CN116381018A - 一种修饰丝网印刷电极、赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种修饰丝网印刷电极、赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器和检测方法，涉及生物传感器技术领域。本发明提供了一种修饰丝网印刷电极，并基于所述修饰丝网印刷电极制备得到赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器，固定有纳米多孔金修饰层的丝网印刷电极，将赭曲霉毒素适配体互补链与纳米孔金形成Au‑S键固定到电极表面，后将其与适配体链进行杂交，形成Apt/cDNA/NPG/SPCE。基于竞争型生物传感器的原理对待测物进行定性和定量检测，检测方法简单，稳定性高、特异性和重现性良好。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种修饰丝网印刷电极、赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器和检测方法。
背景技术
赭曲霉毒素是属于真菌毒素组的天然污染物，由各种真菌类型的曲霉菌和青霉菌产生。赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)作为一种霉菌毒素，20世纪60年代在南非的玉米粉中被发现。多年的研究表明，OTA具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致畸性、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。在6种已知的赭曲霉毒素类型中，赭曲霉毒素A显示出最高的毒性。国际癌症研究机构(IntemationalAgency forResearchon Cancer，IARC)根据几项动物研究中发现的大量致癌性证据，将OTA列为可能的人类致癌物(2B类)。由于OTA在自然界广泛存在，且性质非常稳定，不容易代谢，研究者陆续在动物肾脏、肝脏、猪肉、猪血、香肠、风干肉等动物源性食品中检测出OTA。
OTA的含量通常很低，所以对检测手段的要求较高，检测OTA的定性方法有微柱法，定量分析方法有薄层色谱法、高效薄层色谱法、HPLC、酶联免疫吸附法和荧光比色法等。但是目前已知的方法中均存在缺陷，如薄层层析法灵敏度较差、检测周期长以及重现性不好；色谱法仪器昂贵，操作复杂且不适合用于大批量样品的检测；酶联免疫吸附法基于抗原-抗体的亲和反应，以抗体作为识别分子，但是抗体容易受到外界环境尤其是温度的影响，限制了方法的灵活应用。此外，抗体制备也需经过动物实验或者细胞实验，繁琐费时，制备成本高，检测的成本也高。所以有必要发展一种快速方便，检测灵敏度高的新型检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种修饰丝网印刷电极、赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器和检测方法，检测方法简单，稳定性高、特异性和重现性良好。
本发明提供了一种修饰丝网印刷电极，包括丝网印刷基底电极，固定在所述丝网印刷基底电极的工作电极区域表面的纳米多孔金修饰层，以及与所述纳米多孔金修饰层通过Au-S键键合的赭曲霉毒素的适配体互补链。
优选的，当所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素A时，所述赭曲霉毒素的适配体互补链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，包括以下步骤：将赭曲霉毒素的适配体中的二硫键还原为巯基后，涂覆在固定有纳米多孔金修饰层的丝网印刷电极的工作电极区域，孵育一定时间后封闭活性位点，得所述丝网印刷电极。
本发明还提供了上述修饰丝网印刷电极在制备赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器中的应用。
本发明还提供了一种赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器，包括上述修饰丝网印刷电极，且赭曲霉毒素的适配体互补链上杂交有赭曲霉毒素的适配体链。
优选的，当所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素A时，所述赭曲霉毒素的适配体链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了上述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器的制备方法，包括以下步骤：将赭曲霉毒素的适配体链涂覆到上述修饰丝网印刷电极的工作电极区域，孵育一定时间后得所述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器。
本发明还提供了上述修饰丝网印刷电极或上述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器在检测赭曲霉毒素中的应用。
本发明还提供了一种检测赭曲霉毒素的方法，包括以下步骤：将待测样品的溶液涂覆到上述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器的工作电极区域，孵育后采集电流数据，将待测样品的溶液的电流数据带入预定的标准曲线，得待测样品的溶液中赭曲霉毒素的含量，所述预定的标准曲线为赭曲霉毒素的浓度对数值与对应的电流峰值的差值之间的线性拟合曲线。
优选的，所述预定的标准曲线的线性范围为0.5ng/mL～8ng/mL。
有益效果：本发明提供了一种丝网印刷电极，并基于所述丝网印刷电极制备得到赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器，所述传感器的制备原理和检测机理如图1所示，所述传感器包括固定有纳米多孔金(NPG)修饰层的丝网印刷电极(SPCE)，将赭曲霉毒素适配体互补链(cDNA)与纳米孔金形成Au-S键固定到电极表面，后将赭曲霉毒素适配体互补链与适配体链进行杂交，形成Apt/cDNA/NPG/SPCE。本发明提供的传感器在用于赭曲霉毒素检测时，加入目标物后，基于竞争型生物传感器的原理，适配体与互补链解脱，并与赭曲霉毒素特异性结合形成Apt/赭曲霉毒素复合物，通过DPV的信号测定，靶标浓度的增大使电解液中的探针[Fe(CN)6]3-/4-信号呈现递增趋势，达到对OTA的定性和定量分析。
附图说明
图1为基于NPG修饰层和cDNA-Aptamer探针的赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器的原理示意图；
图2为不同浓度HAuCl4电沉积溶液对CV测试的影响结果图；
图3为NPG的电镜图；
图4为不同OTA适配体互补链(cDNA)浓度对CV测试的影响；
图5为基于NPG赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器构建过程的CV曲线，图中a，裸电极；b，NPG/SPCE；c，cDNA/NPG/SPCE；d，Apt/cDNA/NPG/SPCE；e，OTA/Apt/cDNA/NPG/SPCE；
图6为基于NPG赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器构建过程的Nyquist图，图中a，裸电极；b，NPG/SPCE；c，cDNA/NPG/SPCE；d，Apt/cDNA/NPG/SPCE；e，OTA/Apt/cDNA/NPG/SPCE；
图7为适配体传感器在不同浓度OTA的DPV检测曲线，图中a，0ng/mL；b，0.5ng/mL；c，1ng/mL；d，2ng/mL；e，4ng/mL；f，8ng/mL；
图8为适配体传感器的电流差值与OTA浓度对数的拟合关系图；
图9为适配体传感器重现性测试图；
图10为适配体传感器稳定性测试图；
图11为适配体传感器特异性测试图。
具体实施方式
本发明提供了一种修饰丝网印刷电极，包括丝网印刷基底电极，固定在所述丝网印刷基底电极的工作电极区域表面的纳米多孔金修饰层，以及与所述纳米多孔金修饰层通过Au-S键键合的赭曲霉毒素的适配体互补链。
本发明对所述纳米多孔金(Nanoporous gold,NPG)的制备方法并没有特殊限定，优选包括模板法、表面活性剂介导法或脱合法，本发明实施例中通过电化学沉积法和脱合金相结合的方法在丝网印刷电极(SPCE)表面获得了具有多孔结构的纳米材料。在同一溶液中，由于溶液中的离子络合物和其他附加配体调节了活性金属Cu与贵金属Au沉积电位，使Au与Cu以低电位共沉积到SPCE表面。后通过改变电位选择性将Cu溶解，在电极表面形成NPG修饰层。
在本发明实施例中，制备NPG前，优选对SPCE进行预处理，所述预处理包括在SPCE电极表面滴加0.5mol/L的H2SO4支持电解液，在扫描范围-1.2～1.2V和扫速为100mV/s的条件下，采用循环伏安法扫10圈，晾干。本发明所述NPG优选根据Chen等的方法进行制备(ChenC,Yu S,Jiang S,et al.A novel and sensitive electrochemical sensor based onnanoporous gold for determination ofAs(III)[J].MicrochimicaActa,2020,187(7):1-10.)。
在本发明中，当所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素A(OTA)时，所述赭曲霉毒素的适配体互补链(cDNA)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(5’-3’)：HS-AAATGT CCGATG CTC CCTTTACGC CAC CCACAC CCGATC。
本发明还提供了上述修饰丝网印刷电极的制备方法，包括以下步骤：将赭曲霉毒素的适配体中的二硫键还原为巯基后，涂覆在固定有纳米多孔金修饰层的丝网印刷电极的工作电极区域，孵育一定时间后封闭活性位点，得所述丝网印刷电极。
本发明将赭曲霉毒素的适配体中的二硫键还原为巯基，优选包括将赭曲霉毒素的适配体互补链首先用TE缓冲液将其稀释成标准溶液，并添加一定浓度的TCEP(三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)溶液，使TCEP物质的量为适配体互补链物质的量100倍以上，还原适配体互补链中的二硫键为巯基。
本发明利用上述还原后的适配体互补链溶液滴涂到SPCE上修饰有NPG的工作电极区进行孵育，所述孵育优选包括于37℃下孵育2h。本发明在所述孵育后进行封闭活性位点，以避免非特异性反应，完成适配体互补链的固定。本发明在所述孵育后，优选还包括用10mMPBS缓冲液和超纯水缓慢冲洗数次，而后利用0.5％MCH(巯基乙醇)溶液滴加在工作电极表面，封闭活性位点。
本发明还提供了上述修饰丝网印刷电极在制备赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器中的应用。
本发明基于图1所示原理，可制备赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器。
本发明还提供了一种赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器，包括上述修饰丝网印刷电极，且赭曲霉毒素的适配体互补链上杂交有赭曲霉毒素的适配体链。
在本发明中，当所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素A时，所述赭曲霉毒素的适配体链的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示(5’-3’)：GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAG CATCGGACA。
本发明还提供了上述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器的制备方法，包括以下步骤：将赭曲霉毒素的适配体链涂覆到上述修饰丝网印刷电极的工作电极区域，孵育一定时间后得所述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器。
本发明所述固定有NPG的SPCE电极的制备方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明利用赭曲霉毒素的适配体链与固定有NPG的SPCE电极上的赭曲霉毒素的适配体互补链进行杂交，所述杂交优选包括将赭曲霉毒素的适配体溶液滴涂到SPCE上修饰有NPG的工作电极区，37℃下孵育2h，再用10mM PBS缓冲液和超纯水缓慢冲洗数次，晾干。
本发明还提供了上述修饰丝网印刷电极或上述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器在检测赭曲霉毒素中的应用。
利用本发明所述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器，与目标物混合后，基于竞争型生物传感器的原理，适配体与互补链解脱，并与其特异性结合形成Apt/OTA复合物，通过DPV的信号测定，靶标浓度的增大使电解液中的探针[Fe(CN)6]3-/4-信号呈现递增趋势，达到对OTA的定性和定量分析。
本发明还提供了一种检测赭曲霉毒素的方法，包括以下步骤：将待测样品的溶液涂覆到上述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器的工作电极区域，孵育后采集电流数据，将待测样品的溶液的电流数据带入预定的标准曲线，得待测样品的溶液中赭曲霉毒素的含量，所述预定的标准曲线为赭曲霉毒素的浓度对数值与对应的电流峰值的差值之间的线性拟合曲线。
本发明所述预定的标准曲线的绘制方法，优选包括利用梯度浓度的赭曲霉毒素的标准溶液分别滴涂到上述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器的工作电极区，孵育后采集电流数据，利用所述电流数据测绘标准曲线。本发明优选利用10mM PBS和20mM MgCl2的混合溶液对赭曲霉毒素进行稀释，从而稀释得到不同梯度浓度的标准品溶液。本发明在进行所述稀释时，优选还包括设置空白对照。在进行待测样品的溶液的检测时，优选将待测样本的溶液滴涂到SPCE上修饰有NPG的工作电极区，常温下孵育1h，再用10mM PBS缓冲液和超纯水缓慢冲洗数次，晾干备用。本发明所述标准曲线的建立，优选根据赭曲霉毒素的浓度的对数与电流差值△I进行线性拟合并求表达式，其中△I是以赭曲霉毒素的零浓度对照组的电流峰值Ipa为基准与其他赭曲霉毒素的浓度电流峰值Ip的差值，即ΔI＝|Ipa-Ip|。在本发明实施例中，对OTA进行检测，拟合后的标准曲线方程为y＝15.28146+28.81179lgCOTA，线性回归系数R2＝0.99659，线性范围为0.5ng/mL～8ng/mL，通过空白实验测试数据的标准偏差计算的检测限为0.172ng/mL(S/N＝3)。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种修饰丝网印刷电极、赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器和检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明中，稳定性是指传感器在条件恒定情况下，在单位时间间隔后，传感器对样品检测结果的差异程度，同样这种差异程度也是由得到样品若干次检测结果的标准偏差来表达，标准偏差越小其稳定性越好；传感器灵敏度的定义是输出增量与输入增量的比值，在线性传感器的方法检测中一般以拟合曲线的斜率大小反映其灵敏度大小，斜率越大其灵敏度就越高；重现性是指通过对不同批次的生物传感器在同一条件下进行相同的测试，来检验其测试结果的一致程度，传感器重现性通过得到样品的若干次检测结果的标准偏差来表达，标准偏差越小其重现性越好。
本发明实施例中所用的材料和方法如非特别说明，均为本领域的常规试剂和材料及方法，实验仪器和实验试剂如表1和表2所示。
表1实验仪器
表2实验试剂
其中，适配体的的碱基序列为SEQ ID No.2：GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGGGAG CAT CGG ACA；适配体互补链的碱基序列为SEQ ID No.1：HS-AAATGT CCGATG CTC CCTTTACGC CAC CCACAC CCGATC。
实施例1
NPG修饰层的制备
1)SPCE预处理
在SPCE电极表面滴加50μL的H2SO4支持电解液(0.5mol/L)，在扫描范围-1.2～1.2V和扫速为100mV/s的条件下，采用循环伏安法扫10圈，晾干备用。
2)NPG的制备方法
首先，将5mM的硫酸和5mM的CuSO4以及浓度分别为1mM、5mM、10mM、20mM、25mM的HAuCl4按1：1：0.2、1：1：1、1：1：2、1：1：4、1：1：5的比例配置成混合溶液。将配置好的氯金酸/硫酸铜电解液，取80μL混合溶液滴加到SPCE电极表面。采用恒电流法，施加0.15V的电位，沉积200s，形成Au/Cu合金，超纯水洗净，晾干。后在SPCE电极表面滴加50μL 0.5mol/LH2SO4溶液，同样采用恒电流法，施加1V电位，时间400s，脱去Cu单质，在电极表面形成NPG修饰层，用超纯水洗净，晾干。
4)NPG修饰层的电化学、形貌结构表征及物相成分分析
(1)将修饰好的SPCE电极表面滴加80μL含有5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾和5mM氯化钾的10mM PBS电解液，进行电化学表征。在扫描范围-0.3～0.5V和扫速为50mV/s的条件下，采用循环伏安法扫3圈进行表征；在频率范围0.1～104Hz和交流电压5V/s的条件下，采用电化学阻抗谱进行表征。
纳米孔金沉积完成后，通过循环伏安法的电流峰值大小，来确定最优电沉积液的浓度。结果如图2所示，混合溶液中1mM的HAuCl4其电流峰值最小为263.5μA，而随着HAuCl4浓度的提高，其电流值显著增加，HAuCl4浓度增加到5mM时，电流增长趋势变缓其值为342.4μA，浓度为10mM的HAuCl4电沉积溶液其电流值达到最大为350.9μA，后随着HAuCl4浓度的增大，电流值没有显著变化，这表明纳米孔金的覆盖率已经饱和。因此为了发挥纳米孔金的最大导电性，选择H2SO4和CuSO4的浓度均为5mM，HAuCl4浓度为10mM的混合溶液来进行后续实验。
(2)在参数是5KV加速电压条件下，采用聚焦离子束场发射扫描电子显微镜(FIB-SEmol/L)进行形貌结构分析。采用X射线衍射(XRD)在物相分析中可以定性分析和定量分析，XRD参数是波长0.154nm，工作电压40kV，工作电流150mA。
结果如图3所示，图中NPG在电极表面成薄膜形态，膜上有因氧化脱去铜单质而形成的孔洞结构，这些孔洞的直径在200～300nm之间，且分布均匀。因通过沉积金铜合金再脱合铜方法成功合成了纳米多孔金。
实施例2
基于实施例1所述NPG竞争型适配体生物传感器的构建
将OTA适配体互补链储存液(100μmol/L)，用TE缓冲液将其稀释成1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、10μmol/L浓度的OTA适配体互补链标准溶液，并添加一定浓度的TCEP溶液，使TCEP物质的量为适配体物质的量100倍以上，还原适配体中的二硫键为巯基。取10μL将互补链标准溶液滴涂到SPCE上修饰有NPG的工作电极区，37℃下孵育2h，再用10mM PBS缓冲液和超纯水缓慢冲洗数次，后20μL 0.5％MCH溶液滴加在工作电极表面，封闭活性位点来避免非特异性反应，完成适配体互补链的固定。取10μL 10μmol/L的OTA适配体标准溶液滴涂到SPCE上修饰有NPG的工作电极区，37℃下孵育2h，再用10mM PBS缓冲液和超纯水缓慢冲洗数次，晾干。
通过循环伏安法的电流峰值大小来确定最优电沉积液的浓度。结果如图4所示，浓度为1μmol/L的cDNA溶液的电流值最大，为323.9μA，后随着cDNA的浓度增大，电流值显著减小，直到CDNA的浓度为5μmol/L时，电流值变化趋于平缓，此时电流为233.7μA，这表明cDNA的在修饰层表面的固定量已达到饱和。因此选择5μmol/L的cDNA溶液来进行固定。
将固定过程中的SPCE滴加50μL含有5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾和5mM氯化钾的10mM PBS电解液，进行电化学表征。在扫描范围-0.3～0.5V和扫速为50mV/s的条件下，采用循环伏安法扫3圈进行表征；在频率范围0.1～104Hz和交流电压5V/s的条件下，采用电化学阻抗谱进行表征。
通过CV表征了活化后的裸电极、纳米孔金、OTA适配体互补链(cDNA)以及适配体(Apt)在电极表面的修饰情况，通过比较氧化峰电流的数据，来判断生物传感器的构建完成度，结果如图5所示，通过恒电流法在SPCE表面电沉积脱合NPG，相比于裸电极(曲线a)的峰电流231.7μA，修饰有NPG(NPG/SPCE，曲线b)的峰电流为339.8μA，峰电流增大了46.7％，由于NPG具有良好的导电性以及多孔结构，提高了电极表面的电子传输速率，电流的增大表明NPG已经修饰在电极上。后通过金硫键固定cDNA(cDNA/NPG/SPCE，曲线c)的电流为254.5μA，由于cDNA属于生物物质阻断了电子的传输，相比曲线b的值下降了25.1％，表明cDNA固定在了修饰层上。当Apt与cDNA互补配对结合后(Apt/cDNA/NPG/SPCE，曲线d)，电流值为211.6μA，由于Apt同样为生物物质，会阻断电子传输，因此电流的进一步减小表明Apt已经固定在电极表面。当OTA出现后，由于OTA会与电极表面的Apt特异性结合从而使Apt从电极表面解脱下来，促进了电极表面电子的传输，而检测到的电流(OTA/Apt/cDNA/NPG/SPCE，曲线e)为243.1μA，相比曲线d电流的增大表明该竞争型的适配体生物传感器构建完成。
采用电化学阻抗谱(EIS)来表征修饰层在电极表面的固定情况。在图6所示的Nyquist图中，通过比较半圆的直径代表了电子转移阻抗Rct，来衡量传感器电极表面的修饰情况。裸电极(曲线a)的Rct为760.3Ω，沉积在电极表面的NPG(NPG/SPCE，曲线b)Rct为6.3Ω，阻抗显著降低，表明具有良好导电性以及多孔结构的NPG已经修饰在电极上。后固定cDNA(cDNA/NPG/SPCE，曲线c)的Rct为255.4Ω，相比曲线b的Rct值显著增大，表明cDNA固定在了修饰层上。当Apt与cDNA结合后(Apt/cDNA/NPG/SPCE，曲线d)，Rct为506.8Ω，Rct的进一步增大表明Apt已经固定在电极表面。当OTA出现后，由于OTA会与电极表面的Apt特异性结合从而使Apt从电极表面解脱下来，促进了电极表面电子的传输，而检测到的(OTA/Apt/cDNA/NPG/SPCE，曲线e)Rct为426.4Ω，相比曲线d Rct的减小表明该竞争型的适配体生物传感器构建构建完成。
实施例3
实施例2构建的传感器对赭曲霉毒素A的检测
将OTA储存液(1.0μg/mL)用10mM PBS(pH＝7.4)20mMMgCl2的混合溶液，依次稀释成0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL浓度的标准品溶液，同时配制空白溶液，置于4℃冰箱备用。取20μL不同浓度的OTA标准品溶液滴涂到SPCE上修饰有NPG的工作电极区，常温下孵育1h，再用10mM PBS缓冲液和超纯水缓慢冲洗数次，晾干备用。同样在固定好适配体的SPCE电极表面滴加80μL含有5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾和5mM氯化钾的10mMPBS电解液，在-0.3～0.5V的扫描电压范围内，采用脉冲电压为25mV、步长电压为5mV的差分脉冲伏安法进行测试。
为了检验基于NPG的竞争型适配体生物传感器的性能，并确定对OTA浓度检测的标准曲线，选择灵敏度更高差分脉冲伏安法(DPV)进行测试。结果如图7所示，随着在一定范围内OTA标准品溶液浓度的增大，传感器的输出电流逐渐增大。这表明随着OTA浓度增大，与电极表面的适配体特异性结合的OTA逐渐增多，使适配体与cDNA脱离离开电极表面，阻碍电子的传递。对OTA浓度标准曲线的建立，是根据OTA浓度的对数lgCOTA与电流差值△I进行线性拟合并求表达式，其中△I是以OTA零浓度对照组的电流峰值Ipa为基准与其他OTA浓度电流峰值Ip的差值，即ΔI＝|Ipa-Ip|。
如图8所示，拟合后的标准曲线方程为y＝15.28146+28.81179lgCOTA，线性回归系数R2＝0.99659，线性范围为0.5ng/mL～8ng/mL，通过空白实验测试数据的标准偏差计算的检测限为0.172ng/mL(S/N＝3)。
实施例4
(1)选择5个来自不同批次的利用实施例2方法制备的基于NPG的竞争型生物传感器，通过比较他们在DPV检测下零浓度OTA的电流峰值Ipa与4ng/mL OTA浓度电流峰值Ip的差值，即△I，进行重现性分析。
结果如图9所示，5个样品的电流的变化差值基本一致，其中△I最大为39.53μA，最小为31.23μA，标准偏差为3.23％(n＝3)，这表明构建的NPG竞争型生物传感器的重现性符合期望要求。
(2)选择4个保存时间段，在传感器制备完成后0天、5天、10天以及15天，比较DPV检测下零浓度OTA的电流峰值Ipa与4ng/mL OTA浓度电流峰值Ip的差值，即△I，进行稳定性分析。
结果如图10所示，刚制备完成的传感器检测效果最好，△I最大，为32.3μA，随着传感器保存时间的延长，可能由于电极表面的修饰层脱落或部分适配体失活，导致检测效果依次变弱，15天时的△I为21.5μA，标准偏差为4.92％(n＝3)，这表明构建的OTA/Apt/cDNA/NPG/SPCE的生物传感器的稳定性符合期望要求。
(3)利用同批次制备好的传感器分别对4ng/mL OTA、黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、T-2毒素以及展青霉素(PAT)进行DPV检测，后比较个物质电流峰值Ip与零浓度OTA的电流峰值Ipa差值，进行分析。
结果如图11所示，对OTA检测的△I最大为32.3μA，比其他物质的电流差值存在显著性差异，这表明OTA与适配体结合，使传感器表面发生明显变化，影响电子传输。因此构建的OTA/Apt/cDNA/NPG/SPCE的生物传感器的稳定性符合期望要求。
实施例5
将一定浓度的赭曲霉毒素A的标准溶液添加到红酒样品溶液中，配制成所需的OTA浓度的加标红酒样品，并用构建的适配体传感器对实际样品进行检测，将得到的检测数据与加标样品浓度进行对比分析，计算回收率。加标回收率计算公式为
式中M为回收率；A为检测值，ng/mL；B为加样量，ng/mL。
表3适配体传感器对OTA实际样品检测数据表
检测数据如表3所示，OTA的在实际样品检测中的回收率在99.65％～106.8％的范围内，标准偏差在3.05％～4.91％的范围内，这表明该传感器能够在实际样品检测中能够准确检测出目标物，并且能够在0.5～8ng/mL的低浓度范围内进行检测，拥有良好的回收率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种修饰丝网印刷电极，其特征在于，包括丝网印刷基底电极，固定在所述丝网印刷基底电极的工作电极区域表面的纳米多孔金修饰层，以及与所述纳米多孔金修饰层通过Au-S键键合的赭曲霉毒素的适配体互补链。
2.根据权利要求1所述修饰丝网印刷电极，其特征在于，当所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素A时，所述赭曲霉毒素的适配体互补链的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.权利要求1或2所述修饰丝网印刷电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将赭曲霉毒素的适配体中的二硫键还原为巯基后，涂覆在固定有纳米多孔金修饰层的丝网印刷电极的工作电极区域，孵育一定时间后封闭活性位点，得所述丝网印刷电极。
4.权利要求1或2所述修饰丝网印刷电极在制备赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器中的应用。
5.一种赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器，其特征在于，包括权利要求1或2所述修饰丝网印刷电极，且赭曲霉毒素的适配体互补链上杂交有赭曲霉毒素的适配体链。
6.根据权利要求5所述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器，其特征在于，当所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素A时，所述赭曲霉毒素的适配体链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
7.权利要求5或6所述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将赭曲霉毒素的适配体链涂覆到权利要求1或2所述修饰丝网印刷电极的工作电极区域，孵育一定时间后得所述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器。
8.权利要求1或2所述修饰丝网印刷电极或权利要求5或6所述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器在检测赭曲霉毒素中的应用。
9.一种检测赭曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测样品的溶液涂覆到权利要求5或6所述赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器的工作电极区域，孵育后采集电流数据，将待测样品的溶液的电流数据带入预定的标准曲线，得待测样品的溶液中赭曲霉毒素的含量，所述预定的标准曲线为赭曲霉毒素的浓度对数值与对应的电流峰值的差值之间的线性拟合曲线。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述预定的标准曲线的线性范围为0.5ng/mL～8ng/mL。
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