ｖ〜＋１．６Ｖに４０秒以上１００秒以下で保持することを特徴とする。本発明は、前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるに際し、飽和ＫＣｌ水溶液中で銀塩化銀参照電極に対する前記作用電極の電位を＋１．２Ｖ〜＋１．６Ｖに４０秒以上１００秒以下で保持することを特徴とする。
本発明は、試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集め、前記金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べる被検物質の測定方法において、被検物質に特異的に結合する第２の結合物質を金属微粒子で標識した標識体を用意するとともに、被検物質に特異的に結合する第１の結合物質を少なくとも作用電極及び対極に固定し、前記作用電極と前記対極との表面に試験溶液と前記標識体とを供給して反応させることにより試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極及び前記対極の表面近傍に集め、前記作用電極に対して前記対極を正電位とする電位制御を行った後、前記電位制御により前記作用電極表面に析出した金属と前記作用電極の表面近傍に集めた前記金属微粒子とを電気化学的に酸化することを特徴とする。本発明は、試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集め、前記金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べる被検物質の測定方法において、被検物質に特異的に結合する第１の結合物質を所定の固定化領域に固定したイムノクロマトグラフィー用ストリップと、被検物質に特異的に結合する第２の結合物質を前記金属微粒子で標識した標識体とを用意し、試験溶液及び前記標識体を前記イムノクロマトグラフィー用ストリップに展開した後、前記イムノクロマトグラフィー用ストリップの前記固定化領域と前記作用電極とを重ね合わせることにより、試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極の表面近傍に集めることを特徴とする。
本発明は、試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集め、前記金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べる被検物質の測定方法において、被検物質に特異的に結合する第２の結合物質を金属微粒子で標識した標識体を用意するとともに、被検物質に特異的に結合する第１の結合物質を少なくとも作用電極及び対極に固定し、前記作用電極と前記対極との表面に試験溶液と前記標識体とを供給して反応させることにより試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極及び前記対極の表面近傍に集め、前記作用電極に対して前記対極を正電位とする電位制御を行った後、前記電位制御により前記作用電極表面に析出した金属と前記作用電極の表面近傍に集めた前記金属微粒子とを電気化学的に酸化することを特徴とする。本発明は、試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集め、前記金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べる被検物質の測定方法において、被検物質に特異的に結合する第１の結合物質を所定の固定化領域に固定したイムノクロマトグラフィー用ストリップと、被検物質に特異的に結合する第２の結合物質を前記金属微粒子で標識した標識体とを用意し、試験溶液及び前記標識体を前記イムノクロマトグラフィー用ストリップに展開した後、前記イムノクロマトグラフィー用ストリップの前記固定化領域と前記作用電極とを重ね合わせることにより、試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極の表面近傍に集めることを特徴とする。
次に、前記標識体及び未知量の被検物質３を含む試験溶液を作用電極１の表面に供給し、一次抗体２と接触させ、作用電極１上で抗原抗体反応を行う。標識体が被検物質３を介して一次抗体２に結合することにより、被検物質３の濃度に対応した量の金属微粒子５が作用電極１の近傍に集められた状態となる（図１（ｂ））。
ここで、本発明においては、生体物質、合成物質等のあらゆる物質を被検物質とすることができる。被検物質に特異的に結合する結合物質（第１の結合物質、第２の結合物質）には、被験物質に応じて適切なものを選択する。試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を集めるために、本実施形態では抗原と抗体との特異的結合を利用しているが、物質間で特異的に結合するものであればこの組合せに限らず、例えば、核酸−核酸、核酸−核酸結合タンパク質、レクチン−糖鎖、又はレセプター−リガンドの特異的結合を利用してもよい。被検物質−特異的結合物質の関係の順序は、前記と逆でもよい。
標識物質として用いられる金属微粒子５としては特に制限されないが、例えば金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム等の微粒子やそれらのコロイド粒子、量子ドット等を用いることができる。なかでも粒径１０ｎｍ〜６０ｎｍの金微粒子、特に粒径４０ｎｍ程度の金微粒子を用いることが好ましい。
抗原抗体反応を行い、作用電極１の表面を必要に応じて洗浄した後、例えば電気化学的測定用の溶液と作用電極１と接触させた状態とする。溶液と作用電極１とを接触させるには、作用電極１の表面に溶液を滴下する、作用電極１を溶液に浸す等、任意の手段をとることができる。
次に、金属微粒子５を電気化学的に酸化させる。例えば、参照電極に対する作用電極１の電位を、金属微粒子５が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。このことにより、作用電極１の表面近傍に集めた金属微粒子５を完全に酸化する（図１（ｃ））。このとき、図示は省略するが、対極及び参照電極も溶液に接触させた状態とする。
金属微粒子５を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じるピーク電流値に基づいて、被検物質の有無又は濃度を測定する（図１（ｄ））。具体的には、例えば、作用電極１の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、前述の電位制御により酸化溶出した金属が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。試験溶液中の被検物質が多く、作用電極１の近傍に集められた金属微粒子が多いほど還元電流強度も大きくなることから、これに基づいて被検物質の定量又は検出が実現される。例えば、還元電流値と既知濃度の被検物質と関係を予め求めておき、測定された還元電流値と比較することにより、被検物質濃度を求めることができる。また、得られる還元電流値から試験溶液中の被検物質の有無を知ることができる。
作用電極１の電位制御及び電気化学測定の際に用いる溶液としては、金属微粒子５を容易に電気化学的に酸化させることができることから、酸性溶液を用いることが好ましい。酸性溶液としては、金属微粒子５の種類等に応じて適宜選択すればよいが、例えば塩酸、硝酸、酢酸、リン酸、クエン酸、硫酸等を含む水溶液を用いることができる。金属微粒子５の電気化学的酸化のし易さを考慮すると、０．０５規定〜２規定の塩酸水溶液を用いることが好ましく、０．１規定〜０．５規定の塩酸水溶液を用いることがより好ましい。
一方、作用電極１の電位制御及び電気化学測定の際に用いる溶液としては、酸性溶液の他、塩素を含む中性溶液を用いることも可能である。塩素を含む中性溶液を用いることにより、酸性溶液を用いる場合に比べて大きな電流変化量が得られ、結果として、より高感度な測定が達成される。また、酸性溶液を用いる場合、例えば低電位側における還元ピークの裾が上昇する等のようにピーク形状が非対称となったり、例えば０．１Ｖ付近においてノイズが発生することがある。これに対して、塩素を含む中性溶液を用いることで、還元ピークの裾が平坦となるとともに、前記ノイズ発生が抑えられるので、還元ピーク強度検出が簡便となる。さらに、酸性溶液やアルカリ溶液のような取扱いの難しい溶液の使用を回避することができ、測定操作を安全且つ簡便に実施することができる。塩素を含む中性溶液としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ等を用いたときに前記の効果を得られるが、特にＫＣｌを用いたときに効果が大きい。
金属微粒子５を酸化させるに際して、作用電極１の電位は、金属微粒子５が酸化可能な電位とする。具体的には、作用電極１の電位は、使用する金属微粒子５の種類に応じて適宜最適な値に設定する必要があるが、例えば、銀塩化銀参照電極に対して＋１〜＋２Ｖとすることが好ましい。作用電極１の電位を前記範囲内にすることにより、作用電極１の表面近傍に集めた金属微粒子５を完全に酸化溶出させることができ、被検物質３の検出感度を確実に向上させることができる。作用電極１の電位を前記範囲未満とした場合、測定時に還元電流のピークが現れないおそれがあり、逆に前記範囲を超えた場合、酸化させた金属微粒子５の泳動による拡散が起こり、作用電極１近傍における酸化物の濃度が低下してしまい、これにより還元電流のピークが小さくなるおそれがある。より好ましい範囲は、＋１．２Ｖ〜＋１．６Ｖである。
金属微粒子５を電気化学的に酸化させる具体的な手段としては、作用電極１の電位を金属微粒子５が酸化する電位に所定時間保持することが挙げられる。前記電位を所定時間保持する操作は、金属微粒子を十分に酸化させられるため、好ましい方法である。また、作用電極に金属微粒子が電気化学的に酸化する電位を印加するに際しては、前述したように作用電極の電位を所定の電位に保持する方法の他、例えばサイクリックボルタンメトリー等によって、作用電極の電位を時間経過に伴い変化させてもよい。作用電極の電位を時間経過に伴って変化させる場合には、金属微粒子が酸化する電位の範囲内（例えば、銀塩化銀参照電極に対し＋１〜＋２Ｖ）において、作用電極の電位を変化させることが好ましい。さらに、金属微粒子を酸化させるに際しては、金属微粒子が電気化学的に酸化する電位を作用電極に複数回印加してもよい。
なお、金属微粒子５として粒径１０ｎｍ〜６０ｎｍの金微粒子を使用する場合、金微粒子を電気化学的に酸化させるに際して、０．１規定〜０．５規定の塩酸溶液中で、銀塩化銀参照電極に対する前記作用電極の電位を＋１．２Ｖ〜＋１．６Ｖとすることが好ましい。
ここで、金属微粒子５を十分に酸化させるに際しては、金属微粒子５の量に応じて最適な電荷量を与えるように注意する必要がある。電荷量は電流を積分した値であるため、作用電極１に印加する電位が比較的低い電位であれば、金属微粒子を十分に酸化させるためには当該電位を長時間印加する必要がある。一方、作用電極１に印加する電位が比較的高い電位であれば、金属微粒子５を十分に酸化させるために必要な時間は短時間でよい。
金属微粒子５が電気化学的に酸化する電位に作用電極１の電位を保持する時間を１秒以上とすることで、金属微粒子を十分に酸化させることができ、検出感度を確実に向上させることができる。一方、印加時間を１００秒以上としても得られる電流値は殆ど変わらない。したがって、１秒以上１００秒以下が好ましい。前記電位の保持時間のさらに好ましい範囲は、４０秒以上１００秒以下である。
酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。
以上のような第１の実施形態においては、作用電極上で抗原抗体反応等を行って作用電極の表面近傍に金属微粒子を集め、標識体に含まれる金属微粒子に由来する還元ピーク電流を測定するので、簡便且つ高感度に試験溶液中の被検物質を測定することができる。
（第２の実施形態）
第２の実施形態は、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集める具体的な手段が第１の実施形態と相違している。すなわち、本実施形態においては、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集めるに際し、被検物質に対する２種類の結合物質を用意し、一方（第１の結合物質）を磁性微粒子の表面に固定化しておくとともに、他方（第２の結合物質）を金属微粒子で標識して標識体を形成しておき、標識体と反応させた後の磁性微粒子を作用電極の表面に集めることでこれを実現している。以下、第２の実施形態について、図２を参照しながら説明する。なお、以下の各実施形態の説明では、前述した第１の実施形態と重複する説明は省略する。
第２の実施形態は、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集める具体的な手段が第１の実施形態と相違している。すなわち、本実施形態においては、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集めるに際し、被検物質に対する２種類の結合物質を用意し、一方（第１の結合物質）を磁性微粒子の表面に固定化しておくとともに、他方（第２の結合物質）を金属微粒子で標識して標識体を形成しておき、標識体と反応させた後の磁性微粒子を作用電極の表面に集めることでこれを実現している。以下、第２の実施形態について、図２を参照しながら説明する。なお、以下の各実施形態の説明では、前述した第１の実施形態と重複する説明は省略する。
先ず、磁性微粒子１１の表面に、被検物質３に特異的に結合する第１の結合物質として一次抗体２を固定しておく。一方、磁性微粒子１１に固定した一次抗体２とは異なる部位を認識する第２の結合物質として二次抗体４に金属微粒子５を標識することにより、標識体を用意しておく。
次に、所定の容器１２内に反応溶液１３を準備する。反応溶液１３は、一次抗体２が固定化された磁性微粒子１１と、金属微粒子５で標識した二次抗体４と、未知濃度の被検物質３を含む試験溶液とを混合したものであり、これを所定時間インキュベーションすることにより、磁性微粒子１１上で抗原抗体反応を行う。この結果、標識体が被検物質３を介して磁性微粒子１１に結合する（図２（ａ））。
次に、磁石１４を用いて磁性微粒子１１を反応溶液１３から分離する（図２（ｂ））。その後、分離した磁性微粒子１１を電気化学的測定用の溶液に懸濁する。
次に、金属微粒子５を作用電極１の表面近傍に集める（図２（ｃ））。具体的には、標識体が結合した磁性微粒子１１を電気化学的測定用の溶液１５に懸濁し、懸濁液を作用電極１の表面に滴下する等により供給する。その後、例えば所定時間静置して磁性微粒子１１を沈殿させることにより、金属微粒子５が作用電極１の表面近傍に集められた状態が得られる。或いは、作用電極１の裏面に磁石を配置して磁性微粒子１１を磁気的に作用電極１の表面に吸着させれば、磁性微粒子１１に結合した金属微粒子５を作用電極１の近傍に集める時間を短縮することができる。
この後の工程は、前述した第１の実施形態と同様である。すなわち、金属微粒子５を電気化学的に酸化させる。好ましくは、参照電極に対する作用電極１の電位を、金属微粒子５が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。このことにより、作用電極１の表面近傍に集めた金属微粒子５を完全に酸化する（図２（ｄ））。このとき、図示は省略するが、対極及び参照電極も溶液に接触させた状態とする。
電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じるピーク電流値に基づいて、被検物質の有無又は濃度を測定する（図２（ｅ））。具体的には、作用電極１の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。以上のようにして、第１の実施形態と同様に、被検物質濃度及び被検物質の有無を知ることができる。
また、本実施形態においては、反応溶液中に懸濁することが可能な磁性微粒子１１に一次抗体２を固定化して被検物質３を捕捉するので、作用電極１の表面に一次抗体２を固定化する場合に比較して、被検物質３と標識体との反応効率を高めることができる。
さらに、磁気的な分離が可能な磁性微粒子１１を使用することで、磁性微粒子１１の懸濁に必要な電気化学的測定用溶液の量を減らすことができる。すなわち、電気化学的測定用溶液中に磁性微粒子１１（金属微粒子５）を高濃度に存在させることができるため、検出感度のさらなる向上を図ることができる。
（第３の実施形態）
第３の実施形態は、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集める具体的な手段が第１の実施形態と相違している。すなわち、第３の実施形態においては、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集めるに際し、被検物質に対する２種類の特異的結合物質を用意し、一方（第１の結合物質）をイムノクロマトグラフィー用ストリップの判定部に固定化しておくとともに、他方（第２の結合物質）を金属微粒子で標識して標識体を形成しておき、試験溶液及び標識体をストリップ上に展開した後、ストリップと作用電極の表面とを対向させることにより、これを実現している。以下、イムノクロマトグラフィー法に適用した例について、図３及び図４を参照しながら説明する。
第３の実施形態は、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集める具体的な手段が第１の実施形態と相違している。すなわち、第３の実施形態においては、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集めるに際し、被検物質に対する２種類の特異的結合物質を用意し、一方（第１の結合物質）をイムノクロマトグラフィー用ストリップの判定部に固定化しておくとともに、他方（第２の結合物質）を金属微粒子で標識して標識体を形成しておき、試験溶液及び標識体をストリップ上に展開した後、ストリップと作用電極の表面とを対向させることにより、これを実現している。以下、イムノクロマトグラフィー法に適用した例について、図３及び図４を参照しながら説明する。
イムノクロマトグラフィー分析に用いるストリップの構造は特に限定されるものではないが、例えば図３に示すようなイムノクロマトグラフィー用ストリップ２１を用いることができる。イムノクロマトグラフィー用ストリップ２１は、ニトロセルロースからなる短冊状のメンブレン２２と、メンブレン２２の下流側に接合された吸収パッド２５と、メンブレン２２の裏面側に配されたバッキングシート２６とを備えている。図４（ａ）に示すように、メンブレン２２表面の所定領域には一次抗体２が固定化され、判定部（固定化領域）２３を形成している。判定部２３の下流のメンブレン２２の表面には、金属微粒子５で標識した二次抗体４に特異的に結合する抗体が固定化され、コントロール部２４を形成している。
試験溶液中の被検物質を検出するには、先ず、通常のイムノクロマトグラフィー法と同様に試験溶液を展開する。すなわち、試験溶液と金属微粒子５で標識した二次抗体４とを混合し、イムノクロマトグラフィー用ストリップ２１の一端（図３においては左端）に吸収させ、毛細管現象を利用して展開させる。試験溶液中に被検物質３が存在する場合、一次抗体２と二次抗体４とがサンドイッチ状に被検物質３に対して結合し、結果として被検物質３に応じた量の金属微粒子５が判定部２３に捕捉される（図４（ｂ））。コントロール部２４に捕捉された標識二次抗体からの発色により、展開が終了したことが示される。
次に、メンブレン２２のうち少なくとも判定部２３と作用電極１とを重ね合わせる。これにより、判定部２３に集められた金属微粒子５が作用電極１の表面近傍に近づけられ、集められることになる（図４（ｃ））。金属微粒子５と作用電極１との距離を確実に縮めることを目的に、メンブレン２２のうち少なくとも判定部２３と作用電極１とを重ね合わせた後、加圧してもよい。加圧は、メンブレン２２の表面と作用電極１の表面とが確実に接触する程度に軽く行えばよい。
メンブレン２２のうち少なくとも判定部２３と作用電極１との間隙には電気化学的測定用の溶液１５を満たしておく。このとき、図示は省略するが、対極及び参照電極も溶液１５に接触させた状態とする。
この後の工程は、前述した第１の実施形態と同様である。すなわち、金属微粒子５を電気化学的に酸化させる。好ましくは、参照電極に対する作用電極１の電位を、金属微粒子５が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。このことにより、作用電極１の表面近傍に集めた金属微粒子５を完全に酸化する。
電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じるピーク電流値に基づいて、被検物質の有無又は濃度を測定する（図４（ｄ））。具体的には、作用電極１の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。以上のようにして、第１の例と同様に、被検物質濃度を求めることができる。また、得られる還元電流値から試験溶液中の被検物質の有無を知ることができる。さらに、イムノクロマトグラフィー分析の簡便性を損なうことなく、高感度な定量分析を実現することができる。
（第４の実施形態）
以下、第４の実施形態について説明する。前述した第１の実施形態では、作用電極のみに第１の結合物質として一次抗体を固定し、作用電極のみを反応場として例えば抗原抗体反応を行っている。しかしながら、作用電極、対極及び参照電極が同一基板上に例えば印刷形成されたプレナー型デバイスを用いている場合、反応場である作用電極の面積はデバイス自体の大きさ、対極面積、参照電極面積等に制限されるため、第１の実施形態において説明した測定方法では、感度の向上には限界がある。
以下、第４の実施形態について説明する。前述した第１の実施形態では、作用電極のみに第１の結合物質として一次抗体を固定し、作用電極のみを反応場として例えば抗原抗体反応を行っている。しかしながら、作用電極、対極及び参照電極が同一基板上に例えば印刷形成されたプレナー型デバイスを用いている場合、反応場である作用電極の面積はデバイス自体の大きさ、対極面積、参照電極面積等に制限されるため、第１の実施形態において説明した測定方法では、感度の向上には限界がある。
そこで本実施形態では、作用電極と少なくとも対極との両方を抗原抗体反応等の反応場として利用し、且つ、少なくとも対極の表面近傍に集められた金属微粒子を酸化溶出させ、作用電極へ電気化学的に泳動させて作用電極表面に析出させた後に、第１の例と同様にして作用電極の表面近傍に集められた金属微粒子の電気化学的酸化を行う。これにより、作用電極以外の領域に集められた金属微粒子についても電気化学的測定の対象となるので、より多くの金属微粒子が作用電極の表面に効率よく集められたことになり、検出感度のさらなる向上が実現される。
具体的には、先ず、図５（ａ）に示すように、作用電極１、対極３１及び参照電極（図示は省略する）が同一の基板３２上に形成されたプレナー型電極デバイスを用意し、作用電極１と対極３１の両方に、被検物質３に対する第１の結合物質として一次抗体２を固定する。また、基板３２のうち、作用電極１と対極３１とで挟まれる電極間領域３２ａ上にも一次抗体２を固定する。作用電極１と対極３１とで挟まれる電極間領域３２ａ上にも一次抗体２を固定することで、さらなる高感度検出が達成される。電極デバイス表面は、非特異吸着を防ぐためにブロッキングする。一方、被検物質３上の異なる部位を認識する第２の結合物質として二次抗体４を用意し、これに金属微粒子５を標識することにより標識体を用意しておく。なお、作用電極、対極及び参照電極は互いに近接した場所に存在していれば、必ずしも同一基板上に形成されていなくてもよい。
次に、前記標識体及び未知量の被検物質３を含む試験溶液を作用電極１、対極３１及び電極間領域３２ａの表面に供給し、一次抗体２と接触させ、作用電極１、対極３１及び電極間領域３２ａ上で抗原抗体反応を行う。標識体が被検物質３を介して一次抗体２に結合することにより、被検物質３の濃度に応じた金属微粒子５が作用電極１、対極３１及び電極間領域３２ａの表面近傍に集められた状態となる（図５（ｂ））。
次に、作用電極１、対極３１及び電極間領域３２ａの表面を必要に応じて洗浄した後、これらの表面を電気化学的測定用の溶液と接触させ、作用電極１に対して対極３１を正電位とする電位制御を行う。これにより、対極３１の表面近傍に集められた金属微粒子５は酸化溶出し、溶液中を電気的に泳動する。また、作用電極１と対極３１との間に位置する電極間領域３２ａの表面近傍に集められた金属微粒子５も、溶液中を電気的に泳動する。そして、作用電極１の表面に到達すると金属３３として析出する（図５（ｃ））。この結果、反応に関与した全ての金属微粒子５が作用電極１の表面近傍に集められることになる。
少なくとも対極３１の表面近傍の金属微粒子５を溶出させ、作用電極１の表面に泳動させて析出させるためには、作用電極１に対する対極３１の電位を金属微粒子５が酸化する電位とする必要がある。具体的には、使用する前記測定用の溶液により変わるが、例えば、作用電極１に対する対極の電位を＋１Ｖ〜＋２Ｖの範囲内とすることが好ましい。前記範囲内とすることにより、少なくとも対極３１の表面に集められた金属微粒子５を確実に溶出させ、作用電極１上へ泳動させることができる。作用電極１に対する対極３１の電位は、金属微粒子５が酸化する電位に所定時間保持してもよいし、金属微粒子５が酸化する電位の範囲内で時間経過に伴って変化させてもよい。
この後の工程は、前述した第１の実施形態と同様である。すなわち、作用電極１の表面近傍に集めた金属微粒子５を電気化学的に酸化させる。このことにより、作用電極１の表面近傍に集めた金属微粒子５を完全に酸化する（図５（ｄ））。このとき、作用電極１の表面に析出した金属３３も酸化することになる。次に、酸化した金属を還元する際に生じるピーク電流を測定し、これに基づいて、被検物質の濃度等を調べる（図５（ｅ））。具体的には、例えば、作用電極１の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、前述の電位制御により酸化した（溶出した）金属が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。還元電流値と既知濃度の被検物質と関係を予め求めておき、測定された還元電流値と比較することにより、被検物質濃度を求めることができる。また、得られる還元電流値から試験溶液中の被検物質の有無を知ることができる。
以上のように、本実施形態によれば、作用電極１以外の少なくとも対極３１も反応場として利用するとともに、少なくとも対極３１の表面近傍に集めた金属微粒子５を作用電極１表面へ移すので、反応に関与した標識体中の全ての金属微粒子５について還元電流を測定することができ、作用電極１の表面のみを反応場とする場合に比べてさらなる高感度化を実現することができる。また、少なくとも対極３１の表面に集められた金属微粒子５の作用電極１の表面への泳動は、作用電極１と対極３１との電位を制御するという簡便な操作で達成されるので、例えば溶液を撹拌するための機械的な構造は不要である。したがって、電極デバイス側の構造を変更することなく、また、極めて簡単な操作で高感度化を実現することができる。
なお、以上の説明においては、被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法として、非競合反応を利用して試験溶液中の被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法を例に挙げたが、競合反応を利用して試験溶液中の被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法を採用しても構わない。
以下、本発明の実施例について、実験結果を参照して説明する。
（実験１）
本実験では、作用電極の表面に一次抗体（抗ｈＣＧ抗体）を固定化した印刷電極を用いて、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で希釈したヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定を試みた。ｈＣＧは妊娠診断用マーカーの一種である。金コロイド標識二次抗体としては、金コロイド標識抗ｈαＳ抗体を用いた。
本実験では、作用電極の表面に一次抗体（抗ｈＣＧ抗体）を固定化した印刷電極を用いて、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で希釈したヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定を試みた。ｈＣＧは妊娠診断用マーカーの一種である。金コロイド標識二次抗体としては、金コロイド標識抗ｈαＳ抗体を用いた。
１．作用電極への抗体の固定化
被検物質測定用の電極デバイスとしては、図６に示すようなプレナー型の印刷電極デバイス４１（幅４ｍｍ、長さ１２ｍｍ）を用いた。印刷電極デバイス４１は、カーボンペーストで形成した作用電極４２及び対極４３と、カーボンペーストで形成したリード（図示は省略する。）と、銀／塩化銀で形成した参照電極４４とを絶縁支持体４５上に有するものであり、作用電極４２、対極４３及び参照電極４４の表面の一部が絶縁層４６で被覆されることにより、有効な電極面積が規定されている。
被検物質測定用の電極デバイスとしては、図６に示すようなプレナー型の印刷電極デバイス４１（幅４ｍｍ、長さ１２ｍｍ）を用いた。印刷電極デバイス４１は、カーボンペーストで形成した作用電極４２及び対極４３と、カーボンペーストで形成したリード（図示は省略する。）と、銀／塩化銀で形成した参照電極４４とを絶縁支持体４５上に有するものであり、作用電極４２、対極４３及び参照電極４４の表面の一部が絶縁層４６で被覆されることにより、有効な電極面積が規定されている。
濃度１００μｇ／ｍｌに調製した抗ｈＣＧ抗体（一次抗体）溶液を作用電極上に２μｌ滴下し、４℃の冷暗所で１２時間以上静置することにより抗ｈＣＧ抗体を作用電極の表面に固定した。ＰＢＳを用いて印刷電極デバイスを洗浄後、０．１％の牛血清アルブミンでブロッキングを行った。
２．被検物質の測定
被検物質としてのｈＣＧをＰＢＳ（リン酸緩衝液）で希釈することにより、ｈＣＧ濃度が６２ｐｇ／ｍｌ、６２０ｐｇ／ｍｌ、６２ｎｇ／ｍｌとなるように溶液を調製した。それらの溶液を、抗体の固定及びブロッキングを行った前記作用電極上に２μｌ滴下し、室温で３０分静置することにより抗原抗体反応させた。その後、ＰＢＳを用いて印刷電極デバイスを洗浄した。
被検物質としてのｈＣＧをＰＢＳ（リン酸緩衝液）で希釈することにより、ｈＣＧ濃度が６２ｐｇ／ｍｌ、６２０ｐｇ／ｍｌ、６２ｎｇ／ｍｌとなるように溶液を調製した。それらの溶液を、抗体の固定及びブロッキングを行った前記作用電極上に２μｌ滴下し、室温で３０分静置することにより抗原抗体反応させた。その後、ＰＢＳを用いて印刷電極デバイスを洗浄した。
次に、金コロイド標識ｈαＳ抗体溶液を前記処理した作用電極上に２μｌ滴下し、室温で３０分静置することにより抗原抗体反応させた。その後、ＰＢＳを用いて印刷電極デバイスを洗浄した。
洗浄後、０．１規定塩酸水溶液の３０μｌを、作用電極、参照極及び対極の全面が完全に覆われるように前記処理した印刷電極デバイス上に滴下し、銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位を＋１．２Ｖに保持した。保持時間は４０秒間とした。
次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極の電位を０．８Ｖから−０．１Ｖへ変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス幅０．０５Ｓ、パルス期間０．２Ｓとした。電位に対する電流変化の特性図を、図７に示す。図７に示すように、＋０．４Ｖ付近に、金の還元に伴う電流のピークが得られている。
また、試験溶液中のｈＣＧ濃度と電流値との関係を、図８に示す。図８より、ｈＣＧ濃度が高くなるにつれて、電流値も増加する傾向が見られた。これは、作用電極表面上の一次抗体（ｈＣＧ抗体）と反応した抗原（ｈＣＧ）及び金コロイド標識二次抗体（金コロイド標識ｈαＳ抗体）の量が増加し、その結果、作用電極の表面上で還元される金コロイド量も増加することを表している。
（実験２）
金属微粒子を発色試薬として用いるイムノクロマトグラフィー法は、目視で被検物質の有無を容易に判定することができるという利点を有するが、定量分析には不向きである。イムノクロマトグラフィー用ストリップの判定部を光学的に測定して濃度を求める方法も考えられるが、良好な検出感度が得られるとは言い難い。そこで、本実験では、図３に示すようなｈＣＧ検出用のイムノクロマトグラフィー用ストリップ（幅４ｍｍ、長さ３０ｍｍ）を用いた通常のイムノクロマトグラフィー分析に本発明の電気化学的測定を利用した測定方法を適用し、ｈＣＧの測定を試みた。ストリップにおいては、判定部に抗ｈＣＧ抗体を、コントロール部に抗ｈαＳ抗体をそれぞれ固定してある。
金属微粒子を発色試薬として用いるイムノクロマトグラフィー法は、目視で被検物質の有無を容易に判定することができるという利点を有するが、定量分析には不向きである。イムノクロマトグラフィー用ストリップの判定部を光学的に測定して濃度を求める方法も考えられるが、良好な検出感度が得られるとは言い難い。そこで、本実験では、図３に示すようなｈＣＧ検出用のイムノクロマトグラフィー用ストリップ（幅４ｍｍ、長さ３０ｍｍ）を用いた通常のイムノクロマトグラフィー分析に本発明の電気化学的測定を利用した測定方法を適用し、ｈＣＧの測定を試みた。ストリップにおいては、判定部に抗ｈＣＧ抗体を、コントロール部に抗ｈαＳ抗体をそれぞれ固定してある。
被検物質としてのｈＣＧをＰＢＳで希釈することにより、ｈＣＧ濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように溶液を調製した。
ｈＣＧと充分に反応する濃度の金コロイド標識ｈαＳ抗体を各溶液と混合し、ストリップの一端に吸収させ、展開した。展開が終了した後、ストリップを乾燥させた。
次に、０．１Ｎ塩酸水溶液をストリップに染み込ませた後、図６に示すような印刷電極の作用電極が判定部に接触するように、ストリップと印刷電極とを重ね合わせた。なお、本実験では、作用電極の表面には一次抗体を固定していない。
次に、０．１Ｎ塩酸水溶液をストリップに染み込ませた後、図６に示すような印刷電極の作用電極が判定部に接触するように、ストリップと印刷電極とを重ね合わせた。なお、本実験では、作用電極の表面には一次抗体を固定していない。
次に、参照電極に対する作用電極の電位を＋１．５Ｖに保持した。保持時間は、作用電極近傍の金コロイドが充分に酸化するように、ｈＣＧ濃度に応じて３０秒〜１００秒の間で適宜設定した。
次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極の電位を負方向に変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件はステップパルス５ｍＶ／ｓｅｃ，パルス幅２５ｍＶとした。試験溶液中のｈＣＧ濃度と電流値との関係を、図９に示す。
図９より、ｈＣＧ濃度が高くなるにつれて、電流も増加する傾向が見られた。
なお、イムノクロマトグラフィー分析直後のストリップを観察したところ、ｈＣＧ濃度１ｎｇ／ｍｌまでは金コロイドの集積による判定部の発色を目視により確認することが可能であったが、濃度０．５ｎｇ／ｍｌ以下については目視での確認ができなかった。
これに対し、本発明の方法によれば、０．１ｎｇ／ｍｌのような低濃度のｈＣＧの検出も可能であることが確認された。
なお、イムノクロマトグラフィー分析直後のストリップを観察したところ、ｈＣＧ濃度１ｎｇ／ｍｌまでは金コロイドの集積による判定部の発色を目視により確認することが可能であったが、濃度０．５ｎｇ／ｍｌ以下については目視での確認ができなかった。
これに対し、本発明の方法によれば、０．１ｎｇ／ｍｌのような低濃度のｈＣＧの検出も可能であることが確認された。
（実験３）
本実験では、実験１と同様に、作用電極の表面に一次抗体（抗ｈＣＧ抗体）を固定化した印刷電極と金コロイド標識抗ｈαＳ抗体とを用いて、ヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定を試みた。ただし、本実験では、微分パルスボルタンメトリーを利用した実験１とは異なり、サイクリックボルタンメトリーを利用した。銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位は、−０．８Ｖ〜＋１．３Ｖの範囲とした。ｈＣＧ濃度６２ｎｇ／ｍｌの反応溶液を用いたときの結果を図１０に示す。比較として、銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位を−０．８Ｖ〜＋１．０Ｖの範囲としたときの結果、及び−０．８Ｖ〜＋１．３Ｖの範囲とし且つ抗原抗体反応させていないときの結果を併せて図１０に示す。
本実験では、実験１と同様に、作用電極の表面に一次抗体（抗ｈＣＧ抗体）を固定化した印刷電極と金コロイド標識抗ｈαＳ抗体とを用いて、ヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定を試みた。ただし、本実験では、微分パルスボルタンメトリーを利用した実験１とは異なり、サイクリックボルタンメトリーを利用した。銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位は、−０．８Ｖ〜＋１．３Ｖの範囲とした。ｈＣＧ濃度６２ｎｇ／ｍｌの反応溶液を用いたときの結果を図１０に示す。比較として、銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位を−０．８Ｖ〜＋１．０Ｖの範囲としたときの結果、及び−０．８Ｖ〜＋１．３Ｖの範囲とし且つ抗原抗体反応させていないときの結果を併せて図１０に示す。
図１０より、銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位を−０．８Ｖ〜＋１．０Ｖの範囲とした場合、及び−０．８Ｖ〜＋１．３Ｖの範囲で抗原抗体反応させていない場合には金の還元ピークは認められないが、金コロイド標識抗ｈαＳ抗体とｈＣＧを用いて抗原抗体反応させた後に作用電極の電位を−０．８Ｖ〜＋１．３Ｖの範囲とした場合には、０．３Ｖ付近に還元ピークが確認された。このことから金コロイドの酸化には１．０Ｖより大きな電位を印加する必要があることがわかる。
（実験４）
本実験は、第４の実施形態に対応している。本実験では、実験１〜３とは異なり、図１１に示すような形状のプレナー型印刷電極デバイス５１を用いた。このプレナー型印刷電極デバイス５１は、レジストからなる絶縁被膜５２に設けられた略円形の開口部５２ａに露出した作用電極５３と、作用電極５３の外周の少なくとも一部を取り囲むように配された対極５４と、参照極５５とが短冊状の絶縁支持基板５６上に印刷形成されたものである。絶縁被膜５２上には絶縁被膜５２より疎水性の高い表面を有する帯状のダム構造部材５７が印刷電極デバイス５１のほぼ全幅に亘って積層され、作用電極５２等に滴下された溶液がコネクタとの接続部分へ到達することを防いでいる。
本実験は、第４の実施形態に対応している。本実験では、実験１〜３とは異なり、図１１に示すような形状のプレナー型印刷電極デバイス５１を用いた。このプレナー型印刷電極デバイス５１は、レジストからなる絶縁被膜５２に設けられた略円形の開口部５２ａに露出した作用電極５３と、作用電極５３の外周の少なくとも一部を取り囲むように配された対極５４と、参照極５５とが短冊状の絶縁支持基板５６上に印刷形成されたものである。絶縁被膜５２上には絶縁被膜５２より疎水性の高い表面を有する帯状のダム構造部材５７が印刷電極デバイス５１のほぼ全幅に亘って積層され、作用電極５２等に滴下された溶液がコネクタとの接続部分へ到達することを防いでいる。
先ず、図１１に示す印刷電極デバイス５１のうち作用電極５３及び対極５４の両方を含む一端の表面全面、具体的には図１１中ａ−ａ線より左側の表面全面に、抗ｈＣＧ抗体を固定した。抗ｈＣＧ抗体の固定化及び抗原抗体反応は、実験１と同様に行った。ただし、本実験でのｈＣＧ濃度は６２ｎｇ／ｍｌであり、抗原抗体反応のための溶液は図１１中ａ−ａ線より左側の表面全面（以下、Ａ面と称する）に滴下した。
０．１規定塩酸水溶液をＡ面に滴下し、対極に対する作用電極の電位を−１．４Ｖに保持した。保持時間は８０秒間とした。この操作前後における作用電極及び対極の表面の顕微鏡写真を、図１２に示す。
図１２から、作用電極に対して対極を正電位とすることによって、対極においては金コロイドが酸化溶出することにより消失し、一方、作用電極表面には金が析出していることが確認された。なお、顕微鏡観察によって金の析出が明確に観察されたのは、作用電極の周縁部分であった。
作用電極の表面に金を析出させた後、実験１と同様の条件で、作用電極表面近傍に集めた金を電気化学的に酸化させ、その後、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極の電位を負方向に変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。この結果を実験１と同様に作用電極表面のみを反応領域としたものと比較したところ、より一層高感度な検出が実現したことが確認された。
（実験５）
本実験では、電気化学測定を行う際に用いる溶液として、０．１規定塩酸溶液、又は飽和塩化カリウム水溶液を用い、実験１と同様にして金コロイドの還元ピーク電流を測定した。サイクリックボルタンメトリーの結果を図１３に、微分パルスボルタンメトリーの結果を図１４に示す。図１３に示すように、飽和塩化カリウム水溶液を用いることで、塩酸溶液を用いる場合に比較して大きな還元ピーク電流強度が得られている。また、図１４に示すように、塩酸溶液では０．１Ｖ付近にノイズが発生しているが、飽和塩化カリウム水溶液ではノイズの発生は認められない。したがって、塩酸溶液に比較して、飽和塩化カリウム水溶液が測定溶液に適していることがわかる。
本実験では、電気化学測定を行う際に用いる溶液として、０．１規定塩酸溶液、又は飽和塩化カリウム水溶液を用い、実験１と同様にして金コロイドの還元ピーク電流を測定した。サイクリックボルタンメトリーの結果を図１３に、微分パルスボルタンメトリーの結果を図１４に示す。図１３に示すように、飽和塩化カリウム水溶液を用いることで、塩酸溶液を用いる場合に比較して大きな還元ピーク電流強度が得られている。また、図１４に示すように、塩酸溶液では０．１Ｖ付近にノイズが発生しているが、飽和塩化カリウム水溶液ではノイズの発生は認められない。したがって、塩酸溶液に比較して、飽和塩化カリウム水溶液が測定溶液に適していることがわかる。
（実験６）
本実験では、塩素を含む中性溶液として、飽和塩化カリウム水溶液と１Ｍの塩化ナトリウム水溶液のいずれが測定溶液として適しているかの比較検討を行った。具体的には、電気化学測定を行う際に用いる溶液として、飽和塩化カリウム水溶液、又は１Ｍの塩化ナトリウム水溶液を用い、実験１と同様にして金コロイドの還元ピーク電流を測定した。結果を図１５に示す。飽和塩化カリウム水溶液でより大きな出力が得られていることから、飽和塩化カリウム水溶液の使用が好ましいことが明らかとなった。
本実験では、塩素を含む中性溶液として、飽和塩化カリウム水溶液と１Ｍの塩化ナトリウム水溶液のいずれが測定溶液として適しているかの比較検討を行った。具体的には、電気化学測定を行う際に用いる溶液として、飽和塩化カリウム水溶液、又は１Ｍの塩化ナトリウム水溶液を用い、実験１と同様にして金コロイドの還元ピーク電流を測定した。結果を図１５に示す。飽和塩化カリウム水溶液でより大きな出力が得られていることから、飽和塩化カリウム水溶液の使用が好ましいことが明らかとなった。
（実験７）
本実験では、金属微粒子として粒径１５ｎｍの金コロイド、粒径２０ｎｍの金コロイド、粒径４０ｎｍの金コロイド、粒径６０ｎｍの金コロイドを用い、最適な粒径について検討した。具体的には、金コロイド標識ｈαＳ抗体に用いる金コロイド粒子として、粒径１５ｎｍの金コロイド、粒径２０ｎｍの金コロイド、粒径４０ｎｍの金コロイド、粒径６０ｎｍの金コロイドを用い、その他は実験１と同様にして金の還元ピーク電流のｈＣＧ濃度依存特性を調べた。結果を図１６に示す。ｈＣＧ濃度特性を比較すると、金コロイドの粒径が大きいほど還元電流値が大きく、かつ低濃度まで電流値変化が現れる傾向を示した。しかしながら、４０ｎｍと６０ｎｍでは電流値変化にほとんど差が無いため標識金コロイドの粒径はこれ以上大きくしても効果がないことが予想される。また、ｈＣＧ濃度をゼロとしたときの還元ピーク電流値は、粒径８０ｎｍの金コロイド粒子を用いたとき０．５４μＡ、粒径４０ｎｍのとき０．２μＡ、粒径１５ｎｍのとき０．１４μＡであった。すなわち、金コロイド粒子の粒径が大きくなるとノイズも大きくなる傾向を示すことがわかる。さらに、金コロイドの粒径が小さくなると低濃度の範囲まで電流値変化が得られないことから、１０〜６０ｎｍ程度が適当であり、４０ｎｍが最適であることがわかる。
本実験では、金属微粒子として粒径１５ｎｍの金コロイド、粒径２０ｎｍの金コロイド、粒径４０ｎｍの金コロイド、粒径６０ｎｍの金コロイドを用い、最適な粒径について検討した。具体的には、金コロイド標識ｈαＳ抗体に用いる金コロイド粒子として、粒径１５ｎｍの金コロイド、粒径２０ｎｍの金コロイド、粒径４０ｎｍの金コロイド、粒径６０ｎｍの金コロイドを用い、その他は実験１と同様にして金の還元ピーク電流のｈＣＧ濃度依存特性を調べた。結果を図１６に示す。ｈＣＧ濃度特性を比較すると、金コロイドの粒径が大きいほど還元電流値が大きく、かつ低濃度まで電流値変化が現れる傾向を示した。しかしながら、４０ｎｍと６０ｎｍでは電流値変化にほとんど差が無いため標識金コロイドの粒径はこれ以上大きくしても効果がないことが予想される。また、ｈＣＧ濃度をゼロとしたときの還元ピーク電流値は、粒径８０ｎｍの金コロイド粒子を用いたとき０．５４μＡ、粒径４０ｎｍのとき０．２μＡ、粒径１５ｎｍのとき０．１４μＡであった。すなわち、金コロイド粒子の粒径が大きくなるとノイズも大きくなる傾向を示すことがわかる。さらに、金コロイドの粒径が小さくなると低濃度の範囲まで電流値変化が得られないことから、１０〜６０ｎｍ程度が適当であり、４０ｎｍが最適であることがわかる。
（実験８）
本実験では、作用電極の表面に一次抗体（抗ｈＣＧ抗体）を固定化した印刷電極デバイスを用い、生体試料中のｈＣＧ濃度を測定した。
先ず、既知濃度のｈＣＧ希釈系列を実験１と同様の方法によって測定することにより、検量線を作成した。図１７に示すように、ｈＣＧ濃度と電流値との間に相関が認められた。次に、前記試験溶液の電流値を実験１と同様の方法によって測定し、ｈＣＧ濃度を検量線から読み取り、試験溶液のｈＣＧ濃度を求めた。試験溶液は、妊婦より採取した尿サンプルをＰＢＳで５００倍に希釈することにより調製した。結果を表１に示す。なお、各試験溶液のｈＣＧ濃度を従来のＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＥＬＩＳＡ法で用いた抗体は実験１と同じである。結果を併せて表１に示す。
本実験では、作用電極の表面に一次抗体（抗ｈＣＧ抗体）を固定化した印刷電極デバイスを用い、生体試料中のｈＣＧ濃度を測定した。
先ず、既知濃度のｈＣＧ希釈系列を実験１と同様の方法によって測定することにより、検量線を作成した。図１７に示すように、ｈＣＧ濃度と電流値との間に相関が認められた。次に、前記試験溶液の電流値を実験１と同様の方法によって測定し、ｈＣＧ濃度を検量線から読み取り、試験溶液のｈＣＧ濃度を求めた。試験溶液は、妊婦より採取した尿サンプルをＰＢＳで５００倍に希釈することにより調製した。結果を表１に示す。なお、各試験溶液のｈＣＧ濃度を従来のＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＥＬＩＳＡ法で用いた抗体は実験１と同じである。結果を併せて表１に示す。
表１より、本発明の方法によって、従来法であるＥＬＩＳＡと同様にｈＣＧの定量が可能であることがわかる。
（実験９）
本実験では、本発明の測定方法の検出感度と、従来法であるＥＬＩＳＡ法の検出感度とを、両実験で同じ抗原及び抗体を用いて比較した。本発明の測定方法は、実験１と同様に行った。ＥＬＩＳＡ法は、電極上ではなくＥＬＩＳＡ用のプラスチックプレート上に抗ｈＣＧ抗体を固定し、金コロイドではなくＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識したｈαＳ抗体を使用して抗原抗体反応させ、検出反応にはＴＭＢ（３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン）基質を用いた。結果を図１８に示す。図１８（ａ）に示すように、本発明の方法によれば、ｈＣＧ濃度１０２ｐｇ／ｍｌ程度までｈＣＧ濃度と測定結果との間に直線関係が得られた。一方、図１８（ｂ）に示すように、ＥＬＩＳＡ法で直線関係が得られる範囲はｈＣＧ濃度１０３ｐｇ／ｍｌ程度までだった。したがって、本発明の測定方法によれば、ＥＬＩＳＡ法に比べ１０倍程度感度向上が期待できることがわかる。また、ＥＬＩＳＡ法では１００μｌのサンプル溶液が必要だったのに対し、本発明の測定方法で必要なサンプル溶液はその５０分の１程度の２μｌだった。したがって、本発明の測定方法では、従来法に比較してサンプル量を大幅に減らすことが可能であるとわかる。
本実験では、本発明の測定方法の検出感度と、従来法であるＥＬＩＳＡ法の検出感度とを、両実験で同じ抗原及び抗体を用いて比較した。本発明の測定方法は、実験１と同様に行った。ＥＬＩＳＡ法は、電極上ではなくＥＬＩＳＡ用のプラスチックプレート上に抗ｈＣＧ抗体を固定し、金コロイドではなくＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識したｈαＳ抗体を使用して抗原抗体反応させ、検出反応にはＴＭＢ（３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン）基質を用いた。結果を図１８に示す。図１８（ａ）に示すように、本発明の方法によれば、ｈＣＧ濃度１０２ｐｇ／ｍｌ程度までｈＣＧ濃度と測定結果との間に直線関係が得られた。一方、図１８（ｂ）に示すように、ＥＬＩＳＡ法で直線関係が得られる範囲はｈＣＧ濃度１０３ｐｇ／ｍｌ程度までだった。したがって、本発明の測定方法によれば、ＥＬＩＳＡ法に比べ１０倍程度感度向上が期待できることがわかる。また、ＥＬＩＳＡ法では１００μｌのサンプル溶液が必要だったのに対し、本発明の測定方法で必要なサンプル溶液はその５０分の１程度の２μｌだった。したがって、本発明の測定方法では、従来法に比較してサンプル量を大幅に減らすことが可能であるとわかる。
（実験１０）
本実験では、電気化学的な還元ピーク電流を測定する場合と酸化ピーク電流を測定する場合とで、発生するノイズを比較した。
本実験では、電気化学的な還元ピーク電流を測定する場合と酸化ピーク電流を測定する場合とで、発生するノイズを比較した。
先ず、図１１に示す形状の印刷電極デバイスを用意し、濃度１３μｇ／ｍｌ、１３０μｇ／ｍｌ、１３５μｇ／ｍｌ又は５５０μｇ／ｍｌの抗ｈＣＧ抗体溶液を用い、実験１と同様にして作用電極の表面に抗体を固定した。なお、比較例として、抗ｈＣＧ抗体を固定化せずブロッキングのみ行い、ノイズ評価用印刷電極デバイスを用意した。
次に、作用電極に電位を正方向に印加していき、得られた電流値を測定した。酸化側の結果を図１９（ａ）に示す。一方、作用電極に電位を負方向に印加していき、得られた電流値を測定した。還元側の結果を図１９（ｂ）に示す。図１９（ａ）の酸化側の測定の結果に着目すると、金の酸化ピーク（０．９Ｖ付近）の近傍に、抗体に含まれるチロシンやトリプトファンの酸化ピークも認められた。抗体の固定化量が１３μｇ／ｍｌ、１３５μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌと増加するにつれて、それらの電流値も１０６ｎＡ、２９９ｎＡ、３３４ｎＡと増大した。この電流は、ブロッキングで用いたタンパク質や抗体に含まれるチロシンやトリプトファン等の酸化に由来するものである。一方、図１９（ｂ）の還元側の測定結果に示すように、金の還元ピーク（０．３〜０．４Ｖ）近傍には、前述の抗体やタンパク質等に由来するピークは認められなかった。以上の結果より、還元電流を測定することによって、酸化電流に比べてノイズの影響を抑えることができ、誤検出の危険性を抑えられることがわかる。
（実験１１）
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出させる際に印加する電圧（前処理電圧）について検討した。
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出させる際に印加する電圧（前処理電圧）について検討した。
先ず、図１１に示す形状の印刷電極デバイスを用意し、実験１と同様に、抗原抗体反応により金微粒子を作用電極表面近傍に集める操作を行った。次に、前記電極表面に０．１規定塩酸水溶液を滴下し、参照電極に対する作用電極の電位を１．２Ｖ、１．４Ｖ又は１．６Ｖに所定時間（０〜２００秒）保持した。
次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極の電位を０．８ｍＶから０Ｖへ変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件はこれまでと同じである。酸化電位の印加時間と０．３Ｖ付近に観察される金の還元に伴う電流ピーク値との関係を、図２０に示す。
図２０より、電位を１．２Ｖ以上としたとき還元による電流ピークを観察可能であった。なお、印加電位を１．２Ｖ未満とした場合、０．３Ｖ付近に還元電流のピークは認められなかった。一方、電位を高くするにつれて必要な印加時間は短くなる傾向を示した。なお、本実験の傾向より１．６Ｖより酸化電位が大きくなると僅かな印加時間の差でも電流値が大きく異なってしまうことが予想される。このことから、検出の際の安定性を確保するためには、酸化電位を１．６Ｖ以下に設定する必要がある。以上の結果より、金属微粒子を酸化溶出させるための電位は１．２Ｖ〜１．６Ｖとすることが好ましいことが確認された。
（実験１２）
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出させるための電圧の印加時間（前処理時間）について検討した。
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出させるための電圧の印加時間（前処理時間）について検討した。
金属微粒子を酸化するための電位を１．２Ｖに設定し、試験溶液中のｈＣＧ濃度を６２ｐｇ／ｍｌ、６２０ｐｇ／ｍｌ又は６２ｎｇ／ｍｌとしたこと以外は、実験１１と同様にして電位変化に対する電流変化を測定した。結果を図２１に示す。図２１より、印加時間１秒〜３００秒程度の範囲で測定可能であったが、印加時間を１００秒以上としても電流値に変化は殆ど見られなかった。したがって、１秒以上１００秒以下とすることが好ましいことがわかる。なお、酸化電位の印加時間を４０秒以上としたとき全てのｈＣＧ濃度において十分に高い電流値が得られたことから、４０秒以上１００秒以下が特に好ましいことがわかる。
（実験１３）
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出し、再析出させるための測定溶液である塩酸溶液の濃度条件を検討した。
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出し、再析出させるための測定溶液である塩酸溶液の濃度条件を検討した。
実験１と同様にして同量の金コロイド粒子を固定化した電極を複数用意し、０．０５規定、０．１規定、０．２規定、０．５規定、１．０規定（１．０規定はグラフに掲載無し）のそれぞれの濃度の塩酸溶液で、１．２Ｖ、４０秒の条件で酸化後、微分パルスボルタメトリーで電位変化に伴う還元電流を測定した。結果を図２２に示す。図２２より、０．０５規定の濃度ではグラフの形状が歪みピーク電流値も低くなっている。それ以外の濃度においては、１．０規定も含めてピーク電位は異なるものの同じような波形の結果となった。また、濃度をあまり高くすると扱いが困難になる。したがって、使用する塩酸としては０．０５規定〜２規定程度が適当であり、０．１規定〜０．５規定が特に好ましいことがわかる。
Claims (7)
- 被検物質に特異的に結合する抗体である第１の結合物質が固定された作用電極と、当該被検物質に特異的に結合する抗体である第２の結合物質を金属微粒子で標識した標識体とを用意し、前記作用電極の表面に試験溶液と前記標識体とを供給して抗原抗体反応させることにより、試料溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極の表面近傍に集め、前記作用電極の電位制御を行い、前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるとともに、測定に用いる抗体や測定溶液中の夾雑物に由来するノイズの影響を抑えた状態とし、前記ノイズの影響を抑えた状態で酸化した前記金属微粒子を電気化学的に還元させる際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べることを特徴とする被検物質の測定方法。
- 前記夾雑物が、チロシン又はトリプトファンを含むことを特徴とする請求項１記載の被検物質の測定方法。
- 前記金属微粒子が粒径４０ｎｍ〜６０ｎｍの金微粒子であることを特徴とする請求項１または２記載の被検物質の測定方法。
- 前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるに際し、濃度が０．１規定〜０．５規定の塩酸水溶液中で銀塩化銀参照電極に対する前記作用電極の電位を＋１．２Ｖ〜＋１．６Ｖに４０秒以上１００秒以下で保持することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項記載の被検物質の測定方法。
- 前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるに際し、飽和ＫＣｌ水溶液中で銀塩化銀参照電極に対する前記作用電極の電位を＋１．２Ｖ〜＋１．６Ｖに４０秒以上１００秒以下で保持することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項記載の被検物質の測定方法。
- 試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集め、前記金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べる被検物質の測定方法において、被検物質に特異的に結合する第２の結合物質を金属微粒子で標識した標識体を用意するとともに、被検物質に特異的に結合する第１の結合物質を少なくとも作用電極及び対極に固定し、前記作用電極と前記対極との表面に試験溶液と前記標識体とを供給して反応させることにより試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極及び前記対極の表面近傍に集め、前記作用電極に対して前記対極を正電位とする電位制御を行った後、前記電位制御により前記作用電極表面に析出した金属と前記作用電極の表面近傍に集めた前記金属微粒子とを電気化学的に酸化することを特徴とする被検物質の測定方法。
- 試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集め、前記金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べる被検物質の測定方法において、被検物質に特異的に結合する第１の結合物質を所定の固定化領域に固定したイムノクロマトグラフィー用ストリップと、被検物質に特異的に結合する第２の結合物質を前記金属微粒子で標識した標識体とを用意し、試験溶液及び前記標識体を前記イムノクロマトグラフィー用ストリップに展開した後、前記イムノクロマトグラフィー用ストリップの前記固定化領域と前記作用電極とを重ね合わせることにより、試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極の表面近傍に集めることを特徴とする被検物質の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008509813A JP5187759B2 (ja) | 2006-04-07 | 2007-03-29 | 被検物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006106583 | 2006-04-07 | ||
| JP2006106583 | 2006-04-07 | ||
| JP2006265183 | 2006-09-28 | ||
| JP2006265183 | 2006-09-28 | ||
| JP2008509813A JP5187759B2 (ja) | 2006-04-07 | 2007-03-29 | 被検物質の測定方法 |
| PCT/JP2007/056992 WO2007116811A1 (ja) | 2006-04-07 | 2007-03-29 | 被検物質の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2007116811A1 JPWO2007116811A1 (ja) | 2009-08-20 |
| JP5187759B2 true JP5187759B2 (ja) | 2013-04-24 |
Family
ID=38581105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008509813A Active JP5187759B2 (ja) | 2006-04-07 | 2007-03-29 | 被検物質の測定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090159458A1 (ja) |
| JP (1) | JP5187759B2 (ja) |
| WO (1) | WO2007116811A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016085168A (ja) * | 2014-10-28 | 2016-05-19 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法 |
| WO2021125173A1 (ja) | 2019-12-18 | 2021-06-24 | 株式会社イムノセンス | 電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそのセンサーおよびその製造方法 |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4969236B2 (ja) * | 2006-12-22 | 2012-07-04 | ローム株式会社 | 生体分子または生体関連物質の測定方法 |
| JP4915740B2 (ja) * | 2007-07-20 | 2012-04-11 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 銀イオンの測定方法及び被検物質の測定方法 |
| JP4915741B2 (ja) * | 2007-07-31 | 2012-04-11 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 被検物質の測定方法 |
| WO2009081680A1 (ja) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | 腎症の検査方法及びそれを用いた検査キット |
| JP4941994B2 (ja) * | 2008-01-25 | 2012-05-30 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 遺伝子の検出方法 |
| JP5473382B2 (ja) * | 2008-04-17 | 2014-04-16 | キヤノン株式会社 | 免疫測定方法 |
| JP5327739B2 (ja) * | 2008-05-12 | 2013-10-30 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 被検物質の測定方法 |
| JP2010107502A (ja) * | 2008-09-30 | 2010-05-13 | Sekisui Chem Co Ltd | 定量分析方法及び検出用カートリッジ |
| JPWO2010061772A1 (ja) * | 2008-11-28 | 2012-04-26 | コニカミノルタエムジー株式会社 | イムノクロマト媒体およびイムノクロマトグラフ法 |
| JP2011242387A (ja) * | 2010-04-21 | 2011-12-01 | Osaka Prefecture Univ | 生物学的物質の捕獲又は分離用複合微粒子 |
| JP5856780B2 (ja) | 2010-08-27 | 2016-02-10 | シスメックス株式会社 | 検出物質の光電気化学的検出方法及び被検物質の光電気化学的検出方法 |
| JP5806892B2 (ja) | 2010-09-30 | 2015-11-10 | シスメックス株式会社 | 検出物質の電気化学的検出方法および被検物質の電気化学的検出方法 |
| GB201118293D0 (en) * | 2011-10-24 | 2011-12-07 | Sec Dep For Business Innovation & Skills The | Electrochemical assay |
| JP5571705B2 (ja) * | 2012-01-12 | 2014-08-13 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 電気的分析方法 |
| GB201217390D0 (en) | 2012-09-28 | 2012-11-14 | Agplus Diagnostics Ltd | Test device and sample carrier |
| JP6410308B2 (ja) | 2014-12-12 | 2018-10-24 | 国立大学法人東北大学 | センサチップ、検出システム、及び、検出方法 |
| JP6664737B2 (ja) * | 2015-01-21 | 2020-03-13 | シスメックス株式会社 | 金属イオンの検出方法、被検物質の検出方法、電極基板および検出キット |
| JP7467378B2 (ja) | 2021-03-18 | 2024-04-15 | 株式会社東芝 | ケミカルセンサ、標的物質の検出方法及び検出装置 |
| JP7470461B1 (ja) | 2023-02-22 | 2024-04-18 | 株式会社イムノセンス | 電気化学的手法における被検物質に対する測定の正常性を判定する方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004512496A (ja) * | 2000-06-26 | 2004-04-22 | サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィーク（セーエヌエールエス） | コロイド金属マーカーを使用する電気化学的イムノアッセイ |
| JP2006516721A (ja) * | 2003-01-14 | 2006-07-06 | ディアグノスイス ソシエテ アノニム | 多孔質層上に試薬を含む複層化された電気化学系微小流体センサー |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4859612A (en) * | 1987-10-07 | 1989-08-22 | Hygeia Sciences, Inc. | Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite |
| US5955379A (en) * | 1996-04-25 | 1999-09-21 | Mcgill University | Biosensor device and method |
| AU711861B2 (en) * | 1996-04-25 | 1999-10-21 | Mcgill University | Biosensor device and method |
| US6248378B1 (en) * | 1998-12-16 | 2001-06-19 | Universidad De Sevilla | Enhanced food products |
| DE10015816A1 (de) * | 2000-03-30 | 2001-10-18 | Infineon Technologies Ag | Biosensorchip |
-
2007
- 2007-03-29 US US12/226,060 patent/US20090159458A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-29 JP JP2008509813A patent/JP5187759B2/ja active Active
- 2007-03-29 WO PCT/JP2007/056992 patent/WO2007116811A1/ja active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004512496A (ja) * | 2000-06-26 | 2004-04-22 | サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィーク（セーエヌエールエス） | コロイド金属マーカーを使用する電気化学的イムノアッセイ |
| JP2006516721A (ja) * | 2003-01-14 | 2006-07-06 | ディアグノスイス ソシエテ アノニム | 多孔質層上に試薬を含む複層化された電気化学系微小流体センサー |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN5003003631; ＤＥＱＵＡＩＲＥ， ＭＵＲＩＥＬＬＥ: ＡＮＡＬ． ＣＨＥＭ． Ｖ７２Ｎ２２, 2000, Ｐ５５２１-５５２８ * |
| JPN6012029010; Ｇｕｏｄｏｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．: 'Ａ ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｌａｂｅｌｓ' Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．５, 2005, ｐ．１０６０-１０６５ * |
| JPN6012029011; Ｍ．Ｂ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．: 'Ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｏｎ ｃａｒｂｏｎ ｐａｓｔｅ ｅｌｅｃｔｒｏ' Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ Ｖｏｌ．３８, 1995, ｐ．３８９-３９５ * |
| JPN6012029012; Ｆａｎｇ Ｌｕ ｅｔ ａｌ．: 'Ｒａｐｉｄ， ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔ' Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｏｌ．１３０, 2005, ｐ．１５１３-１５１７ * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016085168A (ja) * | 2014-10-28 | 2016-05-19 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法 |
| US10267759B2 (en) | 2014-10-28 | 2019-04-23 | Sysmex Corporation | Method of detecting test substance |
| WO2021125173A1 (ja) | 2019-12-18 | 2021-06-24 | 株式会社イムノセンス | 電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそのセンサーおよびその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007116811A1 (ja) | 2007-10-18 |
| US20090159458A1 (en) | 2009-06-25 |
| JPWO2007116811A1 (ja) | 2009-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5187759B2 (ja) | 被検物質の測定方法 | |
| Boonkaew et al. | Electrochemical paper-based analytical device for multiplexed, point-of-care detection of cardiovascular disease biomarkers | |
| Zhu et al. | A paper electrode integrated lateral flow immunosensor for quantitative analysis of oxidative stress induced DNA damage | |
| Lin et al. | A nanoparticle label/immunochromatographic electrochemical biosensor for rapid and sensitive detection of prostate-specific antigen | |
| US7045364B2 (en) | Electrochemical immunoassays using colloidal metal markers | |
| Kuntamung et al. | A label-free multiplex electrochemical biosensor for the detection of three breast cancer biomarker proteins employing dye/metal ion-loaded and antibody-conjugated polyethyleneimine-gold nanoparticles | |
| Mao et al. | Multiplex electrochemical immunoassay using gold nanoparticle probes and immunochromatographic strips | |
| Feng et al. | Simultaneous electrochemical detection of multiple biomarkers using gold nanoparticles decorated multiwall carbon nanotubes as signal enhancers | |
| Freitas et al. | Immunomagnetic bead-based bioassay for the voltammetric analysis of the breast cancer biomarker HER2-ECD and tumour cells using quantum dots as detection labels | |
| JP2014502731A5 (ja) | ||
| JP4915740B2 (ja) | 銀イオンの測定方法及び被検物質の測定方法 | |
| Liu et al. | A renewable electrochemical magnetic immunosensor based on gold nanoparticle labels | |
| US20140251832A1 (en) | Electrochemical Assay | |
| Gupta et al. | Electrochemical studies of lateral flow assay test results for procalcitonin detection | |
| Oliveira et al. | Development of impedimetric and optical calcium biosensor by using modified gold electrode with porcine S100A12 protein | |
| DK2734842T3 (en) | Apparatus and method for laterale flow affinity assay | |
| Farshchi et al. | An innovative Immunoanalysis strategy towards sensitive recognition of PSA biomarker in human plasma samples using flexible and portable paper based biosensor: a new platform towards POC detection of cancer biomarkers using integration of pen-on paper technology with immunoassays methods | |
| US20230221311A1 (en) | Method for detecting an analyte with the help of metal nanoparticles on an electrode | |
| Deng et al. | A novel potentiometric immunoassay for carcinoma antigen 15-3 by coupling enzymatic biocatalytic precipitation with a nanogold labelling strategy | |
| Santos et al. | Electrochemical immunosensor for qualitative diagnosis of the American trypanosomiasis based on gold modified with 3-Mercaptopropionic | |
| EP1711826B1 (de) | Biosensor und verfahren zu dessen betrieb | |
| Chikae et al. | Highly sensitive method for electrochemical detection of silver nanoparticle labels in metalloimmunoassay with preoxidation/reduction signal enhancement | |
| Nguyen et al. | Quantitative determination of triiodothyronine by electrochemical impedance spectroscopic biosensor using gold nanoparticle-modified electrode | |
| US20180011054A1 (en) | Metal ion detection method, test substance detection method | |
| JP2009244109A (ja) | 標識物質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100108 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120605 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120803 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121217 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130116 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160201 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5187759 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |