CN108344787A - 检测afb1的免标记便携式适配体传感器的制备方法 - Google Patents

检测afb1的免标记便携式适配体传感器的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108344787A
CN108344787A CN201711269351.2A CN201711269351A CN108344787A CN 108344787 A CN108344787 A CN 108344787A CN 201711269351 A CN201711269351 A CN 201711269351A CN 108344787 A CN108344787 A CN 108344787A
Authority
CN
China
Prior art keywords
preparation
afb1
aptamer
label
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711269351.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108344787B (zh
Inventor
王成全
任婵婵
钱静
王坤
黄星奕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Priority to CN201711269351.2A priority Critical patent/CN108344787B/zh
Publication of CN108344787A publication Critical patent/CN108344787A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108344787B publication Critical patent/CN108344787B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)

Abstract

本发明提供了检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，属于电化学分析领域。包括如下步骤：磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4)的制备；金包四氧化三铁核‑壳结构磁性纳米粒子(Fe3O4@Au)的制备；核酸适配体修饰的Fe3O4@Au纳米生物探针的制备；丝网印刷电极的预处理；免标记便携式适配体传感器的构建；电化学交流阻抗法检测AFB1。本发明采用核酸适配体修饰的磁性壳核材料Fe3O4@Au对丝网印刷电极表面进行修饰，借助外加磁场作用将材料快速修饰在电极表面，操作简单，用时短；利用Au‑S键可更多、更牢固的将巯基化的适配体固定在电极表面，有效提高传感器的灵敏度。具有制备工艺简单，耗时短，试剂用量少，检测成本低廉等特点。

Description

检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法
技术领域
本发明属于电化学分析领域，特点在于通过免标记的方法，实现对黄曲霉毒素B1的快速、灵敏检测。在技术上涉及纳米材料科学和生物传感等领域。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AF)是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类代谢产物，目前已分离鉴定出了20余种，主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、M1(AFM1)、M2(AFM2)等亚型。其中，AFB1是目前发现的毒性最强的霉菌毒素，具有强烈的致癌、致畸、致突变性，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍，致癌性是二甲基亚硝胺的75倍。因此，世界很多国家和组织都对农产品及食品中黄曲霉毒素制定了最高限量标准。联合国粮农组织规定食品中黄曲霉毒素最大允许量为总量(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)应小于15μg/kg(FAO，1995)。欧盟提出人类食用的花生及制品中AFB1的最大量不能超过2μg/kg(EC1881/2006)。我国对各类农产品和食品中黄曲霉毒素的含量也制定了一系列的限量标准(GB2761-2011)，其中，在花生、玉米及其制品中黄曲霉毒素的最大限量为20μg/kg，其他调味剂和发酵食品中的最大限量为5μg/kg，婴儿乳制品中最大限量为0.5μg/kg。
鉴于黄曲霉毒素的剧毒性和广泛存在性，发展和建立高效快速检测AFB1的方法具有非常重要的意义。薄膜层析法和液相色谱法是目前大部分检测机构都在使用的方法，这些方法可以实现灵敏度与特异性检测的要求，但由于其较长的检测周期，复杂的操作程序，而且需要较大的试剂用量，在很大程度上限制了这些方法的使用。免疫化学分析方法，包括放射免疫分析方法，酶联免疫吸附法和免疫层析法，这些方法也能够实现对黄曲霉毒素的定量检测，免疫分析法与传统的高效液相色谱法相比较，更加安全可靠，灵敏度也更高，但在检测过程中需要大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体。然而，由于抗体的制备过程比较复杂，合成价格昂贵，且抗体稳定性差，易受外界环境影响而变性，不易存储等，使得免疫分析方法的推广应用受到限制。核酸适配体(apt)作为可替代抗体的一种新型识别元件，由一段寡核苷酸序列构成，它能与多种目标物高特异性、高选择性的结合。与抗体相比，核酸适配体不仅具有合成简单、易于储存和运输、化学性质稳定和方便再生等优点，还能够用氨基，巯基，荧光基团，生物素和酶等进行功能化，与电化学检测方法相结合，实现生物传感器便携化，而且操作简单，成本低。
本发明以金包四氧化三铁结构磁性纳米粒子(Fe3O4@Au NPs)修饰的丝网印刷碳电极(SPCE)为传感平台，以核酸适配体为识别元件，构建了一种快速、灵敏检测AFB1的免标记便携式适配体传感器；通过建立了AFB1标准品浓度与电化学阻抗值之间的对应关系，实现简单、灵敏、快速检测AFB1的目的。
发明内容
本发明旨在提供一种免标记、操作简单、灵敏度高、选择性好等优点为一体的便携式适配体传感器。所构建的传感器制备工艺简单，检测成本低，可以实现灵敏、快速定量检测AFB1的目的。
所采用的方案概括为：在Fe3O4@Au NPs上修饰aptamer作为纳米生物探针(Fe3O4@Au-apt)，以SPCE为载体，借助外加磁铁的磁性作用将Fe3O4@Au-apt修饰在工作电极表面，创建免标记的电化学传感平台。首先，在Fe3O4@Au NPs修饰的电极表面偶联巯基修饰的AFB1的核酸适配体(基于Au-S的共价键合作用)。然后,Fe3O4@Au-apt纳米粒子能够通过固定在SPCE背面的磁铁的吸附作用，便携并紧固在电极表面。当加入目标物AFB1标准品，核酸适配体与AFB1的特异性结合，阻碍了电子在电极表面和氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-之间的有效传递，使得修饰电极的电化学交流阻抗显著增加。通过建立电子转移阻抗(Ret)与AFB1浓度之间的对应关系，达到对含AFB1的实际样品进行定量检测的目的。
本发明是通过如下具体技术方案实现的：
一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1、磁性纳米粒子Fe3O4的制备；
步骤2、核-壳结构磁性纳米粒子Fe3O4@Au NPs的制备；
步骤3、核酸适配体修饰的Fe3O4@Au纳米生物探针(Fe3O4@Au-apt)的制备；
步骤4、丝网印刷电极(SPCE)的预处理；
步骤5、免标记便携式适配体传感器的构建；
步骤6、电化学交流阻抗法检测AFB1。
步骤1中，磁性纳米粒子Fe3O4NPs的制备方法为：将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇(EG)和一缩乙二醇(DEG)的混合溶液中，超声反应30min；然后，依次加入乙酸钠和聚乙二醇(PEG)；搅拌反应30min后，混合液被移至反应釜中，200℃反应3h；反应结束后冷却至室温，用乙醇和水洗涤数次，重新分散于50mL乙醇中，超声5min，备用。
步骤1中，所述FeCl3·6H2O、EG、DEG、乙酸钠和PEG的摩尔比为1:90:53:10:1。
步骤2中，Fe3O4@Au的制备方法为：取步骤1中制备的Fe3O4磁性纳米粒子分散液，加入丙氨基三乙氧基硅烷(APTS)室温下机械搅拌反应7h，磁分离并用乙醇洗涤数次，将产物重新分散于40mL水中；将HAuCl4溶液(1wt％)逐滴加入到上述分散液中，于100℃温度下回流反应30min，后逐滴加入柠檬酸钠溶液(1wt％)，于100℃温度下回流反应3h后，将所得产物磁分离并水洗数次，重新分散于40mL水中备用。
步骤2中，所述Fe3O4纳米磁性纳米粒子分散液和APTS的体积比为100:1；所用HAuCl4溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为1:2。
步骤3中，核酸适配体修饰的Fe3O4@Au纳米生物探针(Fe3O4@Au-apt)的制备方法为：首先取经过三(2-乙羧基)磷盐酸盐(TCEP)活化的新鲜AFB1(10μM)核酸适配体溶液加入到Fe3O4@Au NPs(1mg mL–1)的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 7.4)分散物中，37℃下振荡反应1h。采用外加磁场分离的方法，将磁控产物用Tris-HCl缓冲溶液反复洗涤数次以去除未反应的核酸适配体。再将其重新分散在2μM 6-巯基己醇(MCH)的溶液，37℃条件下反应1h，得到MCH封闭的纳米生物探针(Fe3O4@Au-apt)，用10mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤数次去除未反应的MCH，将其重新分散在5mL的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 7.4)中，4℃保存备用。
步骤3中，所述核酸适配体溶液、Fe3O4@Au分散液和MCH溶液的体积比为1：70：70。
步骤3中，所用AFB1的核酸适配体序列为：5′-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGTGTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-SH-3′。
步骤4中，SPCE预处理方法为：在50μL含有0.5M H2SO4和0.1M KCl的溶液中对SPCE进行循环伏安扫描，扫描范围为-0.2～1.5V，扫描速率为100mV s-1，扫描时间为5min，之后用二次水淋洗，氮气吹干，备用。
步骤5中，免标记便携式适配体传感器的构建步骤为：将步骤4中预处理过的SPCE的工作电极底部固定磁铁，并在其工作电极表面涂布20μL步骤3中制备的Fe3O4@Au-apt纳米生物探针的分散液，移除上层溶液，制得用于AFB1检测的适配体传感器(SPCE-Fe3O4@Au-apt)；
步骤6中，所述电化学适配体传感器检测AFB1的步骤如下：分别取10μL不同浓度的AFB1标准溶液滴涂在所制备的电化学适配体传感器的界面上，在37℃条件下孵育60min，之后将传感器界面用10mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗；然后用一个带孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜覆盖SPCE，构建一个微型电解槽。30μL阻抗液滴涂在SPCE表面的PDMS膜的孔洞中构建三电极体系，扫描电化学阻抗图谱和循环伏安曲线，根据阻抗值与对应的AFB1标准样浓度建立标准曲线。
步骤6中，所述AFB1标准溶液浓度依次是0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.5，1，5，10，30，50，100ng mL-1；所述阻抗液包括：a.0.1M磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.4；b.5mM[Fe(CN)6]3-/4-；c.0.1M KCl。
步骤6中，所用Fe3O4@Au-apt的浓度为1mg mL–1。
步骤6中，所使用的DNA储存液为10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，含有1.0mMEDTA)，适配体与目标物结合缓冲溶液为10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，含有10mM NaCl和5.0mM MgCl2)。步骤5中，所使用的Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM，pH＝7.4。
有益效果：
本发明利用外加磁场将Fe3O4@Au-apt纳米生物探针修饰在丝网印刷电极表面构建了免标记电化学阻抗适配体传感平台，运用核酸适配体对AFB1的特异性识别作用，实现了对AFB1的免标记灵敏检测，其特色和优点表述如下：
(1)本发明采用一次性的SPCE作为基体来构建传感器，有效避免了繁琐的电极预处理程序，节省传感器制备时间。
(2)本发明采用适配体修饰的Fe3O4@Au NPs对电极表面进行修饰，一方面，借助外加磁场将材料修饰在电极表面，简单灵活；另一方面，利用Au-S键可更多、更牢固的将巯基化的适配体固定在电极表面，有效提高传感器的灵敏度。
(3)本发明所提出的传感模式实现了对AFB1的灵敏检测，在20pg mL-1～50ng mL-1的浓度区间内，AFB1浓度的对数值(lgcAFB1)与Ret的增加值(△Ret)呈现良好的线性关系，检出限可达15pg mL-1。
(4)与传统检测方法相比，本发明中所提出的AFB1的阻抗型传感平台具有制备工艺简单，检测过程耗时短，试剂用量少，检测成本低廉等特点。
附图说明
图1中，A为在不同AFB1浓度下的阻抗图谱；B为AFB1浓度与△Ret值的对应关系图，插图为标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：
磁性纳米粒子Fe3O4的制备
(1)磁性纳米粒子Fe3O4 NPs的制备方法为：将2mmol的FeCl3·6H2O溶解在10mL乙二醇(EG)和10mL一缩乙二醇(DEG)的混合溶液中，超声反应30min；然后，依次加入20mmol乙酸钠和2mmol聚乙二醇(PEG)；搅拌反应30min，混合物被移至反应釜中，200℃反应3h；反应结束冷却至室温，用乙醇和水洗涤数次，重新分散于50mL乙醇中，超声5min，备用。
实施例2：
磁性核壳纳米粒子Fe3O4@Au NPs的制备
(2)磁性核壳纳米粒子Fe3O4@Au NPs的制备方法为：取步骤1中Fe3O4磁性纳米粒子分散液40mL，加入400μL丙氨基三乙氧基硅烷(APTS)室温条件下机械搅拌反应7h，磁分离并用乙醇洗涤数次，将产物重新分散于40mL水中；将4mL的HAuCl4溶液(1wt％)逐滴加入到上述分散液中，于100℃温度下回流反应30min，后逐滴加入8mL柠檬酸钠溶液(1wt％)，于100℃温度下回流反应3h后，将所得产物磁分离并水洗数次，重新分散于40mL水中备用。
实施例3：
核酸适配体修饰的Fe3O4@Au纳米生物探针(Fe3O4@Au-apt)的制备
(3)核酸适配体修饰的Fe3O4@Au纳米生物探针的制备方法为：首先取500μL经过三(2-乙羧基)膦盐酸盐(TCEP)活化的新鲜AFB1(10μM)核酸适配体溶液加入到35mL Fe3O4@AuNPs(1mg mL–1)的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 7.4)分散物中，37℃下振荡反应1h。采用外加磁场分离的方法，将磁控产物用Tris-HCl缓冲溶液反复洗涤数次以去除未反应的aptamer。再将其重新分散在35mL2μM 6-巯基己醇(MCH)的溶液，37℃条件下反应1h，得到MCH封闭的纳米生物探针(Fe3O4@Au-apt)，用10mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤数次去除未反应的MCH，将其重新分散在35mL的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 7.4)中，4℃保存备用。
实施例4：
SPCE预处理
(4)对SPCE进行清洗：处理方法是在50μL含有0.5M H2SO4和0.1M KCl的溶液中对SPCE进行循环伏安扫描，扫描范围为-0.2～1.5V，扫描速率为100mV s-1，扫描时间为5min，之后用二次水淋洗，氮气吹干，备用。
实施例5：
免标记便携式适配体传感器的构建
(5)免标记便携式适配体传感器的构建：将步骤4中预处理过的SPCE的工作电极底部固定磁铁，并在其工作电极表面涂布20μL步骤3中制备的Fe3O4@Au-apt纳米生物探针的分散液，移除上层溶液，制得用于AFB1检测的适配体传感器(SPCE-Fe3O4@Au-apt)。
实施例6：
电化学交流阻抗法检测AFB1
用一个带孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜覆盖SPCE，构建一个微型电解槽。将30μL阻抗液滴涂在SPCE表面的PDMS膜的孔洞中构建三电极体系，扫描电化学阻抗图谱和循环伏安曲线，根据阻抗值与对应的AFB1标准样浓度建立标准曲线。
对AFB1标准品进行检测，建立标准曲线：取10μL不同浓度的AFB1标准溶液滴涂在(5)的传感界面上，标准溶液浓度依次是0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.5，1，5，10，30，50，100ng mL-1，在37℃条件下孵化60 min，之后将修饰电极用Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干；将修饰电极置于5μL 5 mM阻抗液中，阻抗液包含0.1 M磷酸盐缓冲溶液(PB，pH7.4)，5 mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1 M KCl，扫描电化学阻抗图谱，根据阻抗值与对应的AFB1标准样浓度建立标准曲线。图1中，图A为在不同AFB1浓度(从a到l依次为：0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.5，1，5，10，30，50，100 ng mL-1)下的阻抗图谱，从图中可以看出，随着浓度的增大阻抗图谱中所呈现的半圆弧也逐渐增大，表明AFB1阻碍了传感体系中的电荷传递；图B为AFB1浓度与△Ret值的对应关系图，插图为标准曲线图，可以看出在20 pg mL-1～50 ng mL-1的浓度范围内AFB1浓度的对数与△Ret值呈现良好的线性关系。
上述实验所涉及的：
1.适配体序列：5′-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCGCTA GGC CCA CA-SH-3′；
2.AFB1检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的AFB1进行反应后，扫描得到其交流阻抗图谱，根据不同AFB1浓度下得到的阻抗数据建立标准曲线。
3.本发明中所用的Tris-HCl缓冲溶液pH均为7.4。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法
<140> 2017112693512
<141> 2017-12-05
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 核苷酸(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50

Claims (10)

1.一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
步骤1、磁性纳米粒子Fe3O4的制备；
步骤2、金包四氧化三铁核-壳结构磁性纳米粒子(Fe3O4@Au NPs)的制备；
步骤3、核酸适配体修饰的Fe3O4@Au纳米生物探针(Fe3O4@Au-apt)的制备；
步骤4、丝网印刷电极(SPCE)的预处理；
步骤5、免标记便携式适配体传感器的构建；
步骤6、电化学交流阻抗法检测AFB1。
2.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤1中，磁性纳米材料Fe3O4的制备方法为：将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇(EG)和一缩乙二醇(DEG)的混合溶液中，超声反应30min；然后，依次加入乙酸钠和聚乙二醇(PEG)；搅拌反应30min后，混合液被移至反应釜中，200℃反应3h；反应结束后冷却至室温，用乙醇和水洗涤数次，重新分散于50mL乙醇中，超声5min，备用；
步骤1中，所述FeCl3·6H2O、EG、DEG、乙酸钠和PEG的摩尔比为1:90:53:10:1。
3.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤2中，Fe3O4@Au的制备方法为：取步骤1中制备的Fe3O4磁性纳米粒子分散液，加入丙氨基三乙氧基硅烷(APTS)室温下机械搅拌反应7h，磁分离并用乙醇洗涤数次，将产物重新分散于40mL水中；将HAuCl4溶液(1wt％)逐滴加入到上述分散液中，于100℃温度下回流反应30min，后逐滴加入柠檬酸钠溶液(1wt％)，于100℃温度下回流反应3h后，将所得产物磁分离并水洗数次，重新分散于40mL水中备用；
步骤2中，所述Fe3O4纳米粒子分散液和APTS的体积比为100:1；所用HAuCl4溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为1:2。
4.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤3中，核酸适配体修饰的Fe3O4@Au纳米生物探针的制备方法为：首先取经过三(2-乙羧基)磷盐酸盐(TCEP)活化的新鲜AFB1(10μM)核酸适配体溶液加入到Fe3O4@Au NPs(1mg mL–1)的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 7.4)分散物中，37℃下振荡反应6h；采用外加磁场分离的方法，将磁控产物用Tris-HCl缓冲溶液反复洗涤数次以去除未反应的aptamer；再将其重新分散在2μM 6-巯基己醇(MCH)的溶液，37℃条件下反应1h，得到MCH封闭的纳米生物探针(Fe3O4@Au-apt)，用10 mM Tris-HCl缓冲溶液洗涤数次去除未反应的MCH，将其重新分散在5mL的Tris-HCl缓冲溶液(50mM，pH 7.4)中，4℃保存备用；
步骤3中，所述核酸适配体溶液、Fe3O4@Au分散液和MCH溶液的体积比为1：50：50。
5.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤3中，所用AFB1的核酸适配体序列为：5′-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGTGTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-SH-3′。
6.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤4中，SPCE预处理方法为：在50μL含有0.5M H2SO4和0.1M KCl的溶液中对SPCE进行循环伏安扫描，扫描范围为-0.2～1.5V，扫描速率为100mV s-1，扫描时间为5min，之后用二次水淋洗，氮气吹干，备用。
7.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤5中，免标记便携式适配体传感器的构建步骤为：将步骤4中预处理过的SPCE的工作电极底部固定磁铁，并在其工作电极表面涂布20μL步骤3中制备的Fe3O4@Au-apt纳米生物探针的分散液，移除上层溶液，制得用于AFB1检测的适配体传感器(SPCE-Fe3O4@Au-apt)。
8.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤6中，所述电化学适配体传感器检测AFB1的步骤如下：分别取10μL不同浓度的AFB1标准溶液滴涂在所制备的电化学适配体传感器的界面上，在37℃条件下孵育60min，之后将传感器界面用10mM pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗；将SPCE的三电极体系置于50μL阻抗液，扫描电化学阻抗图谱和循环伏安曲线，根据阻抗值与对应的AFB1标准样浓度建立标准曲线。
9.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，其特征在于步骤6中，所述AFB1标准溶液浓度依次是0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.5，1，5，10，30，50，100ng mL-1；所述阻抗液包括：a.0.1M磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.4；b.5mM[Fe(CN)6]3-/4-；c.0.1M KCl。
10.根据权利要求1所述的一种检测AFB1的免标记便携式适配体传感器的制备方法，
其特征在于步骤6中，所用Fe3O4@Au-apt的浓度为1mg mL–1；
步骤6中，所使用的DNA储存液为10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，含有1.0mM EDTA)，适配体与目标物结合缓冲溶液为10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4，含有10mM NaCl和5.0mMMgCl2)；步骤5中，所使用的Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM，pH＝7.4。
CN201711269351.2A 2017-12-05 2017-12-05 检测afb1的免标记便携式适配体传感器的制备方法 Active CN108344787B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711269351.2A CN108344787B (zh) 2017-12-05 2017-12-05 检测afb1的免标记便携式适配体传感器的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711269351.2A CN108344787B (zh) 2017-12-05 2017-12-05 检测afb1的免标记便携式适配体传感器的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108344787A true CN108344787A (zh) 2018-07-31
CN108344787B CN108344787B (zh) 2020-08-28

Family

ID=62963080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711269351.2A Active CN108344787B (zh) 2017-12-05 2017-12-05 检测afb1的免标记便携式适配体传感器的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108344787B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109870497A (zh) * 2019-03-25 2019-06-11 天津科技大学 一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法
CN110514711A (zh) * 2019-08-17 2019-11-29 山东理工大学 基于自清洁电极界面的可再生适配体传感器的制备方法
CN111999502A (zh) * 2020-08-24 2020-11-27 湖南农业大学 基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及方法
CN112179962A (zh) * 2020-09-29 2021-01-05 陕西科技大学 一种基于铁离子探针-纳米金/玻碳电极修饰电极的黄曲霉毒素的检测方法
CN112432983A (zh) * 2020-12-09 2021-03-02 杭州电子科技大学 一种检测四环素用适配体传感器及其制备方法、应用
CN114674904A (zh) * 2022-02-23 2022-06-28 江苏大学 一种基于磁控MoS2纳米片的免标记电化学适配体传感平台的构建方法
CN116381018A (zh) * 2023-04-06 2023-07-04 华北理工大学 一种修饰丝网印刷电极、赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器和检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013157917A2 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Institut Penyelidikan Dan Kemajuan Pertanian Malaysia (Mardi) A biosensor and preparation method thereof
CN105203756A (zh) * 2015-09-21 2015-12-30 江苏大学 快速磁分离电化学免疫传感及检测金黄色葡萄球菌的方法
CN105424777A (zh) * 2015-12-07 2016-03-23 江苏大学 一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法
CN106324057A (zh) * 2016-08-01 2017-01-11 红河学院 一种免疫传感器对黄曲霉毒素的检测方法
CN106706733A (zh) * 2016-11-14 2017-05-24 江苏大学 一种检测伏马毒素b1的电化学适配体传感器的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013157917A2 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Institut Penyelidikan Dan Kemajuan Pertanian Malaysia (Mardi) A biosensor and preparation method thereof
CN105203756A (zh) * 2015-09-21 2015-12-30 江苏大学 快速磁分离电化学免疫传感及检测金黄色葡萄球菌的方法
CN105424777A (zh) * 2015-12-07 2016-03-23 江苏大学 一种通过磁控电化学适配体传感器同时检测两种霉菌毒素的方法
CN106324057A (zh) * 2016-08-01 2017-01-11 红河学院 一种免疫传感器对黄曲霉毒素的检测方法
CN106706733A (zh) * 2016-11-14 2017-05-24 江苏大学 一种检测伏马毒素b1的电化学适配体传感器的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENGQUAN WANG,ET AL.: "Fabrication of magnetically assembled aptasensing device for label-free determination of aflatoxin B1 based on EIS", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
王成全: "基于磁控适配体传感体系的农产品中典型霉菌毒素检测研究", 《江苏大学博士学位论文》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109870497A (zh) * 2019-03-25 2019-06-11 天津科技大学 一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法
CN109870497B (zh) * 2019-03-25 2021-07-09 天津科技大学 一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法
CN110514711A (zh) * 2019-08-17 2019-11-29 山东理工大学 基于自清洁电极界面的可再生适配体传感器的制备方法
CN110514711B (zh) * 2019-08-17 2021-12-21 山东理工大学 基于自清洁电极界面的可再生适配体传感器的制备方法
CN111999502A (zh) * 2020-08-24 2020-11-27 湖南农业大学 基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及方法
CN111999502B (zh) * 2020-08-24 2023-08-04 湖南农业大学 基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及方法
CN112179962A (zh) * 2020-09-29 2021-01-05 陕西科技大学 一种基于铁离子探针-纳米金/玻碳电极修饰电极的黄曲霉毒素的检测方法
CN112432983A (zh) * 2020-12-09 2021-03-02 杭州电子科技大学 一种检测四环素用适配体传感器及其制备方法、应用
CN114674904A (zh) * 2022-02-23 2022-06-28 江苏大学 一种基于磁控MoS2纳米片的免标记电化学适配体传感平台的构建方法
CN116381018A (zh) * 2023-04-06 2023-07-04 华北理工大学 一种修饰丝网印刷电极、赭曲霉毒素适配体竞争型生物传感器和检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108344787B (zh) 2020-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108344787A (zh) 检测afb1的免标记便携式适配体传感器的制备方法
CN103512931B (zh) 一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素a的方法
Siangproh et al. Nanoparticle-based electrochemical detection in conventional and miniaturized systems and their bioanalytical applications: A review
CN109870497B (zh) 一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法
AU2002321531B2 (en) Methods for producing highly sensitive potentiometric sensors
US8895258B2 (en) Device for measuring proteins using biosensor
CN106706733A (zh) 一种检测伏马毒素b1的电化学适配体传感器的制备方法
CN111551608A (zh) 一种同时检测啶虫脒和马拉硫磷的方法
CN103091302A (zh) 基于3D纸芯片电致化学发光DNA传感器的制备并用于同时检测Hg2+、Ag+
CN108051491B (zh) 一种用于检测lag-3蛋白的电化学免疫传感器
CN110823980A (zh) 一种基于类过氧化酶催化银沉积检测gpc3的方法
CN112505119B (zh) 检测黄曲霉素b1的电化学传感器、检测方法和制备方法
Wang et al. Electrochemical immunosensor based on AuNPs/Zn/Ni-ZIF-8-800@ graphene for rapid detection of aflatoxin B1 in peanut oil
CN105259223A (zh) 一种基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法及应用
CN107132260A (zh) 一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器
CN114813872A (zh) 一种基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的电化学/比色双模式检测GP73的方法
CN109613244A (zh) 一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法及应用
CN109211989A (zh) 一种用于检测阿特拉津的电化学适配体传感器及其制备和检测方法
CN109085225A (zh) 一种一步沉积法修饰磁电极的蛋白质电化学印迹传感器的制备方法
CN115586229A (zh) 基于MXene纳米材料的乙基葡萄糖醛酸苷电化学生物传感器及其制备方法和检测方法
CN113588752A (zh) 一种电致化学发光适配体传感器的制备方法及应用
CN112098494B (zh) 一种检测作物中cp4-epsps蛋白的电化学免疫传感器
CN109342532A (zh) 一种负镍碳化层包覆四氧化三铁的核壳纳米棒及其制备方法和应用
CN106338539B (zh) 基于多腺嘌呤的dna捕获探针、生物传感器及其检测方法
JP4744910B2 (ja) バイオセンサ、マルチバイオセンサ及びこれを用いた多成分測定システム

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant