JPWO2007116811A1 - 被検物質の測定方法 - Google Patents
被検物質の測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2007116811A1 JPWO2007116811A1 JP2008509813A JP2008509813A JPWO2007116811A1 JP WO2007116811 A1 JPWO2007116811 A1 JP WO2007116811A1 JP 2008509813 A JP2008509813 A JP 2008509813A JP 2008509813 A JP2008509813 A JP 2008509813A JP WO2007116811 A1 JPWO2007116811 A1 JP WO2007116811A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- working electrode
- fine particles
- test substance
- metal fine
- potential
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 153
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 108
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title description 9
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 143
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 143
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 claims abstract description 142
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 39
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 28
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 26
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 22
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 17
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 10
- GTKRFUAGOKINCA-UHFFFAOYSA-M chlorosilver;silver Chemical compound [Ag].[Ag]Cl GTKRFUAGOKINCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 8
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 7
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 51
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 34
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 39
- 230000008859 change Effects 0.000 description 26
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 26
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 26
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001111 Fine metal Inorganic materials 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 240000006829 Ficus sundaica Species 0.000 description 1
- -1 For example Substances 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002715 bioenergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
第1の実施形態では、被検物質に対する2種類の特異的結合物質を用意し、一方(第1の結合物質)を作用電極の表面に固定化しておくとともに、他方(第2の結合物質)には金属微粒子を標識し、標識体とする。具体的には、先ず、電気化学的測定において用いる作用電極1の表面に、被検物質3に対する第1の結合物質として一次抗体2を固定しておく(図1(a))。電極表面は非特異吸着を防ぐためにブロッキングする。また、被検物質3上の異なる部位を認識する第2の結合物質として二次抗体4を用意し、これに金属微粒子5を標識することにより標識体を用意しておく。
第2の実施形態は、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集める具体的な手段が第1の実施形態と相違している。すなわち、本実施形態においては、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集めるに際し、被検物質に対する2種類の結合物質を用意し、一方(第1の結合物質)を磁性微粒子の表面に固定化しておくとともに、他方(第2の結合物質)を金属微粒子で標識して標識体を形成しておき、標識体と反応させた後の磁性微粒子を作用電極の表面に集めることでこれを実現している。以下、第2の実施形態について、図2を参照しながら説明する。なお、以下の各実施形態の説明では、前述した第1の実施形態と重複する説明は省略する。
第3の実施形態は、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集める具体的な手段が第1の実施形態と相違している。すなわち、第3の実施形態においては、試験溶液中の被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集めるに際し、被検物質に対する2種類の特異的結合物質を用意し、一方(第1の結合物質)をイムノクロマトグラフィー用ストリップの判定部に固定化しておくとともに、他方(第2の結合物質)を金属微粒子で標識して標識体を形成しておき、試験溶液及び標識体をストリップ上に展開した後、ストリップと作用電極の表面とを対向させることにより、これを実現している。以下、イムノクロマトグラフィー法に適用した例について、図3及び図4を参照しながら説明する。
以下、第4の実施形態について説明する。前述した第1の実施形態では、作用電極のみに第1の結合物質として一次抗体を固定し、作用電極のみを反応場として例えば抗原抗体反応を行っている。しかしながら、作用電極、対極及び参照電極が同一基板上に例えば印刷形成されたプレナー型デバイスを用いている場合、反応場である作用電極の面積はデバイス自体の大きさ、対極面積、参照電極面積等に制限されるため、第1の実施形態において説明した測定方法では、感度の向上には限界がある。
本実験では、作用電極の表面に一次抗体(抗hCG抗体)を固定化した印刷電極を用いて、PBS(リン酸緩衝液)で希釈したヒトゴナドトロピン(hCG)の測定を試みた。hCGは妊娠診断用マーカーの一種である。金コロイド標識二次抗体としては、金コロイド標識抗hαS抗体を用いた。
被検物質測定用の電極デバイスとしては、図6に示すようなプレナー型の印刷電極デバイス41(幅4mm、長さ12mm)を用いた。印刷電極デバイス41は、カーボンペーストで形成した作用電極42及び対極43と、カーボンペーストで形成したリード(図示は省略する。)と、銀/塩化銀で形成した参照電極44とを絶縁支持体45上に有するものであり、作用電極42、対極43及び参照電極44の表面の一部が絶縁層46で被覆されることにより、有効な電極面積が規定されている。
被検物質としてのhCGをPBS(リン酸緩衝液)で希釈することにより、hCG濃度が62pg/ml、620pg/ml、62ng/mlとなるように溶液を調製した。それらの溶液を、抗体の固定及びブロッキングを行った前記作用電極上に2μl滴下し、室温で30分静置することにより抗原抗体反応させた。その後、PBSを用いて印刷電極デバイスを洗浄した。
金属微粒子を発色試薬として用いるイムノクロマトグラフィー法は、目視で被検物質の有無を容易に判定することができるという利点を有するが、定量分析には不向きである。イムノクロマトグラフィー用ストリップの判定部を光学的に測定して濃度を求める方法も考えられるが、良好な検出感度が得られるとは言い難い。そこで、本実験では、図3に示すようなhCG検出用のイムノクロマトグラフィー用ストリップ(幅4mm、長さ30mm)を用いた通常のイムノクロマトグラフィー分析に本発明の電気化学的測定を利用した測定方法を適用し、hCGの測定を試みた。ストリップにおいては、判定部に抗hCG抗体を、コントロール部に抗hαS抗体をそれぞれ固定してある。
次に、0.1N塩酸水溶液をストリップに染み込ませた後、図6に示すような印刷電極の作用電極が判定部に接触するように、ストリップと印刷電極とを重ね合わせた。なお、本実験では、作用電極の表面には一次抗体を固定していない。
なお、イムノクロマトグラフィー分析直後のストリップを観察したところ、hCG濃度1ng/mlまでは金コロイドの集積による判定部の発色を目視により確認することが可能であったが、濃度0.5ng/ml以下については目視での確認ができなかった。
これに対し、本発明の方法によれば、0.1ng/mlのような低濃度のhCGの検出も可能であることが確認された。
本実験では、実験1と同様に、作用電極の表面に一次抗体(抗hCG抗体)を固定化した印刷電極と金コロイド標識抗hαS抗体とを用いて、ヒトゴナドトロピン(hCG)の測定を試みた。ただし、本実験では、微分パルスボルタンメトリーを利用した実験1とは異なり、サイクリックボルタンメトリーを利用した。銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位は、−0.8V〜+1.3Vの範囲とした。hCG濃度62ng/mlの反応溶液を用いたときの結果を図10に示す。比較として、銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位を−0.8V〜+1.0Vの範囲としたときの結果、及び−0.8V〜+1.3Vの範囲とし且つ抗原抗体反応させていないときの結果を併せて図10に示す。
本実験は、第4の実施形態に対応している。本実験では、実験1〜3とは異なり、図11に示すような形状のプレナー型印刷電極デバイス51を用いた。このプレナー型印刷電極デバイス51は、レジストからなる絶縁被膜52に設けられた略円形の開口部52aに露出した作用電極53と、作用電極53の外周の少なくとも一部を取り囲むように配された対極54と、参照極55とが短冊状の絶縁支持基板56上に印刷形成されたものである。絶縁被膜52上には絶縁被膜52より疎水性の高い表面を有する帯状のダム構造部材57が印刷電極デバイス51のほぼ全幅に亘って積層され、作用電極52等に滴下された溶液がコネクタとの接続部分へ到達することを防いでいる。
本実験では、電気化学測定を行う際に用いる溶液として、0.1規定塩酸溶液、又は飽和塩化カリウム水溶液を用い、実験1と同様にして金コロイドの還元ピーク電流を測定した。サイクリックボルタンメトリーの結果を図13に、微分パルスボルタンメトリーの結果を図14に示す。図13に示すように、飽和塩化カリウム水溶液を用いることで、塩酸溶液を用いる場合に比較して大きな還元ピーク電流強度が得られている。また、図14に示すように、塩酸溶液では0.1V付近にノイズが発生しているが、飽和塩化カリウム水溶液ではノイズの発生は認められない。したがって、塩酸溶液に比較して、飽和塩化カリウム水溶液が測定溶液に適していることがわかる。
本実験では、塩素を含む中性溶液として、飽和塩化カリウム水溶液と1Mの塩化ナトリウム水溶液のいずれが測定溶液として適しているかの比較検討を行った。具体的には、電気化学測定を行う際に用いる溶液として、飽和塩化カリウム水溶液、又は1Mの塩化ナトリウム水溶液を用い、実験1と同様にして金コロイドの還元ピーク電流を測定した。結果を図15に示す。飽和塩化カリウム水溶液でより大きな出力が得られていることから、飽和塩化カリウム水溶液の使用が好ましいことが明らかとなった。
本実験では、金属微粒子として粒径15nmの金コロイド、粒径20nmの金コロイド、粒径40nmの金コロイド、粒径60nmの金コロイドを用い、最適な粒径について検討した。具体的には、金コロイド標識hαS抗体に用いる金コロイド粒子として、粒径15nmの金コロイド、粒径20nmの金コロイド、粒径40nmの金コロイド、粒径60nmの金コロイドを用い、その他は実験1と同様にして金の還元ピーク電流のhCG濃度依存特性を調べた。結果を図16に示す。hCG濃度特性を比較すると、金コロイドの粒径が大きいほど還元電流値が大きく、かつ低濃度まで電流値変化が現れる傾向を示した。しかしながら、40nmと60nmでは電流値変化にほとんど差が無いため標識金コロイドの粒径はこれ以上大きくしても効果がないことが予想される。また、hCG濃度をゼロとしたときの還元ピーク電流値は、粒径80nmの金コロイド粒子を用いたとき0.54μA、粒径40nmのとき0.2μA、粒径15nmのとき0.14μAであった。すなわち、金コロイド粒子の粒径が大きくなるとノイズも大きくなる傾向を示すことがわかる。さらに、金コロイドの粒径が小さくなると低濃度の範囲まで電流値変化が得られないことから、10〜60nm程度が適当であり、40nmが最適であることがわかる。
本実験では、作用電極の表面に一次抗体(抗hCG抗体)を固定化した印刷電極デバイスを用い、生体試料中のhCG濃度を測定した。
先ず、既知濃度のhCG希釈系列を実験1と同様の方法によって測定することにより、検量線を作成した。図17に示すように、hCG濃度と電流値との間に相関が認められた。次に、前記試験溶液の電流値を実験1と同様の方法によって測定し、hCG濃度を検量線から読み取り、試験溶液のhCG濃度を求めた。試験溶液は、妊婦より採取した尿サンプルをPBSで500倍に希釈することにより調製した。結果を表1に示す。なお、各試験溶液のhCG濃度を従来のELISA法によって測定した。ELISA法で用いた抗体は実験1と同じである。結果を併せて表1に示す。
本実験では、本発明の測定方法の検出感度と、従来法であるELISA法の検出感度とを、両実験で同じ抗原及び抗体を用いて比較した。本発明の測定方法は、実験1と同様に行った。ELISA法は、電極上ではなくELISA用のプラスチックプレート上に抗hCG抗体を固定し、金コロイドではなくHRP(horseradish peroxidase)標識したhαS抗体を使用して抗原抗体反応させ、検出反応にはTMB(3、3’、5、5’−テトラメチルベンジジン)基質を用いた。結果を図18に示す。図18(a)に示すように、本発明の方法によれば、hCG濃度102pg/ml程度までhCG濃度と測定結果との間に直線関係が得られた。一方、図18(b)に示すように、ELISA法で直線関係が得られる範囲はhCG濃度103pg/ml程度までだった。したがって、本発明の測定方法によれば、ELISA法に比べ10倍程度感度向上が期待できることがわかる。また、ELISA法では100μlのサンプル溶液が必要だったのに対し、本発明の測定方法で必要なサンプル溶液はその50分の1程度の2μlだった。したがって、本発明の測定方法では、従来法に比較してサンプル量を大幅に減らすことが可能であるとわかる。
本実験では、電気化学的な還元ピーク電流を測定する場合と酸化ピーク電流を測定する場合とで、発生するノイズを比較した。
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出させる際に印加する電圧(前処理電圧)について検討した。
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出させるための電圧の印加時間(前処理時間)について検討した。
本実験では、作用電極の表面近傍に集めた金属微粒子を酸化溶出し、再析出させるための測定溶液である塩酸溶液の濃度条件を検討した。
Claims (16)
- 金属微粒子を標識物質として用いる被検物質の測定方法であって、試料溶液中の被検物質に対応した量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集め、前記金属微粒子を電気化学的に酸化した後、酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定し、前記電流値に基づいて被検物質の有無又は濃度を調べることを特徴とする被検物質の測定方法。
- 前記作用電極の電位を前記金属微粒子が電気化学的に酸化する電位に保持することにより、前記金属微粒子を電気化学的に酸化することを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 前記金属微粒子を電気化学的に酸化させるに際し、銀塩化銀参照電極に対する前記作用電極の電位を+1.2V〜+1.6Vに保持することを特徴とする請求の範囲第2項記載の被検物質の測定方法。
- 前記作用電極の電位を保持する時間を1秒以上100秒以下とすることを特徴とする請求の範囲第2項記載の被検物質の測定方法。
- 前記作用電極の電位を時間経過に伴い変化させて前記金属微粒子が電気化学的に酸化する電位にすることにより、前記金属微粒子を電気化学的に酸化することを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 酸性溶液中で前記作用電極の電位制御を行うことを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 酸性溶液が0.05規定〜2規定の塩酸であることを特徴とする請求の範囲第6項記載の被検物質の測定方法。
- 塩素を含む中性溶液中で前記作用電極の電位制御を行うことを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 前記塩素を含む中性溶液がKCl水溶液であることを特徴とする請求の範囲第8項記載の被検物質の測定方法。
- 前記金属微粒子が粒径10nm〜60nmの金微粒子であることを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 0.1規定〜0.5規定の塩酸溶液中で銀塩化銀参照電極に対する前記作用電極の電位を+1.2〜+1.6Vに保持することにより、前記金属微粒子を電気化学的に酸化させることを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 被検物質に特異的に結合する第1の結合物質が固定された作用電極と、被検物質に特異的に結合する第2の結合物質を金属微粒子で標識した標識体とを用意し、前記作用電極の表面に試験溶液と前記標識体とを供給して反応させることにより、試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極の表面近傍に集めることを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 被検物質に特異的に結合する第2の結合物質を金属微粒子で標識した標識体を用意するとともに、被検物質に特異的に結合する第1の結合物質を少なくとも作用電極及び対極に固定し、前記作用電極と前記対極との表面に試験溶液と前記標識体とを供給して反応させることにより試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極及び前記対極の表面近傍に集め、前記作用電極に対して前記対極を正電位とする電位制御を行った後、前記電位制御により前記作用電極表面に析出した金属と前記作用電極の表面近傍に集めた前記金属微粒子とを電気化学的に酸化することを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 被検物質に特異的に結合する第1の結合物質が固定された磁性微粒子と、被検物質に特異的に結合する第2の結合物質を前記金属微粒子で標識した標識体とを用意し、試験溶液と前記磁性微粒子と前記標識体とを混合して反応させた後、前記磁性微粒子を前記作用電極の表面近傍に集めることにより、試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極の表面近傍に集めることを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 被検物質に特異的に結合する第1の結合物質を所定の固定化領域に固定したイムノクロマトグラフィー用ストリップと、被検物質に特異的に結合する第2の結合物質を前記金属微粒子で標識した標識体とを用意し、試験溶液及び前記標識体を前記イムノクロマトグラフィー用ストリップに展開した後、前記イムノクロマトグラフィー用ストリップの前記固定化領域と前記作用電極とを重ね合わせることにより、試験溶液中の被検物質に対応した量の前記金属微粒子を前記作用電極の表面近傍に集めることを特徴とする請求の範囲第1項記載の被検物質の測定方法。
- 前記第1の結合物質及び第2の結合物質は抗体であることを特徴とする請求の範囲第12項から第15項のいずれか1項記載の被検物質の測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008509813A JP5187759B2 (ja) | 2006-04-07 | 2007-03-29 | 被検物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006106583 | 2006-04-07 | ||
JP2006106583 | 2006-04-07 | ||
JP2006265183 | 2006-09-28 | ||
JP2006265183 | 2006-09-28 | ||
JP2008509813A JP5187759B2 (ja) | 2006-04-07 | 2007-03-29 | 被検物質の測定方法 |
PCT/JP2007/056992 WO2007116811A1 (ja) | 2006-04-07 | 2007-03-29 | 被検物質の測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2007116811A1 true JPWO2007116811A1 (ja) | 2009-08-20 |
JP5187759B2 JP5187759B2 (ja) | 2013-04-24 |
Family
ID=38581105
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008509813A Active JP5187759B2 (ja) | 2006-04-07 | 2007-03-29 | 被検物質の測定方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090159458A1 (ja) |
JP (1) | JP5187759B2 (ja) |
WO (1) | WO2007116811A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4969236B2 (ja) * | 2006-12-22 | 2012-07-04 | ローム株式会社 | 生体分子または生体関連物質の測定方法 |
JP4915740B2 (ja) * | 2007-07-20 | 2012-04-11 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 銀イオンの測定方法及び被検物質の測定方法 |
JP4915741B2 (ja) * | 2007-07-31 | 2012-04-11 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 被検物質の測定方法 |
JP5359885B2 (ja) * | 2007-12-21 | 2013-12-04 | コニカミノルタ株式会社 | 腎症の検査方法及びそれを用いた検査キット |
JP4941994B2 (ja) * | 2008-01-25 | 2012-05-30 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 遺伝子の検出方法 |
JP5473382B2 (ja) * | 2008-04-17 | 2014-04-16 | キヤノン株式会社 | 免疫測定方法 |
JP5327739B2 (ja) * | 2008-05-12 | 2013-10-30 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 被検物質の測定方法 |
JP2010107502A (ja) * | 2008-09-30 | 2010-05-13 | Sekisui Chem Co Ltd | 定量分析方法及び検出用カートリッジ |
JPWO2010061772A1 (ja) * | 2008-11-28 | 2012-04-26 | コニカミノルタエムジー株式会社 | イムノクロマト媒体およびイムノクロマトグラフ法 |
JP2011242387A (ja) * | 2010-04-21 | 2011-12-01 | Osaka Prefecture Univ | 生物学的物質の捕獲又は分離用複合微粒子 |
JP5856780B2 (ja) * | 2010-08-27 | 2016-02-10 | シスメックス株式会社 | 検出物質の光電気化学的検出方法及び被検物質の光電気化学的検出方法 |
JP5806892B2 (ja) * | 2010-09-30 | 2015-11-10 | シスメックス株式会社 | 検出物質の電気化学的検出方法および被検物質の電気化学的検出方法 |
GB201118293D0 (en) * | 2011-10-24 | 2011-12-07 | Sec Dep For Business Innovation & Skills The | Electrochemical assay |
JP5571705B2 (ja) * | 2012-01-12 | 2014-08-13 | 株式会社Lsiメディエンス | 電気的分析方法 |
GB201217390D0 (en) | 2012-09-28 | 2012-11-14 | Agplus Diagnostics Ltd | Test device and sample carrier |
JP6486065B2 (ja) * | 2014-10-28 | 2019-03-20 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法 |
JP6410308B2 (ja) | 2014-12-12 | 2018-10-24 | 国立大学法人東北大学 | センサチップ、検出システム、及び、検出方法 |
JP6664737B2 (ja) * | 2015-01-21 | 2020-03-13 | シスメックス株式会社 | 金属イオンの検出方法、被検物質の検出方法、電極基板および検出キット |
JP6714256B1 (ja) | 2019-12-18 | 2020-06-24 | 株式会社イムノセンス | 電気化学法ラテラルフロー式免疫検査方法とそのセンサーおよびその製造方法 |
JP7467378B2 (ja) | 2021-03-18 | 2024-04-15 | 株式会社東芝 | ケミカルセンサ、標的物質の検出方法及び検出装置 |
JP7470461B1 (ja) | 2023-02-22 | 2024-04-18 | 株式会社イムノセンス | 電気化学的手法における被検物質に対する測定の正常性を判定する方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4859612A (en) * | 1987-10-07 | 1989-08-22 | Hygeia Sciences, Inc. | Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite |
JP2000510233A (ja) * | 1996-04-25 | 2000-08-08 | ペンス,インコーポレイテッド | バイオセンサ装置および方法 |
US5955379A (en) * | 1996-04-25 | 1999-09-21 | Mcgill University | Biosensor device and method |
US6248378B1 (en) * | 1998-12-16 | 2001-06-19 | Universidad De Sevilla | Enhanced food products |
DE10015816A1 (de) * | 2000-03-30 | 2001-10-18 | Infineon Technologies Ag | Biosensorchip |
FR2810739B1 (fr) * | 2000-06-26 | 2007-01-26 | Centre Nat Rech Scient | Immunodosage electrochimiques a l'aide de marqueurs metalliques colloidaux |
GB0300820D0 (en) * | 2003-01-14 | 2003-02-12 | Diagnoswiss Sa | Membrane-microchannel strip |
-
2007
- 2007-03-29 US US12/226,060 patent/US20090159458A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-29 JP JP2008509813A patent/JP5187759B2/ja active Active
- 2007-03-29 WO PCT/JP2007/056992 patent/WO2007116811A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20090159458A1 (en) | 2009-06-25 |
WO2007116811A1 (ja) | 2007-10-18 |
JP5187759B2 (ja) | 2013-04-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5187759B2 (ja) | 被検物質の測定方法 | |
Zhu et al. | A paper electrode integrated lateral flow immunosensor for quantitative analysis of oxidative stress induced DNA damage | |
Yang et al. | Ultrasensitive electrochemical immunosensor for carbohydrate antigen 19-9 using Au/porous graphene nanocomposites as platform and Au@ Pd core/shell bimetallic functionalized graphene nanocomposites as signal enhancers | |
Lin et al. | A nanoparticle label/immunochromatographic electrochemical biosensor for rapid and sensitive detection of prostate-specific antigen | |
Kuntamung et al. | A label-free multiplex electrochemical biosensor for the detection of three breast cancer biomarker proteins employing dye/metal ion-loaded and antibody-conjugated polyethyleneimine-gold nanoparticles | |
Xu et al. | Simultaneous electrochemical detection of multiple tumor markers using metal ions tagged immunocolloidal gold | |
US7045364B2 (en) | Electrochemical immunoassays using colloidal metal markers | |
Mao et al. | Multiplex electrochemical immunoassay using gold nanoparticle probes and immunochromatographic strips | |
Feng et al. | Simultaneous electrochemical detection of multiple biomarkers using gold nanoparticles decorated multiwall carbon nanotubes as signal enhancers | |
Idegami et al. | Gold nanoparticle‐based redox signal enhancement for sensitive detection of human chorionic gonadotropin hormone | |
Freitas et al. | Immunomagnetic bead-based bioassay for the voltammetric analysis of the breast cancer biomarker HER2-ECD and tumour cells using quantum dots as detection labels | |
JP2014502731A5 (ja) | ||
JP4915740B2 (ja) | 銀イオンの測定方法及び被検物質の測定方法 | |
Liu et al. | A renewable electrochemical magnetic immunosensor based on gold nanoparticle labels | |
JP2014531027A (ja) | 電気化学的分析 | |
Gupta et al. | Electrochemical studies of lateral flow assay test results for procalcitonin detection | |
DK2734842T3 (en) | Apparatus and method for laterale flow affinity assay | |
US20230221311A1 (en) | Method for detecting an analyte with the help of metal nanoparticles on an electrode | |
Deng et al. | A novel potentiometric immunoassay for carcinoma antigen 15-3 by coupling enzymatic biocatalytic precipitation with a nanogold labelling strategy | |
Santos et al. | Electrochemical immunosensor for qualitative diagnosis of the American trypanosomiasis based on gold modified with 3-Mercaptopropionic | |
Chikae et al. | Highly sensitive method for electrochemical detection of silver nanoparticle labels in metalloimmunoassay with preoxidation/reduction signal enhancement | |
EP1711826B1 (de) | Biosensor und verfahren zu dessen betrieb | |
Nguyen et al. | Quantitative determination of triiodothyronine by electrochemical impedance spectroscopic biosensor using gold nanoparticle-modified electrode | |
US20180011054A1 (en) | Metal ion detection method, test substance detection method | |
JP5327739B2 (ja) | 被検物質の測定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100108 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120605 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120803 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121217 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130116 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160201 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5187759 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |