CN112505119B - 检测黄曲霉素b1的电化学传感器、检测方法和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测黄曲霉素B1的电化学传感器、检测方法和制备,该电化学传感器包括两种相互结合的探针,分别为探针A:包括预处理好的金电极,装配在金电极上带有巯基的单链DNA链、末端带生物素的AFB1适配体;其中单链DNA链与AFB1适配体完全杂交;探针B:链霉亲和素功能化的钯纳米粒子‑卟啉化金属有机复合物。本发明将具有高灵敏度、较低检测成本、使用方便等优点的电化学分析技术和具有分子间特异性结合的适配体传感器结合起来,通过用钯纳米粒子/卟啉化金属有机框架材料为信号标记物放大检测信号,消除了电化学检测过程中所引起的电化学信号发生变化的原因不确定的问题,同时检测限低,实现了AFB1的超灵敏检测。
Description
技术领域
本发明属于电化学传感分析技术领域,具体涉及一种检测黄曲霉素B1的电化学传感器、检测方法和制备。
背景技术
黄曲霉素(Ochratoxins,OTs)是人类最早发现的真菌毒素之一,是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物,它们存在于各种动植物、土壤中,特别是容易污染玉米、花生、小麦等粮油产品,也容易随着饲料摄入进入动物体内,进而被人通过食物摄入,对人类的身体健康危害极大。2017年,黄曲霉毒素被世界卫生组织列为一类致癌物。黄曲霉素是结构相似的系列化合物,其中毒性最强、最常见的是黄曲霉素B1(AFB1)。AFB1,分子式为C20H17O6,分子量317,是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,结构中含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。AFB1具有强烈的毒性,其急性毒性强于氰化钾和砒霜,慢性毒性可导致肝出血甚至癌变,是已知化学物质中致癌性最强的一种。国家标准中明确规定,对于玉米、花生等易受AFB1污染的食品中允许的最大AFB1含量为20μg/kg。因此,AFB1的鉴定和定量检测在环境分析中具有重要的意义。
目前粮食作物中的AFB1的检测技术大多采用基于实验室分析的高效液相色谱、气相色谱法、液相色谱-质谱及气相色谱-质谱联机检测方法,样品前处理过程复杂、耗时长,需要专业技术人员操作,检测费用高。
发明内容
针对上述问题,本发明提出一种检测黄曲霉素B1的电化学传感器、检测方法和制备。
实现上述技术目的,达到上述技术效果,本发明通过以下技术方案实现:
一种用于检测黄曲霉素B1的电化学传感器,包括两种相互结合的探针,分别为:
探针A:包括预处理好的金电极,装配在金电极上带有巯基的单链DNA链、末端带生物素的AFB1适配体;其中单链DNA链与AFB1适配体完全杂交
探针B:链霉亲和素功能化的钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物。
作为本发明的进一步改进,所述探针B中的钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物的具有纺锤体结构的配合物。
本发明还提供了一种黄曲霉素B1的电化学检测方法,通过应用以上所述的一种用于检测黄曲霉素B1的电化学传感器进行检测,包括以下步骤:
步骤一:将AFB1溶液滴加在探针A表面,经第一次温育处理后,再将探针B滴加在探针A表面,经第二次温育处理后,制备待检测电极;
步骤二:将待检测电极用作工作电极进行电化学测试,根据所获得的电化学信号推算AFB1溶液中AFB1的浓度。
作为本发明的进一步改进,包括绘制标准浓度曲线和测试样品AFB1溶液的浓度,
所述绘制标准浓度曲线为多次重复步骤一和步骤二,单次对具有不同浓度的标准AFB1溶液进行测试,并绘制标准浓度曲线,获得标准浓度曲线所对应的线性关系式;
所述测试样品AFB1溶液的浓度,包括采用AFB1溶液完成所述步骤一和所述步骤二的操作,获得电化学信号值,并基于所获得的线性关系式计算样品AFB1溶液中所含的AFB1的浓度。
作为本发明的进一步改进,所述测试样品AFB1溶液的浓度时所使用的探针A和所述绘制标准浓度曲线时所使用相同的探针A具有相同的结构。
作为本发明的进一步改进,步骤一中,所述第一次温育处理的温度为310K,时间为1h;所述第二次温育处理的温度为310K,时间为1h。
作为本发明的进一步改进,采用差分脉冲伏安法进行电化学测试,电伏的扫描范围为-0.6~0.1V。
本发明还提供了一种如以上所述的一种用于检测黄曲霉素B1的电化学传感器的制备方法,其特征在于:
所述探针A的制备包括依次在金电极上装配带有巯基的单链DNA链、末端带生物素的AFB1适配体;
所述探针B的制备包括先制备钯纳米粒子/卟啉化金属有机复合物,之后将链霉亲和素与钯纳米粒子/卟啉化金属有机复合物复合,得到链霉亲和素功能化钯纳米粒子/卟啉化金属有机复合物。本发明的有益效果:本发明将具有高灵敏度、较低检测成本、使用方便等优点的电化学分析技术和具有分子间特异性结合的适配体传感器结合起来,构建了AFB1电化学适配体传感器,并用钯纳米粒子/卟啉化金属有机框架材料为信号标记物放大检测信号,消除了电化学检测过程中所引起的电化学信号发生变化的原因不确定的问题,同时检测限低,实现了AFB1的超灵敏检测。
附图说明
图1所示的采用不同的材料对于氧还原电化学响应的差分脉冲伏安图,(a)钯纳米粒子修饰的金电极,(b)Fe(III)TCPP修饰的金电极,(c)钯纳米粒子/卟啉化金属修饰的金电极,(d)钯纳米粒子/卟啉化金属修饰的金电极在氮气饱和下的差分脉冲伏安图(对照组);
图2适配体传感器对不同AFB1浓度(0.00001,0.0001,0.001,0.01,0.1,1ng/mL)的差分脉冲伏安图;
图3为适配体传感器峰电流值与AFB1浓度对数值之间的线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
A电化学传感器的制备
A1探针A的制备
A1.1)金电极的预处理:
a、将直径为3mm金电极(GE)在食人鱼溶液中浸泡30min;
b、用0.3μm,0.05μm的Al2O3抛光粉对GE进行打磨,再用无水乙醇和超纯水分别超声清洗,得到处理好的洁净的金电极。
A1.2)带有巯基的单链捕获DNA在金电极上的固定:
用移液枪移取5μL 1μmol/L带有巯基的单链捕获DNA滴在步骤A1.1)处理好的GE表面,室温下温育12h,然后用0.01mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)淋洗电极,备用。
A1.3)末端带生物素的AFB1适配体在修饰电极上的固定:
吸取5μL 1mmol/L 6-巯基-1-己醇溶液滴在步骤A1.2)制备的电极表面,并在室温下温育1h,以降低非特异性吸附并且封堵未结合的位点,随后用0.01mol/L PBS淋洗电极。吸取5μL 1μmol/L AFB1适配体溶液滴加在电极表面,并在310K下温育1h,使得AFB1适配体能够与单链捕获DNA能够杂交完全,接着用缓冲溶液冲洗,得到制备好的AFB1适配体传感器,标记为探针A,保存于277K备用。
A2探针B的制备
A2.1)钯纳米粒子/卟啉化金属有机框架材料复合物的制备:
a、7mg ZrCl4和10mg meso-四(4-羧基苯基)卟吩氯化铁加入到50mL圆底烧瓶中,再加入10mL N,N-二甲基甲酰胺,超声溶解,随后再加入1mL甲酸,继续超声10min,然后将混合物在393K下反应回流16h,冷却至室温,产物离心后,用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇反复洗涤数次,得到产物卟啉化金属有机框架材料。
b、将1mL浓度为1mg/mL步骤A2.1a)制备的卟啉化金属有机框架材料溶液加到在50mL圆底烧瓶中,将0.2mmol的PdCl2和聚乙烯吡咯烷酮加入5mL乙二醇溶液中,随后,将配制好的乙二醇溶液加到上述的圆底烧瓶中,搅拌均匀;在混合物溶液中滴加氨水溶液,搅拌均匀后,将混合物溶液加到313K的10mL乙二醇溶液中,反应数分钟后,混合物溶液变黑,30min后,用丙酮、乙醇反复洗涤,干燥得到钯纳米粒子/卟啉化金属有机框架材料复合物。
A2.2)链霉亲和素功能化的信号探针(探针B)的制备:
将步骤A2.1)制备的1mg钯纳米粒子/卟啉化金属有机框架材料复合物加到1mL超纯水中,配制成1mg/mL钯纳米粒子/卟啉化金属有机框架材料复合物悬浮液,将100μL1mg/mL链霉亲和素溶液加入到上述配制好的复合物悬浮液中,277K下缓慢搅拌12h,然后离心和洗涤,得到链霉亲和素功能化的信号探针;最后,将所得到的产物重新分散在1mL 0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液中,即探针B,保存于277K备用。
B黄曲霉素B1浓度检测测试
B1检测方法
B1.1)AFB1标准溶液或样品溶液的温育:
将5μL不同浓度的AFB1标准溶液或稀释一定倍数的实际样品溶液滴加在步骤(A)制备的传感器表面,置于310K恒温培养箱中温育1h,用0.01mol/L PBS淋洗后备用。
B 1.2)链霉亲和素功能化的信号探针B和探针A的键合:
在步骤B1.1制备的探针A表面滴加5μL步骤A2制备的1mg/mL链霉亲和素功能化的信号探针,将其置于310K下温育1h,用0.01mol/L PBS淋洗待检测。
B 1.3)电化学检测方法的构建:
电化学检测AFB1体系采用经典三电极工作体系:工作电极、参比电极和对电极,工作电极为步骤B1.2制备的修饰电极,对电极为铂丝电极,参比电极为饱和甘汞电极,测定液为20mL 0.1mol/L PBS(pH 6.0)氧气饱和溶液,采用的方法为差分脉冲伏安法,扫面的范围为-0.6~0.1V,电位增量为4mV,脉冲振幅为50mV,脉冲宽度为50ms。
B2绘制标准浓度工作曲线
参照以上步骤,将不同已知浓度的AFB1温育液(0.00001,0.0001,0.001,0.01,0.1,1ng/mL),滴加在探针A的表面。温育液中的AFB1能够特异性的结合电极表面的有限的适配体,随后再加入信号探针B,其能够通过适配体末端的生物素与信号探针上的链霉亲和素特异性结合,从而将探针B固定到传感器表面,催化氧还原,产生电化学信号。还原峰峰电流值随着温育液AFB1浓度的增加而减小(图2)。之后根据所获得的数据构建关系式,如图3所示,还原峰峰电流值的降低与温育溶液中待测AFB1浓度对数在0.00001-1ng/L范围内成正比,线性相关系数为0.9952,该电化学适配体传感器的检出限为3ng/L。由此可以看出,采用本方法所制造的传感器检测AFB1的稳定性好,检测限低。
B3实际样品的检测
实际样品为两个发霉的玉米样品,将玉米样品粉碎至20目,取1g样品放入样品管中,加入抽提液5mL,震荡3分钟,1500rpm离心5分钟,取上清液,取上清液0.5mL备用。5μL稀释了一定倍数的样品滴到AFB1适配体传感器上,随后5μL 1mg/mL链霉亲和素功能化的信号探针滴在适配体表面。用该方法测得AFB1的溶度为0.038±0.0006ng/L和0.078±0.001ng/L,用回收率实验来鉴定所提出方法的可靠性,所得回收率均分别为97.9±1.8%和99.8±2.1%,说明此方法准确度很好,该方法能用于玉米样品中AFB1分析。
C探针特异性检测
另外,本发明对纳米粒子/卟啉化金属有机框的特异性进行了测试,其结果如图1所示。由图1可以看出,曲线c相比与曲线a和曲线b电流值有着大幅度的提高,且相对于对照组d中的无任何明显还原峰的情况,表明钯纳米粒子/卟啉化金属有机框架材料复合物对于氧还原有着特定的响应,同时具有较低的干扰和背景电流,能够显著的提高检测的灵敏度。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种用于检测黄曲霉素B1的电化学传感器,其特征在于:包括两种相互结合的探针,分别为探针A:包括预处理好的金电极,装配在金电极上带有巯基的单链DNA链、末端带生物素的AFB1适配体;其中单链DNA链与AFB1适配体完全杂交;
探针B:链霉亲和素功能化的钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物;
其中,探针B的制备步骤如下:
1)钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物的制备:
a、7mg ZrCl4和10mg meso-四(4-羧基苯基)卟吩氯化铁加入到50mL圆底烧瓶中,再加入10mL N,N-二甲基甲酰胺,超声溶解,随后再加入1mL甲酸,继续超声10min,然后将混合物在393K下反应回流16h,冷却至室温,产物离心后,用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇反复洗涤数次,得到产物卟啉化金属有机框架材料;
b、将1mL浓度为1mg/mL步骤a制备得到的卟啉化金属有机框架材料溶液加到在50mL圆底烧瓶中,将0.2mmol的PdCl2和聚乙烯吡咯烷酮加入5mL乙二醇溶液中,随后,将配制好的乙二醇溶液加到上述的圆底烧瓶中,搅拌均匀;在混合物溶液中滴加氨水溶液,搅拌均匀后,将混合物溶液加到313K的10mL乙二醇溶液中,反应数分钟后,混合物溶液变黑,30min后,用丙酮、乙醇反复洗涤,干燥得到钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物;
2)链霉亲和素功能化的信号探针的制备:
将步骤1)制备的1mg钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物加到1mL超纯水中,配制成1mg/mL钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物悬浮液,将100μL 1mg/mL链霉亲和素溶液加入到上述配制好的复合物悬浮液中,277K下缓慢搅拌12h,然后离心和洗涤,得到链霉亲和素功能化的信号探针;最后,将所得到的产物重新分散在1mL 0.01mol/LpH 7.4PBS缓冲溶液中,即探针B。
2.一种黄曲霉素B1的电化学检测方法,其特征在于,应用权利要求1所述的一种用于检测黄曲霉素B1的电化学传感器进行检测,包括以下步骤:
步骤一:将AFB1溶液滴加在探针A表面,经第一次温育处理后,再将探针B滴加在探针A表面,经第二次温育处理后,制备待检测电极;
步骤二:将待检测电极用作工作电极进行电化学测试,根据所获得的电化学信号推算AFB1溶液中AFB1的浓度。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉素B1的电化学检测方法,其特征在于:包括绘制标准浓度曲线和测试样品AFB1溶液的浓度,
所述绘制标准浓度曲线为多次重复步骤一和步骤二,单次对具有不同浓度的标准AFB1溶液进行测试,并绘制标准浓度曲线,获得标准浓度曲线所对应的线性关系式;
所述测试样品AFB1溶液的浓度,包括采用AFB1溶液完成所述步骤一和所述步骤二的操作,获得电化学信号值,并基于所获得的线性关系式计算样品AFB1溶液中所含的AFB1的浓度。
4.根据权利要求3所述的黄曲霉素B1的电化学检测方法,其特征在于:所述测试样品AFB1溶液的浓度时所使用的探针A和所述绘制标准浓度曲线时所使用相同的探针A具有相同的结构。
5.根据权利要求2-4任一项所述的黄曲霉素B1的电化学检测方法,其特征在于:步骤一中,所述第一次温育处理的温度为310K,时间为1h;所述第二次温育处理的温度为310K,时间为1h。
6.根据权利要求2-4任一项所述的黄曲霉素B1的电化学检测方法,其特征在于:采用差分脉冲伏安法进行电化学测试,电伏的扫描范围为-0.6~0.1V。
7.如权利要求1所述的一种用于检测黄曲霉素B1的电化学传感器的制备方法,其特征在于:
所述探针A的制备包括依次在金电极上装配带有巯基的单链DNA链、末端带生物素的AFB1适配体;
所述探针B的制备包括先制备钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物,之后将链霉亲和素与钯纳米粒子-卟啉化金属有机复合物复合,得到链霉亲和素功能化钯纳米粒子/卟啉化金属有机复合物。
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