CN109738417B - 一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，属于肿瘤细胞学领域，包括：(1)多孔金纳米球的制备；(2)将多孔金纳米球与巯基修饰的适配体进行共孵育，制得功能化的多孔金纳米球；(3)将功能化的多孔金纳米球与样本细胞结合，除去未结合的多孔金纳米球，制得细胞待测样；(4)向细胞待测样中加入碳酸氢盐溶液，在808nm激光下进行照射。本发明提供一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，该方法操作简单、检测成本低，采用的多孔金纳米球，其制备过程简单、光热稳定性高、生物相容性好，在808nm的激光照射下会产生高温，使得碳酸氢盐受热分解，通过监测反应体系中气压的变化，从而区分出肿瘤细胞和正常细胞。

Description

一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法

技术领域

本发明属于肿瘤细胞学领域，具体涉及一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法。

背景技术

肿瘤是机体在多种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。目前，对于癌症的治疗主要分为中药治疗、手术治疗、放射治疗及化学治疗等。无论哪一类治疗方法，越早发现，癌症的治疗成功几率就越大。因此，对肿瘤的预警和早期诊断具有重要的临床意义。目前，对肿瘤细胞的检测主要采用荧光分析法、酶联免疫吸附法、流式细胞术以及其它生物传感的方法。但是，上述方法依赖于进口高精度的检测仪器，且操作不方便，检测成本较高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，该方法操作简单、检测成本低。

本发明提供的这种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：

(1)多孔金纳米球的制备；

(2)将步骤(1)所得多孔金纳米球与巯基修饰的适配体进行共孵育，制得功能化的多孔金纳米球；

(3)将步骤(2)所得功能化的多孔金纳米球与样本细胞结合，除去未结合的多孔金纳米球，制得细胞待测样；

(4)向步骤(3)所得细胞待测样中加入碳酸氢盐溶液，在808nm激光下进行照射，通过监测反应体系中气压的变化，区分出肿瘤细胞和正常细胞并得到该肿瘤细胞的准确数目。

作为优选，步骤(1)中，所述多孔金纳米球通过以下方式得到：

1)以聚乙烯吡咯烷酮为稳定剂，氯金酸及硝酸银分别作为金源和银源，对苯二酚作为还原剂，合成金银复合纳米球；

2)以浓氨水溶解金银复合纳米球中的银原子，经离心、洗涤、再分散，制得多孔金纳米球。

进一步，所述多孔金纳米球的制备过程为：

i)依次将0.15～0.20g聚乙烯吡咯烷酮、120～560μL对苯二酚、10～100μL硝酸银、640μL氯金酸混合，并用二次水定容至18mL，37℃摇床下剧烈震荡5分钟后，静置90分钟；

ii)随后，加入200μL浓氨水后继续震荡2h，经离心、洗涤、再分散，即得所述的多孔金纳米球。

进一步，所述对苯二酚的浓度为50mM。

进一步，所述硝酸银的浓度为60mM。

进一步，所述氯金酸的浓度为25mM。

作为优选，所述多孔金纳米球的直径为150～550nm。

作为优选，步骤(4)中，所述碳酸氢盐溶液为碳酸氢铵溶液，其浓度为1M。

作为优选，步骤(4)中，通过监测该反应体系中气压的变化，具体为：

若反应体系中气压不断增大，则样本细胞为肿瘤细胞，且气压的变化值与肿瘤细胞数量成正比；

若反应体系中气压不变，则样本细胞为正常细胞。

金纳米粒子具有局域表面等离子体共振特性、易控的界面修饰以及良好的生物相容性，被广泛应用于光电子学、生物及医学等领域。在特定激光照射下，金纳米粒子可有效吸收入射光，并将吸收的光能转化为热能，使得金纳米粒子表面温度急剧升高。鉴于其独特的光学性质，本发明采用制备过程简单、光热稳定性高、生物相容性好的多孔金纳米球，并将其作为一种光热制剂用于肿瘤细胞的检测。

本发明的原理：本发明将多孔金纳米球与巯基修饰的适配体进行共孵育，制得功能化的多孔金纳米球；通过适配体的特异性识别作用，将功能化的金纳米球连接到肿瘤细胞表面，而正常细胞与功能化的金纳米球不发生特异性结合；向细胞待测样中加入碳酸氢盐溶液，假如样本细胞为肿瘤细胞，在808nm的激光下进行照射，肿瘤细胞表面连接的多孔金纳米球将吸收的光能转化为热量，导致溶液温度升高，且随肿瘤细胞数量增多，碳酸氢盐不断分解产生气体，反应体系的气压也随之不断变大；假如样本细胞为正常细胞，由于正常细胞不与功能化的金纳米球发生结合，因而细胞待测样中不含金纳米球，在808nm的激光下进行照射，反应体系中不产生气体。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

本发明提供一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，该方法操作简单、检测成本低，采用的多孔金纳米球，其制备过程简单、光热稳定性高、生物相容性好，在808nm的激光照射下会产生高温，使得碳酸氢盐受热分解，通过监测反应体系中气压的变化，从而区分出肿瘤细胞和正常细胞，并得到肿瘤细胞数目。

附图说明

图1为实施例制备的多孔金纳米球的微观形貌，a为多孔金纳米球的SEM图；b为多孔金纳米球的TEM图。

图2为不同实验条件下气压值变化(△P)柱状图，808nm激光照射以808nm表示，多孔金纳米球以Au NQs表示，碳酸氢铵以NH₄HCO₃表示。

图3为不同数量肿瘤细胞与气压值变化关系图。

图4为正常细胞与肿瘤细胞气压值变化(△P)柱状图，乳腺癌细胞以MCF-7表示，正常成纤维细胞以L929表示，宫颈癌细胞以HeLa表示。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1

多孔金纳米球的制备：

1)金银复合纳米球的制备：称取0.18g聚乙烯吡咯烷酮粉末，分散至含有18mL二次水的圆底烧瓶中(注意：多次少量加入，确保每次加入的聚乙烯吡咯烷酮完全溶解后再加下一次)，避光条件下按顺序加入对苯二酚溶液(360μL，50mM)、硝酸银溶液(40μL,60mM)、氯金酸溶液(640μL,25mM)，在37℃下，摇床中剧烈震荡5min后，静置90min，溶液颜色由浅黄色逐渐变为蓝色，最后变为浅红色，表明已成功制备出金银复合纳米球；

2)银原子溶解：往金银复合纳米球溶液中加入200μL浓氨水后，37℃下摇床震荡2h，溶液颜色进一步加深，然后，5000r/pm转速下离心5min，去除上清液，随后加入二次水清洗并继续离心，3次同样操作后，加入二次水定容至2mL，得到1.5mg/mL的多孔金纳米球。

图1为实施例制备的多孔金纳米球的微观形貌(a为多孔金纳米球的SEM图；b为多孔金纳米球的TEM图)，从图1可以看出，金纳米球为多孔结构，分散性好，多孔金纳米球的直径约为250nm。

实施例2

采用实施例1制备多孔金纳米球；

气压值的测定：在0.6mL离心管中，将50μL碳酸氢铵溶液(1M)与0.75mg/mL多孔金纳米球等体积混合，随后，插入便携式气压计并密封该离心管，在808nm的激光下照射10分钟后，记录离心管中气压值。

图2为不同实验条件下气压值变化(△P)柱状图，由图2可以看出，多孔金纳米球在808nm激光照射下可使碳酸氢铵溶液分解产生气体，导致气压值升高；没有多孔金纳米球或者808nm激光照射时，反应体系不会产生气体；不添加碳酸氢铵溶液时，多孔金纳米球将吸收的光能转化为热量，导致溶液温度升高产生少量水蒸汽。

实施例3

本发明提供一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：

(1)采用实施例1制备多孔金纳米球；

(2)将多孔金纳米球与巯基修饰的适配体进行共孵育：将32μL的100μM巯基修饰的MUC1适配体(序列1：5’-HS-tttttttttt gcagttgatc ctttggatac cctgg-3’，巯基以HS表示)与500μL多孔金纳米球(0.75mg/mL)轻微震荡过夜，然后逐渐加入5M氯化钠(每两小时加2μL，共5次，即10μL)，静置过夜，5000r/pm转速下离心5分钟，移除90％上清液后，再加入450μL二次水，重复离心操作3次后，定容至500μL，制得功能化的多孔金纳米球；

(3)将功能化的多孔金纳米球与样本细胞结合：将含10μL MUC1适配体修饰的多孔金纳米球的细胞培养基与MCF-7细胞在CO₂培养箱中共培养3小时，然后，以磷酸盐缓存液(PBS)清洗细胞3次，以除去未结合的多孔金纳米球，再用50μL胰蛋白酶消化细胞后，1000r/pm转速下离心10分钟以除去胰蛋白酶，加入50μL PBS混匀细胞，并转移至0.6mL离心管中，制得细胞待测样；

(4)气压法检测：往上述离心管中加入50μL碳酸氢铵溶液(1M)，随后，插入便携式气压计并密封该离心管，808nm激光照射10分钟后，记录离心管中气压值。

图3为不同数量肿瘤细胞与气压值变化关系图，由图3可以看出，离心管内气压值随肿瘤细胞数量增多而不断变大。

实施例4

本发明提供一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：

(1)采用实施例3制备的功能化的多孔金纳米球；

(2)将功能化的多孔金纳米球与样本细胞结合：将含10μL MUC1适配体修饰的多孔金纳米球的细胞培养基分别与正常细胞(L929)、肿瘤细胞(MCF-7及HeLa)在CO₂培养箱中共培养3小时，然后，以PBS清洗细胞3次，以除去未结合的多孔金纳米球，再用50μL胰蛋白酶消化细胞后，1000r/pm转速下离心10分钟以除去胰蛋白酶，加入50μL PBS混匀细胞，并转移至0.6mL离心管中，制得细胞待测样；

(3)气压法检测：往上述离心管中加入50μL碳酸氢铵溶液(1M)，随后，插入便携式气压计并密封该离心管，808nm激光照射10分钟后，记录离心管中气压值。

图4为正常细胞与肿瘤细胞气压值变化(△P)柱状图，由图4可以看出，含正常细胞的离心管内气压值基本保持不变，肿瘤细胞的气压值明显升高，两种肿瘤细胞(MCF-7及HeLa)气压值升高不同的原因在于MCF-7细胞表面MUC1适配体的受体表达量更多，从而连接至MCF-7细胞表面的多孔金纳米球也更多。

本发明功能化的多孔金纳米球还可用于诱导肿瘤细胞凋亡，金纳米球通过适配体的特异性识别作用而连接到肿瘤细胞表面，在808nm的激光照射下，吸附至细胞表面的金纳米球产生高温，当照射时间足够长，就可以诱导肿瘤细胞凋亡。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tttttttttt gcagttgatc ctttggatac cctgg 35

Claims (7)

1.一种利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 多孔金纳米球的制备；

(2) 将步骤(1)所得多孔金纳米球与巯基修饰的适配体进行共孵育，制得功能化的多孔金纳米球；

(3) 将步骤(2)所得功能化的多孔金纳米球与样本细胞结合，除去未结合的多孔金纳米球，制得细胞待测样；

(4) 向步骤(3)所得细胞待测样中加入碳酸氢盐溶液，在808 nm激光下进行照射，通过监测反应体系中气压的变化，区分出肿瘤细胞和正常细胞，同时得到该肿瘤细胞实际数目；

所述多孔金纳米球通过以下方式得到：

1) 以聚乙烯吡咯烷酮为稳定剂，氯金酸及硝酸银分别作为金源和银源，对苯

二酚作为还原剂，合成金银复合纳米球；

2)以浓氨水溶解金银复合纳米球中的银原子，经离心、洗涤、再分散，制得多孔金纳米球；

所述碳酸氢盐溶液为碳酸氢铵溶液，其浓度为1 M。

2.根据权利要求1所述的利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述多孔金纳米球的制备过程为：

) 依次将0.15～0.20 g聚乙烯吡咯烷酮、120～560 μL对苯二酚、10～100 μL硝酸银、640 μL氯金酸混合，并用二次水定容至18 mL，37℃摇床下剧烈震荡5分钟后，静置90分钟；

) 随后，加入200 μL浓氨水后继续震荡2 h，经离心、洗涤、再分散，即得所述的多孔金纳米球。

3.根据权利要求2所述的利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述对苯二酚的浓度为50 mM。

4.根据权利要求2所述的利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述硝酸银的浓度为60 mM。

5.根据权利要求2所述的利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述氯金酸的浓度为25 mM。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述多孔金纳米球的直径为150～550 nm。

7.根据权利要求1所述的利用多孔金纳米球检测肿瘤细胞的方法，其特征在于，步骤(4)中，通过监测该反应体系中气压的变化，具体为：

若反应体系中气压不断增大，则样本细胞为肿瘤细胞，且气压的变化值与肿瘤细胞数量成正比；

若反应体系中气压不变，则样本细胞为正常细胞。

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