JP7079092B2 - サンプル分析のためのデバイスおよび方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年4月3日に出願された米国特許仮出願第62/142,872号、2016年1月13日に出願された第62/278,303号、および2016年1月15日に出願された第62/279,488号の利益を主張し、それらの出願はそれら全体の参照によって本明細書に援用される。
本開示は、例えばマイクロ流体デバイスと作動可能にカップリングされたナノポアデバイスを使用する検体分析のための方法、デバイス、およびシステムに関する。
本開示の実施形態を記載する前に、記載される特定の実施形態は当然変動し得るので、本発明はかかるものに限定されないことを理解すべきである。本明細書において使用される用語は特定の実施形態を記載するのみの目的のためのものであり、限定するとは意図されないことも理解すべきである。
検体分析のための方法が本明細書において提供される。本方法は単一の分子カウントを包含し得る。ある特定の実施形態において、検体分析のための方法は、サンプル中に存在する検体を査定することを包含し得る。ある特定の実施形態において、査定は、サンプル中の検体の存在および/または濃度の決定のために使用され得る。ある特定の実施形態において、本方法は、サンプル中に存在する複数の異なる検体の存在および/または濃度の決定のためにも使用され得る。
本方法は、マルチプレックス化アッセイにおけるサンプル中の1又は2以上の(またはあるいは2つ以上の)標的検体を検出する1又は2以上の(またはあるいは2つ以上の)特異的な結合メンバーを包含し得る。1又は2以上の(またはあるいは2つ以上の)特異的な結合メンバーの各々は、異なる標的検体へ結合し、各々の特異的な結合メンバーは異なるタグおよび/またはアプタマーにより標識される。例えば、第1の特異的な結合メンバーは第1の標的検体へ結合する、第2の特異的な結合メンバーは第2の標的検体へ結合する、第3の特異的な結合メンバーは第3の標的検体へ結合する、などであり、第1の特異的な結合メンバーは第1のタグおよび/またはアプタマーにより標識される、第2の特異的な結合メンバーは第2のタグおよび/またはアプタマーにより標識される、第3の特異的な結合メンバーは第3のタグおよび/またはアプタマーにより標識される、などである。いくつかの実施形態において、第1の条件は、第1の特異的な結合メンバーがタグにより標識されるならば、第1のタグの切断もしくは放出、または第1の特異的な結合メンバーがアプタマーにより標識されるならば、第1のアプタマーの解離もしくは放出を引き起こす、第2の条件は、第2の特異的な結合メンバーがタグにより標識されるならば、第2のタグの切断もしくは放出、または第2の特異的な結合メンバーがアプタマーにより標識されるならば、第2のアプタマーの解離もしくは放出を引き起こす、第3の条件は、第3の特異的な結合メンバーがタグにより標識されるならば、第3のタグの切断もしくは放出、または第3の特異的な結合メンバーがアプタマーにより標識されるならば、第3のアプタマーの解離もしくは放出を引き起こす、などである。いくつかの実施形態において、サンプルの条件はアッセイの間に様々な時間で変化させ第1のタグまたはアプタマー、第2のタグまたはアプタマー、第3のタグまたはアプタマーなどの検出を可能にし、それによって、1又は2以上の(またはあるいは2つ以上の)標的検体を検出することができる。いくつかの実施形態において、1又は2以上の(またはあるいは2つ以上の)切断されたタグおよび/または解離されたアプタマーは、ナノポア中の滞留継続期間、電流インピーダンスの大きさ、またはその組み合わせに基づいて、ポアを介して同時に検出される。
当業者によって認識されるように、第1の結合メンバーおよび第2の結合メンバーによって特異的に結合できる任意の検体は、本開示の方法およびデバイスを使用して、検出され、随意に定量化され得る。
本明細書において使用される時、「サンプル」、「試験サンプル」、「生物学的サンプル」は、対象となる検体を含有するかまたは含有する疑いのある流体サンプルを指す。サンプルは任意の好適な源に由来し得る。いくつかの事例において、サンプルは、液体、流動性の微粒子固体、または固体粒子の流体懸濁物を含み得る。いくつかの事例において、サンプルは本明細書において記載される分析前に加工され得る。例えば、サンプルは分析前にその源から分離または精製され得るが、特定の実施形態において、検体を含有する未加工サンプルは直接アッセイされ得る。検体分子の源は、合成(例えば、実験室中で産生された)、環境(例えば空気、土壌、流体サンプル、例えば水道設備など)、動物(例えば哺乳類)、植物、またはその任意の組み合わせであり得る。特定の例示において、検体の源は、ヒトの身体の物質(例えば、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、汗、喀痰、精液、粘液、涙液、リンパ液、羊水、間質液、肺洗浄、脳脊髄液、糞便、組織、器官、または同種のもの)である。組織には、骨格筋組織、肝臓組織、肺組織、腎臓組織、心筋組織、脳組織、骨髄、子宮頸部組織、皮膚などが含まれ得るが、これらに限定されない。サンプルは、液体サンプルまたは固体サンプルの液体抽出物であり得る。ある特定の事例において、サンプルの源は器官または組織(生検サンプル等)であり得、それは組織崩壊/細胞溶解によって可溶化され得る。
当業者によって認識されるように、結合メンバーは、分析される予定の検体によって決定されるだろう。様々な標的分子のための結合メンバーは公知であるか、または公知の技法を使用して容易に見出されるかもしくは開発することができる。例えば、標的検体がタンパク質である場合に、結合メンバーには、タンパク質、特に抗体またはその断片(例えば抗原結合断片(Fab)、Fab’断片、F(ab’)2断片、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(「scFv」)、単一鎖抗体、ラクダ科の動物に由来する可変重鎖ドメイン(「VHH」;「VHH断片」としても公知)等の単一ドメイン抗体(VHH、およびそれらを作製する方法は、Gottlin et al.,Journal of Biomolecular Screening,14:77-85(2009)中で記載される)、組換えVHH単一ドメイン抗体、およびVNAR断片、ジスルフィド結合Fv(「sdFv」)、および抗イディオタイプ(「抗Id」)抗体、ならびに上記のうちのいずれかの機能的に活性のあるエピトープ結合断片、全長のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体様断片、など)、他のタンパク質(受容体タンパク質、プロテインA、プロテインC、または同種のもの等)が含まれ得る。検体が小分子(ステロイド、ビリン、レチノイド、および脂質等)である事例において、第1の結合メンバーおよび/または第2の結合メンバーは、スキャフォールドタンパク質(例えばリポカリン)または受容体であり得る。いくつかの事例において、タンパク質検体についての結合メンバーはペプチドであり得る。例えば、標的検体が酵素である場合に、好適な結合メンバーには、ペプチド、小分子、および同種のものであり得る、酵素基質および/または酵素阻害因子が含まれ得る。いくつかの事例において、標的検体がリン酸化種である場合に、結合メンバーはリン酸結合剤を含み得る。例えば、リン酸結合剤には、金属イオン親和性媒質(米国特許第7,070,921号および米国特許出願第20060121544号中で記載されるようなもの)が含まれ得る。
本明細書において記載される方法は、インピーダンスによって検体を分析するためにタグ(標識等)へ結合されている特異的な結合メンバーを包含し得る。取り込まれたタグまたは標識は、反応スキームの遂行を実質的に妨害しない。例えば、取り込まれたタグまたは標識は、検体とその相補的な結合メンバーの結合定数またはそれらの間の相互作用を妨害しない。取り込まれたタグまたは標識のサイズおよび数は、捕捉のスピードおよびリード速度に関係し得る。捕捉のスピードおよびリード速度は、取り込まれたタグまたは標識のサイズおよび/または番号を増加させることによって増加され得る。例えば、取り込まれたタグまたは標識のサイズおよび数は、電荷を増加させ、ナノポアの捕捉ゾーンを増加させ得る。取り込まれたタグまたは標識は、結合メンバーの反応速度論(例えば抗体の反応速度論)または反応スキームを改変しない。例示的なタグには、ポリマーが約5~1000残基の長さである、陰イオン性ポリマーまたは陽イオン性ポリマー等のポリマー(例えばポリヒスチジンまたはポリリジン等の、正味の正電荷を備えたポリペプチド);結合メンバーと交差反応しないおよび/またはアッセイを妨害しないタンパク質(例えば球形タンパク質)、デンドリマー(例えばDNAデンドリマー);ならびに荷電したナノ粒子(例えばナノビーズ)が含まれる。ポリマータグには、核酸(デオキシリボ核酸またはリボ核酸等)が含まれ得る。ポリマータグには核酸塩基ポリマーが含まれ得る。ある特定の事例において、タグはDNAまたはRNAアプタマーであり得、そこではアプタマーは検体へ結合しない。いくつかの事例において、タグがアプタマーである場合に、それはナノポアを介する移動の前に随意に変性させることができる。ポリマータグまたはナノ粒子(例えばナノビーズ)は、それがナノポアを介してまたは横切って移動するにつれて再現性のあるシグナルを生成するのに十分に大きいだろう。アプタマーは、20~220塩基長(例えば20~60塩基長)であり得る。ナノ粒子(例えばナノビーズまたはデンドリマー)のサイズは、直径で約1nm~約950nm、例えば、直径で10nm~900nm、20nm~800nm、30nm~700nm、50nm~600nm、80nm~500nm、100nm~500nm、200nm~500nm、300nm~500nm、または400nm~500nm、例えば10nm、20nm、30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、または900nmの範囲であり得る。タグとして使用される時に、ナノ粒子のための好ましいサイズは、ナノポア(更に本明細書において記載されるような)を介してまたは横切って通過することができるものである。ある特定の事例において、ナノビーズ/ナノ粒子は、正味の負電荷もしくは正電荷を有する材料から作製することができるか、または正味の負電荷もしくは正電荷を有するように処理することができる。例示的なナノビーズ/ナノ粒子には、有機ポリマーまたは無機ポリマーから作製されたものが含まれる。有機ポリマーには、ポリマー(ポリスチレン、炭素、ポリアクリルアミドなど等)が含まれる。無機ポリマーには、シリコンまたは金属ナノビーズ/ナノ粒子が含まれる。ある特定の事例において、ナノビーズ/ナノ粒子は磁性でなくてもよい。
本明細書において記載される方法において使用されるタグは、ジェネリックリンカーによって特異的な結合メンバーへ添付され得る。切断可能なリンカーは、タグを除去できることを保証する。ジェネリックリンカーは切断可能なリンカーであり得る。例えば、タグは切断可能なリンカー経由で第2の結合メンバーへ添付され得る。第1の結合メンバー-検体-第2の結合メンバーの複合体は、切断可能なリンカーの切断を媒介する切断剤へ曝露され得る。リンカーは、任意の好適な方法(酸、塩基、求核剤、親電子性物質、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素などへの曝露が含まれる)によって切断することができる。Greene&Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons中で開示されるように、好適なリンカーは標準的な化学的ブロック基から適合させることができる。固相合成において使用される更に好適な切断可能なリンカーが、Guillier et al.(Chem.Rev.100:2092-2157,2000)中で開示される。リンカーは、酸切断可能、塩基切断可能、または光切断可能であり得る。レドックス反応は切断スキームの一部であり得る。切断可能なリンカーは荷電したポリマーであり得る。
本開示において、タグ(例えばポリマー、アプタマー、ナノ粒子)の検出および/またはカウントは、ナノポアまたはナノチャンネルを介してまたは横切ってタグを移動させることによって実行され得る。いくつかの実施形態において、タグ(例えばポリマー、アプタマー、ナノ粒子)の検出および/またはカウントは、少なくとも1又は2以上のナノポアまたはナノチャンネルを介してまたは横切ってタグを移動させることによって実行され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも2つ(to)以上のナノポアまたはナノチャンネルが並んでまたは連続して提示される。いくつかの実施形態において、ナノポアまたはナノチャンネルは、一度に1つ以下のタグ移動のための寸法にされる。したがって、いくつかの実施形態におけるナノポアの寸法は、典型的には検査されるタグの寸法に依存するだろう。二本鎖領域を備えたタグは、全体的に一本鎖のタグの移動のために十分なものよりも大きいナノポア寸法を要求し得る。加えて、ナノ粒子タグ(ナノビーズタグ等)はオリゴマータグよりも大きなポアまたはチャンネルを要求し得る。典型的には、約1nmの直径のポアは一本鎖のポリマーの通過を可能にすることができ、その一方で2nmの直径またはより大きいポア寸法は二本鎖核酸分子の通過を可能にするだろう。いくつかの実施形態において、ナノポアまたはナノチャンネルは、一本鎖のタグについて選択的であり(例えば約1nm~2nm未満の直径)、その一方で他の実施形態において、ナノポアまたはナノチャンネルは二本鎖ポリヌクレオチドの通過を可能にするのに十分な直径である(例えば2nm以上)。選択されたポアサイズは、対象となる検体に至適なシグナル対ノイズ比を提供する。
タグ/アプタマーの検出および随意にカウントのために、タグの移動を可能にするチャンネル寸法を備えた任意の生体ポアを使用することができる。2つの広いカテゴリーの生体チャンネルが、本明細書において開示される方法に好適である。非電圧ゲート型チャンネルは、チャンネルを活性化または開口する膜電位の変化を要求せずに、ポアを介する分子の通過を可能にする。その一方で、電圧ゲート型チャンネルは、チャンネル開口を活性化する特定の範囲の膜電位を要求する。生体ナノポアによる大部分の研究は、α-溶血素(Staphylococcus aureusにおいて見出された、約10nmの長さのマッシュルーム型のホモオリゴマー七量体のチャンネル)を使用している。各々のサブユニットは2つのβストランドに寄与して、14ストランドの逆平行のβバレルを形成する。βバレル構造によって形成されるポアはおよそ2.6nmの直径を備えた入口を有し、その入口はリジン残基のリングを含有し、約3.6nmの直径の内部空洞の中へ開口する。溶血素ポアのステム(それは脂質二分子膜を貫通する)は約2.0nmの平均内径を有し、前庭とステムとの間に1.5nmの狭窄がある。ステムの寸法は、二本鎖核酸ではなく一本鎖の核酸の通過に十分である。したがって、α-溶血素のポアは、一本鎖のポリヌクレオチドおよび類似する寸法の他のポリマーについての選択的ナノポアとして使用することができる。
他の実施形態において、タグの分析は、非生体材料から製作されたナノポアまたはナノチャンネルを介してまたは横切ってタグを移動させることによって実行される。ナノポアまたはナノチャンネルは、多くの異なる技法(とりわけ、化学析出、電気化学析出、電気めっき、電子ビーム彫刻、イオンビーム彫刻、ナノリソグラフィー、化学エッチング、レーザーアブレーション、集束イオンビーム、原子層堆積、および当技術分野において周知の他の方法が含まれる)を使用して、様々な固体材料から作製することができる(例えばLi et al.,2001,Nature 412:166-169;およびWO2004/085609を参照)。
ナノポアを介するまたは横切る移動によってタグ/アプタマーを問い合わせることおよび検出可能な特性を検出することは、シグナルを生成し、そのシグナルは、タグ/アプタマーをカウントする(すなわち量または濃度を決定する)ことおよび/または同定する(すなわちその存在を決定する)ことに使用することができる。用いられた検出方法のタイプは、タグについて検出されている特性へ対応し得る。
本開示は、ナノポアデバイスと併用して使用されるマイクロ流体デバイスおよび集積マイクロ流体ナノポアデバイスを記載する。ナノポアデバイスと併用して使用される開示されるマイクロ流体デバイスおよび集積マイクロ流体ナノポアデバイスは、上記のように、検体分析の方法において使用され得る。しかしながら、ある特定の事例において、本明細書において記載されるデバイスは、他の適用のために使用され得る。同様に、ある特定の事例において、本明細書において記載される方法は他のデバイスにより使用され得る。
4.DMFモジュールの1つの側面上へのナノポアモジュールの集積
対象となるサンプル中に存在する検体の存在または量を決定する開示される方法、およびマイクロ流体デバイスの使用は、上述の通りであり得る。本方法および開示されるマイクロ流体デバイスの使用は、検体を分析する他の方法を考慮して適合させることもできる。周知の変形の例には、サンドイッチ免疫アッセイ(例えば酵素検出を含むモノクローナル-ポリクローナルサンドイッチ免疫アッセイ(酵素免疫アッセイ(EIA)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)))、競合阻害免疫アッセイ(例えばフォワードおよびリバース)、酵素増幅免疫アッセイ技法(EMIT)、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)、1ステップ抗体検出アッセイ、ホモジニアスアッセイ、ヘテロジニアスアッセイ、オンザフライ捕捉アッセイなど等の免疫アッセイが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実例において、以下の記載は上記の方法に重複し得る。他には、以下の記載が代替物を提供し得る。
対象となる検体および/またはペプチドまたはその断片は、免疫アッセイを使用して分析することができる。対象となる検体の存在または量は、本明細書において記載される抗体を使用し、対象となる検体への特異的結合を検出して決定することができる。任意の免疫アッセイを利用することができる。例えば免疫アッセイは、酵素結合免疫アッセイ(ELISA)、競合阻害アッセイ(フォワード競合阻害アッセイまたはリバース競合阻害アッセイ等)、または競合結合アッセイであり得る。いくつかの実施形態において、1つのタグは捕捉抗体および検出抗体へ添付される。あるいは、捕捉のために用いられるマイクロ粒子またはナノ粒子も検出のために機能することができる(例えばそれが切断可能なリンカーへいくつかの手段によって添付または会合される場合)。
サンドイッチ免疫アッセイは、抗体の2つの層(すなわち捕捉抗体(すなわち少なくとも1つの捕捉抗体)および検出抗体(すなわち少なくとも1つの検出抗体))の間の抗原の量を測定する。捕捉抗体および検出抗体は、抗原(例えば対象となる検体)上の異なるエピトープへ結合する。望ましくは、捕捉抗体のエピトープへの結合は、検出抗体のエピトープへの結合を妨害しない。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを、サンドイッチ免疫アッセイにおける捕捉抗体および検出抗体として使用することができる。
フォワード競合フォーマットにおいて、既知の濃度の対象となる標識検体(例えば切断可能なリンカーにより添付されたタグを有する検体)のアリコートを使用して、対象となる検体抗体への結合を、試験サンプル中の対象となる検体と競合する。
リバース競合アッセイにおいて、対象となる固定化検体は、試験サンプルおよび少なくとも1つの標識抗体と連続してまたは同時に接触させることができる。
1ステップ免疫アッセイまたはオンザフライ捕捉アッセイにおいて、固体基板は固定化剤により前コーティングされる。捕捉剤、検体および検出剤を固体基板へ一緒に添加し、続いて検出の前に洗浄ステップを行う。捕捉剤は検体を結合することができ、固定化剤のためのリガンドを含む。捕捉剤および検出剤は、本明細書において記載されるようなまたは当技術分野において公知の、捕捉または検出の可能な抗体または任意の他の部分であり得る。リガンドはペプチドタグを含むことができ、固定化剤は抗ペプチドのタグ抗体を含むことができる。あるいは、リガンドおよび固定化剤は、オンザフライ捕捉アッセイ(例えば特異的な結合ペアおよび当技術分野において公知の他のもの等)のために用いられるように、一緒に結合できる任意のペアの薬剤であり得る。2つ以上の検体を測定することができる。いくつかの実施形態において、固体基板は抗原によりコーティングすることができ、分析される検体は抗体である。
組み合わせアッセイにおいて、固体基板(マイクロ粒子等)は抗原および抗体により共コーティングされて、サンプルから抗体および抗原をそれぞれ捕捉する。固体支持体を2つ以上の異なる抗原により共コーティングして、サンプルから2つ以上の異なる抗体を捕捉することができる。固体支持体を2つ以上の異なる抗体により共コーティングして、サンプルから2つ以上の異なる抗原を捕捉することができる。
移動事象の数は、当技術分野において公知の任意のルーチンの技法を定性的または定量的に使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、移動事象の数は、方程式
定性分析は、本明細書において記載されるようなステップの方法およびプロセスを使用して遂行することができる。図25中で示され、実施例17中で記載されるように、チオールベースの切断ステップにより、切断可能なリンカーコンジュゲートを使用して、直接分析を遂行することができる。本明細書において記載されるような様々なタグのカウントを可能にするように、かかるアッセイの遂行への他の切断可能なリンカーアプローチは、リンカーの切断の様々な他の方法も包含し得るが、これらに限定されないことが理解される。加えて、アプタマーを用いることができる。例えば、実施例17中で記載される方法に加えて他のかかる代替の切断方法および/または試薬は、実施例16、実施例18、実施例19、実施例20および実施例21中で記載されるものに加えて、本明細書において記載されるおよび当業者に公知の他の切断方法を包含することができる。この実施例(実施例24)において実証されたアッセイフォーマットが、直接分析を表わしている一方で、他のフォーマット(サンドイッチ免疫アッセイフォーマットおよび/または様々な競合アッセイフォーマット等、および当業者に公知のオンザフライ捕捉フォーマット等が含まれる)は、記載される方法を使用して、アッセイを実装、また遂行できることも理解される。
定量的アッセイは、本明細書において記載されるような方法およびステップのプロセスを使用して遂行することができる。図25中で示され、実施例17中で記載されるように、チオールベースの切断ステップにより、切断可能なリンカーコンジュゲートを使用して、直接分析を遂行することができる。本明細書において記載されるような様々なタグをナノポアを使用してカウントすることを可能にするように、かかるアッセイの遂行への他の切断可能なリンカーアプローチは、リンカーの切断の様々な他の方法も包含し得るが、これらに限定されないことが理解される。加えて、アプタマーを用いることができる。例えば、実施例17中で記載される方法に加えて他のかかる切断方法は、実施例18、実施例19、実施例20および実施例21中で記載されるものに加えて、本明細書において記載されるおよび当業者に公知の他の方法を包含することができるが、これらに限定されない。この実施例(実施例25)において実証されたアッセイフォーマットが、直接分析を表わしている一方で、他のフォーマット(サンドイッチ免疫アッセイフォーマットおよび/または様々な競合アッセイフォーマット等、および当業者に公知のオンザフライ捕捉フォーマット等が含まれる)は、アッセイを実装、また遂行することができることも理解される。
開示されるデバイスありまたはなしで上述の方法の実行における使用のためのキットも本明細書において提供される。キットは、開示されるデバイスによる検体の分析のための指示を含むことができる。キット中に含まれる指示は、パッケージ材料へ添付され得るか、またはパッケージ挿入物として含まれ得る。指示は書面または印刷材料であり得るが、これらに限定されない。かかる指示を保存することができ、エンドユーザーへそれらを伝える任意のメディアは、本開示によって企図される。かかるメディアには、電子ストレージメディア(例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学メディア(例えばCD ROM)、および同種のものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書において使用される時、「指示」は、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを包含することができる。
本発明は、以下の非限定的実施例によって例証される複数の態様を有する。
光切断可能なスルホスクシンイミジル/マレイミジルリンカーの合成は、Agasti,et al.,J.Am.Chem.Soc.,134(45),18499-18502,2012に由来する。簡潔には、出発物質4-[4-(1-ヒドロキシエチル)-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ]酪酸(0.334mmol)を、アルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン(DCM)中で溶解する。フラスコを氷浴中に設置することによって0℃へ冷却する。化合物2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)(0.368mmol)およびトリメチルアミン(TEA)(0.835mmol)を、溶液へ添加する。反応混合物を0℃で5分間撹拌し、続いてN-(2-アミノエチル)マレイミドトリフルオロアセテート塩(0.368mmol)を添加する。0℃で15分間撹拌した後に、反応混合物を室温(RT)へ上昇させ、18時間更に撹拌する。DCM(45ml)による反応混合物の希釈の後に、有機相を水(2×)、飽和NaCl溶液(1×)により洗浄し、硫酸ナトリウムの上で乾燥する。有機層を減圧下で濃縮し、SiO2カラムを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製する(溶出液:100%のDCMからDCM中の3%のメタノールへ、v/v)。化合物1(0.024mmol)を無水ジメチルホルムアミド(1ml)中で溶解する。N,N’-ジスルホスクシンイミジルカーボネート(DSC)(0.071mmol)およびTEA(0.096mmol)を、溶液へ連続的に添加する。反応混合物をRTで18時間撹拌する。反応混合物をC18逆相カラムの上へ直接ロードすることによって精製する(溶出液:水中の5%のアセトニトリルから水中の95%のアセトニトリルへ、v/v)。合成のために使用される出発物質および他の化学物質は、Sigma-Aldrichから購入することができる。
光切断可能なスルホスクシンイミジル/ジベンゾシクロオクチル(DBCO)アルキニルリンカーの合成は、Agasti,et al.,J.Am.Chem.Soc.,134(45),18499-18502,2012中で記載される類似する手順に由来する。簡潔には、出発物質4-[4-(1-ヒドロキシエチル)-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ]酪酸(0.334mmol)を、アルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン(DCM)中で溶解する。フラスコを氷浴中に設置することによって0℃へ冷却する。化合物2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)(0.368mmol)およびトリメチルアミン(TEA)(0.835mmol)を、溶液へ添加する。反応混合物を0℃で5分間撹拌し、続いてDBCO-アミン(0.368mmol)を添加する。0℃で15分間撹拌した後に、反応混合物をRTへ上昇させ、18時間更に撹拌する。DCM(45ml)による反応混合物の希釈の後に、有機相を水(2×)、飽和NaCl溶液(1×)により洗浄し、硫酸ナトリウムの上で乾燥する。有機層を減圧下で濃縮し、SiO2カラムを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製する(溶出液:100%のDCMからDCM中の3%のメタノールへ、v/v)。化合物3(0.024mmol)を無水ジメチルホルムアミド(1ml)中で溶解する。N,N’-ジスルホスクシンイミジルカーボネート(DSC)(0.071mmol)およびTEA(0.096mmol)を、溶液へ連続的に添加する。反応混合物をRTで18時間撹拌する。反応混合物をC18逆相カラムの上へ直接ロードすることによって精製する(溶出液:水中の5%のアセトニトリルから水中の95%のアセトニトリルへ、v/v)。合成のために使用される出発物質および他の化学物質は、Sigma-Aldrichから購入することができる。
以下のスキームを使用して、DNA分子を抗体へコンジュゲートすることができる。DNAは、1つまたは両方のプライマーが5’チオール基により標識される2つのPCRプライマーを使用してPCR反応においてDNA配列を複製することによって、5’末端でチオール化することができる。標識されたDNA(100μMの最終的な濃度)を、50mMのHEPES(pH=7.0)中で撹拌しながら溶解する。化合物2(2mM)を添加し、RTで2時間反応を進ませる。カップリング後に、過剰な未反応マレイミド基を過剰なジチオスレイトール(DTT)によりクエンチングする。ゲル濾過カラム(セファデックスG-25)上で、または適切なコンジュゲート保管バッファー中での4℃の大規模な透析によって、コンジュゲートを精製する。精製されたDNA-スクシンイミジルリンカー(50μMの最終濃度)を、100mMのPBS(pH=7.5)中で撹拌しながら溶解する。生来の抗体(50μMの最終濃度)を添加し、RTで2時間反応を進ませる。100mMのPBS(pH7.5)により作動するセファデックスカラム(セファデックスG25)、またはBioGel P-30ゲル濾過媒質を使用して、Ab-DNAのコンジュゲートを精製する。
以下のスキームを使用して、DNA分子を抗体へコンジュゲートすることができる。DNAは、1つまたは両方のプライマーが5’アミン基により標識される2つのPCRプライマーを使用してPCR反応においてDNA配列を複製することによって、5’末端でアミノ化することができる。標識されたDNA(100μMの最終的な濃度)を、100mMのPBS(pH=7.5)中で撹拌しながら溶解する。化合物4(2mMの最終濃度)を添加し、RTで2時間反応を進ませる。ゲル濾過カラム(セファデックスG-25)上で、または適切なコンジュゲート保管バッファー中での4℃の大規模な透析によって、DNA-DBCOリンカーを精製する。精製されたDNA-DBCOリンカー(50μMの最終濃度)を、50mMのトリス(pH=7.0)中で撹拌しながら溶解する。銅不含有クリックケミストリーを使用して、DNA-DBCOリンカーを抗体へカップリングする。アジド標識抗体(Kazane et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,109(10),3731-3736,2012)(25μMの最終濃度)を添加し、RTで6~12時間反応を進ませる。100mMのPBS(pH7.5)により作動するセファデックスカラム(セファデックスG25)、またはBioGel P-30ゲル濾過媒質を使用して、Ab-DNAのコンジュゲートを精製する。
デジタル免疫アッセイ(ナノポアカウント)のためのナノ粒子-抗体のコンジュゲート
本実施例は、26nmのカルボキシル化ポリスチレンナノ粒子(NP、PC02N)(Bangs Labs(Fishers、IN、米国)から得ることができるもの等)への抗体の共有結合性コンジュゲーションを記載する。26nmのNPは、528.7μ当量/gの表面電荷および68.4平方Å/基のパーキングエリアを有する(製造業者情報によって)。
1.0mL(100mg/mL)の26nmのカルボキシル化NPを、10mLの0.1MのMES(2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(pH4.5~5.0)により洗浄する。洗浄の後に、ペレットを、1.0mg/mLのNP濃度(0.1%固体)で100mLの0.1MのMES(pH4.5~5.0)の中で再懸濁する。10.0mLのナノ粒子懸濁物(10mgのNP、5.28μ当量カルボキシル)をバイアルへ移し、新たに調製された10μLの10mg/mLのEDC水溶液(1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド)(5.28μモル、1.0当量/CO2H当量)、および17μLの10mg/mLのスルホ-NHS水溶液(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、Sigma、カタログ番号56485)の溶液(7.93μモル、1.5当量/1当量EDC)と、連続的に混合しながら室温で15分間反応させる。反応させた懸濁物を6,500gで遠心分離し、溶液を廃棄する。ペレットを20mLの20mMのPBS/5mMのEDTA(pH7.5)により洗浄し、6,500gでの遠心分離によって遠心沈殿させる。上清を除去する。スクシンイミド活性化カルボキシル-NPペレットを50mMのPBS(pH7.5)中で再懸濁し、9.8μLの1.0mg/mLのピリジンジチオエチルアミン水溶液(52.8ナノモル、0.01当量/1 CO2H当量)を直ちに添加し、室温で2~4時間連続的に撹拌しながら反応させる。ピリジル誘導体化カルボキシル-NPを10mLの20mMのPBS/5mMのEDTA(pH7.5)により洗浄し、10.0mLの同じバッファー中で再懸濁する。ナノ粒子濃度を、カルボキシル-NPのキャリブレーションカーブを使用する紫外線-可視光線分光法(600nm、散乱)を使用して決定する。NP上にロードするピリジル-リガンドは、10mMのTCEPまたはDTTにより定義された量のNPを還元すること、遠心分離によって還元剤を除去すること、PBS/EDTA(pH7.2)中でピリジル活性化NPペレットを再懸濁すること、およびエルマン試薬と反応させること(上清のA412を測定する)によって決定する。活性化されたNPは、同じ日に抗体のコンジュゲーションのために使用しないならば、4℃で保存する。
1.0mLの10mg/mLの抗体溶液(10mg)を、新たに調製された38μLの30mg/mLの2-MEA溶液(10mMの反応濃度)(2-メルカプトエチルアミンヒドロクロリド)と十分に混合し、次いでキャップをし、37℃で90分間置く。溶液を室温へ導き、過剰な2-MEAを、20mMのPBS/5mMのEDTA(pH7.5)中で前平衡化された脱塩カラムにより除去する。還元された抗体の濃度を、A280(タンパク質吸光度)およびA320(散乱補正)で紫外線-可視光線吸光度を使用して決定する。遊離チオールの数をエルマン試験を使用して決定する。2つまたは4つの遊離チオール(抗体ヒンジ領域中のCys)を生成するのに必要なように、条件を最適化する。還元された抗体を、ピリジル誘導体化カルボキシル-NPへのカップリングのために直ちに使用する。
(1)抗体のパーキングエリアは45nm2である;(2)26nmのナノ粒子表面領域は2,120nm2である;(3)47の抗体分子が26nmのNPの表面上に理論的にフィットする、という仮定が立てられる。
20mMのPBS/5mMのEDTA(pH7.5)中の10mLの0.1%のピリジル活性化カルボキシナノ粒子の溶液(10mg)へ、0.10mgの還元された抗体(0.66ナノモル、0.10mL)を、同じEDTA含有バッファー中で1.0mg/mLで添加する。混合物を室温で2時間混合することにより反応させ、遠心分離して未結合の分子を除去し、吸引する。ペレットを10mLのPBS(pH7.2)により洗浄し、遠心分離し、吸引する。抗体-NPのコンジュゲートを10.0mLのPBS(pH7.2)中で懸濁する。コンジュゲートのNP濃度(%固体)を、紫外線-可視光線分光法(600nm)を使用して決定する。粒子コンジュゲートを走査電子顕微鏡によって検査し、サイズ/電荷分布をZetaSizerを使用して決定する。サイズ排除クロマトグラフィーは、コンジュゲート集団の電位分布から別個のコンジュゲートを単離するのに使用することができる。抗体対NPの取り込み比は、蛍光標識された抗原コンジュゲートを使用するフローサイトメトリーによって、またはマイクロBCA(uBCA)アッセイを使用して、決定することができる。抗体対NPのモルインプットの範囲をコンジュゲーションの温度およびpHと共に評価して、別個のコンジュゲート(すなわち2または4のNPの取り込み比)の均質な集団を生成することができる。
磁性撹拌機および窒素注入口を装備した25mLの丸底フラスコに、3-(9-((3-カルボキシプロピル)(トシル)カルバモイル)アクリジン-10-イウム-10-イル)プロパン-1-スルホネート(CPSP)(1)(1mmol)、ピリジン(5mmol)、およびジメチルホルムアミド(10mL)をチャージした。溶液を氷浴中で冷却し、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート(1.3mmol)を滴加した。氷浴を除去し、反応物を室温で3時間撹拌した。揮発性構成要素を真空下で反応物から除去し、残留物をメタノール中で取り上げ、逆相HPLCによって精製して表題化合物を得た。
2の溶液(DMSO中の1μLの10mMの溶液)を、抗体溶液(100μLの10μMの水溶液)および重炭酸ナトリウム水溶液(10μLの1Mの溶液)へ添加した。もたらされた混合物を室温で4時間撹拌した。産物の精製をスピンカラム上で達成して、CPSP抗体のコンジュゲート3を得た。「n」の値は抗体依存性様式で変動する。取り込みは、活性エステル濃度を上昇もしくは低下させることによって(すなわち化合物2、5、9および13)、および/または反応の間にpHを上昇もしくは低下させることによって、ある程度制御することができるが、常に取り込み値の分布をもたらす。平均取り込み定量(「I.R.」)は、反応後に実験的に決定される。典型的には、「n」は1~10の間の任意の値である。
磁性撹拌機および窒素注入口を装備した25mLの丸底フラスコに、3-(9-((3-カルボキシプロピル)(トシル)カルバモイル)アクリジン-10-イウム-10-イル)プロパン-1-スルホネートCPSP(1)(1mmol)、ピリジン(5mmol)、およびジメチルホルムアミド(10mL)をチャージした。溶液を氷浴中で冷却し、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート(1.3mmol)を滴加した。氷浴を除去し、反応物を室温で3時間撹拌した。次いで6-アミノカプロン酸(1.3mmol)、続いてN,N-ジイソプロピルエチルアミン(5mmol)を小分けで反応物へ添加し、反応物を室温で1時間撹拌した。この後に、揮発性構成要素を真空下で反応物から除去し、逆相HPLCによって精製して表題化合物を得た。
磁性撹拌機および窒素注入口を装備した25mLの丸底フラスコに、4(1mmol)、ピリジン(5mmol)およびジメチルホルムアミド(10mL)をチャージした。溶液を氷浴中で冷却し、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート(1.3mmol)を滴加した。氷浴を除去し、反応物を室温で3時間撹拌した。この後に、揮発性構成要素を窒素気流下で反応物から除去し、逆相HPLCによって精製して表題化合物を得た。
5の溶液(DMSO中の1μLの10mMの溶液)を、抗体溶液(100μLの10μMの水溶液)および重炭酸ナトリウム水溶液(10μLの1Mの溶液)へ添加した。もたらされた混合物を室温で4時間撹拌した。産物の精製をスピンカラム上で達成して、スペーサーを備えたCPSP抗体のコンジュゲート6を得た。典型的には、「n」は1~10の間の任意の値である。
磁性撹拌機および窒素注入口を装備した100mLの丸底フラスコに、プロパルギルアルコール(10mmol)、2,6-ジ-tert-ブチルピリジン(10mmol)および塩化メチレン(50mL)をチャージし、-20℃へ冷却した。次いでトリフルオロメタンスルホン酸無水物を溶液へ滴加し、反応物を-20℃で2時間撹拌した。ペンタン(25mL)を反応物へ添加し、もたらされた沈殿した塩を濾過によって分離した。揮発性構成要素を真空下で蒸発させ、残留物を100mLの丸底フラスコ中の塩化メチレン(25mL)中で再溶解した。4-(N-トシルアクリジン-9-カルボキサミド)ブタン酸(CPアクリジン)(7)(1mmol)を小分けで添加し、反応物を室温で18時間撹拌した。揮発性構成要素を真空下で蒸発させ、残留物をメタノール(5mL)中で取り上げ、逆相HPLCによって精製して表題化合物を得た。
磁性撹拌機および窒素注入口を装備した25mLの丸底フラスコに、8(1mmol)、ピリジン(5mmol)およびジメチルホルムアミド(10mL)をチャージした。溶液を氷浴中で冷却し、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート(1.3mmol)を滴加した。氷浴を除去し、反応物を室温で3時間撹拌した。揮発性構成要素を真空下で反応物から除去し、残留物をメタノール中で取り上げ、逆相HPLCによって精製して表題化合物を得た。
9の溶液(DMSO中の1μLの10mMの溶液)を、抗体溶液(100μLの10μMの水溶液)および重炭酸ナトリウム水溶液(10μLの1Mの溶液)へ添加した。もたらされた混合物を室温で4時間撹拌した。産物の精製をスピンカラム上で達成して、CPSP抗体のコンジュゲート10を得た。典型的には、「n」は1~10の間の任意の値である。
オリゴアジド(5μLの水中で10nmol)、CPSP抗体のコンジュゲート10(10μLの水中で10nmol)および新たに調製された0.1Mの「クリック溶液」(3μL、以下を参照)の混合物を、室温で4時間振盪した。反応物を0.3Mの酢酸ナトリウム(100μL)により希釈し、DNAコンジュゲートをEtOH(1mL)の添加によって沈殿させた。上清を除去し、残留物を冷EtOH(2×1mL)により2回洗浄した。残留物を水(20μL)中で取り上げ、CPSPオリゴヌクレオチド-抗体のコンジュゲート11の溶液を更なる精製なしに使用した。典型的には、「n」は1~10の間の任意の値である。
CuBr(1mg)を70μLのDMSO/t-BuOH(3:1)中で溶解して、0.1Mの溶液を形成した(この溶液は必ず新たに調製すべきであり、保存することはできない)。トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン(TBTA)(54mg)を1mLのDMSO/t-BuOH(3:1)中で溶解して、0.1Mの溶液を形成した(この溶液は-20℃で保存することができる)。1体積の0.1MのCuBr溶液を2体積の0.1MのTBTA溶液へ添加して、「クリック溶液」を提供した。
磁性撹拌機および窒素注入口を装備した25mLの丸底フラスコに、8(1mmol)、ピリジン(5mmol)およびジメチルホルムアミド(10mL)をチャージした。溶液を氷浴中で冷却し、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート(1.3mmol)を滴加した。氷浴を除去し、反応物を室温で3時間撹拌した。次いで6-アミノカプロン酸(1.3mmol)、続いてN,N-ジイソプロピルエチルアミン(5mmol)を小分けで反応物へ添加し、反応物を室温で1時間撹拌した。この後に、揮発性構成要素を真空下で反応物から除去し、逆相HPLCによって精製して表題化合物を得た。
磁性撹拌機および窒素注入口を装備した25mLの丸底フラスコに、12(1mmol)、ピリジン(5mmol)およびジメチルホルムアミド(10mL)をチャージした。溶液を氷浴中で冷却し、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート(1.3mmol)を滴加した。氷浴を除去し、反応物を室温で3時間撹拌した。この後に、揮発性構成要素を窒素気流下で反応物から除去し、逆相HPLCによって精製して表題化合物を得た。
13の溶液(DMSO中の1μLの10mMの溶液)を、抗体溶液(100μLの10μMの水溶液)および重炭酸ナトリウム水溶液(10μLの1Mの溶液)へ添加した。これを室温で4時間撹拌した。産物の精製をスピンカラム上で達成して、スペーサーを備えたCPSP抗体のコンジュゲート14を得た。典型的には、「n」は1~10の間の任意の値である。
オリゴアジド(例えば商業的に入手可能なもの等)(5μLの水中で10nmol)、スペーサーを備えたCPSP抗体のコンジュゲート14(10μLの水中で10nmol)および新たに調製された0.1Mの「クリック溶液」(3μL、実施例6.Cを参照)の混合物を、室温で4時間振盪した。典型的には、「n」は1~10の間の任意の値である。反応物を0.3Mの酢酸ナトリウム(100μL)により希釈し、DNAコンジュゲートをEtOH(1mL)の添加によって沈殿させた。上清を除去し、残留物を冷EtOH(2×1mL)により2回洗浄した。残留物を水(20μL)中で取り上げ、スペーサーを備えたCPSPオリゴヌクレオチド-抗体のコンジュゲート15の溶液を更なる精製なしに使用した。
記載されるような、スペーサーを備えたまたは備えていないCPSP抗体のコンジュゲートおよびスペーサーを備えたまたは備えていないCPSPオリゴヌクレオチド-抗体のコンジュゲートは、塩基性過酸化水素水を使用して、切断されるかまたは「トリガー」される。ARCHITECT(登録商標)システムにおいて、励起状態のアクリドン中間体は光子を産生し、それを測定する。加えて、分解産物はアクリドンおよびスルホンアミドである。実施例6.A~Dのコンジュゲートは、アクリドン分子および/またはスルホンアミド分子のカウントによって、開示されるデバイスにより使用される。
オリゴアジド(例えば商業的に入手可能なもの等)(5μLの水中で10nmol)、プロパルギル-CPSP 8(10μLの水中で10nmol)および新たに調製された0.1Mの「クリック溶液」(3μL、実施例6.Cを参照)の混合物を、室温で4時間振盪することができる。反応物を0.3Mの酢酸ナトリウム(100μL)により希釈し、DNAコンジュゲートをEtOH(1mL)の添加によって沈殿させることができる。上清を除去し、残留物を冷EtOH(2×1mL)により2回洗浄することができる。残留物を水(20μL)中で取り上げ、スペーサーを備えたCPSPオリゴヌクレオチド-抗体のコンジュゲート16の溶液を更なる精製なしに使用することができる。
低コストのDMF底部チップの製作
低コストの可撓性DMFチップは、いくつかの修飾による、Lo C-Y et al.,Microelectronic Engineering 86(2009)979-983中で記載されるプロセスの使用によって、電極パターニングのためのウェットリフトオフプロセスと組み合わせたロール・ツー・ロール(R2R)フレキソ印刷を使用して、製作された。製作プロセスの概略図は図10中で描写される。MELINEX(登録商標)ST506ポリエチレンテレフタレート(PET)の5.0ミルの基板(1)のロールを、DMF電極印刷のための出発物質として使用した。黄インク(Sun Chemical)の層を、Aniloxローラーアセンブリー上で3.8ml/m2のインク転送体積を使用して10m/分間の速度で、1.14mm厚の印刷プレート(Flint MCO3)を使用して、PET基板上でフレキソ印刷した(2)。DMF電極パターンのネガティブイメージがフレキソ印刷ステップから生じる(3)。金属堆積の前に、インクをホットエアオーブン中で2回乾燥した(2×100℃)。EVA R2R金属エバポレーターを使用して、印刷されたPET基板の上へ銀金属の層を堆積させて80nmの厚みで銀の一様なコーティングを形成させた(4)。金属化されたインク-フィルム基板(5)に、1m/分間のスピードで、超音波処理槽中で超音波とアセトンの組み合わせを使用して、ウェットリフトオフプロセスを行った(6)。この化学的/物理的処理は銀-インク層の溶解を可能にし、その一方で、銀のみの層をインタクトで維持する。インク-銀層の除去は、50または140μmのいずれかの電極ギャップの間隔を備えた80のアクチュエーション電極(2.25×2.25mm)からなる、DMF印刷の電極パターンをもたらした(7)。品質管理チェックとして、単一のロールからの合計80~90のランダムなチップは、電極ギャップの間隔およびコネクターリード幅のバラツキについて視覚的に調査された。許容されるギャップ規格を有すると決定されたチップの典型的な収率は100%近くであった。単一の製作された可撓性チップを、図11中で描写する。製作された可撓性チップは3インチ×2インチの測定値であり、電極、リザーバー、接触パッドおよびリードを含む。
低コストのDMFチップの機能的試験
上記の実施例7で略述されるように製造された3インチ×2インチのPETベースDMF底部チップを、アクチュエーション能力について試験した。図12は、3インチ×2インチのPETベースのDMFチップ(1)、その上にわたって位置する0.7mm厚のガラス基板(3)を描写する。ガラス基板(3)は、ガラス基板の下方表面上で、透明なインジウムスズ酸化物(ITO)電極およびITOの電極の上ににわたるテフロンコーティングを含む。DMFチップは、直線状縁部電極デザインおよび電極の間の50μmギャップを備えた80の銀のアクチュエーション電極を、8つのバッファーリザーバーと共に含む(上記の実施例7を参照)。
低コストのDMFチップ上でのTSH免疫アッセイ
上記の実施例8中で記載されるような、ガラス基板により重層された3インチ×2インチのPETベースのDMFチップを、化学発光検出を使用して、甲状腺刺激ホルモン(TSH)免疫アッセイを実行する能力について試験した。モックサンプルは、ブロッキング剤および界面活性剤を含有するトリス緩衝食塩水(TBS)バッファーの中へ少量添加されたTSHキャリブレーター材料を含んでいた。3つのサンプルを試験した(0、4、40μIU/ml)。2μLの、5μmの磁性マイクロ粒子(3×108粒子/ml)上にコーティングされた抗βTSH捕捉抗体を、中央のDMF電極アレイの中へマイクロ粒子リザーバーから分注した。DMFチップ下で、ネオジム磁石バー(3インチ×1/2インチ×1/4インチ厚、相対的透磁率μr=1.05、残留磁界の強さBr=1.32T)を係合させることによって、磁性マイクロ粒子をバッファーから分離した(図13A)。5μLのサンプルをマイクロ粒子スラグへ動かし、続いて4つの電極の正方形の立体配置にわたるマイクロ粒子懸濁物を5分間混合した(図13B)。マイクロ粒子を磁石によってサンプルから分離し、上清を廃液リザーバーへ動かした(図13Cおよび13D)。2μLの、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)へコンジュゲートされた1μg/mLの抗TSH検出抗体をマイクロ粒子スラグへ動かし、2分間混合した。マイクロ粒子を磁石によって分離し、上清を廃液リザーバーへ動かした。免疫アッセイサンドイッチ複合体を含有するマイクロ粒子を、4×2μLの0.1%の界面活性剤を含有するPBSの洗浄バッファーにより合計4回洗浄した。ステップが完了した後に、各々の洗浄ステップからの洗浄バッファーを廃液へ動かした。化学発光基質は1μLのSuperSignal H2O2および1μLのルミノール(ThermoFisher Scientific)からなり、それをマイクロ粒子スラグへ動かし、続いて6分間混合した。化学発光シグナルを、5Vの直流電源を備えた集積Hamamatsu H10682-110 PMTを使用して、427nmの発光(347nmの励起)で測定した。用量-応答カーブを、相対的発光に対してプロットした(図13Eを参照)。
ナノポアモジュール製作
ナノポアモジュールを、TEMウィンドウ(Norcada)中に包埋された商業的に入手可能な窒化ケイ素(SiNx)膜の組み込みとカップリングさせた標準的なソフトリソグラフィー製作方法を使用して製作した。モジュールは、PDMSの4つの分離した層(転送マイクロチャンネルを含有する上部PDMS基板および底部PDMS基板、ならびにTEMウィンドウをシールする2つの随意の中間PDMS層)からなっていた。
清浄で乾いたガラス基板を、フォトレジスト(SU8-50)で、所望される厚みへスピンコーティングした。次いでコーティングした基板の領域を、フォトマスクを使用して近紫外線光へ選択的に曝露した。マスクは、転送マイクロチャンネルおよびリザーバーの形が残るべき領域においてのみ、フォトレジストを紫外線へ曝露する。曝露に続いてベークして、曝露されたフォトレジストの領域を架橋した。次いでSU8現像液を使用して、残存している曝露されないフォトレジストを基板から除去する。最終産物は、マスターモールド(ハードフォトレジストのパターニングされた転送マイクロチャンネルおよびリザーバーを備えたガラス基板)である。
中間PDMS層の製作のために、7:1(PDMSモノマー:硬化剤)の比でPDMSモノマーおよびその硬化剤(Sylgard 184シリコンエラストマー)を含有する溶液を、スライドグラス上にスピンコーティングし、続いて70℃で30分間ホットプレート上で加熱した。PDMS層をガラス基板から剥離し、1.25mmの切り欠きをPDMS層を介して穿孔して、TEMウィンドウへのアクセスを可能にする開口部を提供した。PDMS層の表面を、コロナ処理機を8mmの距離で使用して30秒間プラズマ処理することによって親水性にした。第2のプラズマ処理(5秒)を、2つの中間PDMS層の間にSiNxTEMウィンドウを接合する前に使用して、PDMS層およびTEMウィンドウの表面を処理した。
7:1(PDMSモノマー:硬化剤)の比でPDMSモノマーおよび硬化剤を混合することならびに転送マイクロチャンネルおよびリザーバーをパターニングしたSU8パターニングモールド(6)を含有するガラスの上にわたって注ぐことによって、図14B中で示されるように、マイクロチャンネルを含有する上部PDMS基板および底部PDMS基板を製作した(上記のSU8マスターモールド製作を参照)。マイクロチャンネルはおよそ110~135μmの幅および50μmの深さの測定値であった。15分間脱気した後に、SU8モールドを70℃で60分間ホットプレート上で加熱した(7)。硬化後に、PDMS基板をSU8モールド(8)から剥離し、切断して、30mmの長さ×20mmの幅×3mmの深さの近似的寸法を有する矩形のPDMS基板を得た。アクセス孔(直径1.25mm)をPDMS基板を介して穿孔して、マイクロチャンネルの中へ電極の後続する挿入を可能にした。最終的なアセンブリーを図14A中で示し、底部から上部へ、1つのマイクロチャンネル(1)を含有する底部PDMS基板、マイクロチャンネルの上にわたって位置する切り欠きを含有する第1の中間PDMS層(2)、TEMウィンドウ中のSiNx膜(3)、切り欠きも含有する第2の中間PDMS層(4)、および第2のマイクロチャンネルを含有する上部PDMS基板(5)を含む。
PDMS底部基板(上記の「上部PDMSおよび底部PDMSの製作」中で略述されるように調製される)を30秒間プラズマ処理し、続いて、PDMS底部基板の上へ第1の中間PDMS層(「中間PDMS層の製作」中で略述されるように調製される)を接合した。同様に、PDMS上部基板を30秒間プラズマ処理し、続いて、PDMS上部基板の上へ第2の中間PDMS層を接合した。中間層中の切り欠きをマイクロチャンネルと整列させた。上部PDMS片および底部PDMS片の両方を30秒間酸素プラズマ処理し、続いて、上部片と底部片との間にSiNx膜ウィンドウを設置し、中間PDMS層中の切り欠きと整列させた。底部片と整列させたSiNx膜と整列させた上部片を、すべての気泡が放出されるまで、一緒にプレスした。最終的なナノポアPDMSアセンブリーを、100℃で30分間ホットプレート上で加熱し、5分間プラズマ処理した。図14C中で示される最終的なモジュールアセンブリー(9a)は2つのチャンネル(1つの直線状チャンネルおよび1つの「L型」チャンネル)を含有し、各々は溶液(例えばバッファー)のためのリザーバー中で終結した。SiNx膜を含有するTEMウィンドウは、2つの垂直なマイクロチャンネルの交差で位置する(図14C、9b)。
ナノポア製作
誘電破壊が発生するまでSiNxTEMウィンドウ(2つのPDMS層の間に収容された)を電位バイアスへさらし、それによって、膜中で小さな直径の孔を開口させることによって、ナノポア製作を達成した。これは、検体の検出の前に、マイクロ流体デバイス内のポアのインシトゥーの形成を可能にする。誘電破壊によるナノポア形成は、固相誘電体膜中の小さな直径ポアの迅速製作のために有用であることがこれまでに示された(H.Kwok,K.Briggs,V.Tabard-Cossa,PLoS-One,9(3),2014)。
乾いたマイクロチャンネルの充填
アセンブルされたPDMSモジュール(すなわちDMFモジュールおよびナノポアモジュールを含む集積デバイス)中で含有されるキャピラリー導管を、DMF電極アセンブリーからの高塩溶液を自発的に充填する能力について試験した(図16A~16C)。充填は自発的キャピラリー流(SCF)経由で達成された。マイクロチャンネルのより良好な可視化を可能にするために、ナノポア膜は含まれなかった。図16Aを参照して、80のアクチュエーション電極(1)(2.25mm×2.25mm、Cr-200nmの厚み)を含有するガラスDMFチップ(3インチ×2インチ×0.0276インチ)を使用して、3.6MのLiCl、0.05%のブリジ35および青色色素(可視化を支援する)の小滴(2)を動かした。PDMSモジュール(3)は、DMF電極アレイに直面する2つの開口部(4)、2つのリザーバー(5)、および2つのマイクロチャンネル(1つの直線状チャンネル(6)および1つのL型チャンネル(7))を含有していた。2つのチャンネル開口部がDMF電極アレイの内部に直面するように、モジュールアセンブリーをDMFガラス表面上に設置した。上部接地電極チップが使用されなかったので、小滴の動きは、駆動電位を生成するために共面の底部電極を使用することによって達成された。
10μLの青色をつけたLiCl塩溶液の小滴を、DMF電極アレイの真中の電極上に設置した。100Vrms(10kHz)の電圧を使用して、直線状マイクロチャンネル開口部へ隣接する転送電極へ小滴を動かす。チャンネルをエタノールにより前填済して、前もって湿らせたチャンネルを模倣した。小滴がPDMS表面に接触した後に、<1秒の時間が、リザーバーまでのチャンネルを充填するのに要求された。これは乾いたチャンネルよりも有意に速く、親水性溶液により前もって湿らせることはマイクロチャンネル充填速度を促進することを示唆した。
集積シリコンNPデバイス中でのDMF小滴の転送
可撓性基板(PDMS等)に加えて、硬質基板(例えばシリコン)を使用して、ナノポアモジュールを製作することができる。図17は、アクチュエーション電極(4)を含有するデジタルマイクロ流体(DMF)チップ(1)を示し、そこから、小滴は、ナノポアセンサーを含有するシリコンマイクロ流体チップ(2)へ転送される。小滴は、ナノポアセンサーを含有するマイクロ流体チップの上部表面中のアクセスポート(3)によって2つの構成要素チップの間に転送される。アクセスポートはマイクロ流体チャンネル(6)によってナノポアセンサー(5)へ接続される。小滴は毛細管力によってアクセスポートからマイクロ流体チャンネルを介して動かされ、動きはマイクロピラーのアレイから製作された受動的ペーパーポンプ(7)によって支援され得る(図18)。受動的ポンプはマイクロチャンネルから流体を除去することもでき、異なる流体溶液が混入なしに連続して使用されることを可能にする(例えばナノポア形成およびナノポアセンシングのための溶液の間で)。
毛細管力によるDMFとナノポアのモジュールとの間の小滴転送
DMFチップから好適なナノポア膜を含有するモジュールへ、高塩の移動バッファーを動かす能力は、シリコンマイクロ流体チップ中で試験された。曲がりくねったマイクロチャンネルは、唯一の駆動力として自発的キャピラリー流(SCF)を使用して、1MのKCl(pH=8)の小滴を受動的に動かす能力について試験された。全体のマイクロチャンネルをシリコン中で製作し、CMOSベースのシリコン環境中で流体転送のためのモデルとして供した。曲がりくねったマイクロチャンネルは、2つのアクセスポート(流体ローディングのための)を有するようにデザインされた。チャンネル寸法は、160μmの直径で2.5cmのおよその長さと測定された。誘電破壊によるナノポアの形成のための好適な溶液の小滴は、受動的毛細管力を使用して、シリコンマイクロ流体構造を満たすことが実証された。
流体マイクロチャンネルによる集積ナノポアセンサーの製作
流体マイクロチャンネル内の集積ナノポアセンサーを、フォトリソグラフィーおよびエッチングプロセスを使用して製作して、シリコン・オン・オキサイド(SOI)ウエハを修飾する(図23A~23B)。
切断可能なDNA-ビオチンコンストラクトの合成
非ビオチン化二本鎖DNA(NP1)の合成
2つの一本鎖の50merを標準的なホスホロアミダイトケミストリー(Integrated DNA Technologies)を使用して合成した。オリゴNP1-1Sは、C-12炭素スペーサーによってDNAから分離された5’末端上にアミノ基を含有する50ヌクレオチドのDNA配列(配列番号:1)(1、MW=15,522.3g/モル、ε=502,100M-1cm-1)からなっていた。オリゴNP1-2ASは、NP1-1Sに相補的な50ヌクレオチドのDNA配列(配列番号:2)(2、MW=15,507.1g/モル、ε=487,900M-1cm-1)からなっていた。両方のオリゴヌクレオチドを後続の操作の前に定量および凍結乾燥した。示される配列は、上から順に、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:1~2である。
100mMのスルホ-NHS-SSビオチン(4、ThermoFisher Scientific)の溶液を、0.099mLの無水DMSO(Sigma Aldrich)中での6mgの粉末の溶解によって作製した。溶液をボルテックスで撹拌し、5’アミノ-DNAのビオチン化のために直ちに使用した。およそ100μLの50mMのPBS(pH7.5)中のssDNA(1、171μM、17.1μモル、0.265mg)(配列番号:1)溶液を、3.4μLのDMSO中の0.1mMのビオチン化試薬(34.1μモル、ssDNAの20倍のモルの過剰量)と混合した。混合物を混合し、室温で2時間反応させた。2つの0.5mLのZebaスピン脱塩カラム(MWカットオフ7,000Da、ThermoFisher Scientific)を、10mMのPBS(pH7.2)中で平衡化した。粗製のビオチン化ssDNA溶液を1つのZebaカラムへ添加し、1.3分間4,600rpmで溶出させた。記載されるように、溶出液を第2のZebaカラムへ移し溶出させた。精製されたNP1-1S-SS-ビオチン(5)(配列番号:1)の濃度を、A260の吸光度の測定によって決定した(2.03mg/ml、131μM)。
およそ60μLのNP1-1S-SS-ビオチン溶液(5、7.85μモル、131μM、2.03mg/mL)を、42μLのNP1-2AS溶液(2、7.85μモル、187μmol/L)(配列番号:2)と混合した。溶液を85℃で30分間加熱ブロック中に設置し、続いて、2時間にわたって室温へ徐冷した。10mMのPBS(pH7.2)を使用するTosoH G3000SWカラム(7.8mm×300mm)に全アニーリング体積(およそ100μL)を注入することによって、二本鎖産物を精製した。A260の吸光度によってモニターされるように、二本鎖ビオチン化材料は7.9分(20分間のランタイム)で溶出された。溶出体積を、0.5mLのAmiconフィルター濃縮器(MWカットオフ10,000Da)を使用して、480μLへ低減した。最終的なNP1-ジチオ-ビオチン(6)(配列番号:1、フォワードストランド(上部);配列番号:2、リバースストランド(下部))濃度は、A260の吸光度によって決定されるように、16.3μMであると計算された。
切断可能なDNA-ビオチンコンストラクトの代替合成
相補的DNA配列(NP-31aおよびNP-31b):2つの一本鎖の60merを標準的なホスホロアミダイトケミストリー(Integrated DNA Technologies)を使用して合成した。オリゴNP-31aは、C-6炭素スペーサーによってDNAから分離された5’末端上にアミノ基を含有する60ヌクレオチドのDNA配列(配列番号:3)(1、MW=18,841.2g/モル、1.7μM/OD)からなっていた。オリゴNP-31bは、NP-31aに相補的な60ヌクレオチドのDNA配列(配列番号:4)(2、MW=18292.8g/モル、1.8μM/OD)からなっていた。両方のオリゴヌクレオチドを後続の操作の前に定量および凍結乾燥した。示される配列は、上から順に、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:3~4である。
10mMのNHS-S-S-dPEG4-ビオチン(4、MW=751.94g/モル、Quanta BioDesign,Ltd)の溶液を、2.0mLのジメチルホルムアミド(Sigma Aldrich)中での15.04mgの粉末の溶解によって調製した。溶液をボルテックスで撹拌し、5’アミノ-DNAのビオチン化のために直ちに使用した。およそ100μLの10mMのリン酸緩衝食塩水(PBS)(pH7.4)中のssDNA(1、100μM、0.01μモル、0.188mg)(配列番号:3)溶液を、10μLのDMF中の10mMのビオチン化試薬(0.1μモル、ssDNAに対して10倍のモルの過剰量)と混合した。混合物を混合し、室温で2時間反応させた。2つの0.5mLのZebaスピン脱塩カラム(MWカットオフ7,000Da、ThermoFisher Scientific)を、10mMのPBS(pH7.2)中で平衡化した。粗製のビオチン化ssDNA溶液を1つのZebaカラムへ添加し、2分間4,600rpmで溶出させた。記載されるように、溶出液を第2のZebaカラムへ移し溶出させた。精製されたNP-31-SS-ビオチン(5)(配列番号:3)の濃度を、A260の吸光度の測定によって決定した(1.45mg/ml、77μM)。示される配列は、上から順に、配列番号:3、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:3~4である。
およそ60μLのNP-31-SSビオチン溶液(5、77μM)(配列番号:3)を、50μLのNP-31b溶液(2、100μM)と混合した。溶液を85℃で30分間加熱ブロック中に設置し、続いて、2時間にわたって室温へ徐冷した。10mMのPBS(pH7.2)を使用するTosoH G3000SWカラム(7.8mm×300mm)に全アニーリング体積(およそ100μL)を注入することによって、二本鎖産物(配列番号:3、フォワードストランド(上部);配列番号:4、リバースストランド(下部))を精製した。A260の吸光度によってモニターされるように、二本鎖ビオチン化材料は7.57分で溶出された。溶出体積を、0.5mLのAmiconフィルター濃縮器(MWカットオフ10,000Da)を使用して低減した。最終的なdsNP-31-SS-ビオチン(6)(配列番号:3、フォワードストランド(上部);配列番号:4、リバースストランド(下部))濃度は、A260の吸光度によって決定されるように、11μMであると計算された。
切断可能なDNA-ビオチン(チオール媒介性切断コンストラクト)の合成
ストレプトアビジンコーティング磁性マイクロ粒子(SA-MP)へのssNP-31-SSビオチンの結合および化学切断(TCEPまたはDTT)
化学切断実験を以下の方法によって磁性マイクロ粒子上で実行した(図25を参照)。100μLの77μMのPBS(pH7.2)中で修飾オリゴヌクレオチドssNP-31-SSビオチン溶液を、1μLの0.1%のストレプトアビジン常磁性マイクロ粒子と共に室温で30分間インキュベーションした。磁石へ粒子を誘引することおよびPBSTバッファー(pH7.4)により10回洗浄することによって、過剰なオリゴを除去した。オリゴ結合粒子を、PBS(pH7.4)中の変動濃度のDTTまたはTCEPのいずれかにより15分間インキュベーションした。マイクロ粒子をPBSTバッファー(pH7.4)により10回洗浄して、任意の切断されたオリゴヌクレオチドを除去した。フルオロフォアを含有する相補的配列NP-31c(配列番号:5)(7、MW=7494.6g/モル、5.2μM/OD)を、マイクロ粒子と共にPBS(pH7.4)中で30分間インキュベーションして、粒子上でインタクトなままの任意の未切断のssNP-31-SSビオチンと結合させた。マイクロ粒子を磁石へ誘引し、PBSTバッファー(pH7.4)により10回洗浄して、任意の過剰なNP-31cセグメントを除去した。上記のように調製されたコーティングマイクロ粒子を洗浄したが、化学切断を行わず、対照として供した。粒子上の蛍光シグナルを蛍光顕微鏡法によって測定した。表1中に示されるように、最大切断効率はDTTおよびTCEPについてそれぞれ79%および93%と測定された。以下に示される配列は配列番号:5である。
切断可能なDNA-ビオチン(光切断コンストラクト)の合成
光切断可能なDNA配列およびマイクロ粒子上での切断の効率の評価
一本鎖DNAの光切断可能な配列を、標準的なホスホロアミダイトケミストリー(Integrated DNA Technologies)を使用して合成した。オリゴヌクレオチドは、2つの光切断可能な部分によって分離される2つのオリゴセグメント(オリゴ8-1(配列番号:6)およびオリゴ8-2(配列番号:7))を構成する、48ヌクレオチド(8、MW=15,430.1g/モル、441800Lmol-1cm-1)からなっていた。5’末端は、C-6炭素スペーサーによってDNAから分離されたアミノ基を含有していた。オリゴ8-2に相補的なストランドを、蛍光性タグを含有して合成した(9、MW=7738.8g/モル、212700Lmol-1cm-1)(配列番号:8)。両方のオリゴヌクレオチドを後続の操作の前に定量および凍結乾燥した。
オリゴ8-1(配列番号:6):5’AAA AAA GGT CCG CAT CGA CTG CAT TCA3’
オリゴ8-2(配列番号:7):5’CCC TCG TCC CCA GCT ACG CCT3’
NP-8(8)(2つの光切断可能な部分(「PC」)によって連結されたオリゴ8-1(配列番号:6)およびオリゴ8-2(配列番号:7)):
H2N-5’AAAAAAGGTCCGCATCGACTGCATTCA-PC-PC-CCCTCGTCCCCAGCTACGCCT3’
NP-9(9)(配列番号:8):AlexaFluor546-5’AGG CGT AGC TGG GGA CGA GGG3’
熱切断可能なリンカー
この実施例は、熱切断可能なリンカーおよびそれらの切断を記載する。本明細書において記載されるように、かかる熱切断可能なリンカーは、例えばDMFチップ、小滴ベースのマイクロ流体チップ、SAWチップ、または同種のもの中で用いることができる。
マイクロ波誘導性の粒子ハイパーサーミアによって達成される熱切断
この実施例は、低出力のマイクロ波照射の使用により免疫アッセイ検出を加速できるように、熱変性(dsDNA変性、逆マイケル反応、逆ディールス・アルダー、および他の脱離等)を促進して、熱感受性切断可能なリンカー経由でカウント可能な部分を放出するマイクロ波誘導性の粒子ハイパーサーミアの使用を記載する。本明細書において記載されるように、かかる熱感受性切断可能なリンカーは例えばDMFチップ中で用いることができる。
DNA配列1b(11)(配列番号:10):マレイミド-5’TTA CGA CCG GGC TTG3’
dsDNA配列(12)(配列番号:9、フォワードストランド(上部);配列番号:10、リバースストランド(下部)):
H2N-5’CAA GCC CGG TCG TAA3’
3’GTT CGG GCC AGC ATT5’-マレイミド。
PBS(pH7.5)中のおよそ100μMのDNA配列1(配列番号:9)の溶液を、PBS(pH7.5)中の1.0モル当量のDNA配列1b(Integrated DNA Technologiesオリゴ分析器ツールによって理論的Tmは51.6℃)(配列番号:10)と混合し、60℃で30分間加熱ブロック中に設置し、続いて、2時間にわたって室温へ徐冷することができる。全アニーリング体積を注入することによって、10mMのPBS(pH7.2)を使用するTosoH G3000SWカラム(7.8mm×300mm)上で、もたらされたdsDNA産物を精製する。溶出液体積を、0.5mLのAmiconフィルター濃縮器を使用して低減する。最終的なdsDNA濃度をA260の吸光度によって決定する。反応スキームを以下で描写する(「Mal」はマレイミドである)。
セクション「カルボキシル-ポリスチレンナノ粒子の活性化」下の実施例5中で記載されるように、カルボキシナノ粒子を前活性化する。NP上のDNAローディングを、結合されているDNA鎖の熱変性、粒子の洗浄、蛍光標識された相補的DNA配列(AlexaFluor546-5’-TTA CGA CCG GGC TTG3’(配列番号:11)等)のアニールによって決定し、蛍光顕微鏡を使用して定量化する。
セクション「抗体の還元」下の実施例5中で記載されているように、抗体を還元する。還元された抗体を、NP-dsDNAの複合体へのカップリングのために直ちに使用することができる。もたらされたコンジュゲートを6,500gで遠心分離し、上清をデカントによって除去する。洗浄手順をPBS(pH7.5)により5回反復して、ナノ粒子から任意の遊離抗体を除去する。活性抗体対ナノ粒子の取り込み比を、与えられた抗体に対する蛍光標識された抗原を使用して定量化することができる。コンジュゲートのNP濃度(%固体)を、紫外線-可視光線分光法(600nm)を使用して決定する。粒子コンジュゲートを走査電子顕微鏡によって検査し、サイズ/電荷分布をZetaSizerを使用して決定する。
上記のスキームは、熱変性させた抗体-ナノ粒子のコンジュゲート(その調製は上記される)を利用する、ナノポアカウントアッセイを図示する。サンドイッチタイプの免疫アッセイは、検体捕捉剤によりコーティングされた磁性マイクロ粒子を使用して調製することができ、そこで、血液検体は洗浄され、磁性マイクロ粒子と共にインキュベーションされ、記載される抗体-ナノ粒子のコンジュゲート共にインキュベーションされる。マイクロ波照射を使用して粒子ハイパーサーミアを誘導して、粒子表面の近くで局所温度の勾配を生ずることができる。粒子ハイパーサーミア方法(Dutz and Hergt(Nanotechnology,25:452001(2014))中に概説されるもの等)を使用することができる。免疫アッセイ設定における局所的熱変性へのこれらの技法の適応は、カウント部分(ナノ粒子等)を放出する方法を提供することができる。磁性マイクロ粒子の除去に続いて、カウント部分(ナノ粒子)はナノポアを介する通過に際してカウントされる。
ナノポアカウントデータ
この実施例は、様々なタグ(例えばポリエチレングリコールを備えたssDNAハイブリッド分子(DNA-スター)、dsDNA、DBCOにより標識されたdsDNA、およびPAMAMスクシンアミド酸デンドリマー)についてのナノポアカウントデータを記載する。異なるサイズのナノポアと共にこれらの異なるタグを使用して、ナノポアに至適化を提供した。異なる分子ポリマー標識を適切な塩バッファー中に懸濁し、標準的な流体セルカセットを使用して検出した。
生体分子のナノポアによる区別
この実施例において、ナノポアを使用して、生体分子(例えばdsDNAスター、DBCO修飾dsDNA、および通常のdsDNA)を区別した。この方法論は、異なる標識タイプを使用するマルチプレックス化のために使用することができる。
定性分析
以下の実施例は、定性アッセイを遂行するための方法を記載する。基本的に、この実施例において、コンストラクトを使用して、DMFチップ上のアッセイの原理を実証した。コンストラクトを切断し標識を放出させ、次いでそれがナノポアを移動するにつれてシグナルを生成するのでナノポアを使用してカウントし、したがって2つの特異的な結合メンバーペア(ストレプトアビジンおよびビオチン)の結合が指摘され、そこで、dsDNA標識のこの切断および後続のカウントはアッセイの間に発生した特異的な結合に相関していた。さらに、適切な対照実験を遂行して、ナノポア移動測定の間にカウントされた標識から生成されるシグナルは、アッセイプロセスの間に発生した特異的な結合事象のためであり、アッセイプロセス流の中へ導入されているチオール切断試薬の存在に相関するのではないことを確認した。遂行された実験の詳細は以下の通りである。
切断可能なジスルフィド結合を含有するビオチン標識二本鎖DNA(実施例17の(6))を、ナノポア検出/カウントのための標的として使用した。結合アッセイは、DMFチップ上のストレプトアビジン磁性マイクロ粒子へのビオチンDNAの結合、続いて、チオール媒介性化学切断ステップからなっていた(図25を参照)。DMFチップ上の試薬の設置を図27中で示す。切断されたDNA標的(ストレプトアビジン磁性粒子へ結合されている種から分離された)を、制御された誘電破壊によって生じたあらかじめ開けられたナノポアを備えた固相窒化ケイ素(SiNx)膜を含有するナノポア流体セルへ転送した(H.Kwok,et al.,PLoS,9(3),2014)。DNA標的材料をカウントし、オープンソースのCUSUMソフトウェア解析パッケージ(NIST)を使用して分析した。
TEMウィンドウ(0.05μm×0.05μm)中に包埋した10nm厚のSiNx膜(Norcada NT0052、低応力SiNx)の制御された誘電破壊(CBD)を使用して、ナノポア製作を達成した。この方法は、高精度で最小の費用の小直径の固相ポアを産生することができる。TEM-SiNx膜を2つのバッファーチャンバーを含有するポリテトラフルオロエチレン(PTFE)流体セル中に設置し、2つのシリコンエラストマーガスケットを使用してシールした。流体セルはセルの底部において16μLの体積のチャンネルを含有し、それは上方チャンバー中の塩溶液をナノポア膜へ接続させた。ナノポア製作のために、流体セルを脱気したエタノールにより最初に充填し、脱気した脱イオン水により交換し、次いで、18MΩ脱イオン水中の重炭酸ナトリウムによりpH10へ緩衝された脱気した0.5MのKClにより充填した。8Vのバイアス電圧を使用する増幅器を使用して、製作を実行した。流体セルの2つの側面を、銀/塩化銀ワイヤーを使用して接続した。Kwok et al中で記載されるように、8Vの固定した電圧を設定している間、電流はリアルタイムでの静電容量(電流の低減)を示す。電流が増加する場合に、電力をセルから除去する。製作のためのサンプリングレート=25kHzであった。漏洩電流の増加はポアの形成を指摘し、それによって電圧をオフした。ポア直径を、以下のコンダクタンスベースの方程式
移動事象の数は、方程式
この実施例は、本明細書において記載されるようなステップのプロセスの遂行による定性アッセイを記載する。図25中で示され、実施例17中で記載されるように、チオールベースの切断ステップにより、切断可能なリンカーコンジュゲートを使用して、直接分析を遂行した。本明細書において記載されるような様々なタグのカウントを可能にするように、かかるアッセイの遂行への他の切断可能なリンカーアプローチは、リンカーの切断の様々な他の方法も包含し得るが、これらに限定されないことが理解される。例えば、実施例17中で記載される方法に加えて他のかかる代替の切断方法および/または試薬は、実施例16、実施例18、実施例19、実施例20および実施例21中で記載されるものに加えて、本明細書において記載されるおよび当業者に公知の他の切断方法を包含することができる。この実施例(実施例24)において実証されたアッセイフォーマットが、直接分析を表わしている一方で、他のフォーマット(サンドイッチ免疫アッセイフォーマットおよび/または様々な競合アッセイフォーマット等、当業者に公知のもの等)は、記載される方法を使用して、アッセイを実装、また遂行することができることも理解される。
定量分析
以下の実施例は、定量アッセイを遂行するための方法を記載する。基本的に、この実施例において、および実施例24の延長として、カウント標識の増加量(この事例においてdsDNA分子であるカウント可能な標識)が、スタンダードカーブ上で、アッセイ(結合)ステップにおいて、結合されていた特異的な結合剤の量に相関する(それは、そしてもとのサンプル中に存在する検体の量に相関する)ことを実証するように、スタンダードカーブを生成した。この特定の実験のためのスタンダードカーブは、データ分析の様々な異なる方法に基づいた図31、図32、図34、またはスタンダードカーブを生成するのに流動に依存する図34中で見出すことができる。後者の事例において、図34中で示される測定法は事象/時間(カウントの流動の事象)に基づいていたが、与えられたサンプル中で測定される検体濃度の量に相関するスタンダードカーブを生成するのに他の測定法を使用できることは理解される。遂行された実験の詳細は以下の通りである。
この方法は高精度で最小の費用の小直径の固相ポアを産生することができるので、TEMウィンドウ(0.05μm×0.05μm)中に包埋した10nm厚のSiNx膜(Norcada NT0052、低応力SiNx)の制御された誘電破壊(CBD)を使用して、ナノポア製作を達成した。TEM-SiNx膜を2つのバッファーチャンバーを含有するポリテトラフルオロエチレン(PTFE)流体セル中に設置し、2つのシリコンエラストマーガスケットを使用してシールした。流体セルはセルの底部において16μLの体積のチャンネルを含有し、それは上方チャンバー中の塩溶液をナノポア膜へ接続させた。ナノポア製作のために、流体セルを脱気したエタノールにより最初に充填し、脱気した脱イオン水により交換し、次いで、18MΩ脱イオン水中の重炭酸ナトリウムによりpH10へ緩衝された脱気した0.5MのKClにより充填した。8Vのバイアス電圧を使用して増幅器を使用して、製作を実行した。流体セルの2つの側面を、銀/塩化銀ワイヤーを使用して接続した。Kwok et al中で記載されるように、8Vの固定した電圧を設定している間、電流はリアルタイムでの静電容量(電流の低減)を示す。電流が増加する場合に、電力をセルから除去する。製作のためのサンプリングレートは25kHzであった。漏洩電流の急激な増加はポアの形成を指摘し、それによって電圧をオフした。0.5MのKClバッファーを3.6MのLiCl(pH=8.3)と置き換えた。
DNAスタンダードをキャリブレーターとして使用して、DNAの濃度の増加にともなうナノポア流動速度の変化の決定によって、用量-応答カーブを観察した。これによりスタンダードカーブが生成され、それは免疫アッセイにおいて切断されたDNA標識の定量のために使用することができる。2μlの1.5μMの100bpのDNAスタンダード(ThermoScientific)を、330μlの.6MのLiCl塩溶液を含有するPTFE流体セルの中へピペットで移して、94nMのDNAの最終濃度を得た。ナノポア分析の前に、溶液を数回を上下にピペッティングすることによって、試薬を混合した。セルを+200mVのDCのバイアスにさらし、60分間にわたって電流遮断についてモニターした。CUSUM解析ソフトウェアを使用して、電気信号およびカウント率を特徴づけた。この手順を2回反復して、スタンダードカーブ上で2つの追加の点(182nMおよび266nM)を得た。異なる時間的な期間にわたる電流遮断がすべての3つのスタンダードについて示され、それらは94nMについて41秒(図30A);182nMについて24秒(図30B);266nMについて8秒(図30C)であった。ベースラインノイズは、図30A、図30Bおよび図30Cについて、それぞれおよそ900pA、900pAおよび1,000pAであると経験的に推測された。
合成のDNAコンストラクト(Seq31-SS-ビオチン)を原材料として使用して、用量-応答カーブを生成した(図47)。この標的を使用して切断された標識NP-Seq31-SS-ビオチン(それは定性アッセイにおいてストレプトアビジンビーズから切断される)を定量することができる。この材料は、切断された標識Seq31-SS-ビオチンとおよそ同じMWおよび電荷密度を有するので、これをキャリブレーションカーブにおいて使用して、ストレプトアビジンマイクロ粒子から、TCEPおよび/またはDTTを使用して切断された標的を定量することができる。
移動事象の数は、方程式
この実施例は、本明細書において記載されるようなステップのプロセスの遂行による定量アッセイを記載する。図25中で示され、実施例17中で記載されるように、チオールベースの切断ステップにより、切断可能なリンカーコンジュゲートを使用して、直接分析を遂行した。本明細書において記載されるような様々なタグをナノポアを使用してカウントすることを可能にするように、かかるアッセイの遂行への他の切断可能なリンカーアプローチは、リンカーの切断の様々な他の方法も包含し得るが、これらに限定されないことが理解される。例えば、実施例17中で記載される方法に加えて他のかかる切断方法は、実施例18、実施例19、実施例20および実施例21中で記載されるものに加えて、本明細書において記載されるおよび当業者に公知の他の方法を包含することができるが、これらに限定されない。この実施例(実施例25)において実証されたアッセイフォーマットが、直接分析を表わしている一方で、他のフォーマット(サンドイッチ免疫アッセイフォーマットおよび/または様々な競合アッセイフォーマット等、当業者に公知のもの等)は、アッセイを実装、また遂行することができることも理解される。
ナノポア電界シミュレーション
COMSOLシミュレーションランのシリーズを、シリコンモジュールにおいて使用される提案されたナノポア膜デザイン上で実行して、理論上の10nmの直径ナノポアを介するカウンターイオン濃度および電気浸透流速度に対するSiO2ビアのサイズの影響を研究した。SiO2の上部層は複数の目的を果たし、それらは、1)SiNx膜に絶縁する層を提供し、それによって、ナノポアの容量性ノイズを低減すること;2)シリコン基板内のSiNx膜の堅牢性および強度を増加すること;3)溶液へ曝露されるSiNx領域のサイズを減少させ、それによって、制御された誘電破壊(CBD)プロセスからの膜上のポアの位置決めを改善することである。電界シミュレーションを使用して、ポアを介する局在化カウンターイオン濃度および電気浸透流に対するSiO2層の干渉を決定した。
COMSOL電界シミュレーションは、材料、静電気学、分子輸送、および層流特性に基づく物理的モデルを使用した。電位はポアソン方程式に基づき;イオン流動はネルンスト-プランク方程式に基づき;流体速度はストークス方程式に基づいていた。シミュレーションのために使用される物理的パラメーターは、図36において示される表1中で定義される。
デジタルマイクロ流体(DMF)モジュールの中へのナノポアモジュールの集積
ナノポアモジュールはDMFモジュールの1つの側面上に所在した。孔は、ポア生成および検体検出のためにDMFモジュールからナノポアモジュールへの液体輸送を可能にするように、DMFモジュール中に存在した(例えば図40を参照)。
カウントされる標識およびポアサイズの分析
様々な条件のセット下で二本鎖DNAを使用して実験のセットを行って、ポアサイズおよびカウントされる標識サイズと比べて特定の属性があることを分析および実証した。これらの実験において、様々なパラメーターを調査し、それらには、検出電圧、DNA長、DNA濃度、塩濃度および塩組成、膜材料、膜厚、ナノポア直径、ならびに他の因子が含まれる。
・イオン強度(3Mまたは3.6Mのいずれか)
・DNA長(10kbp、50bpまたは1kbp)
・使用されるイオン性塩(LiClまたはKClのいずれか)
・膜材料(SiNx、データセットを通して一定)
・膜の厚み(10nm、データセットを通して一定)
・DNA濃度(複数可)(3nM~約306nMの間で変動)
・電圧(50~600mVの間で増分を含んで変動)
・ナノポア直径(様々なポアサイズ、8.0、1.1、3.6、4.2、2.8、2.5、7.7、3.1、2.7、2.6、2.9および4.2が含まれる(すべてナノメートルで))。
を含む、該方法。
Claims (12)
- 集積デジタルマイクロ流体ナノポアデバイスであって、
マイクロ流体モジュール、ここで、前記マイクロ流体モジュールは、その上に配置された液滴上に電気アクチュエーション力を生成するための電極のアレイを含む第1の基板を含む;および
マイクロ流体モジュールと流体的に連通され、層中の少なくとも1つのナノポアを含むナノポアモジュール、ここで、前記ナノポアモジュールは単一分子をカウントするように構成される;
を含み、
マイクロ流体モジュールが少なくとも1つのナノポアに液滴を導入するように構成される、該デバイス。 - 前記ナノポアが固体ナノポアまたは生体ナノポアである、請求項1に記載のデバイス。
- 前記マイクロ流体モジュールが、電気力、エレクトロウェッティング、誘電泳動、電極媒介性、オプト-エレクトロウェッティング、電界媒介性、静電アクチュエーション、圧力、および弾性表面波からなる群から選択される流体操作力により前記液滴を動かすように構成される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記マイクロ流体モジュールが、
第1の基板から離れて置かれた第2の基板
を更に含み、
アレイ中の第1の電極がアノードを形成し、アレイ中の第2の電極がカソードを形成して、ナノポアを介して電流を駆動する、
請求項1に記載のデバイス。 - 前記ナノポアが、第1の基板および第2の基板の少なくとも1つに添付されたナノポア層中に配置され、かつ、前記第1の電極および第2の電極が前記ナノポア層に接する、請求項4に記載のデバイス。
- 前記第1の基板および第2の基板の少なくとも1つが実質的に透明である、請求項4に記載のデバイス。
- 前記アレイ中の電極がグリッドパターンで配置される、請求項4に記載のデバイス。
- 前記アレイ中の電極が櫛型である、請求項4に記載のデバイス。
- 前記マイクロ流体モジュールが、弾性表面波(SAW)生成材料の層を含む、請求項1に記載のデバイス。
- 前記マイクロ流体モジュール上に配置され、かつ、前記液滴により保有されるように構成される少なくとも1つの試薬を更に含む、請求項1に記載のデバイス。
- 前記試薬が、結合メンバー、切断可能なタグ、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項10に記載のデバイス。
- 前記切断可能なタグが、陰イオン性ポリマー、陽イオン性ポリマー、デンドリマー、またはナノ粒子を含み、前記結合メンバーが、抗体または受容体を含む、請求項11に記載のデバイス。
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