JP6664737B2 - 金属イオンの検出方法、被検物質の検出方法、電極基板および検出キット - Google Patents

金属イオンの検出方法、被検物質の検出方法、電極基板および検出キット Download PDF

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Description

本発明は、金属イオンの検出方法、被検物質の検出方法、電極基板および検出キットに関する。
試料中に含まれる金属イオンまたはその他の被検物質を検出する方法として、例えば、電気化学測定法を用いる方法などがある（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１には、電気化学測定法を用いて銀イオンまたは被検物質を測定する方法が記載されている。特許文献１に記載の銀イオンの測定方法は、以下のように行なわれる。まず、銀イオンを含有する試料に含まれる銀イオンを作用電極上に電気化学的に析出させる。つぎに、析出した銀を電気化学的に酸化させる際の電流を測定することによって銀イオンの有無または濃度を測定する。また、特許文献１に記載の被検物質の測定方法は、以下のように行なわれる。まず、生物学的相互作用を利用して被検物質の量に対応する量の銀微粒子を作用電極の表面近傍に集積させる。つぎに、集積した銀微粒子を電気化学的に酸化し溶出させる。溶出した銀イオンを還元して作用電極表面に析出させる。その後、析出した銀を電気化学的に酸化させる際の電流を測定することによって被検物質の有無または濃度を検出する。
特開２００７−１９０１３０号公報
本発明は、高い検出感度で金属イオンまたは被検物質を検出することができる、金属イオンの検出方法および被検物質の検出方法、これらの方法に用いるための電極基板ならびに被検物質の検出キットを提供する。
本発明者らは、特許文献１に記載の方法では、後述するように、低濃度の銀イオンまたは被検物質を測定した場合、Ｓ／Ｎ比（シグナルとノイズの比の値）が小さく、シグナルと銀イオンまたは被検物質の濃度との関係において、直線性が悪い場合があることを見出した。また、本発明者らは、金属イオンを生成させるために酸化電位を印加した部分の面積よりも小さい面積を有する部分に還元電位を印加して金属を析出させた。その結果、本発明者らは、例えば、試料における金属イオンまたは被検物質の濃度が低い場合であっても、大きいＳ／Ｎ比が得られることを見出した。加えて、本発明者らは、例えば、試料における金属イオンまたは被検物質の濃度が低い場合であっても、シグナルと金属イオンまたは被検物質の濃度と関係において、優れた直線性が得られることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
本発明の１つの側面は、作用電極と対極とを含む電極基板の作用電極の表面に、被検物質と金属粒子とを含む複合体を固定化する固定化工程、
作用電極に酸化電位を印加することにより、作用電極に固定化された複合体中の金属粒子から金属イオンを生成させるイオン化工程、
作用電極における酸化電位を印加した部分の面積よりも小さい面積を有する部分に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を、還元電位を印加した部分の表面に析出させる析出工程、および
析出工程で析出させた金属に起因する電流、電圧または電荷を測定する測定工程、
を含む被検物質の検出方法を含む。
本発明の他の側面は、第１作用電極と第２作用電極と対極とを含む電極基板の第１作用電極上および第２作用電極の表面に、被検物質と金属粒子とを含む複合体を固定化する固定化工程、
第１作用電極および第２作用電極に酸化電位を印加することにより、第１作用電極および第２作用電極に固定化された複合体中の金属粒子から金属イオンを生成させるイオン化工程、
第２作用電極には還元電位を印加せず、第１作用電極に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を第１作用電極の表面に析出させる析出工程、および
析出工程で析出させる金属に起因する電流、電圧または電荷を測定する測定工程、
を含む被検物質の検出方法を含む。
本発明のさらに他の側面は、作用電極と対極とを含む電極基板の作用電極の表面に、金属イオンを含む試料を接触させ、作用電極に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を作用電極の表面に析出させる第１析出工程、
作用電極に酸化電位を印加することにより、第１析出工程で析出させた金属から金属イオンを生成させるイオン化工程、
作用電極において、酸化電位を印加した部分の面積よりも小さい面積を有する部分に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を、還元電位を印加した部分の表面に析出させる第２析出工程、および
析出工程で析出させる金属に起因する電流、電圧または電荷を測定し、電流、電圧または電荷を測定する測定工程、
を含む金属イオンの検出方法を含む。
本発明のさらに他の側面は、第１作用電極と第２作用電極と対極とを含む電極基板の作用電極の表面に、金属イオンを含む試料を接触させ、作用電極に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を第１作用電極および第２作用電極の表面に析出させる第１析出工程、
第１作用電極および第２作用電極に酸化電位を印加することにより、第１析出工程で析出させた金属から金属イオンを生成させるイオン化工程、
第２作用電極には還元電位を印加せず、第１作用電極に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を、第１作用電極の表面に析出させる第２析出工程、および
析出工程で析出させる金属に起因する電流、電圧または電荷を測定し、電流、電圧または電荷を測定する測定工程、
を含む金属イオンの検出方法を含む。
本発明の別の側面は、作用電極と、対極とを備え、作用電極が、金属イオンを生成させるための部分と、金属イオンの生成後に金属を析出させるための部分とを含み、金属イオンを生成させるための部分よりも金属イオンの生成後に金属を析出させるための部分が小さくなるように構成されている、前述した金属イオンの検出方法または被検物質の検出方法に用いるための電極基板を含む。
本発明の別の側面は、作用電極と、対極とを備え、作用電極が、酸化電位の印加と酸化電位の印加後の還元電位の印加とが行なわれる第１作用電極と、酸化電位の印加が行なわれ、かつ酸化電位の印加後還元電位の印加が行なわれない第２作用電極とを含む、前述した被検物質の検出方法または金属イオンの検出方法に用いるための電極基板を含む。
本発明の別の側面は、前述した電極基板と、金属粒子を含む試薬とを含む、被検物質の検出キットを含む。
本発明によれば、高い検出感度で金属イオンまたは被検物質を検出することができる、金属イオンの検出方法および被検物質の検出方法、これらの方法に用いるための電極基板ならびに被検物質の検出キットを提供できる。
検出装置を示す斜視図である。 図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。 （Ａ）は電極基板の一例を示す正面図、（Ｂ）は（Ａ）に示された電極基板の部分拡大説明図である。 （Ａ）は電極基板の変形例を示す正面図、（Ｂ）は（Ａ）に示された電極基板の部分拡大説明図である。 （Ａ）は電極基板の変形例を示す正面図、（Ｂ）は（Ａ）に示された電極基板の部分拡大説明図である。 金属イオンの検出方法の処理手順の一例を示す工程説明図である。 金属イオンの検出方法の処理手順の変形例を示す工程説明図である。 被検物質の検出方法の処理手順の一例を示す工程説明図である。 被検物質の検出方法の処理手順の変形例を示す工程説明図である。 検査キットを示す斜視図である。 実施例１、比較例１および比較例２において、図３に示された電極基板を用い、試料に含まれる銀イオンに起因する電流を検出した結果を示すグラフである。 実施例２、比較例３および比較例４において、図４に示された電極基板を用い、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を示すグラフである。 実施例３および比較例５において、図４に示された電極基板を用い、試料における被検物質の濃度と、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流との関係を調べた結果を示すグラフである。 実施例４および比較例６において、図３に示された電極基板を用い、試料における被検物質の濃度と、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流との関係を調べた結果を示すグラフである。 実施例５および比較例７において、図５に示された電極基板を用い、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を示すグラフである。 実施例６、比較例８および比較例９において、図４に示された電極基板を用い、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を示すグラフである。
１．用語の定義
本明細書において、「Ｘ以上」は、Ｘの値と、Ｘよりも大きい値とを含むことを意味する。また、「Ｙ以下」は、Ｙの値と、Ｙよりも小さい値とを含むことを意味する。さらに、「Ｘ〜Ｙ」のように、端点による数値範囲の記載は、各範囲内に含まれるすべての数および有理数ならびに記載されている端点を含む。
本明細書において、「被検物質」は、金属イオン以外の物質を意味する。被検物質としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗原、抗体などが挙げられるが、特に限定されない。
２．検出装置の構成
まず、金属イオンの検出方法および被検物質の検出方法に用いられる検出装置の一例を添付図面により説明する。図１において、検出装置１０は、電極基板３０が挿入される基板受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを含んでいる。検出装置１０は、図２に示されるように、ディスプレイ１２と、電気測定装置１３と、電源１４と、Ａ／Ｄ変換部１５と、制御部１６とを含んでいる。
電気測定装置１３は、析出させる金属に起因する電流、電圧または電荷を測定する。電源１４は、電極基板３０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。Ａ／Ｄ変換部１５は、電気測定装置１３によって測定された電流値、電圧値または電荷の値をデジタル変換する。制御部１６は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）などを含んでいる。制御部１６は、ディスプレイ１２、電気測定装置１３および電源１４の動作を制御する。また、制御部１６は、後述のように、電極基板の作用電極への酸化電位および還元電位の印加を制御する。さらに、制御部１６は、Ａ／Ｄ変換部１５でデジタル変換された電流値から、予め作成された電流値、電圧値または電荷の値と、金属の量との関係を示す検量線に基づき、金属の量を概算し、金属イオンの量または被検物質の量を算出することができる。ディスプレイ１２は、制御部１６で算出された金属イオンの量または被検物質の量などの情報を表示する。
３．電極基板の構成
本実施形態に係る電極基板は、作用電極と、対極とを備えている。作用電極は、金属イオンを生成させるための部分（以下、「イオン生成部」ともいう）と、金属イオンの生成後に金属を析出させるための部分（以下、「金属析出部」ともいう）とを含む。また、作用電極では、金属析出部の面積が、イオン生成部の面積よりも小さくなるように構成されている。そのため、作用電極全体で金属イオン生成および金属イオン生成後の金属析出を行なう場合に比べて、作用電極の一部分のみで電流、電圧または電荷の測定を行なうので、ノイズが低減される。また、本実施形態に係る電極基板によれば、大きい面積の部分（イオン生成部）で金属イオンを生成させた後、当該金属イオンを小さい面積の部分（金属析出部）に集積させて金属を析出させることができる。そのため、作用電極全体で金属イオン生成および金属イオン生成後の金属析出を行なう場合と同等のシグナルを得ることができる。したがって、Ｓ／Ｎ比が向上する。
作用電極において、酸化還元電位印加部と、酸化電位印加部とを設けてもよい。酸化還元電位印加部には、金属イオン生成のために酸化電位が印加され、かつ金属イオン生成後の金属析出のために還元電位が印加される。酸化電位印加部には、金属イオンを生成させるために酸化電位が印加されるが、金属イオン生成後は還元電位が印加されない。酸化還元電位印加部と、酸化電位印加部とは、互いに電気的に絶縁されている。この場合、イオン生成部は、酸化還元電位印加部と酸化電位印加部とから構成される。また、金属析出部は、酸化還元電位印加部からなる。
以下、電極基板の一例を添付図面により説明する。図３（Ａ）において、電極基板３０ａは、基板本体３１を備えている。
基板本体３１の表面には、第１作用電極４１と、第２作用電極４２と、対極５１と、参照電極６１と、電極リード７１，７２，７３，７４とが形成されている。第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１が露出し、かつ電極リード７１，７２，７３，７４の一部が覆われるように、レジスト絶縁膜８０が配置されている。これにより、各電極への試料の接触を維持し、かつ各電極リードへの試料の漏出が抑制されている。図３に示される実施形態において、第１作用電極４１は、電極リード７１と一体的に構成されている。図３（Ｂ）においては、第１作用電極４１は、レジスト絶縁膜８０に覆われていない露出した部分である。この部分において、金属の析出、金属のイオン化などが行なわれる。図３（Ｂ）では、第１作用電極４１は、Ａ１で示される２つの部分からなる。また、第２作用電極４２は、電極リード７２と一体的に構成されている。図３（Ｂ）においては、第２作用電極４２は、レジスト絶縁膜８０に覆われていない露出した部分である。この部分において、金属のイオン化などが行なわれる。図３（Ｂ）においては、第１作用電極４１および第２作用電極４２にハッチを付している。
第１作用電極４１および第２作用電極４２は、基板本体３１の一側部〔図３（Ａ）の上側〕に配置されている。電極リード７１は、第１作用電極４１から基板本体３１の他側部〔図３（Ａ）の下側〕に向けて延びている。電極リード７２は、第２作用電極４２から基板本体３１の他側部〔図３の下側〕に向けて延びている。対極５１は、基板本体３１上において、第１作用電極４１および第２作用電極４２よりも外側〔図３（Ａ）において、第１作用電極４１および第２作用電極４２の上側〕に配置されている。電極リード７３は、対極５１から、第１作用電極４１、第２作用電極４２および参照電極６１を迂回して、基板本体３１の他側部〔図３の下側〕に向けて延びている。参照電極６１は、第１作用電極４１および第２作用電極４２を挟んで、対極５１と対向する位置に配置されている。電極リード７４は、参照電極６１から基板本体３１の他側部〔図３の下側〕に向けて延びている。電極リード７１，７２，７３，７４は、基板本体３１の他側部（図３の下側）において互いに並列するように配置されている。
図３に示される電極基板３０ａでは、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方がイオン生成部であり、第１作用電極４１が金属析出部である。第１作用電極４１は、酸化還元電位印加部である。第１作用電極４１には、酸化電位の印加および当該酸化電位の印加後の還元電位の印加が行なわれる。第２作用電極４２は、酸化電位印加部である。第２作用電極４２には、酸化電位の印加が行なわれるが、当該酸化電位の印加後の還元電位の印加は行なわれない。第１作用電極４１と第２作用電極４２との間は、図３（Ｂ）に示されるように、距離ΔＧの隙間によって互いに電気的に絶縁されている。
金属イオンまたは被検物質の検出に際して、金属の析出に伴う電流、電圧または電荷を測定する場合、金属を析出させる部分の面積が小さいほど、ノイズが低いことが本発明者らによって見出されている。したがって、第１作用電極４１の面積〔図３（Ｂ）中、Ａ１参照〕と、全作用電極の面積〔図３（Ｂ）中、Ａ１＋Ａ２参照〕との比の値〔Ａ１／（Ａ１＋Ａ２）〕が小さいほど、Ｓ／Ｎ比を向上することができる。Ａ１／（Ａ１＋Ａ２）は、Ｓ／Ｎ比を向上させる観点から、通常、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／１０以下である。一方、Ａ１／（Ａ１＋Ａ２）の下限値は、基板本体の表面への電極の形成方法による形成精度の限界、電極基板の用途などに応じて適宜決定することができる。なお、「全作用電極」は、第１作用電極および第２作用電極の両方を含む概念を意味する。
また、本実施形態において、第１作用電極４１と第２作用電極４２との間の距離ΔＧが小さいほど、第１作用電極４１への金属イオンの移動時間が短縮される。したがって、金属イオンまたは被検物質の検出に要する操作時間の短縮が期待される。第１作用電極４１と第２作用電極４２との間の距離ΔＧは、金属イオンまたは被検物質の検出に要する操作時間の短縮する観点から、通常、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは５０μｍ以下である。一方、第１作用電極４１と第２作用電極４２との間の距離ΔＧの下限値は、基板本体の表面への電極の形成方法による限界、電極基板の用途などに応じて適宜決定することができる。
図３に示される電極基板３０ａにおいて、第２作用電極４２は、櫛形形状を有している。第１作用電極４１は、図３に示されるように、第２作用電極の櫛歯の隙間部分に挿入されるよう配置されている。これにより、第１作用電極４１と第２作用電極４２との間で金属イオンを容易に移動させることができる。また、製造も容易である。なお、第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの形状は、多角形形状、矩形状、円盤状、楕円状などであってもよい。
第２作用電極の櫛歯部分の櫛歯の数は、特に限定されない。図３では、第２作用電極４２の櫛歯部分の櫛歯の数は、３本である。図４では、第２作用電極４４の櫛歯部分の櫛歯の数は２本である。図５では、第２作用電極４６の櫛歯部分の櫛歯の数は４本である。図３（Ｂ）、図４（Ｂ）および図５（Ｂ）それぞれのＡ１で示される第１作用電極は、第２作用電極の複数本の櫛歯の全ての間隙に挿入されるよう配置されることが好ましい。
なお、基板本体３１の表面上には、第１作用電極として機能する１個以上の電極を設けることができる。また、基板本体３１の表面上には、第２作用電極として機能する１個以上の電極を設けることができる。
第１作用電極４１および第２作用電極４２は、それぞれ、導電性を有する薄膜から構成されている。導電性を有する薄膜は、主に導電性材料から構成されている。導電性材料としては、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー、カーボンナノチューブ、グラフェンなどの炭素材料；金、白金などの金属材料、スズをドープした酸化インジウム（ＩＴＯ）、フッ素をドープした酸化スズ（ＦＴＯ）などの酸化物半導体などが挙げられるが、特に限定されない。なお、第１作用電極４１および第２作用電極４２は、ガラス、プラスチックなどの非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性材料からなる導電層が設けられた複合基材などから構成されていてもよい。薄膜の厚さは、電極基板の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。
図３において、電極基板が被検物質の検出に用いるための電極基板である場合、第１作用電極４１および第２作用電極４２の表面には、被検物質に結合する捕捉物質が固定化されていることが好ましい。捕捉物質としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を有するナノ構造体などが挙げられるが、特に限定されない。捕捉物質は、被検物質の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。被検物質が核酸である場合、捕捉物質として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、核酸に対する抗体などを用いることができる。被検物質がタンパク質またはペプチドである場合、捕捉物質として、抗体を用いることができる。被検物質が糖鎖である場合、捕捉物質として、かかる糖鎖に対するレクチン、糖鎖に対する抗体などを用いることができる。被検物質が抗原である場合、捕捉物質として、かかる抗原に対する抗体などを用いることができる。
第１作用電極４１および第２作用電極４２の表面に固定化される単位面積当たりの捕捉物質の量は、被検物質の種類、捕捉物質の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。第１作用電極４１および第２作用電極４２の表面に固定化される単位面積あたりの捕捉物質の量は、被検物質を捕捉するのに十分な量であればよい。
本実施形態においては、基板本体３１は、矩形状を呈している。しかし、基板本体３１の形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状などであってもよい。
基板本体３１を構成する材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ガラスエポキシなどのプラスチック類；ガラス、金属などの無機材料などが挙げられるが、特に限定されない。基板本体３１の厚さは、電極基板の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。
対極５１は、導電性を有する薄膜から構成されている。導電性を有する薄膜は、主に導電性材料から構成されている。対極５１に用いられる導電性材料は、第１作用電極４１および第２作用電極４２に用いられる導電性材料と同様である。対極５１を構成する薄膜の厚さは、電極基板の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。
参照電極６１は、導電性を有する薄膜からなる。導電性を有する薄膜は、主に導電性材料から構成されている。導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケルなどの金属；当該金属の少なくとも１つを含む合金；金属の塩化物などの金属ハロゲン化物；これらの混合物などが挙げられるが、特に限定されない。参照電極６１は、ガラス、ガラスエポキシ、プラスチックなどの非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性材料からなる導電層が設けられた複合基材などから構成されていてもよい。かかる参照電極６１の具体例としては、例えば、銀−塩化銀電極、水銀と塩化水銀とを用いるカロメル電極などが挙げられるが、特に限定されない。参照電極６１を構成する薄膜の厚さは、電極基板の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。なお、本実施形態では、基板本体３１の表面に参照電極６１が設けられている。そのため、本実施形態に係る電極基板３０ａによれば、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、第１作用電極４１および第２作用電極４２に印加する電圧を安定化させることができる。しかし、他の実施形態では、基板本体３１の表面に参照電極６１が設けられていなくてもよい。例えば、対極５１に用いられる導電性材料の種類、対極５１の厚さなどにもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合、対極５１が参照電極６１を兼ねていてもよい。
本実施形態に係る電極基板は、例えば、以下の工程を含む方法などによって製造することができる。
（Ｉ）基板本体の表面に、作用電極、対極および任意に参照電極のパターンを形成するように導電性を有する薄膜を形成させる工程、
（ＩＩ）必要により、作用電極の表面に捕捉物質を固定化する工程、
（ＩＩＩ）必要により、作用電極表面のブロッキング処理を行なう工程。
工程（Ｉ）において、導電性を有する薄膜の形成は、例えば、スクリーン印刷法、フォトリソグラフィー法などの方法によって行なうことができる。
電極基板を被検物質の検出に用いる場合、工程（ＩＩ）を行なえばよい。工程（ＩＩ）において、捕捉物質の固定化は、例えば、作用電極を構成する導電性材料などに結合する結合基などを介して行なうことができる。結合基としては、例えば、チオール基、ヒドロキシル基、リン酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基、アミノ基などが挙げられるが、特に限定されない。また、捕捉物質の固定化は、例えば、物理吸着などによって行なわれてもよい。
工程（ＩＩ）を行なった場合、作用電極への被検物質以外の物質（以下、「夾雑物質」ともいう）の非特異的吸着を抑制する観点から、工程（ＩＩＩ）を行なうことが望ましい。工程（ＩＩＩ）において、ブロッキング処理は、作用電極にブロッキング剤を接触させることなどによって行なうことができる。ブロッキング剤は、夾雑物質が作用電極に非特異的に吸着するのを抑制するものであればよい。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳、カゼインおよびゼラチンのうちのいずれかまたは複数を溶媒に溶解させた溶液などが挙げられるが、特に限定されない。
得られた電極基板は、余剰のブロッキング剤を除去するため、適宜洗浄して用いることができる。
４．金属イオンの検出方法
本実施形態に係る金属イオンの検出方法は、作用電極と対極とを含む電極基板の作用電極の表面に、金属イオンを含む試料を接触させ、作用電極に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を作用電極の表面に析出させる第１析出工程、
作用電極に酸化電位を印加することにより、第１析出工程で析出させた金属から金属イオンを生成させるイオン化工程、
作用電極において、酸化電位を印加した部分の表面積よりも小さい表面積を有する部分に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を、還元電位を印加した部分の表面に析出させる第２析出工程、および
析出工程で析出させる金属に起因する電流、電圧または電荷を測定し、電流、電圧または電荷を測定する測定工程、
を含む方法である（以下、「方法１」という）。
本実施形態の方法１では、作用電極として、第１作用電極および第２作用電極を含む作用電極を用いることができる。第１作用電極には、酸化電位の印加および当該酸化電位の印加後の還元電位の印加が行なわれる。また、第２作用電極には、酸化電位の印加が行なわれるが、当該酸化電位の印加後の還元電位の印加は行なわれない。第１作用電極および第２作用電極の両方がイオン生成部であり、第１作用電極が金属析出部である。この場合、本実施形態の方法１では、第１析出工程において、第１作用電極上および第２作用電極上に金属を析出させる。また、イオン化工程において、第１作用電極および第２作用電極の両方に酸化電位を印加する。これにより、第１作用電極および第２作用電極それぞれの表面に析出させた金属から金属イオンを生成させる。さらに、第２析出工程において、第２作用電極には還元電位を印加せず、第１作用電極に還元電位を印加する。これにより、金属イオンから生成する金属を第１作用電極の表面に析出させる。本実施形態に係る方法１では、例えば、図１に示される検出装置１０などを用いることができる。
本明細書において、「金属イオンの検出」とは、金属イオンを定量すること；「強陽性（＋＋）」、「弱陽性（＋）」、「陰性（−）」などのように金属イオンを半定量すること；金属イオンの有無を定性的に判定することを含む概念である。
金属イオンを含む試料としては、例えば、河川水、海水、土壌、食品などが挙げられるが、特に限定されない。これらの試料には、作用電極に接触させる前に適宜前処理を施してもよい。例えば、土壌および食品は、後述の電解液に溶解・懸濁させることができる。
金属イオンとしては、例えば、鉛イオン、銅イオン、水銀イオン、カドミウムイオン、金イオン、白金イオン、銀イオン、亜鉛イオンなどの遷移金属イオンなどが挙げられるが、特に限定されない。本実施形態に係る方法１によれば、これらの金属イオンのなかでも、鉛イオン、銅イオン、水銀イオン、カドミウムイオン、金イオンおよび銀イオンを良好に検出することができる。遷移金属イオンは、電極に負の電位を印加することにより、電極表面に容易に金属を析出・溶着させることができる。したがって、遷移金属イオンは、本実施形態に係る方法１によって検出することができる。金属は、金属イオンが還元されて析出する金属である。
銀イオン、または銀イオンと同様の性質を有する他の金属イオンを検出する場合、測定工程においては、析出工程で第１作用電極の表面に析出させた金属から金属イオンを生成させる際に生じる電流、電圧または電荷を測定する。この場合、電流、電圧または電荷に基づいて金属イオンを検出することができる（以下、「方法１−１」という）。「銀イオンと同様の性質を有する他の金属イオン」は、銀イオンと同様に、電極に正の電圧を印加することにより容易に酸化（イオン化）させ得るイオンである。銀イオンと同様の性質を有する他の金属イオンとしては、例えば、鉛イオン、銅イオン、水銀イオン、カドミウムイオン、亜鉛イオンなどが挙げられるが、特に限定されない。
以下、本実施形態に係る方法１−１の処理手順の一例を添付図面により説明する。図６においては、図４（Ａ）に示されるパターンとなるように形成された第１作用電極４３および第２作用電極４４を含み、かつ捕捉物質を有しない電極基板３０ｂを用い、銀イオンを検出する場合を例として挙げて説明する。なお、図６は、図４（Ｂ）中の第１作用電極４３および第２作用電極４４のＡ−Ａ線での断面説明図である。図４に示される実施形態では、第１作用電極４３は、電極リード７１と一体的に構成されている。図４（Ｂ）においては、第１作用電極４３は、レジスト絶縁膜８０に覆われていない露出した部分である。この部分において、金属の析出、金属のイオン化などが行なわれる。図４（Ｂ）では、第１作用電極４３は、Ａ１で示される。また、第２作用電極４４は、電極リード７２と一体的に構成されている。図４（Ｂ）においては、第２作用電極４４は、レジスト絶縁膜８０に覆われていない露出した部分である。この部分において、金属のイオン化などが行われる。図４（Ｂ）においては、第１作用電極４３および第２作用電極４４にハッチを付している。
まず、図６（Ａ）に示されるように、試料添加工程Ｓ１１において、ユーザーは、銀イオン２１１ａを含む試料２０１を、第１作用電極４３、第２作用電極４４、図示しない対極５１および図示しない参照電極６１それぞれの露出部分を覆うように電極基板３０ｂに添加する。つぎに、ユーザーは、図１に示される検出装置１０の基板受入部１１に電極基板３０を挿入する。ここでは、検出装置１０に挿入された電極基板３０の電極リード７１，７２，７３，７４は、検出装置１０の電気測定装置１３および電源１４に接続される。
つぎに、図６（Ｂ）に示されるように、第１析出工程Ｓ１２において、ユーザーは、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に、還元電位を印加する。ここでは、ユーザーは、検出装置１０に処理手順の開始を指示する。これにより、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の還元電位が第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に印加される。
還元電位は、検出対象の金属イオンが還元されて金属が生成される電位である。したがって、還元電位は、金属イオンの種類に応じて適宜決定することができる。金属イオンが、例えば、銀イオンである場合、還元電位は、銀／塩化銀基準で−１．２〜０Ｖである。金属イオンが、例えば、銅イオンである場合、還元電位は、銀／塩化銀基準で−１．２〜−０Ｖである。かかる還元電位は、印加に際して一定に保持してもよく、時間の経過に伴い変化させてもよい。また、還元電位の印加時間は、本実施形態に係る方法１の用途、試料の種類、試料に含まれる金属イオンの量、金属イオンの種類などに応じて適宜決定することができる。第１析出工程Ｓ１２では、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に還元電位を印加する。これにより、図６（Ｂ）に示されるように、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方で銀イオン２１１ａを還元し、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方の表面上に銀２１１ｂを析出させることができる。これにより、試料２０１に含まれる銀イオン２１１ａから生成される銀２１１ｂを第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方の表面上に集めることができる。
第１析出工程Ｓ１２を行なったのち、第１作用電極４３、第２作用電極４４、図示しない対極５１および図示しない参照電極６１それぞれの露出部分を洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄液としては、例えば、水；リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水などの緩衝液；後述のイオン化工程Ｓ１３、第２析出工程Ｓ１４および検出工程Ｓ１５で使用する電解液などが挙げられる。電解液に用いられる電解質としては、例えば、塩酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウムなどが挙げられるが、特に限定されない。また、電解液に用いられる溶媒としては、例えば、水；リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水などの緩衝液などが挙げられるが、特に限定されない。
つぎに、図６（Ｃ）に示されるように、イオン化工程Ｓ１３において、ユーザーは、第１作用電極４３、第２作用電極４４、対極５１および参照電極６１のそれぞれの露出部を覆うように電解液を滴下し、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に酸化電位を印加する。ここでは、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の酸化電位が第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に印加される。電解液は前記に示した電解液と同様である。
酸化電位は、金属が酸化されて金属イオンが生成される電位である。したがって、酸化電位は、金属の種類に応じて適宜決定することができる。金属イオンが、例えば、銀イオンである場合、酸化電位は、銀／塩化銀基準で１〜２．５Ｖである。金属イオンが、例えば、銅イオンである場合、酸化電位は、銀／塩化銀基準で０．８〜２．０Ｖである。かかる酸化電位は、印加に際して一定に保持してもよく、時間の経過に伴い変化させてもよい。また、酸化電位の印加時間は、本実施形態に係る方法１の用途、金属の量、試料の種類、金属の種類などに応じて適宜決定することができる。イオン化工程Ｓ１３では、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に酸化電位を印加する。これにより、図６（Ｃ）に示されるように、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方で銀２１１ｂを酸化し、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方の近傍において、銀２１１ｂから銀イオン２１１ａを生成させることができる。
つぎに、図６（Ｄ）に示されるように、第２析出工程Ｓ１４において、第２作用電極４４には還元電位を印加せず、第１作用電極４３のみに還元電位を印加する。ここでは、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の還元電位が第１作用電極４３のみに印加される。
第２析出工程Ｓ１４における還元電位および印加時間は、第１析出工程Ｓ１２における還元電位および印加時間と同様である。還元電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。第２析出工程Ｓ１４で用いられる電解液は、イオン化工程Ｓ１３で用いられる電解液と同様である。なお、第２析出工程Ｓ１４においては、第２作用電極４４に銀２１１ｂが析出しない範囲内で電位が印加されていてもよい。このように、第２析出工程Ｓ１４では、イオン化工程Ｓ１３で銀イオン２１１ａを生成させるために酸化電位を印加した部分の面積よりも小さい面積を有する部分に還元電位を印加して銀２１１ｂを析出させる。これにより、図６（Ｄ）に示されるように、イオン化工程で生成された銀イオン２１１ａから生成される銀２１１ｂを第１作用電極４３で集積し析出させることができる。したがって、作用電極全体で金属イオン生成及び金属イオン生成後の金属析出を行なう場合と同等のシグナルを得ることができる。
その後、図６（Ｅ）に示されるように、検出工程Ｓ１５では、ユーザーは、第２析出工程Ｓ１４で第１作用電極４３の表面上の銀２１１ｂに起因する電流、電圧または電荷として、第１作用電極４３の表面上の銀２１１ｂがイオン化する際に生成される電流、電圧または電荷を測定する。ここでは、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の酸化電位が第１作用電極４３のみに印加される。また、印加と同時に、電気測定装置１３により、銀２１１ｂに起因して第１作用電極４３と対極５１との間の電流もしくは電圧または電荷が測定される。
酸化電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。検出工程Ｓ１５で用いられる電解液は、イオン化工程Ｓ１３に用いられる電解液と同様である。
検出工程Ｓ１５において、電流、電圧または電荷の測定方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法、クロノアンペロメトリー法などが挙げられるが、特に限定されない。
方法１−１によって金属イオンを定量する場合、例えば、既知量の金属イオンを含む試料を用いて作成された検量線に基づいて試料に含まれる金属イオンの量を求めることができる。検量線は、既知量の金属イオンを含む試料を用いて方法１−１の各工程を行なうことによって測定された金属に起因する電流、電圧または電荷と、金属イオンの量との関係をプロットすることによって作成することができる。また、方法１−１によって金属イオンを半定量する場合、例えば、既知量の金属イオンを含む試料および金属イオンを含まない試料をそれぞれ複数用い、金属イオンの濃度に基づいて陽性および陰性の判定だけでなく、陽性と判定された試料をさらに細分類することができる。例えば、「強陽性（＋＋）」と「弱陽性（＋）」とを分ける閾値および「弱陽性（＋）」と「陰性（−）」とを分ける閾値を設定することにより、「強陽性（＋＋）」、「弱陽性（＋）」または「陰性（−）」を判定することができる。方法１−１によって金属イオンの有無を定性的に判定する場合、金属イオンを含まない試料を用いたときの電流、電圧または電荷に対して、電流、電圧または電荷の変化が見られた場合、「試料が金属イオンを含む」と判断することができる。一方、金属イオンを含まない試料を用いたときの電流、電圧または電荷に対して、電流、電圧または電荷の変化が見られない場合、「試料が金属イオンを含まない」と判断することができる。
このように、銀２１１ｂに起因する電流、電圧または電荷を測定するのに用いられる第１作用電極４３の表面積が全作用電極の表面積と比べて小さい。そのため、本実施形態に係る方法１−１では、作用電極の一部分のみで電流、電圧または電荷の測定を行なう。これにより、作用電極全体で金属イオン生成および金属イオン生成後の金属析出を行なう場合に比べて、ノイズが低減される。したがって、本実施形態に係る方法１−１によれば、例えば、試料における銀イオンの濃度が低い場合であっても、大きいＳ／Ｎ比を得ることができる。しかも、本実施形態に係る方法１−１によれば、低濃度において、銀イオン濃度とそれに対応するシグナルとの関係において、優れた直線性を得ることができる。したがって、本実施形態に係る方法１−１によれば、高い検出感度で銀イオンなどの金属イオンを検出することができる。
５．金属イオンの検出方法の変形例
金イオン、または金イオンと同様の性質を有する他の金属イオンを検出する場合、測定工程において、析出工程で第１作用電極上に金属が析出するまでの電流、電圧または電荷を測定し、第１作用電極上における金属の析出に伴う電流の変化、電圧の変化または電荷の変化が生じるまでの還元電位の印加時間に基づいて金属イオンを検出することができる（以下、「方法１−２」という）。「金イオンと同様の性質を有する他の金属イオン」は、金イオンと同様に、溶着した金属を酸化させにくく、大きな電圧を必要とする金属イオンである。金イオンと同様の性質を有する他の金属イオンとしては、例えば、白金イオンなどが挙げられるが、限定されない。
以下、本実施形態に係る方法１−２の処理手順の一例を添付図面により説明する。図７においても、図４（Ａ）に示されるパターンとなるように形成された第１作用電極４３および第２作用電極４４を含み、かつ捕捉物質を有しない電極基板３０ｂを用い、金イオンを検出する場合を例として挙げて説明する。なお、図７は、図４（Ｂ）中の第１作用電極４３および第２作用電極４４のＡ−Ａ線での断面説明図である。
本実施形態に係る方法１−２は、以下の点を除き、方法１−１と同様の処理手順によって行なうことができる。
１） 方法１−１では、銀イオン２１１ａを含む試料２０１を用いるのに対し、方法１−２では、金イオン２２１ａを含む試料２０２を用いる点。
２） 方法１−１では、第１作用電極４３の表面上に析出した銀２１１ｂが再度イオン化する際の電流、電圧または電荷を測定し、当該電流、電圧または電荷に基づいて銀イオン２１１ａを検出する。これに対し、方法１−２において、第１作用電極４３の表面上における金２２１ｂが析出する際の電流、電圧もしくは電荷を測定するか、金２２１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化を測定し、金２１１ｂの析出の際の電流、電圧もしくは電荷、金２１１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化に基づいて金イオン２２１ａを検出する点。
本実施形態に係る方法１−２では、まず、図７（Ａ）に示されるように、試料添加工程Ｓ２１において、ユーザーは、金イオン２２１ａを含む試料２０２を、第１作用電極４３、第２作用電極４４、図示しない対極５１および図示しない参照電極６１それぞれの露出部分を覆うように電極基板３０ｂに添加する。
つぎに、図７（Ｂ）に示されるように、析出工程Ｓ２２において、ユーザーは、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に還元電位を印加する。
金属イオンが、例えば、金イオンである場合、還元電位は、銀／塩化銀基準で−１．０〜０．５Ｖである。金属イオンが、例えば、白金イオンである場合、還元電位は、銀／塩化銀基準で−１．０〜０．２Ｖである。また、還元電位の印加時間は、本実施形態に係る方法１−２の用途、試料の種類、金属イオンの種類などに応じて適宜決定することができる。析出工程Ｓ２２では、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に還元電位を印加する。これにより、図７（Ｂ）に示されるように、試料２０２に含まれる金イオン２２１ａから生成される金２２１ｂを第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方の表面上に集めることができる。
析出工程Ｓ２２を行なったのち、第１作用電極４３、第２作用電極４４、図示しない対極５１および図示しない参照電極６１それぞれの露出部分を洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄に用いられる洗浄液は、方法１−１で用いられる洗浄液と同様である。
つぎに、図７（Ｃ）に示されるように、イオン化工程Ｓ２３において、ユーザーは、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に酸化電位を印加する。
金属イオンが、例えば、金イオンである場合、酸化電位は、銀／塩化銀基準で１．３〜２．４Ｖである。金属イオンが、例えば、白金イオンである場合、酸化電位は、銀／塩化銀基準で１．０〜２．０Ｖである。また、酸化電位の印加時間は、本実施形態に係る方法１−２の用途、試料の種類、金属の種類などに応じて適宜決定することができる。イオン化工程Ｓ２３では、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に酸化電位を印加する。これにより、図７（Ｃ）に示されるように、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方で金２２１ｂを酸化し、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方の近傍において、金２２１ｂから金イオン２２１ａを生成させることができる。
酸化電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。方法１−１に用いられる電解液と同様である。
その後、図７（Ｄ）に示されるように、検出工程Ｓ２４において、第２作用電極４４には還元電位を印加せず、第１作用電極４３のみに還元電位を印加する。ここでは、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の還元電位が第１作用電極４３のみに印加される。また、印加と同時に、電気測定装置１３により、第１作用電極４３の表面上に金２２１ｂが析出する際の電流、電圧もしくは電荷を測定するか、または第１作用電極４３上における金２２１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化を測定する。その後、第１作用電極上における金２２１ｂの析出の際の電流、電圧もしくは電荷、または金２２１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化に基づいて金イオン２２１ａを検出する。
検出工程Ｓ２４における還元電位および印加時間は、析出工程Ｓ２２における還元電位および印加時間と同様である。このように、検出工程Ｓ２４では、イオン化工程Ｓ２３で金イオン２２１ａを生成させるために酸化電位を印加した部分の面積よりも小さい面積を有する部分に還元電位を印加して金２２１ｂを析出させる。したがって、図７（Ｄ）に示されるように、イオン化工程で生成された金イオン２２１ａから生成される金２２１ｂを第１作用電極４３で集積し析出させることができる。
還元電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。方法１−１に用いられる電解液と同様である。
検出工程Ｓ２４における金２２１ｂの析出の際の電流、電圧および電荷ならびに金２２１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化および電荷の変化は、方法１−１における検出工程Ｓ１５における電流、電圧または電荷の測定方法と同様の手法によって測定することができる。金イオン２２１ａの検出には、例えば、第１作用電極４３の表面上における金２２１ｂの析出までに流れた電流量または電荷量、金２２１ｂの析出に必要な電圧、析出に依存した電流値が飽和するまでに要する時間などを指標として用いることができる。
方法１−２では、金属イオンの定量、金属イオンの半定量および金属イオンの有無の定性的な判定は、方法１−１と同様に行なうことができる。
このように、金２２１ｂに起因する電流、電圧または電荷を測定するのに用いられる第１作用電極４３の表面積が全作用電極の表面積と比べて小さい。したがって、本実施形態に係る方法１−２によれば、方法１−１と同様に、高い検出感度で金イオンなどの金属イオンを検出することができる。
６．被検物質の検出方法
本実施形態に係る被検物質の検出方法は、作用電極と対極とを含む電極基板の作用電極の表面に、被検物質と金属粒子とを含む複合体を固定化する固定化工程、
作用電極に酸化電位を印加することにより、作用電極に固定化された複合体中の金属粒子から金属イオンを生成させるイオン化工程、
作用電極における酸化電位を印加した部分の面積よりも小さい面積を有する部分に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を、還元電位を印加した部分の表面に析出させる析出工程、および
析出工程で析出させた金属に起因する電流、電圧または電荷を測定する測定工程、
を含む方法である（以下、「方法２」という）。
本実施形態の方法２では、作用電極として、第１作用電極および第２作用電極を含む作用電極を用いることができる。第１作用電極には、酸化電位の印加および当該酸化電位の印加後の還元電位の印加が行なわれる。また、第２作用電極には、酸化電位の印加が行なわれるが、当該酸化電位の印加後の還元電位の印加は行なわれない。第１作用電極および第２作用電極の両方がイオン生成部であり、第１作用電極が金属析出部である。この場合、本実施形態の方法２では、固定化工程において、第１作用電極上および第２作用電極の表面に複合体を固定化する。また、イオン化工程において、第１作用電極および第２作用電極の両方に酸化電位を印加することにより、第１作用電極上および第２作用電極に固定化された複合体中の金属粒子から金属イオンを生成させる。さらに、析出工程において、第２作用電極には還元電位を印加せず、第１作用電極に還元電位を印加することにより、金属イオンから生成する金属を第１作用電極の表面に析出させる。本実施形態に係る方法２では、例えば、図１に示される検出装置１０などを用いることができる。
本明細書において、「被検物質の検出」とは、被検物質を定量すること；「強陽性（＋＋）」、「弱陽性（＋）」、「陰性（−）」などのように被検物質を半定量すること；被検物質の有無を定性的に判定することを含む概念である。
被検物質を含む試料としては、例えば、全血、血漿、血清、尿、唾液などに代表される検体；河川水、海水、土壌、食品などが挙げられるが、特に限定されない。
金属粒子としては、例えば、金粒子、銀粒子、銅粒子、鉛粒子、白金粒子、インジウム粒子などの遷移金属粒子、金―銀複合粒子や金―銅複合粒子など各金属の複合粒子；硫化カドミウム、硫化亜鉛などの量子ドット（「半導体粒子」ともいう）などが挙げられるが、特に限定されない。金属粒子の粒子径は、金属の析出の際に十分な電流、電圧、電化などのシグナルを得る観点から、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上である。また、金属粒子の粒子径は、被検物質の捕捉効率および被検物質の標識効率を向上させる観点から、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下である。なお、本明細書において、「金属粒子」は、球形の金属粒子だけでなく、球形以外の形状の金属粒子をも含む。また、「粒子径」とは、金属粒子が球形を有する場合、直径をいい、金属粒子が球形以外の形状を有する場合、粒子の最大径と最小径との平均をいう。金属粒子の粒子径は、例えば、光散乱法、顕微鏡観察などによって求めることができる。
本実施形態における方法２において、金属粒子として、銀、銀と同様の性質を有する他の金属の粒子、または量子ドットを用いる方法（以下、「方法２−１」ともいう）では、測定工程において、析出工程で第１作用電極の表面に析出させた金属から金属イオンを生成させる際に生じる電流、電圧または電荷を測定する。この場合、電流、電圧または電荷に基づいて被検物質を検出する。「銀と同様の性質を有する他の金属」は、銀と同様に、粒子を容易に形成でき、電極に酸化電位を印加することで容易に酸化（イオン化）させ得る金属である。銀と同様の性質を有する金属としては、例えば、銅、鉛、インジウムなどが挙げられるが、特に限定されない。なお、方法２−１において、量子ドットを用いる場合、量子ドットを構成する金属イオンから得られる金属から金属イオンを生成させる際に生じる電流、電圧または電荷を測定することができる。例えば、量子ドットが硫化カドミウムである場合、カドミウムからカドミウムイオンを生成させる際に生じる電流、電圧または電荷を測定することができる。また、例えば、量子ドットが硫化亜鉛である場合、亜鉛から亜鉛イオンを生成させる際に生じる電流、電圧または電荷を測定することができる。
本実施形態における方法２において、金属粒子として、金、または金と同様の性質を有する他の金属の粒子を用いる方法（以下、「方法２−２」ともいう）では、測定工程において、析出工程で第１作用電極上に金属が析出するまでの電流、電圧または電荷を測定する。この場合、第１作用電極上における金属の析出に伴う電流の変化、電圧の変化または電荷の変化が生じるまでの還元電位の印加時間に基づいて被検物質を検出する。「金と同様の性質を有する他の金属」は、金と同様に、粒子を形成でき、電極上で酸化する際に大きな酸化電位を必要とする金属である。金と同様の性質を有する他の金属としては、例えば、白金などが挙げられるが、特に限定されない。
なお、方法２において、金―銀複合粒子、金―銅複合粒子など各金属の複合粒子を用いる場合、複合粒子を構成する金属の種類に応じて、方法２−１および方法２−２のいずれかを行なうことができる。
金属粒子上には、被検物質に結合する結合物質が固定化されていることが好ましい。結合物質は、被検物質において、捕捉物質とは異なる場所に結合することが好ましい。結合物質は、被検物質の種類などに応じて適宜選択される。被検物質が核酸である場合、結合物質として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質などを用いることができる。被検物質がタンパク質またはペプチドである場合、結合物質として、かかるタンパク質に対する抗体、ペプチドに対する抗体などを用いることができる。被検物質が糖鎖である場合、結合物質として、かかる糖鎖に対するレクチン、糖鎖に対する抗体などを用いることができる。
以下、方法２−１の処理手順の一例を添付図面により説明する。図８においては、銀粒子２１１ｂ上に被検物質２０６に結合する結合物質２１２が固定化された標識結合物質２１０と、図４（Ａ）に示されるパターンとなるように形成された第１作用電極４３および第２作用電極４４を含み、かつ捕捉物質を有する電極基板３０ｅとを用い、金属イオンとして銀を用いる場合を例として挙げて説明する。なお、図８は、図４（Ｂ）中の第１作用電極４３および第２作用電極４４のＡ−Ａ線での断面説明図である。本実施形態においては、第１作用電極４３および第２作用電極４４上の捕捉物質９１と被検物質２０６との間の生物学的相互作用を利用して第１作用電極４３および第２作用電極４４の表面に被検物質２０６を含む標識複合体２１５を固定化する。かかる生物学的相互作用としては、例えば、抗原抗体反応、核酸間の水素結合、核酸と核酸結合タンパク質との間の結合、レクチンと糖鎖との間の結合などが挙げられるが、特に限定されない。なお、捕捉物質９１は、前述の電極基板の構成の説明で挙げられた捕捉物質と同様である。
まず、図８（Ａ）に示されるように、標識工程Ｓ３１において、ユーザーは、被検物質２０６を含む試料２０５と、標識結合物質２１０とを混合し、被検物質２０６を標識結合物質２１０で標識する。これにより、被検物質２０６と標識結合物質２１０とを含む標識複合体２１５が形成される。なお、図中、２０７は、試料２０５に含まれる可能性のある夾雑物質を示す。
標識結合物質２１０は、被検物質２０６に結合する結合物質２１２と、標識物質である銀２１１ｂとから構成されている。
標識工程Ｓ３１において、試料２０５に対する標識結合物質２１０の量は、試料２０５の種類などに応じて適宜決定することができる。通常、試料２０５に対する標識結合物質２１０の量は、試料２０５に含まれていると予想される被検物質２０６の量に対して過剰量となることが望ましい。
つぎに、図８（Ｂ）に示されるように、試料添加工程Ｓ３２において、ユーザーは、標識複合体２１５を含む試料を、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの露出部分を覆うように電極基板３０ｅに添加する。つぎに、ユーザーは、図１に示される検出装置１０の基板受入部１１に電極基板３０ｅを挿入する。ここでは、検出装置１０に挿入された電極基板３０ｅの電極リード７１，７２，７３，７４は、検出装置１０の電気測定装置１３および電源１４に接続される。
試料添加工程Ｓ３２では、試料に含まれる標識複合体２１５の被検物質２０６が電極基板３０ｅの基板本体３１に形成された第１作用電極４３および作用電極４４それぞれの表面上の捕捉物質９１によって捕捉される。これにより、第１作用電極４３および作用電極４４それぞれの表面に、被検物質２０６と銀２１１ｂとを含む標識複合体２１５が固定化される。試料中の夾雑物質２０７は、捕捉物質９１に捕捉されない。
なお、本実施形態では、図８（Ａ）に示されるように、電極基板３０ｅに試料を添加するに先立って、標識工程Ｓ３１を行なう。これにより、標識結合物質２１０と試料２０５中の被検物質２０６とを含む標識複合体２１５を形成させる。その後、得られた標識複合体２１５を含む試料を、第１作用電極４３および作用電極４４それぞれの表面上の捕捉物質９１と接触させる。しかし、被検物質２０６を含む試料２０５と、標識結合物質２１０と、第１作用電極４３および作用電極４４それぞれの表面上の捕捉物質９１との接触の順序は、特に限定されない。例えば、まず、第１作用電極４３および作用電極４４それぞれの表面上の捕捉物質９１と、被検物質２０６を含む試料２０５とを接触させてもよい。この場合、捕捉物質９１と試料２０５との接触後、捕捉物質９１に捕捉された被検物質２０６と標識結合物質２１０とを接触させればよい。一方、まず、標識結合物質２１０を、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの露出部分を覆うように電極基板３０ｅに添加してもよい。この場合、添加後、被検物質２０６を含む試料２０５を添加すればよい。
試料添加工程Ｓ３２において、捕捉物質９１による標識複合体２１５中の被検物質２０６の捕捉は、例えば、捕捉物質９１と被検物質２０６とが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質９１と被検物質２０６とが結合する条件は、被検物質２０６の種類などに応じて適宜選択することができる。被検物質２０６が核酸であり、捕捉物質９１が核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質２０６の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また、捕捉物質９１が抗体または抗原である場合、被検物質２０６の捕捉は、被検物質２０６を、抗原抗体反応を行なうのに適した溶液中で行なうことが好ましい。抗原抗体反応を行なうための溶液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液などが挙げられるが、特に限定されない。被検物質２０６が糖鎖であり、捕捉物質９１が糖鎖に対するレクチンである場合、被検物質２０６を、糖鎖とレクチンとが結合するのに適した溶液中で行なうことが好ましい。この場合、糖鎖とレクチンとを結合させるための溶液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水などの緩衝液；塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩で塩濃度を調整した水溶液などが挙げられるが、特に限定されない。
なお、本実施形態においては、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面への標識複合体２１５の固定化は、被検物質２０６と捕捉物質９１との間の生物学的相互作用を用いて行なわれ得る。
試料添加工程Ｓ３２を行なったのち、第１作用電極４３、第２作用電極４４、図示しない対極５１および図示しない参照電極６１それぞれの露出部分を洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄に用いられる洗浄液は、方法１−１および１−２で用いられる洗浄液と同様である。
つぎに、図８（Ｃ）に示されるように、イオン化工程Ｓ３３において、ユーザーは、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に酸化電位を印加する。ここでは、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の酸化電位が第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に印加される。
イオン化工程Ｓ３３における酸化電位および酸化電位の印加時間は、方法１−１および１−２と同様に金属が酸化されて金属イオンが生成される電位である。したがって、酸化電位は、金属の種類に応じて適宜決定することができる。イオン化工程Ｓ３３では、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に酸化電位を印加することにより、図８（Ｃ）に示されるように、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方で標識複合体２１５中の銀２１１ｂを酸化し、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方の近傍において、銀イオン２１１ａを生成させることができる。
酸化電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。方法１−１および方法１−２に用いられる電解液と同様である。
つぎに、図８（Ｄ）に示されるように、析出工程Ｓ３４において、ユーザーは、第２作用電極４４には還元電位を印加せず、第１作用電極４３のみに還元電位を印加する。ここでは、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の還元電位が第１作用電極４３のみに印加される。
析出工程Ｓ３４における還元電位および印加時間は、方法１−１および方法１−２における還元電位および印加時間と同様である。なお、析出工程Ｓ３４においては、第２作用電極４４に銀２１１ｂが析出しない範囲内で電位が印加されていてもよい。このように、析出工程Ｓ３４では、イオン化工程Ｓ３３で銀イオン２１１ａを生成させるために酸化電位を印加した部分の面積よりも小さい面積を有する部分に還元電位を印加して銀２１１ｂを析出させることにより、図８（Ｄ）に示されるように、イオン化工程で生成された銀イオン２１１ａから生成される銀２１１ｂを第１作用電極４３で集積し析出させることができる。
還元電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。方法１−１および方法１−２に用いられる電解液と同様である。
その後、図８（Ｅ）に示されるように、検出工程Ｓ３５では、ユーザーは、析出工程Ｓ３４の第１作用電極４３の表面上の銀２１１ｂに起因する電流、電圧または電荷として、第１作用電極４３の表面上の銀２１１ｂがイオン化する際に生成される電流、電圧または電荷を測定する。ここでは、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の酸化電位が第１作用電極４３のみに印加される。また、印加と同時に、電気測定装置１３により、銀２１１ｂに起因して第１作用電極４３と対極との間の電流もしくは電圧または電荷量が測定される。
酸化電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。方法１−１および方法１−２に用いられる電解液と同様である。
検出工程Ｓ３５において、電流、電圧または電荷の測定方法は、方法１−１における電流、電圧または電荷の測定方法と同様である。
方法２−１では、被検物質の定量、被検物質の半定量および被検物質の有無の定性的な判定は、方法１−１および１−２と同様に行なうことができる。
このように、銀２１１ｂに起因する電流、電圧または電荷を測定するのに用いられる第１作用電極４３の表面積が全作用電極の表面積と比べて小さい。そのため、本実施形態に係る方法２−１では、作用電極の一部分のみで電流、電圧または電荷の測定を行なう。これにより、作用電極全体で金属イオン生成および金属イオン生成後の金属析出を行なう場合に比べて、ノイズが低減される。したがって、本実施形態に係る方法２−１によれば、例えば、試料における被検物質の濃度が低い場合であっても、大きいＳ／Ｎ比を得ることができる。さらに、低濃度領域における被検物質の量に比例する銀に基づくシグナルと被検物質の濃度との関係において、優れた直線性を得ることができる。したがって、本実施形態に係る方法２−１によれば、高い検出感度で被検物質を検出することができる。
７．被検物質の検出方法の変形例
つぎに、方法２−２の処理手順の一例を添付図面により説明する。図９においては、金粒子２２１ｂ上に被検物質２０６に結合する結合物質２２２が固定化された標識結合物質２２０と、図４（Ａ）に示されるパターンとなるように形成された第１作用電極４３および第２作用電極４４を含み、かつ捕捉物質を有する電極基板３０ｅとを用い、金を検出する場合を例として挙げて説明する。なお、図９は、図４（Ｂ）中の第１作用電極４３および第２作用電極４４のＡ−Ａ線での断面説明図である。本実施形態においては、第１作用電極４３および第２作用電極４４上の捕捉物質９１と被検物質２０６との間の生物学的相互作用を利用して第１作用電極４３および第２作用電極４４の表面に被検物質２０６を含む標識複合体２１５を固定化する。
本実施形態に係る方法２−２は、以下の点を除き、方法２−１と同様の処理手順によって行なうことができる。
１） 方法２−１では、銀２１１ｂである銀粒子を含む標識結合物質２１０を用いるのに対し、方法２−２では、金２２１ｂである金粒子を含む標識結合物質２２０を用いた点。
２） 方法２−１では、第１作用電極４３の表面上に析出した銀２１１ｂが再度イオン化する際の電流、電圧または電荷を測定し、当該電流、電圧または電荷に基づいて被検物質２０６を検出する。これに対し、方法１−２において、第１作用電極４３の表面上における金２２１ｂが析出する際の電流、電圧もしくは電荷を測定するか、金２２１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化を測定し、金２１１ｂの析出の際の電流、電圧もしくは電荷、金２１１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化に基づいて被検物質２０６を検出する点。
まず、図９（Ａ）に示されるように、標識工程Ｓ４１において、ユーザーは、被検物質２０６を含む試料２０５と、標識結合物質２２０とを混合し、被検物質２０６を標識結合物質２２０で標識する。なお、図中、２０７は、試料２０５に含まれる可能性のある夾雑物質を示す。
つぎに、図９（Ｂ）に示されるように、試料添加工程Ｓ４２において、ユーザーは、標識複合体２２５を含む試料を、第１作用電極４３、第２作用電極４４、図示しない対極５１および図示しない参照電極６１それぞれの露出部分を覆うように電極基板３０ｅに添加する。
試料添加工程Ｓ４２では、試料に含まれる標識複合体２２５の被検物質２０６が電極基板３０ｅの基板本体３１に形成された第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上の捕捉物質９１によって捕捉される。これにより、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面に、被検物質２０６と金２２１ｂとを含む標識複合体２２５が固定化される。
なお、本実施形態においても、試料２０５と、標識結合物質２２０と、捕捉物質９１との接触の順序は、特に限定されない。
試料添加工程Ｓ４２において、捕捉物質９１による標識複合体２２５中の被検物質２０６の捕捉は、方法２−１における試料添加工程Ｓ３２における被検物質２０６の捕捉と同様の条件下で行なうことができる。また、本実施形態においては、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面への標識複合体２２５の固定化は、被検物質２０６と捕捉物質９１との間の生物学的相互作用を用いて行なわれ得る。
試料添加工程Ｓ４２を行なったのち、第１作用電極４３、第２作用電極４４、図示しない対極５１および図示しない参照電極６１それぞれの露出部分を洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄に用いられる洗浄液は、方法１−１、１−２および２−１で用いられる洗浄液と同様である。
つぎに、図９（Ｃ）に示されるように、イオン化工程Ｓ４３において、ユーザーは、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に酸化電位を印加する。
イオン化工程Ｓ４３における酸化電位および酸化電位の印加時間は、方法１−１、１−２および方法２−１における酸化電位と同様である金属が酸化されて金属イオンが生成される電位である。これにより、図９（Ｃ）に示されるように、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方で標識複合体２２５中の金２２１ｂを酸化し、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方の近傍において、金イオン２２１ａを生成させることができる。
酸化電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。イオン化工程Ｓ４３に用いられる電解液は、方法１−１、１−２および２−１に用いられる電解液と同様である。
その後、図９（Ｄ）に示されるように、検出工程Ｓ４４において、第２作用電極４４には還元電位を印加せず、第１作用電極４３のみに還元電位を印加する。ここでは、検出装置１０の電源１４により、参照電極６１を基準とする所定の還元電位が第１作用電極４３のみに印加される。また、印加と同時に、電気測定装置１３により、第１作用電極４３の表面上に金２２１ｂが析出する際の電流、電圧もしくは電荷を測定するか、または第１作用電極４３上における金２２１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化を測定する。その後、第１作用電極上における金２２１ｂの析出の際の電流、電圧もしくは電荷、または金２２１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化に基づいて被検物質２０６を検出する。
検出工程Ｓ４４における還元電位および印加時間は、方法１−２における還元電位および印加時間と同様である。このように、検出工程Ｓ２４では、イオン化工程Ｓ２３で金イオン２２１ａを生成させるために酸化電位を印加した部分の面積よりも小さい面積を有する部分に還元電位を印加して金２２１ｂを析出させる。また、印加と同時に、電流、電圧または電荷を測定する。したがって、図９（Ｄ）に示されるように、イオン化工程で生成された金イオン２２１ａから生成される金２２１ｂを第１作用電極４３で集積し析出させることができる。
還元電位の印加は、電解液の存在下に行なわれる。検出工程Ｓ４４に用いられる電解液は、方法１−１、１−２および２−１に用いられる電解液と同様である。
検出工程Ｓ２４における金２２１ｂの析出の際の電流、電圧および電荷ならびに金２２１ｂの析出に伴う電流の変化、電圧の変化および電荷の変化は、方法１−１、１−２および２−１における電流、電圧または電荷の測定方法と同様の手法によって測定することができる。
方法２−２では、被検物質の定量、被検物質の半定量および被検物質の有無の定性的な判定は、方法２−１と同様に行うことができる。
８．被検物質の検出キット
本実施形態に係る被検物質の検出キットは、前述した電極基板と、金属粒子を含む試薬とを含む。本実施形態に係る被検物質の検出キットは、例えば、図１０に示されるように、電極基板３０と、金属粒子を含有する金属粒子懸濁液が入った試薬ボトル１０１と、還元電位または酸化電位の印加の際に用いられる電解液が入った試薬ボトル１０２と、各電極を洗浄するための洗浄液が入った試薬ボトル１０３とを含むキット１００として提供することができる。なお、電極基板３０、試薬ボトル１０１，１０２，１０３は、それぞれ別々に提供されてもよく、２種以上を組み合わせて提供してもよい。
電極基板３０としては、例えば、電極基板３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３０ｄなどが挙げられるが、特に限定されない。
金属粒子懸濁液に用いられる溶媒は、金属粒子を安定に保持することができる溶媒であればよい。金属粒子懸濁液に用いられる溶媒としては、例えば、水；ウシ血清アルブミンなどの生体分子を含んだＰＢＳ、ＴＢＳなどの緩衝液；塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩を低濃度に調整した水溶液などが挙げられるが、特に限定されない。金属粒子懸濁液における金属粒子の含有量は、被検物質検出キットの用途などに応じて適宜決定することができる。電解液および洗浄液は、方法１−１、１−２、２−１および２−２で用いられる電解液および洗浄液と同様である。
以下、実施例などにより本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１） 銀イオンの検出方法
（１）電極基板の作製
ガラスエポキシからなる基板本体３１の表面に、図３（Ａ）に示されるパターンとなるようにカーボンペーストを塗布し、乾燥させることにより、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１、参照電極本体６１ａおよび電極リード７１，７２，７３，７４を形成した。つぎに、参照電極本体６１ａの先端部に、銀／塩化銀を塗布し、参照電極６１を得た。各電極への試料の接触を維持し、かつ各電極リードへの試料の漏出を抑制するために、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１が露出し、かつ電極リード７１，７２，７３，７４それぞれの一部が覆われるように、レジスト絶縁膜〔図３（Ａ）中、８０参照〕を配置し、電極基板３０ａを得た。
第１作用電極４１の面積〔図３（Ａ）中、Ａ１〕を０．３ｍｍ２に設定した。また、第２作用電極４２の面積〔図３（Ａ）中、Ａ２〕を２．７ｍｍ２に設定した。これにより、［第１作用電極の面積Ａ１］／［全作用電極の面積（Ａ１＋Ａ２）］を１／１０に設定した。第１作用電極４１と第２作用電極４２との間の距離を５０μｍに設定した。
（２）銀の析出
実施例１（１）で得られた電極基板３０ａをポテンショスタット〔ビー・エー・エス（株）製、商品名：８３２Ｂ〕に接続した。つぎに、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１が覆われるように、試料〔硝酸ナトリウム水溶液（０ｐＭ硝酸銀）または１００ｐＭ硝酸銀を含む硝酸ナトリウム水溶液〕３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方に、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を３００秒間印加し、第１作用電極４１および第２作用電極４２の表面上に銀を析出させた。
つぎに、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１それぞれの表面上の液体を除去した。その後、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１を精製水で洗浄し、ついで、風乾させた。
（３）銀イオンの測定
実施例１（２）で銀を析出させた電極基板３０ａをポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を３０秒間印加した。その後、第１作用電極４１のみに、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を３００秒間印加した。その後、第１作用電極４１に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４１と対極５１との間に流れる電流を測定した。
実施例１において、試料に含まれる銀イオンに起因する電流を検出した結果を図１１に示す。図中、白色バーは硝酸ナトリウム水溶液（０ｐＭ硝酸銀）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは１００ｐＭ硝酸銀を含む硝酸ナトリウム水溶液を試料として用いたときの電流を示す。
図１１において、硝酸ナトリウム水溶液（０ｐＭ硝酸銀）を試料として用いたときの電流と、１００ｐＭ硝酸銀を含む硝酸ナトリウム水溶液を試料として用いたときの電流とから、実施例１の銀イオンの検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、２０８であった。
（比較例１） 銀イオンの検出方法
実施例１（２）で銀を析出させた電極基板３０ａをポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を３０秒間印加した。その後、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方に、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を３００秒間印加した。その後、第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれに対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４１と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４２と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例１において、試料に含まれる銀イオンに起因する電流を検出した結果を図１１に示す。なお、図１１において、比較例１の被検物質の検出方法で検出された電流は、第１作用電極４１と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４２と対極５１との間に流れる電流の合計である。図中、白色バーは硝酸ナトリウム水溶液（０ｐＭ硝酸銀）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは１００ｐＭ硝酸銀を含む硝酸ナトリウム水溶液を試料として用いたときの電流を示す。
図１１において、硝酸ナトリウム水溶液（０ｐＭ硝酸銀）を試料として用いたときの電流と、１００ｐＭ硝酸銀を含む硝酸ナトリウム水溶液を試料として用いたときの電流とから、比較例１の銀イオンの検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、２１であった。
本比較例では、実施例１と同じ電極基板を用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極および第２作用電極の両方で銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、本比較例の銀イオンの検出方法は、第１作用電極の面積と第２作用電極の面積との合計の面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例１および比較例１の結果から、実施例１の方法によると、従来法と同等のシグナルを確保し、かつ従来法よりもノイズを低減できることがわかった。
（比較例２） 銀イオンの検出方法
実施例１（２）で銀を析出させた電極基板３０ａをポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極のみに、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を３０秒間印加した。その後、第１作用電極４１のみに、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を３００秒間印加した。その後、第１作用電極４１に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４１と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例２において、試料に含まれる銀イオンに起因する電流を検出した結果を図１１に示す。図中、白色バーは硝酸ナトリウム水溶液（０ｐＭ硝酸銀）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは１００ｐＭ硝酸銀を含む硝酸ナトリウム水溶液を試料として用いたときの電流を示す。
図１１において、硝酸ナトリウム水溶液（０ｐＭ硝酸銀）を試料として用いたときの電流と、１００ｐＭ硝酸銀を含む硝酸ナトリウム水溶液を試料として用いたときの電流とから、比較例２の銀イオンの検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、３７であった。
本比較例では、実施例１と同じ電極基板を用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、本比較例の銀イオンの検出方法は、第１作用電極の面積と同じ面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例１および比較例２の結果から、実施例１の方法によると、ノイズは比較例２と同等に抑え、かつ比較例２よりも高いシグナルを得られることがわかった。
以上の結果から、実施例１の方法によると、比較例１および比較例２よりも高いＳ／Ｎ比を得られることがわかった。
（実施例２） 被検物質の検出方法
（１）電極基板本体の作製
実施例１（１）において、基板本体３１の表面に、図３に示されるパターンとなるようにカーボンペーストを塗布する代わりに、基板本体３１の表面に、図４（Ａ）に示されるパターンとなるようにカーボンペーストを塗布したことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、第１作用電極４３、第２作用電極４４、対極５１および参照電極６１を有する電極基板本体を得た。第１作用電極４３の面積〔図４（Ｂ）中、Ａ１〕を０．３ｍｍ２に設定した。また、第２作用電極４４の面積〔図４（Ｂ）中、Ａ２〕を２．７ｍｍ２に設定した。これにより、［第１作用電極の面積Ａ１］／［全作用電極の面積（Ａ１＋Ａ２）］を１／１０に設定した。第１作用電極４３と第２作用電極４４との間の距離を５０μｍに設定した。
（２）１次抗体の固定
抗ＨＢｓ抗原１次抗体溶液〔（株）シスメックスにて調製〕を抗ＨＢｓ抗原１次抗体の濃度が１００μｇ／ｍＬになるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に添加し、１次抗体溶液を得た。得られた１次抗体溶液３μＬを、実施例２（１）で得られた電極基板本体の第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に滴下した。その後、電極基板本体を高湿度条件〔測定範囲（６０体積％）以上〕下に室温（２５℃）で２時間静置した。つぎに、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上の溶液を除去した。リン酸緩衝生理食塩水４μＬを第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に滴下し、ピペッティングで洗浄を行なった。洗浄後、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上のリン酸緩衝生理食塩水を除去した。
（３）ブロッキング処理
実施例２（２）で１次抗体が固定された電極基板本体の第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に１０％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水４μＬを滴下した。その後、抗体固定電極基板を高湿度条件下に４℃で一晩静置した。つぎに、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上の溶液を除去した。リン酸緩衝生理食塩水４μＬを第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に滴下し、ピペッティングで洗浄を行なった。洗浄後、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上のリン酸緩衝生理食塩水を除去し、電極基板３０ｂを得た。
（４）標識複合体の作製
抗ＨＢｓ抗原２次抗体溶液〔（株）シスメックス製〕を抗ＨＢｓ抗原２次抗体の濃度が１００μｇ／ｍＬになるようにリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に添加し、２次抗体溶液を得た。
１Ｍ塩酸を用いて銀ナノ粒子溶液〔シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製、銀ナノ粒子の直径：６０ｎｍ、銀ナノ粒子の濃度：０．０２ｍｇ／ｍＬ〕のｐＨを６．２に調整した。ｐＨ調整後の銀ナノ粒子溶液９００μＬに１０％（ｗ／ｖ）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））溶液１０．１μＬを添加した。得られた混合液に２次抗体溶液１００μＬを添加し、室温で２０分間静置した。つぎに、得られた混合液に１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔ溶液（以下、「ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液」ともいう）４００μＬを添加した。その後、得られた混合液を６５００×ｇで４℃での２０分間の遠心分離に供し、上澄み液を除去した。得られた残渣に、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液１ｍＬを添加した。得られた混合液を６５００×ｇで４℃での２０分間の遠心分離に供し、上澄み液を除去した。得られた残渣に、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液１ｍＬを添加した。これらの遠心分離および上澄み液の除去の操作をさらに２回行なった。得られた残渣に、１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡと０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）とを含有したリン酸緩衝生理食塩水３００μＬを添加し、標識複合体の溶液を得た。
（５）被検物質の固定
被検物質であるＨＢｓ抗原〔シスメックス（株）製、商品名：ＨＩＳＣＬ ＨＢｓＡｇキャリブレータ、２５００ＩＵ／ｍＬ〕をＨＢｓ抗原の濃度が１２．５ＩＵ／ｍＬとなるようにウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」ともいう）に添加し、ＨＢｓ抗原含有ＦＢＳを得た。つぎに、試料としてのＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）またはＨＢｓ抗原含有ＦＢＳと、実施例２（２）で得られた標識複合体の溶液とを、［試料］／［標識複合体の溶液］（体積比）が３／１となるように混合した。
得られた混合液４μＬを、実施例２（３）で得られた電極基板３０ｂの第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に滴下した。その後、電極基板３０ｂを高湿度条件下に室温で４５分間静置することにより、抗原・抗体反応を行なった。つぎに、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上の溶液を除去した。リン酸緩衝生理食塩水４μＬを第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に滴下し、ピペッティングで洗浄を行なった。洗浄後、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上のリン酸緩衝生理食塩水を除去した。精製水１．５ｍＬを用いて第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれを洗浄し、ついで、風乾させた。これにより、電極基板３０ｂの第１作用電極４３および第２作用電極４４上に被検物質を固定した。
（６）電気化学測定
実施例２（５）で被検物質を固定化した電極基板３０ｂを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４３、第２作用電極４４、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩酸水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を１５秒間印加した。その後、第１作用電極４３のみに、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を８分間印加した。その後、第１作用電極４３に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流を測定した。
実施例２において、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を図１２に示す。図中、白色バーはＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは試料として１２．５ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流を示す。
図１２において、ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流と、試料として１２．５ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流とから、実施例２の被検物質の検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、３３．７であった。
（比較例３） 被検物質の検出方法
実施例２（５）で被検物質を固定化した電極基板３０ｂを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４３、第２作用電極４４、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍの塩酸３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４３と第２作用電極４４の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を１５秒間印加した。その後、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を８分間印加した。その後、第１作用電極４３および第２作用電極４４に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖ〜０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４４と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例３において、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を図１２に示す。なお、図１２において、比較例３の被検物質の検出方法で検出された電流は、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４４と対極５１との間に流れる電流の合計である。図中、白色バーはＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは試料として１２．５ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流を示す。
図１２において、ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流と、試料として１２．５ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流とから、比較例３の被検物質の検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、６．８であった。
本比較例では、実施例２と同じ電極基板を用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極および第２作用電極の両方で銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、本比較例の被検物質の検出方法は、第１作用電極の面積と第２作用電極の面積との合計の面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例２および比較例３の結果から、実施例２の方法によると、従来法と同等のシグナルを確保し、かつ従来法よりもノイズを低減できることがわかった。
（比較例４） 被検物質の検出方法
実施例２（５）で被検物質を固定化した電極基板３０ｂを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４３、第２作用電極４４、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍの塩酸３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４３に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を１５秒間印加した。その後、第１作用電極４３に、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を８分間印加した。その後、第１作用電極４３に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖ〜０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例４において、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を図１２に示す。図中、白色バーはＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは試料として１２．５ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流を示す。
図１２において、ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流と、試料として１２．５ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流とから、比較例４の被検物質の検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、１３．２であった。
本比較例では、実施例２と同じ電極基板を用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、本比較例の被検物質の検出方法は、第１作用電極の面積と同じ面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例２および比較例４の結果から、実施例２の方法によると、ノイズを比較例４の方法と同等に抑え、かつ比較例４の方法よりも高いシグナルを得られることがわかった。
以上の結果から、実施例２の方法によると、比較例３および比較例４の方法よりも高いＳ／Ｎ比を得られることがわかった。
（実施例３） 被検物質の検出方法（定量測定）
（１）被検物質の固定
被検物質であるＨＢｓ抗原〔シスメックス（株）製、商品名：ＨＩＳＣＬ ＨＢｓＡｇキャリブレータ、２５００ＩＵ／ｍＬ〕をＨＢｓ抗原の濃度が０．０９、０．１９、０．７８、３．１２、１２．５または５０ＩＵ／ｍＬとなるようにＦＢＳに添加し、ＨＢｓ抗原含有ＦＢＳを得た。つぎに、試料としてのＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）またはＨＢｓ抗原含有ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０．０９、０．１９、０．７８、３．１２、１２．５または５０ＩＵ／ｍＬ）と、実施例２（２）で得られた標識複合体の溶液とを、［試料］／［標識複合体の溶液］（体積比）が３／１となるように混合した。
得られた混合液４μＬを、実施例２（３）で得られた電極基板３０ｂの第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に滴下した。その後、電極基板３０ｂを高湿度条件下に室温で４５分間静置することにより、抗原・抗体反応を行なった。つぎに、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上の溶液を除去した。リン酸緩衝生理食塩水４μＬを第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に滴下し、ピペッティングで洗浄を行なった。洗浄後、第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上のリン酸緩衝生理食塩水を除去した。精製水１．５ｍＬを用いて第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれを洗浄し、ついで、風乾させた。これにより、電極基板３０ｂの第１作用電極４３および第２作用電極４４それぞれの表面上に被検物質を固定した。
（２）電気化学測定
実施例２（６）と同様の操作を行なうことにより、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流を測定した。
実施例３において、試料における被検物質の濃度と、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流との関係を調べた結果を図１３に示す。図中、白丸は実施例３の被検物質の検出方法によって試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を測定した結果を示す。
（比較例５） 被検物質の検出方法（定量測定）
実施例３（１）で被検物質を固定化した電極基板３０ｂを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４３、第２作用電極４４、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩酸水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を１５秒間印加した。その後、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を８分間印加した。その後、第１作用電極４３および第２作用電極４４に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖ〜０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４４と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例５において、試料における被検物質の濃度と、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流との関係を調べた結果を図１３に示す。なお、図１３において、比較例５の被検物質の検出方法で検出された電流は、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４４と対極５１との間に流れる電流の合計である。図中、黒丸は比較例５の被検物質の検出方法によって試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を測定した結果を示す。
図１３に示されるように、実施例３の被検物質の検出方法では、低濃度（０．０９〜０．７８ＩＵ／ｍＬ)のＨＢｓ抗原を含む試料を用いた場合でも、ノイズが抑制され、低濃度のＨＢｓ抗原由来の微量電流を定量的に測定でき、低濃度のＨＢｓ抗原の定量的な検出が可能であることがわかる。これに対し、比較例５の被検物質の検出方法では、低濃度（０．０９〜０．７８ＩＵ／ｍＬ)のＨＢｓ抗原の定量測定が困難であることがわかる。また、図１３において、ＨＢｓ抗原濃度：０ＩＵ／ｍＬに対する電流値＋３ＳＤ（標準偏差）から算出した各検出方法での検出限界は、実施例３では０．０９ＩＵ／ｍＬであり、比較例５では０．７８ＩＵ／ｍＬであった。つまり、実施例３の検出方法の感度は、比較例５の検出方法の感度の８倍程度高かった。
本比較例では、実施例３と同じ電極基板が用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極および第２作用電極の両方で銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、第１作用電極の面積と同じ面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例３および比較例５の結果から、実施例３の方法によると、低濃度のＨＢｓ抗原を含む試料を用いた場合でも、従来の被検物質の検出方法を行なったときの検出感度よりも向上することがわかった。
（実施例４） 被検物質の検出方法（定量測定）
（１）１次抗体の固定
抗ＨＢｓ抗原１次抗体溶液を抗ＨＢｓ抗原１次抗体の濃度が１００μｇ／ｍＬになるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に添加し、１次抗体溶液を得た。得られた１次抗体溶液３μＬを、実施例１（１）で得られた電極基板３０ａの第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上に滴下した。その後、電極基板３０ａを高湿度条件下に室温（２５℃）で２時間静置した。つぎに、第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上の溶液を除去した。リン酸緩衝生理食塩水４μＬを第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上に滴下し、ピペッティングで洗浄を行なった。洗浄後、第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上のリン酸緩衝生理食塩水を除去した。
（２）ブロッキング処理
実施例４（１）で１次抗体が固定された電極基板本体の第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上に１０％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水４μＬを滴下した。その後、電極基板本体を高湿度条件下に４℃で一晩静置した。つぎに、第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上の溶液を除去した。リン酸緩衝生理食塩水４μＬを第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上に滴下し、ピペッティングで洗浄を行なった。洗浄後、第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上のリン酸緩衝生理食塩水を除去し、図３（Ａ）に示される電極基板３０ｃを得た。
（３）被検物質の固定
被検物質であるＨＢｓ抗原〔シスメックス（株）製、商品名：ＨＩＳＣＬ ＨＢｓＡｇキャリブレータ、２５００ＩＵ／ｍＬ〕をＨＢｓ抗原の濃度が０．０９、０．１９、０．７８、３．１２、１２．５または５０ＩＵ／ｍＬとなるようにＦＢＳに添加し、ＨＢｓ抗原含有ＦＢＳを得た。つぎに、試料としてのＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）またはＨＢｓ抗原含有ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０．０９、０．１９、０．７８、３．１２、１２．５または５０ＩＵ／ｍＬ）と、実施例２（２）で得られた標識複合体の溶液とを、［試料］／［標識複合体の溶液］（体積比）が３／１となるように混合した。
得られた混合液４μＬを、実施例４（２）で得られた電極基板３０ｃの第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上に滴下した。その後、電極基板３０ｃを高湿度条件下に室温で２５分間浸透させながらインキュベーションすることにより、抗原・抗体反応を行なった。つぎに、第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上の溶液を除去した。リン酸緩衝生理食塩水４μＬを第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上に滴下し、ピペッティングで洗浄を行なった。洗浄後、第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上のリン酸緩衝生理食塩水を除去した。精製水１．５ｍＬを用いて第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれを洗浄し、ついで、風乾させた。これにより、電極基板３０ｃの第１作用電極４１および第２作用電極４２それぞれの表面上に被検物質を固定した。
（４）電気化学測定
実施例４（３）で被検物質を固定化した電極基板３０ｃを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩酸水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を１５秒間印加した。その後、第１作用電極４１のみに、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を５分間印加した。その後、第１作用電極４１に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４１と対極５１との間に流れる電流を測定した。
実施例４において、試料における被検物質の濃度と、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流との関係を調べた結果を図１４に示す。図中、白丸は実施例４の被検物質の検出方法によって試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を測定した結果を示す。
（比較例６） 被検物質の検出方法（定量測定）
実施例４（３）で被検物質を固定化した電極基板３０ｃを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４１、第２作用電極４２、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩酸水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を１５秒間印加した。その後、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方に、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を５分間印加した。その後、第１作用電極４１および第２作用電極４２の両方に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４１と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４２と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例６において、試料における被検物質の濃度と、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流との関係を調べた結果を図１４に示す。図中、黒丸は比較例６の被検物質の検出方法によって試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を測定した結果を示す。
図１４に示された結果から、実施例４の被検物質の検出方法では、実施例３の被検物質の検出方法（図１４の白丸参照）と同様に、低濃度（０．０９〜０．７８ＩＵ／ｍＬ)のＨＢｓ抗原を含む試料を用いた場合でも、ノイズが抑制され、低濃度のＨＢｓ抗原由来の微量電流を定量的に測定でき、低濃度のＨＢｓ抗原の定量的な検出が可能であることがわかる。これに対し、比較例６の被検物質の検出方法では、低濃度（０．０９〜０．７８ＩＵ／ｍＬ)のＨＢｓ抗原の定量測定が困難であることがわかる。
本比較例では、実施例４と同じ電極基板が用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極および第２作用電極の両方で銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、第１作用電極の面積と同じ面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例４および比較例６の結果から、実施例４の方法によると、低濃度のＨＢｓ抗原を含む試料を用いた場合でも、従来の被検物質の検出方法を行なったときの検出感度よりも向上することがわかった。
（実施例５） 被検物質の検出方法
実施例１〜４で用いられた電極基板とは第１作用電極と第２作用電極との面積比が異なる電極基板を用い、被検物質の検出感度を検証した。
（１）電極基板の作製
実施例１（１）において、基板本体３１の表面に、図３に示されるパターンとなるようにカーボンペーストを塗布する代わりに、基板本体３１の表面に、図５に示されるパターンとなるようにカーボンペーストを塗布したことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、第１作用電極４５、第２作用電極４６、対極５１および参照電極６１を有する電極基板本体を得た。図５において、第１作用電極４５は、電極リード７１と一体的に構成されている。図５（Ｂ）においては、第１作用電極４５は、レジスト絶縁膜８０に覆われていない露出した部分である。この部分において、金属の析出、金属のイオン化などが行なわれた。図５（Ｂ）において、第１作用電極４５は、図５（Ｂ）のＡ１で示される部分である。また、第２作用電極４６は、電極リード７２と一体的に構成されている。図５（Ｂ）においては、第２作用電極４６は、レジスト絶縁膜８０に覆われていない露出した部分である。この部分において、金属のイオン化などが行なわれた。図５（Ｂ）においては、第１作用電極４５および第２作用電極４６にハッチを付している。第１作用電極４５の面積〔図５（Ｂ）中、Ａ１参照〕を０．４５ｍｍ２に設定した。また、第２作用電極４６の面積〔図５（Ｂ）中、Ａ２参照〕を２．５５ｍｍ２に設定した。［第１作用電極の面積（Ａ１）］／［全作用電極の面積（Ａ１＋Ａ２）］を３／２０に設定した。第１作用電極４５と第２作用電極４６との間の距離を５０μｍに設定した。
（２）１次抗体の固定
実施例２（２）において、実施例２（１）で得られた電極基板本体を用いる代わりに、実施例５（１）で得られた電極基板本体を用いたことを除き、実施例２（２）と同様の操作を行ない、実施例５（１）で得られた電極基板本体に１次抗体を固定した。
（３）ブロッキング処理
実施例２（３）において、実施例２（２）で１次抗体が固定された電極基板本体を用いる代わりに、実施例５（２）で１次抗体が固定された電極基板本体を用いたことを除き、実施例２（３）と同様の操作を行ない、電極基板３０ｄを得た。
（４）被検物質の固定
被検物質であるＨＢｓ抗原〔シスメックス（株）製、商品名：ＨＩＳＣＬ ＨＢｓＡｇキャリブレータ、２５００ＩＵ／ｍＬ〕をＨＢｓ抗原の濃度が３．１３ＩＵ／ｍＬとなるようにＦＢＳに添加し、ＨＢｓ抗原含有ＦＢＳを得た。つぎに、試料としてのＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）またはＨＢｓ抗原含有ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：３．１３ＩＵ／ｍＬ）と、実施例２（２）で得られた標識複合体の溶液とを、［試料］／［標識複合体の溶液］（体積比）が１／１となるように混合した。
得られた混合液４μＬを、実施例５（３）で得られた電極基板３０ｄの第１作用電極４５および第２作用電極４６それぞれの表面上に滴下した。その後、電極基板を高湿度条件下に室温で９０分間静置することにより、抗原・抗体反応を行なった。つぎに、第１作用電極４５および第２作用電極４６それぞれの表面上の溶液を除去した。リン酸緩衝生理食塩水４μＬを第１作用電極４５および第２作用電極４６それぞれの表面上に滴下し、ピペッティングで洗浄を行なった。洗浄後、第１作用電極４５および第２作用電極４６それぞれの表面上のリン酸緩衝生理食塩水を除去した。精製水１．５ｍＬを用いて第１作用電極４５および第２作用電極４６それぞれを洗浄し、ついで、風乾させた。これにより、電極基板３０ｄの第１作用電極４５および第２作用電極４６それぞれの表面上に被検物質を固定した。
（５）電気化学測定
実施例５（４）で被検物質を固定化した電極基板３０ｄを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４５、第２作用電極４６、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩酸水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４５および第２作用電極４６の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を３０秒間印加した。その後、第１作用電極４５のみに、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を４分間印加した。その後、第１作用電極４５に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４５と対極５１との間に流れる電流を測定した。
実施例５において、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を図１５に示す。図中、白色バーはＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは試料として３．１３ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流を示す。
図１５において、ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流と、試料として３．１３ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流とから、実施例５の被検物質の検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、２３．５であった。
（比較例７） 被検物質の検出方法
実施例５（４）で被検物質を固定化した電極基板３０ｄを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４５、第２作用電極４６、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩酸水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４５および第２作用電極４６の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を３０秒間印加した。その後、第１作用電極４５および第２作用電極４６の両方に、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を４分間印加した。その後、第１作用電極４５に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４５と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４６と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例７において、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を図１５に示す。なお、図１５において、比較例７の被検物質の検出方法で検出された電流は、第１作用電極４５と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４６と対極５１との間に流れる電流の合計である。図中、白色バーはＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは試料として３．１３ＩＵ／ｍＬのＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流を示す。
図１５に示されるように、実施例５の被検物質の検出方法では、比較例７の被検物質の検出方法と比べて電極由来のノイズが低いが、ＨＢｓ抗原由来のシグナルが比較例７の被検物質の検出方法と同程度であることがわかる。図１５において、ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流と、試料として３．１３ＩＵ／ｍＬのＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流とから、比較例７の被検物質の検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、４．１であった。
本比較例では、実施例５と同じ電極基板を用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極および第２作用電極の両方で銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、本比較例の被検物質の検出方法は、第１作用電極の面積と第２作用電極の面積との合計の面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例５および比較例７の結果から、実施例５の方法によると、従来法と同等のシグナルを確保し、かつ従来法よりもノイズを低減できることがわかった。
（実施例６） 被検物質の検出方法
第１作用電極４３と第２作用電極４４との間の距離を５０μｍとする代わりに、第１作用電極４３と第２作用電極４４との間の距離を１００μｍとしたことを除き、実施例２と同様の操作を行ない、電極基板３０ｅを得た。得られた電極基板３０ｅを用い、実施例２と同様の操作を行ない、測定を行なった。
実施例６において、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を図１６に示す。図中、白色バーはＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは試料として３．１３ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流を示す。
図１６において、ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流と、試料として３．１３ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流とから、実施例５の被検物質の検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、２５．９であった。
（比較例８）
実施例６で被検物質を固定化した電極基板３０ｅを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４３、第２作用電極４４、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩酸水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を３０秒間印加した。その後、第１作用電極４３および第２作用電極４４の両方に、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を４分間印加した。その後、第１作用電極４３に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４３および第２作用電極４４と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例８において、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を図１６に示す。なお、図１６において、比較例７の被検物質の検出方法で検出された電流は、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流および第２作用電極４４と対極５１との間に流れる電流の合計である。図中、白色バーはＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは試料として３．１３ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流を示す。
図１６において、ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流と、試料として３．１３ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流とから、比較例８の被検物質の検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、１．１であった。
本比較例では、実施例６と同じ電極基板を用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極および第２作用電極の両方で銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、本比較例の被検物質の検出方法は、第１作用電極の面積と第２作用電極の面積との合計の面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例６および比較例８の結果から、実施例６の方法によると、従来法と同等のシグナルを確保し、かつ従来法よりもノイズを低減できることがわかった。
（比較例９）
実施例６で被検物質を固定化した電極基板３０ｅを、ポテンショスタットに接続した。つぎに、第１作用電極４３、第２作用電極４４、対極５１および参照電極６１が覆われるように、０．０５Ｍ塩酸水溶液３０μＬを滴下した。滴下終了後、第１作用電極４３のみに、参照電極６１基準で２．１Ｖの電位を３０秒間印加した。その後、第１作用電極４３のみに、参照電極６１基準で−１．０Ｖの電位を４分間印加した。その後、第１作用電極４３に対し、微分パルスボルタンメトリー法で、−０．４Ｖから０．４Ｖ間で電位を掃引し、第１作用電極４３と対極５１との間に流れる電流を測定した。
比較例９において、試料に含まれる被検物質に結合した標識複合体中の銀ナノ粒子に起因する電流を検出した結果を図１６に示す。図中、白色バーはＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流、ハッチが付されたバーは試料として３．１３ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流を示す。
図１６において、ＦＢＳ（ＨＢｓ抗原の濃度：０ＩＵ／ｍＬ）を試料として用いたときの電流と、試料として３．１３ＩＵ／ｍＬＨＢｓ抗原を含むＦＢＳを用いたときの電流とから、比較例９の被検物質の検出方法を行なったときのＳ／Ｎ比を求めた。その結果、Ｓ／Ｎ比は、１７．２であった。
本比較例では、実施例６と同じ電極基板を用いた。しかし、本比較例では、第１作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なった。そのため、本比較例の被検物質の検出方法は、第１作用電極の面積と同じ面積を有する１つの作用電極のみで銀の析出およびイオン化を行なう従来の方法と同等と考えることができる。実施例６および比較例９の結果から、実施例６の方法によると、ノイズを比較例９の方法と同等に抑え、かつ比較例９の方法よりも高いシグナルを得られることがわかった。
以上の結果から、実施例２の方法によると、比較例８および比較例９の方法よりも高いＳ／Ｎ比を得られることがわかった。
１０ 検出装置
１１ 基板受入部
１２ ディスプレイ
１３ 電気測定装置
１４ 電源
１５ 変換部
１６ 制御部
３０ 電極基板
３０ａ 電極基板
３０ｂ 電極基板
３０ｃ 電極基板
３０ｄ 電極基板
３０ｅ 電極基板
３１ 基板本体
４１ 第１作用電極
４２ 第２作用電極
４３ 第１作用電極
４４ 第２作用電極
４５ 第１作用電極
４６ 第２作用電極
５１ 対極
６１ 参照電極
６１ａ 参照電極本体
７１ 電極リード
７２ 電極リード
７３ 電極リード
７４ 電極リード
８０ レジスト絶縁膜
９１ 捕捉物質
１００ キット
１０１ 試薬ボトル
１０２ 試薬ボトル
１０３ 試薬ボトル
２０１ 試料
２０２ 試料
２０５ 試料
２０６ 被検物質
２０７ 夾雑物質
２１０ 標識結合物質
２１１ａ 銀イオン
２１１ｂ 銀
２１２ 結合物質
２１５ 標識複合体
２２０ 標識結合物質
２２１ａ 金イオン
２２１ｂ 金
２２２ 結合物質
２２５ 標識複合体

Claims (16)

  1. 第１作用電極と第２作用電極と対極とを含む電極基板の第１作用電極上および第２作用電極の表面に、被検物質と金属粒子とを含む複合体を固定化する固定化工程、
    前記第１作用電極および第２作用電極に酸化電位を印加することにより、前記第１作用電極および前記第２作用電極に固定化された複合体中の金属粒子から金属イオンを生成させるイオン化工程、
    前記第２作用電極には還元電位を印加せず、前記第１作用電極に還元電位を印加することにより、前記金属イオンから生成する金属を前記第１作用電極の表面に析出させる析出工程、および
    前記析出工程で析出させる金属に起因する電流、電圧または電荷を測定する測定工程、
    を含み、
    前記第１作用電極の面積が前記第２作用電極の面積よりも小さい、被検物質の検出方法。
  2. 前記測定工程において、前記析出工程で前記第１作用電極の表面に析出させた前記金属から金属イオンを生成させる際に生じる電流、電圧または電荷を測定し、
    前記電流、電圧または電荷に基づいて被検物質を検出する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記測定工程において、前記析出工程で前記第１作用電極の表面に金属が析出する際の電流、電圧もしくは電荷を測定するか、または前記析出工程で前記第１作用電極の表面における金属の析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化を測定し、
    前記第１作用電極の表面における金属の析出の際の電流、電圧もしくは電荷、または前記金属の析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化に基づいて被検物質を検出する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記金属粒子上に、被検物質に結合する結合物質が固定化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記結合物質が、抗体である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記第１作用電極及び前記第２作用電極の表面に、被検物質に結合する捕捉物質が固定化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記捕捉物質が、抗体である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記第１作用電極の面積Ａ１及び前記第２作用電極の面積Ａ２により表される、比（Ａ１／（Ａ１＋Ａ２））が、３／２０以下である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 第１作用電極と第２作用電極と対極とを含む電極基板の作用電極の表面に、金属イオンを含む試料を接触させ、前記作用電極に還元電位を印加することにより、前記金属イオンから生成する金属を前記第１作用電極および前記第２作用電極の表面に析出させる第１析出工程、
    前記第１作用電極および前記第２作用電極に酸化電位を印加することにより、前記第１析出工程で析出させた金属から金属イオンを生成させるイオン化工程、
    前記第２作用電極には還元電位を印加せず、前記第１作用電極に還元電位を印加することにより、前記金属イオンから生成する金属を、前記第１作用電極の表面に析出させる第２析出工程、および
    前記第２析出工程で析出させる金属に起因する電流、電圧または電荷を測定する測定工程、
    を含み、
    前記第１作用電極の面積が前記第２作用電極の面積よりも小さい、金属イオンの検出方法。
  10. 前記測定工程において、前記第２析出工程で前記第１作用電極の表面に析出させた前記金属から金属イオンを生成させる際に生じる電流、電圧または電荷を測定し、
    前記電流、電圧または電荷に基づいて金属イオンを検出する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記測定工程において、前記第２析出工程で前記第１作用電極の表面に金属が析出する際の電流、電圧もしくは電荷を測定するか、または前記第２析出工程で前記第１作用電極における金属の析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化を測定し、
    前記第１作用電極における金属の析出の際の電流、電圧もしくは電荷、または前記金属の析出に伴う電流の変化、電圧の変化もしくは電荷の変化に基づいて金属イオンを検出する、請求項９に記載の方法。
  12. 前記金属が、亜鉛、鉛、銅、水銀、カドミウム、金または銀である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記第１作用電極の面積Ａ１及び前記第２作用電極の面積Ａ２により表される、比（Ａ１／（Ａ１＋Ａ２））が、３／２０以下である、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 作用電極と、対極とを備え、
    前記作用電極が、酸化電位の印加と前記酸化電位の印加後の還元電位の印加とが行なわれる第１作用電極と、酸化電位の印加が行なわれ、かつ前記酸化電位の印加後還元電位の印加が行なわれない第２作用電極とを含み、
    前記第１作用電極の面積が前記第２作用電極の面積よりも小さい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の被検物質の検出方法または請求項９〜１２のいずれか１項に記載の金属イオンの検出方法に用いるための電極基板。
  15. 前記第１作用電極の面積Ａ１及び前記第２作用電極の面積Ａ２により表される、比（Ａ１／（Ａ１＋Ａ２））が、３／２０以下である、請求項１４に記載の電極基板。
  16. 請求項１４または１５に記載の電極基板と、金属粒子を含む試薬とを含む、被検物質の検出キット。
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