JP2014531027A - 電気化学的分析 - Google Patents
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Abstract
電気化学的分析では、関心のある被検体（３０）を検出または測定するために、電気活性材料（１２）のコーティングを備える常磁性粒子（１０）を使用する。被検体は、被覆常磁性粒子（１０）と共に電極（４２）の付近に移動させる。電位を印加すると、常磁性粒子（１０）上の電気活性コーティング（１２）が、たとえば、アノーディック・ストリッピング・ボルタンメトリーを用いて測定することができるイオンに変換される。イオンの濃度は、サンプル内の関心のある被検体（３０）の量に対応する。
Description
本願は電気化学的分析に関し、特に、サンプル中の被検体の存在または量を決定するための方法に関する。
サンプル内の特定の被検体の検出には、免疫学的測定法が多くの場合使用される。たとえば、テストステロンやコルチゾールなど、特定のバイオマーカーに対する抗体を使用して、スポーツ選手の唾液、血液または尿内のこれらの物質の濃度を検査することができる。
国際公開第２００５／１２１７９２号には、関心のある種に結合している金属粒子の使用が開示されている。金属粒子を溶解させ、その後電気化学的に測定して、金属標識化種の存在または量の指標を与える。しかしながら、これらの方法には、金属粒子を溶解させるために化学酸化剤が必要となる。これに関連する問題は、酸化剤がスキャンのベースラインを乱すことによって、スキャンの電気化学的プロファイルを阻害する可能性があることである。国際公開第２００５／１２１７９２号に記載されている分析は、金属を電極表面に電気分析的に移動させるために、金属イオンの形成に依存する。これは、特に、生物サンプルを分析する場合には問題となる。生物サンプル溶液中のたんぱく質および他の分子は通常、それら分子を電気化学的に不活性にする金属イオンに結合する。金属イオンもまた、化学酸化剤とのキレート化／カップリングによって電気化学的に不活性となる可能性がある。したがって、信号の感度が低下する。
国際公開第２００９／０６８８６２号には、上記問題に対処する分析が開示されている。この分析では、化学離型剤を活用して、関心のある被検体から金属標識を放出し、離型剤および金属標識は共に（典型的には負の）電荷を帯びた種を形成する。その後、電位を印加して、電荷を帯びた種を電極に移動させる。その後、電荷を帯びた種に正の電位を印加して、金属標識から金属イオンを形成する。その後、アノーディック・ストリッピング・ボルタンメトリー（ＡＳＶ）などの定量的決定手順を行って、金属標識化被検体の存在または量を決定する。この分析には化学離型剤が必要となる。
本発明は、上記問題のうち１つまたはそれ以上を回避しようとするものである。
本発明の第１の態様によれば、サンプル中の被検体の存在または量を決定するための方法が提供される。この方法は、電気活性材料で被覆されている常磁性粒子で、被検体を標識化する工程と、磁場を印加して、標識化被検体を電極に移動させる工程と、標識化被検体に電位を印加して、電気活性材料からイオンを形成する工程と、定量的決定手順を行って、前記金属標識化被検体の存在または量を決定する工程とを含む。
イオンは、電極表面の非常に近くで形成される。したがって、イオンには、測定される前に不活性化する機会がほとんどない。したがって、イオンとキレート剤との間で錯体を形成する必要がない。さらに、電気化学ポテンシャルを使用して電気活性材料を溶解させるため、化学酸化剤を使用する必要がなく、化学酸化剤に関連する問題が回避される。さらには、電気活性材料で被覆されている常磁性粒子を使用すると、被検体から電気活性標識を放出する必要なく、電極における電気活性材料の測定が可能となる。したがって、これにより、化学離型剤を使用する必要性が回避される。
好ましい実施形態においては、標識化被検体が、電極と近接したサンプルキャリアの領域に設けられている結合部と結合する。
好ましくは、定量的決定手順を行う前に、磁場を反転させる。その結果、被検体を介して結合部と結合している被覆常磁性粒子のみが電極に残り、したがって、それら粒子を被覆している電気活性材料のみが測定される。これにより、電極から洗浄工程により非結合粒子を取り除く必要性が回避される。
本発明の第２の態様によれば、サンプル中の被検体の存在または量を決定するための方法が提供される。この方法は、電気活性材料で被覆され、第１の結合部を含む常磁性粒子を設ける工程と、電極に近接したサンプルキャリアの領域に第２の結合部を設ける工程と、第１および第２の結合部と共に被検体を含有している疑いのあるサンプルを培養する工程と、磁場を印加して、常磁性粒子を電極に移動させる工程と、電気活性材料に電位を印加して、イオンを形成する工程と、定量的決定手順を行って、被検体の存在または量を決定する工程とを含む。
標的被検体が存在する場合、電気活性常磁性粒子は結合部を介して電極表面で結合することができる。非結合粒子は、磁場によって電極から離すことができる。その後、電位を印加してイオンを形成し、定量的決定手順を行うことによって、結合粒子を測定することができる。
用語「培養する」は、サンプルが結合部と接触することを可能にする、また適当な結合部と被検体が結合することを可能にすることを除けば、何ら特定のプロセスを意味するものではない。
一実施形態においては、第１の結合部および第２の結合部が、それぞれ関心のある被検体の異なるエピトープに対して特異性のある抗体である。これは、「サンドイッチ分析」と有用に呼ぶことができる。このような分析は、トロポニンＩ、心筋細胞死のマーカー、妊娠検査におけるヒト絨毛性ゴナドトロピン、または甲状腺機能を監視するための甲状腺刺激ホルモンの検出および／または測定に有用となることがある。
いくつかの実施形態において、第１の結合部または第２の結合部は、それぞれ第２の結合部または第１の結合部と結合するための被検体と競合することができる。たとえば、第１の結合部または第２の結合部は、被検体と実質的に同一であってもよい。この配列により競合分析（またはハプテン分析）がもたらされ、またこの配列は、関心のある被検体が単一のエピトープしか有していない場合に特に有用となることがある。スポーツ選手のテストステロンまたはコルチゾールの濃度を検査する際に、または女性の受精能を評価するためにエストラジオールの濃度を測定する際に、ハプテン分析が特に有用となることがある。
第１の結合部および／または第２の結合部は、抗体であってもよい。
いくつかの実施形態において、被検体が抗体であるが、第１の結合部および／または第２の結合部は対応する抗原であってよい。被検体が抗体である場合には、第１の結合部または第２の結合部はさらなる抗体、たとえば、ａｎｔｉ−Ｉｇ抗体であってもよい。このような分析は、「血清学的分析」と呼ぶことができ、一般的には予防接種または感染に対する抗体応答を決定するために使用することができる。したがって、抗原は、感染因子(infectious agent)またはその一部であってよい。
もちろん、抗体は、結合部の単なる例である。結合部、すなわち実際には検体である結合部は、たとえば、分子インプリントポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一塩基多型、ミモトープなど、任意の適切な分子でよい。
電気活性材料は金属でよく、その場合、正電位を印加して金属イオンを形成する。好ましい実施形態において、この金属は、たとえば、金、銀、銅またはヒ素でよい。他の実施形態においては、電気活性材料は非金属であってもよい。たとえば、電気活性材料はピロール、チオフェンまたはカルバゾールでよく、その場合、使用する材料に応じて正または負のレドックスプロセスを測定することができる。
定量的決定手順は、アノーディック・ストリッピング・ボルタンメトリー（ＡＳＶ）などのボルタンメトリー法でよい。
第２の態様の好ましい特徴は、第１の態様にも等しく当てはまり、逆もまた同様である。
本発明の第３の態様によれば、上述の方法において使用するキットが提供される。このキットは、検出器単位に挿入するためのサンプルキャリアを含み、サンプルキャリアは、検出器単位の電極に近接して位置するサンプルキャリアの領域でキャリアに結合している結合部と、電気活性材料で被覆され、結合部を含む常磁性粒子とを含む。
常磁性粒子は、いくつかの実施形態において、サンプルキャリア内に設けることができる。
ここで、好ましい実施形態をほんの一例として、また以下の図面を参照して説明する。
まず図１を参照すると、常磁性粒子１０が、化学還元蒸着など従来の方法を用いることにより、銀１２で被覆されている。銀被覆常磁性粒子１０の表面には、関心のある被検体の第１のエピトープに対して特異性のある結合した抗体１４が存在している。以下この粒子全体を、標識化常磁性結合体（labelled paramagnetic conjugate）１６と称する。
図２はサンプルキャリア２０を示し、その内面の領域２２が、関心のある被検体の第２のエピトープに対して特異性のある抗体２４で被覆されている。図１の標識化常磁性結合体１６もまた、サンプルキャリア２０内に、たとえば、不活性液体キャリア内に設けられている。
関心のある被検体について検査しようとするサンプル、たとえば、唾液、血液または尿のサンプルが、サンプルキャリア２０に導入される。図３は、抗原３０がサンプル内に存在する状態を示す。抗原３０は、常磁性粒子上に設けられている抗体１４にも、サンプルキャリア２０の内面に設けられている第２の抗体２４にも結合することになることがわかる。
問題になっている特定の抗原／抗体に応じて当業者が決定することができる必要な培養期間の後、磁石４０（たとえば、固体磁石または電磁石であってよい）を用いて磁場を印加する。好ましい実施形態において、サンプルキャリア２０は、必要な磁石４０と電極４２も備える検出器単位に挿入される（図４参照）。磁場が電極４２で導入され、したがってその磁場により標識化常磁性結合体１６が電極４２に引き付けられ、ここで抗原３０が存在する場合には「サンドイッチ」が生じる。
図５に示すように、その後の磁場の反転により、非結合標識化常磁性結合体１６が電極４２から取り除かれ、それにより電極４２には結合標識化常磁性結合体１６のみが残される。
その後、電極４２で結合している標識化常磁性結合体１６の銀金属１２を銀金属イオンに電気化学的に変換するために、電極４２に正電位を印加する。結果として得られた金属イオンはその後、たとえば、アノーディック・ストリッピング・ボルタンメトリー（ＡＳＶ）を用いて測定することができる。抗原３０に結合している標識化常磁性結合体１６のみが電極で保持されるため、酸化により生成する銀イオンの測定は、元のサンプル中の関心のある抗原３０の量に直接関係していることが理解されよう。電極４２で第２の抗体２４に結合しない標識化常磁性結合体１６が、（この実施形態においては、磁場を反転させることによって）電極４２から取り除かれる。したがって、これらの標識化常磁性結合体１６についての銀被覆１２は、酸化により生成される銀イオンの量に影響を与えないことになる。
上述のサンドイッチ分析は、たとえば、トロポニンＩの濃度を測定する心筋細胞死の検査として、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの濃度を測定する妊娠試験として、または甲状腺刺激ホルモンの濃度を測定する甲状腺機能の試験として使用することができる。
上記実施形態には利点がいくつかある。
銀１２の酸化の前に、電極４２から非結合標識化常磁性結合体１６を取り除くために洗浄工程を含む必要はない。これは、磁場を反転させることによって、非結合標識化常磁性結合体１６が電極４２から取り除かれるからである。
ＡＳＶにより、生成する銀イオンの量が直接測定され、この銀イオンの量は、電極４２に保持される標識化常磁性結合体１６に正比例し、標識化常磁性結合体１６は、元のサンプルに存在する抗原３０の量に正比例する。
図６はハプテン分析を示す。この実施形態は図２〜５の実施形態と類似しているが、抗体で被覆される代わりに、標識化常磁性結合体１６が、関心のある抗原の結合型であるハプテン６０に結合し、抗体２４に結合するために抗原と競合する。この場合、サンプル中の任意の抗原が抗体２４と結合し、ハプテン標識化常磁性結合体１６の結合を防止する。したがって、この場合、ＡＳＶによって測定される金属イオンの濃度は、サンプル中の抗原の量と反比例するはずである。
図７は、図６に示す方法に非常に類似した方法を示す。しかしながら、変更点としては、ハプテン６０を、電極近くに位置すべきサンプルキャリア２０の領域２２に設け、抗体１４を設けて標識化常磁性結合体１６を形成する。サンプル中の任意の抗原が抗体１４に結合し、それによりハプテン６０への標識化常磁性結合体１６の結合が防止されることになる。やはりこの場合も、ＡＳＶによって測定される金属イオンの濃度は、元のサンプル中の抗原の量と反比例する。
ハプテン分析が、単一のエピトープしか有していない抗原に特に有用となるはずであるため、たとえば、テストステロンまたはコルチゾールについてスポーツ選手を検査するために使用することができる。
さらなる一実施形態において、血清学的分析が提供される。この場合、被検体が抗体であり、この分析を使用して、感染または予防接種に対する免疫応答を測定することができる。
図８および図９に示すように、特異抗体である被検体３０が、電極の隣に位置すべきサンプルキャリア２０の領域２２に設けられている抗原２４と結合することができる。抗体３０と抗原２４との間の結合を可能とした後、非結合抗体９０を取り除くために洗浄工程を行う。
標識化常磁性結合体１６をその後、サンプルキャリア２０に導入する（図１０参照）。標識化常磁性結合体１６は、この例においては、関心のある抗体３０と結合する第２の抗体１４と抱合している。したがって、第２の抗体１４は、ａｎｔｉ−Ｉｇ抗体でよい一変形形態において、血清学的分析において使用される標識化常磁性結合体１６に抗原２４を設けることができる。
図１１に示すように、標識化常磁性結合体１６は、電極の隣に位置すべきサンプルキャリア２０の領域２２で抗原２４と結合し、上述のように酸化に続くＡＳＶによって測定することができる。
サンプルおよび標識化常磁性結合体１６をサンプルキャリア２０内で混ぜ合わせ、その後磁石４０および電極４２を含み、さらに分析の結果を解釈および表示するために動作可能な検出器単位に導入することが想定される。そのような際、関心のある特定の被検体について、適当な結合部（たとえば、抗体、また、いくつかの実施形態において、標識化常磁性結合体１６それら自体）を、各サンプルキャリア２０にあらかじめ組み込むことができる。したがって、各サンプルキャリア２０を使い捨て用とし、より高価な電子機器が再利用可能な検出器単位内に見つかることがある。ＷＯ２０１０／００４２４４として公開されている本出願人の先のＰＣＴ出願に開示されているデバイスは、本願に開示されている方法を実施するために容易に適合させることができる。
上記説明により例示的な方法が提供され、またその方法には多くの変更を加えることができることが当業者には理解されよう。
抗体、抗原およびハプテンの図示した配列は、単なる例示である。他の種類の被検体の検査を行うために、記載の方法をどのように適合させるかを当業者は心得ていよう。
銀が、適切な電気活性材料の唯一の例である。銀は、電気化学的に容易に酸化して銀イオンを形成することができるため好ましいことがあるが、他の電気活性材料も適切であることがある。特に、金、銅、ヒ素などの金属、およびピロール、チオフェン、カルバゾールなどの非金属が好ましいことがある。
一変形形態において、２種の異なる電気活性材料で、たとえば、金で、または銀で被覆されている標識化常磁性結合体を使用することによって、同じサンプル内の２種の異なる被検体を検出することができる。たとえば、第１の被検体を認識する第１の結合部に、金被覆常磁性粒子を付着させることができ、第２の被検体を認識する別の結合部に、銀被覆常磁性粒子を付着させることができる。金イオンおよび銀イオンは、ＡＳＶによって同じ電極で測定した場合に、異なる識別可能なピークをもたらす。
上述の実施形態では、関心のある被検体についての簡易分析が提供されるが、この分析は、標的被検体に結合している標識化常磁性結合体からの非結合標識化常磁性結合体の分離を可能とするよう、単一のチャンバ内で行うことができる。したがって、培養、分離および測定はすべて、簡略化された機械的および電子的構造を可能にする同じチャンバ内で行うことができる。さらに、任意の制御バイオアッセイにおいて使用される標準的な化学薬品（サンプルやｐＨ緩衝剤など）以外は、従来技術においては必要とされる酸化剤および離型剤とは対照的に、追加の化学試薬は必要ない。
英国特許出願ＧＢ１１１８２９３．８における、またこの出願に添付されている要約書における開示内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。
Claims (32)
- サンプル中の被検体（３０）の存在または量を決定するための方法であって、電気活性材料（１２）で被覆され、第１の結合部（１４、６０）を含む常磁性粒子（１０）を設ける工程と、サンプルキャリア（２０）内に第２の結合部（２４、６０）を設ける工程と、前記第１および第２の結合部と共に前記被検体を含有している疑いのあるサンプルを培養する工程と、磁場を印加して、前記常磁性粒子を電極（４２）に移動させる工程と、前記電気活性材料に電位を印加して、イオンを形成する工程と、定量的決定手順を行って、前記被検体の存在または量を決定する工程とを含む方法。
- サンプル中の被検体（３０）の存在または量を決定するための方法であって、電気活性材料（１２）で被覆されている常磁性粒子（１０）で、前記被検体を標識化する工程と、磁場を印加して、前記標識化被検体を電極（４２）に移動させる工程と、前記標識化被検体に電位を印加して、前記電気活性材料からイオンを形成する工程と、定量的決定手順を行って、前記金属標識化被検体の存在または量を決定する工程とを含む方法。
- 前記常磁性粒子（１０）が第１の結合部（１４）を含む、請求項２に記載の方法。
- 前記標識化被検体（３０）が、前記電極（４２）に近接したサンプルキャリア（２０）の領域に設けられている第２の結合部（２４）に結合する、請求項２または３に記載の方法。
- 前記常磁性粒子（１０）が第１の結合部（１４）を含み、第２の結合部（２４）がサンプルキャリア（２０）内に設けられ、前記第１および第２の結合部と共に、前記被検体（３０）を含有している疑いのあるサンプルを培養する工程を含む、請求項２、３または４に記載の方法。
- 前記第１の結合部（１４、６０）および／または前記第２の結合部（２４、６０）が抗体である、請求項１または請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の結合部（１４）および前記第２の結合部（２４）が、それぞれ前記被検体（３０）の異なるエピトープに対して特異性のある抗体である、請求項６に記載の方法。
- 前記被検体がトロポニンＩである、請求項７に記載の方法。
- 前記被検体がヒト絨毛性ゴナドトロピンである、請求項７に記載の方法。
- 前記被検体が甲状腺刺激ホルモンである、請求項７に記載の方法。
- 前記第１の結合部（６０）または前記第２の結合部（６０）が、それぞれ前記第２の結合部（２４）または前記第１の結合部（１４）と結合するために前記被検体（３０）と競合する、請求項１または５に記載の方法。
- 前記第１の結合部（６０）または前記第２の結合部（６０）が、前記被検体と実質的には同一である、請求項１１に記載の方法。
- 前記被検体（３０）が単一のエピトープしか有していない、請求項１１または１２に記載の方法。
- 前記被検体（３０）がテストステロンである、請求項１１、１２または１３に記載の方法。
- 前記被検体（３０）がコルチゾールである、請求項１１、１２または１３に記載の方法。
- 前記被検体（３０）がエストラジオールである、請求項１１、１２または１３に記載の方法。
- 前記被検体（３０）が抗体であり、前記第１の結合部および／または前記第２の結合部が対応する抗原（２４、６０）である、請求項１または請求項３から１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の結合部（１４、６０）または前記第２の結合部（２４、６０）がさらなる抗体である、請求項１７に記載の方法。
- 前記第１の結合部（１４）および／または前記第２の結合部（２４）がａｎｔｉ−Ｉｇ抗体である、請求項１８に記載の方法。
- 予防接種または感染に対する抗体応答を決定するための、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記被検体抗体（３０）の抗原が、感染因子またはその一部である、請求項２０に記載の方法。
- 前記被検体（３０）が、分子インプリントポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一塩基多型またはミモトープである、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の結合部（１４、６０）および／または前記第２の結合部（１４、６０）が、分子インプリントポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一塩基多型および／またはミモトープである、請求項１、３から５、または請求項１１から２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記定量的決定手順を行う前に、前記磁場が反転される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記電気活性材料（１２）が金属であり、正電位が印加されて金属イオンが形成される、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記金属（１２）が金、銀、銅またはヒ素である、請求項２５に記載の方法。
- 前記電気活性材料（１２）が非金属である、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記電気活性材料（１２）がピロール、チオフェンまたはカルバゾールである、請求項２７に記載の方法。
- 前記定量的決定手順がボルタンメトリー法である、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記定量的決定手順がアノーディック・ストリッピング・ボルタンメトリー（ＡＳＶ）である、請求項２９に記載の方法。
- 検出器単位に挿入するためのサンプルキャリア（２０）を含み、前記サンプルキャリアは、前記検出器単位の電極（４２）に近接して位置する前記サンプルキャリアの領域（２２）で前記キャリアに結合している結合部（２４、６０）と、電気活性材料（１２）で被覆され、結合部（１４、６０）を含む常磁性粒子（１０）とを含む、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法において使用するキット。
- 前記常磁性粒子（１０）が前記サンプルキャリア（２０）内に設けられる、請求項３１に記載のキット。
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