JP2016085168A - 被検物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】精度よく被検物質を検出することができる被検物質の検出方法を提供する。【解決手段】作用電極と、対極とを用い、試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を作用電極上に形成させて被検物質を検出する被検物質の検出方法において、金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷の測定に用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する。前記測定溶液として、前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液またはｐＨが３．５以上の測定溶液を用いる。【選択図】なし
Description
本発明は、被検物質の検出方法に関する。より詳しくは、試料に含まれる生体関連物質である被検物質の検出、定量などに有用な、被検物質の検出方法に関する。
試料に含まれる生体関連物質である被検物質を検出する方法としては、例えば、被検物質と、当該被検物質を特異的に認識する特異的結合物質と、金属微粒子とを用い、生物学的相互作用（例えば、抗原抗体反応など）を利用して被検物質の量に対応する量の金属微粒子を作用電極の表面近傍に集積させ、集積された金属微粒子の量を電気化学的に測定することにより、被検物質を検出する方法が知られている（例えば、特許文献１および２、非特許文献１および２を参照）。
特許文献１および非特許文献１には、生物学的相互作用を利用して被検物質の量に対応する量の金微粒子を作用電極の表面近傍に集積させた後、集積した金微粒子を電気化学的に酸化して溶出させ、溶出された金イオンを還元する際の電流を測定することにより、被検物質を検出する方法が開示されている。また、特許文献２または非特許文献２には、生物学的相互作用を利用して被検物質の量に対応する量の銀微粒子を作用電極の表面近傍に集積させた後、集積した銀微粒子を電気化学的に酸化し溶出させ、溶出した銀イオンを還元して作用電極表面に析出させ、析出した銀を電気化学的に酸化させる際の電流を測定する方法が記載されている。
イデガミ（Ｋｏｕｔａｒｏｕ Ｉｄｅｇａｍｉ）ら、「ヒト絨毛性ゴナドトロピンの高感度検出のための金ナノ粒子に基づく酸化還元シグナル増強（Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ）」、エレクトロアナリシス（Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｙｓｉｓ）、２７ ＳＥＰ ２００７年９月２７日公開、第２０巻、ｐｐ．１４−２１
チカエ（Ｍｉｙｕｋｉ Ｃｈｉｋａｅ）ら、「酸化／還元シグナル増強によるメタロイムノアッセイの銀ナノ粒子標識の高感度電気化学的検出方法（Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｌａｂｅｌｓ ｉｎ Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｗｉｔｈ Ｐｒｅｏｘｉｄａｔｉｏｎ／Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」、エレクトロケミストリー（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１０年発行、第７８巻、ｐｐ．７４８−７５３
しかしながら、前記方法よりも、精度よく被検物質を測定することができる方法が求められている。
本発明は、前記従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、精度よく被検物質を検出することができる被検物質の検出方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、従来のように洗浄のために用いられ、測定溶液としては用いられない溶液（以下、本明細書において「洗浄専用液」ともいう）を用いることにより、測定結果にばらつきが生じることを見出した。そして、本発明者らは、洗浄液としても用いることができ、かつ測定溶液としても用いることができる溶液を開発し、当該溶液により、測定結果のばらつきを抑制し、精度よく測定することに成功した。
すなわち、本発明の被検物質の検出方法は、１つの側面では、作用電極と、対極とを用い、試料中に含まれる被検物質を検出する被検物質の検出方法であって、
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を、作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
を含み、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液が、前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液であることを特徴とする方法（以下、「検出方法１」ともいう）である。
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を、作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
を含み、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液が、前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液であることを特徴とする方法（以下、「検出方法１」ともいう）である。
前記検出方法１によれば、前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄するので、洗浄専用液を用いることなく、簡便な操作で被検物質を検出することができ、しかも洗浄専用液が残存することによって生じる金属微粒子の電気化学的測定に用いられる測定溶液の組成や濃度の変動を抑制して被検物質の検出の精度のばらつきの発生を抑制することができる。また、前記検出方法１によれば、従来用いられていた洗浄専用液と測定溶液とが共通化されており、当該洗浄専用液が不要となるので、必要な試薬の種類を低減することができる。したがって、前記検出方法１によれば、測定操作が簡便化され、人為的な試薬の取り扱いミスなどをも防ぐことができる。さらに、検出方法１によれば、前記測定溶液として、前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液が用いられているので、ノイズを生じる原因となる非特異的な金属微粒子の作用電極への吸着を抑制することができ、十分な検出感度を確保することができる。
前記検出方法１において、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨが、前記金属微粒子のゼータ電位と前記作用電極のゼータ電位とが同符号の電位となるｐＨであることが好ましい。
また、前記検出方法１において、前記測定溶液のｐＨが３．５以上であることが好ましい。
また、前記検出方法１において、前記測定溶液のｐＨが３．５以上であることが好ましい。
本発明の被検物質の検出方法は、他の側面では、作用電極と、対極とを用い、試料中に含まれる被検物質を検出する被検物質の検出方法であって、
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液のｐＨが、３．５以上であることを特徴とする方法（以下、「検出方法２」ともいう）である。
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液のｐＨが、３．５以上であることを特徴とする方法（以下、「検出方法２」ともいう）である。
前記検出方法２によれば、前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄するので、前記検出方法１と同様の作用効果を得ることができる。また、前記検出方法２によれば、３．５以上の測定溶液が用いられているので、ノイズを生じる原因となる非特異的な金属微粒子の作用電極への吸着を抑制することができ、十分な検出感度を確保することができる。
前記検出方法２において、前記作用電極は、カーボンを含むことが好ましい。
前記検出方法１および２においては、前記金属微粒子が、金、銀、銅、白金およびインジウムからなる群より選択される少なくとも1種の金属からなる微粒子であることが好ましい。
また、前記検出方法１および２では、前記電気化学的測定法が、微分パルスボルタンメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法およびクロノアンペロメトリー法からなる群より選ばれた方法であることが好ましい。
さらに、前記検出方法１および２では、前記工程（Ｃ）において、前記作用電極に集められた金属微粒子の金属を、前記作用電極の表面に析出させ、析出した金属イオンを酸化還元反応に供し、前記酸化還元反応の際に生じる電流、電圧または電荷を測定することが好ましい。
また、前記検出方法１および２では、前記電気化学的測定法が、微分パルスボルタンメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法およびクロノアンペロメトリー法からなる群より選ばれた方法であることが好ましい。
さらに、前記検出方法１および２では、前記工程（Ｃ）において、前記作用電極に集められた金属微粒子の金属を、前記作用電極の表面に析出させ、析出した金属イオンを酸化還元反応に供し、前記酸化還元反応の際に生じる電流、電圧または電荷を測定することが好ましい。
本発明の被検物質の検出方法によれば、精度よく被検物質を検出することができる。
［検出装置の構成］
まず、本発明の一実施の形態に係る被検物質の検出方法に用いる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図１において、検出装置１は、電極基板３０が挿入される基板受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを備えている。
検出装置１は、図２に示されるように、ディスプレイ１２と、電流計１３と、電源１４と、Ａ／Ｄ変換部１５と、制御部１６とを備えている。
電流計１３は、標識物質である金属微粒子の酸化または還元の際に生じる電流を測定する。電源１４は、電極基板３０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。Ａ／Ｄ変換部１５は、電流計１３によって測定された電流値をデジタル変換する。制御部１６は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）などから構成されている。この制御部１６は、ディスプレイ１２、電流計１３および電源１４の動作を制御する。また、制御部１６は、Ａ／Ｄ変換部１５でデジタル変換された電流値から、予め作成された電流値と標識物質である金属微粒子の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出するものであってもよい。ディスプレイ１２は、制御部１６で概算された被検物質の量などの情報を表示する。
まず、本発明の一実施の形態に係る被検物質の検出方法に用いる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図１において、検出装置１は、電極基板３０が挿入される基板受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを備えている。
検出装置１は、図２に示されるように、ディスプレイ１２と、電流計１３と、電源１４と、Ａ／Ｄ変換部１５と、制御部１６とを備えている。
電流計１３は、標識物質である金属微粒子の酸化または還元の際に生じる電流を測定する。電源１４は、電極基板３０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。Ａ／Ｄ変換部１５は、電流計１３によって測定された電流値をデジタル変換する。制御部１６は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）などから構成されている。この制御部１６は、ディスプレイ１２、電流計１３および電源１４の動作を制御する。また、制御部１６は、Ａ／Ｄ変換部１５でデジタル変換された電流値から、予め作成された電流値と標識物質である金属微粒子の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出するものであってもよい。ディスプレイ１２は、制御部１６で概算された被検物質の量などの情報を表示する。
［電極基板の構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る被検物質の検出方法に用いる電極基板３０の構成を説明する。
電極基板３０は、図３および図４に示されるように、基板本体３０ａと、作用電極６１と、対極６３と、参照電極６５とを備えている。基板本体３０ａの表面には、作用電極６１と、この作用電極６１に接続された電極リード７１と、対極６３と、この対極６３に接続された電極リード７３と、参照電極６５と、この参照電極６５に接続された電極リード７５とが形成されている。これらの電極リード７１，７３，７５の一部は、測定溶液が漏出して当該電極リード７１，７３，７５に接触するのを防止する漏出防止部材４０によって覆われている。この漏出防止部材４０には、作用電極６１および参照電極６５が露出するように、孔部４０ａ，４０ｂが設けられている。
つぎに、本発明の一実施の形態に係る被検物質の検出方法に用いる電極基板３０の構成を説明する。
電極基板３０は、図３および図４に示されるように、基板本体３０ａと、作用電極６１と、対極６３と、参照電極６５とを備えている。基板本体３０ａの表面には、作用電極６１と、この作用電極６１に接続された電極リード７１と、対極６３と、この対極６３に接続された電極リード７３と、参照電極６５と、この参照電極６５に接続された電極リード７５とが形成されている。これらの電極リード７１，７３，７５の一部は、測定溶液が漏出して当該電極リード７１，７３，７５に接触するのを防止する漏出防止部材４０によって覆われている。この漏出防止部材４０には、作用電極６１および参照電極６５が露出するように、孔部４０ａ，４０ｂが設けられている。
作用電極６１は、基板本体３０ａの一側部〔図３の上側〕に配置されている。電極リード７１は、作用電極６１から基板本体３０ａの他側部〔図３の下側〕に向けて延びている。また、対極６３は、基板本体３０ａ上において、作用電極６１よりも外側〔図３において、作用電極６１の上側〕に配置されている。電極リード７３は、対極６３から、作用電極６１および参照電極６５を迂回して、基板本体３０ａの他側部〔図３の下側〕に向けて延びている。さらに、参照電極６５は、作用電極６１を挟んで、対極６３と対向する位置に配置されている。電極リード７５は、参照電極６５から基板本体３０ａの他側部〔図３の下側〕に向けて延びている。作用電極６１に接続された電極リード７１と、対極６３に接続された電極リード７３と参照電極６５に接続された電極リード７５とは、基板本体３０ａの他側部（図３の下側）において互いに並列するように配置されている。
本実施の形態において、基板本体３０ａは、矩形状に形成されている。なお、基板本体３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状などであってもよい。
基板本体３０ａを構成する材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂、ガラスエポキシなどのプラスチック類；ガラス、金属などの無機材料などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。基板本体３０ａの厚さは、本発明の被検物質の検出方法の用途などによって異なることから、本発明の被検物質の検出方法の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。
作用電極６１は、作用電極本体６２と、この作用電極本体６２の表面上に固定化された捕捉物質とから構成されている。作用電極本体６２は、導電性を有するほぼ円形状の薄膜から構成されている。前記導電性を有する薄膜は、主に導電性材料から構成されている。前記導電性材料としては、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー、カーボンナノチューブ、グラフェンなどの炭素材料；金、白金などの金属材料、スズをドープした酸化インジウム（ＩＴＯ）、フッ素をドープした酸化スズ（ＦＴＯ）などの酸化物半導体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、作用電極本体６２は、ガラス、プラスチックなどの非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性材料からなる導電層が設けられた複合基材から構成されていてもよい。作用電極本体６２を構成する薄膜の厚さは、本発明の被検物質の検出方法の用途などによって異なることから、本発明の被検物質の検出方法の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。作用電極本体６２の表面には、捕捉物質が固定化されている。捕捉物質は、被検物質を捕捉する物質である。前記捕捉物質は、被検物質の種類などに応じて異なることから、被検物質の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。前記捕捉物質としては、例えば、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。作用電極本体６２に固定化される単位面積当たりの捕捉物質の量は、被検物質の種類、捕捉物質の種類、本発明の被検物質の検出方法の用途などによって異なることから、被検物質の種類、捕捉物質の種類、本発明の被検物質の検出方法の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。作用電極本体６２に固定化される単位面積あたりの捕捉物質の量は、被検物質を捕捉するのに十分な量であればよい。
対極６３は、導電性を有する薄膜から構成されている。前記導電性を有する薄膜は、主に導電性材料から構成されている。対極６３に用いられる導電性材料は、作用電極本体６２に用いられる導電性材料と同様である。対極６３を構成する薄膜の厚さは、本発明の被検物質の検出方法の用途などによって異なることから、本発明の被検物質の検出方法の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。
参照電極６５は、導電性材料からなる薄膜からなる。導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケルなどの金属、当該金属の少なくとも１つを含む合金、前記金属の塩化物などの金属ハロゲン化物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。かかる参照電極の具体例としては、例えば、銀−塩化銀電極、水銀と塩化水銀を用いるカロメル電極などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
参照電極６５を構成する薄膜の厚さは、本発明の被検物質の検出方法の用途などによって異なることから、本発明の被検物質の検出方法の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。なお、本実施の形態では、参照電極６５を設けているが、本発明においては、参照電極６５を設けなくてもよい。対極６３に用いられる導電性材料の種類、対極６３の厚さなどにもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極６３が参照電極６５を兼ねていてもよい。また、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極６１に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極６５を設けることが好ましい。
参照電極６５を構成する薄膜の厚さは、本発明の被検物質の検出方法の用途などによって異なることから、本発明の被検物質の検出方法の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。なお、本実施の形態では、参照電極６５を設けているが、本発明においては、参照電極６５を設けなくてもよい。対極６３に用いられる導電性材料の種類、対極６３の厚さなどにもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極６３が参照電極６５を兼ねていてもよい。また、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極６１に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極６５を設けることが好ましい。
［被検物質の検出方法の処理手順］
つぎに、本発明の一実施形態に係る被検物質の検出方法の処理手順などを詳細に説明する。本発明の一実施形態に係る被検物質の検出方法は、作用電極と、対極とを用い、試料中に含まれる被検物質を検出する被検物質の検出方法であって、
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を、作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
を含み、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液が、前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液であることを特徴とする。
つぎに、本発明の一実施形態に係る被検物質の検出方法の処理手順などを詳細に説明する。本発明の一実施形態に係る被検物質の検出方法は、作用電極と、対極とを用い、試料中に含まれる被検物質を検出する被検物質の検出方法であって、
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を、作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
を含み、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液が、前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液であることを特徴とする。
なお、以下において、被検物質の検出方法を「検出方法」ともいう。また、本明細書において、「被検物質を検出する」とは、被検物質の分子数、質量、濃度などを指標として被検物質を定量すること；「強陽性（＋＋）」、「弱陽性（＋）」、「陰性（−）」などのように被検物質を半定量すること；被検物質の有無を定性的に判定することを含む概念である。
従来、金属微粒子を標識物質とし、作用電極と、対極とを用いて試料中に含まれる被検物質を検出する際には、ノイズを低減させるために、洗浄専用液を用いた洗浄により、作用電極の表面近傍に存在し、ノイズの原因となる非特異的な物質（例えば、夾雑物質、金属微粒子など）を除去する操作が行なわれている。しかし、この場合、洗浄専用液の残存や洗浄の強さなどにより、被検物質の検出の精度のばらつきを招く。加えて、作用電極などから洗浄専用液が測定前に十分に除去されず残留することにより、被検物質の測定に悪影響を及ぼし得るため、作用電極上の洗浄専用液の除去が必要になる。
これに対し、本発明においては、洗浄液としても用いることができ、かつ測定溶液としても用いることができる溶液が用いられるため、金属微粒子を電気化学的測定法によって測定する際に用いられる測定溶液の組成や濃度の変動が無く、被検物質の検出の精度のばらつきの発生を抑制することができる。さらに、被検物質の検出に要する試薬の数を減らすことができる。これにより、本発明の一実施形態に係る検出方法によれば、操作が簡便になり、人為的な試薬の取り扱いミスなどをも防ぐことができ、しかも、用いられる検出装置の簡易化が可能になる。さらに、本発明の一実施形態に係る検出方法は、前記測定溶液として、前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液が用いられている。したがって、本発明の一実施形態に係る検出方法によれば、測定溶液と異なる組成を有する洗浄専用液を用いることなく十分な検出感度を確保することができる。
前記被検物質としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
前記生物学的相互作用としては、例えば、抗原抗体反応、核酸間の水素結合、核酸と核酸結合タンパク質との間の結合、レクチンと糖鎖との間の結合、レセプターとリガンドとの間の会合などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
以下、本発明の一実施の形態に係る被検物質の検出方法の処理手順を添付図面に基づいて説明する。図５は本発明の一実施形態に係る被検物質の検出方法の処理手順を示す工程説明図、図６は本発明の一実施形態に係る被検物質の検出方法の測定工程における処理手順を示す工程説明図である。以下においては、生物学的相互作用として抗原抗体反応を用いた場合の検出方法を例として挙げて説明するが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ユーザーは、測定試料を、電極基板３０の作用電極６１上に供給する〔図５の（Ａ）試料供給工程を参照〕。これにより、測定試料中の被検物質Ｓが電極基板３０の基板本体３０ａに形成された作用電極本体６２上の捕捉物質８１によって捕捉され、作用電極本体６２上の捕捉物質８１と、標識複合体９０（被検物質Ｓと標識結合物質９０ａとを含む複合体）とを含む複合体が形成される〔図５（Ｂ）反応（捕捉・標識工程を参照〕。このとき、測定試料中の被検物質Ｓ以外の物質（夾雑物質Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３）は、捕捉物質８１に捕捉されない。
本実施形態において、前記測定試料は、作用電極６１に供給するに先立って、被検物質Ｓなどを含む試料と標識結合物質９０ａとを混合し、被検物質Ｓと標識結合物質９０ａとを結合させて標識複合体９０を形成させることによって得られたものである。
なお、作用電極本体上の捕捉物質と、被検物質を含む試料と、標識結合物質との接触の順序は、上記に特に限定されない。例えば、作用電極本体上の捕捉物質と、被検物質を含む試料とを接触させた後、標識結合物質を接触させることにより、作用電極本体上に標識複合体を形成してもよい。また、作用電極本体上に標識結合物質を添加した後、被検物質を含む試料を添加することにより、作用電極本体上に標識複合体を形成してもよい。
なお、作用電極本体上の捕捉物質と、被検物質を含む試料と、標識結合物質との接触の順序は、上記に特に限定されない。例えば、作用電極本体上の捕捉物質と、被検物質を含む試料とを接触させた後、標識結合物質を接触させることにより、作用電極本体上に標識複合体を形成してもよい。また、作用電極本体上に標識結合物質を添加した後、被検物質を含む試料を添加することにより、作用電極本体上に標識複合体を形成してもよい。
標識結合物質９０ａは、被検物質Ｓに結合する結合物質９１と、標識物質である金属微粒子９２とから構成されている。結合物質９１は、被検物質Ｓにおいて、捕捉物質８１とは異なる位置や場所に結合する物質であればよい。結合物質９１は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、結合物質９１として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質などを用いることができる。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、結合物質９１として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体用いることができる。金属微粒子９２としては、例えば、金微粒子、銀微粒子、銅微粒子、白金微粒子、インジウム微粒子、金―銀複合微粒子や金―銅複合微粒子など各金属の複合微粒子などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。金属微粒子９２の平均粒子径は、電気化学的な酸化や還元の際にシグナルを得る観点から、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上であり、被検物質の捕捉効率および被検物質の標識効率を向上させる観点から、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下である。なお、本明細書において、「平均粒子径」とは、電子顕微鏡観察、光散乱法などによって求められた粒子径をいう。
捕捉物質８１は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択することができる。被検物質Ｓが核酸である場合、捕捉物質８１として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、核酸に対する抗体、核酸と結合するタンパク質などを用いることができる。被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、捕捉物質８１として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体などを用いることができる。
捕捉物質８１による被検物質Ｓの捕捉は、例えば、捕捉物質８１と被検物質Ｓとが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質８１と被検物質Ｓとが結合する条件は、被検物質Ｓの種類などに応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質Ｓが核酸であり、捕捉物質８１が核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質Ｓの捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また、例えば、被検物質Ｓが核酸、タンパク質又はペプチドであり、捕捉物質８１が核酸に対する抗体、タンパク質に対する抗体又はペプチドに対する抗体である場合、被検物質Ｓの捕捉は、全血、血漿、血清、尿、唾液などに代表される検体を、抗原抗体反応を行なうのに適した溶液、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液などに混合して行なうことができる。
つぎに、ユーザーは、測定溶液を用いて電極基板３０の作用電極本体６２の表面の洗浄を行なう〔図５（Ｃ）洗浄工程を参照〕。工程（Ｃ）では、まず、測定溶液を電極基板３０の作用電極本体６２上に添加し〔図５（Ｃ−１）測定溶液添加工程を参照〕、捕捉物質８１に捕捉されなかった物質〔例えば、標識物質、夾雑物質（夾雑物質Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３）など〕を除去する〔図５（Ｃ−２）夾雑物質除去工程を参照〕。工程（Ｃ）では、後述の測定溶液添加工程および測定工程で用いられる測定溶液を用いて洗浄を行なう。
前記測定溶液は、金属微粒子９２および作用電極６１のゼータ電位に基づき、金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液である。かかる測定溶液は、電解質が配合された溶液である
従来、金属微粒子に起因する電流に基づき、被験物質を検出する場合、金属微粒子の電気化学的な酸化などを効率よく行なうために、洗浄専用液による洗浄の後、測定溶液として塩酸水溶液が用いられている。このように、従来、洗浄には洗浄専用液が用いられているが、本発明者らは、洗浄専用液の残留に起因する測定結果のばらつきを抑制する目的で従来の測定溶液を用いて洗浄工程を実施しても、精度よく測定できないことを検証している（詳しくは、試験例３および図９参照）。
そこで、本発明者らは、洗浄にも測定にも使用できる溶液として、電気化学測定に用いる金属微粒子および作用電極のそれぞれのゼータ電位に基づき、測定溶液中で前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないか、または前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるようにｐＨを設定した溶液を開発した。すなわち、本発明の一実施形態に係る検出方法に用いられる前記測定溶液は、金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定されているので、捕捉物質８１を介して作用電極６１に固定化されていない（遊離の）金属微粒子９２が作用電極６１に非特異的に吸着するのを抑制することができると考えられる。したがって、本実施形態に係る検出方法によれば、被検物質の検出の精度を向上させることができる。金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的相互作用が生じないｐＨは、具体的には、金属微粒子９２のゼータ電位が０となるｐＨまたは作用電極６１の表面電位が０となるｐＨである。金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的に斥力を生じるｐＨは、金属微粒子が非特異的に吸着するのを静電的な斥力により抑制し、ノイズを低減する観点から、好ましくは金属微粒子９２のゼータ電位と作用電極６１のゼータ電位とが同符号の電位となるｐＨである。
そこで、本発明者らは、洗浄にも測定にも使用できる溶液として、電気化学測定に用いる金属微粒子および作用電極のそれぞれのゼータ電位に基づき、測定溶液中で前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないか、または前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるようにｐＨを設定した溶液を開発した。すなわち、本発明の一実施形態に係る検出方法に用いられる前記測定溶液は、金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定されているので、捕捉物質８１を介して作用電極６１に固定化されていない（遊離の）金属微粒子９２が作用電極６１に非特異的に吸着するのを抑制することができると考えられる。したがって、本実施形態に係る検出方法によれば、被検物質の検出の精度を向上させることができる。金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的相互作用が生じないｐＨは、具体的には、金属微粒子９２のゼータ電位が０となるｐＨまたは作用電極６１の表面電位が０となるｐＨである。金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは金属微粒子９２と作用電極６１との間に静電気的に斥力を生じるｐＨは、金属微粒子が非特異的に吸着するのを静電的な斥力により抑制し、ノイズを低減する観点から、好ましくは金属微粒子９２のゼータ電位と作用電極６１のゼータ電位とが同符号の電位となるｐＨである。
前記ｐＨは、作用電極を構成する導電性材料の種類、金属微粒子の種類などによって異なることから、作用電極を構成する導電性材料の種類、金属微粒子の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。通常、測定溶液のｐＨは、高い感度で被検物質の検出を行なうことができることから、３．５以上、より好ましくは４以上であり、取り扱いやすく、操作性に優れることから、好ましくは１１以下、より好ましくは１０以下である。具体的には、例えば、作用電極がカーボンを含む電極である場合、測定溶液のｐＨは、高い感度で被検物質の検出を行なうことができることから、３．５以上、より好ましくは４以上であり、取り扱いやすく、操作性に優れることから、好ましくは１１以下、より好ましくは１０以下である。また、例えば、金属微粒子が銀微粒子である場合、測定溶液のｐＨは、高い感度で被検物質の検出を行なうことができることから、３．５以上、より好ましくは４以上であり、取り扱いやすく、操作性に優れることから、好ましくは１１以下、より好ましくは１０以下である。
前記電解質としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウムなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
つぎに、ユーザーは、測定溶液を洗浄後の電極基板３０に添加する〔図５（Ｄ）測定溶液添加工程を参照〕。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１の基板受入部１１に電極基板３０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示し、金属微粒子に起因する電流を測定する〔図５（Ｅ）測定工程を参照〕。ここでは、検出装置１に挿入された電極基板３０の電極リード７１，７３，７５は、検出装置１の電流計１３および電源１４に接続される。そして、検出装置１の電源１４により、参照電極６５を基準として任意の電位が作用電極本体６２に印加される。
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１５によってデジタル変換された電流値が制御部１６に入力される。つぎに、予め作成された電流値と被検物質の量との関係を示す検量線に基づき、制御部１６により、デジタル変換後の電流値から、測定試料中に含まれる被検物質の量が概算される。そして、概算された被検物質の量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１６によって作成される。その後、制御部１６によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
前記工程（Ｄ）において、測定溶液の添加量は、電流の測定を行なうのに十分な量であればよい。
前記工程（Ｅ）においては、まず、金属微粒子９２を電気化学的に酸化させる。印加する電位の大きさは、金属微粒子９２の粒子径、測定溶液に配合された電解質の種類や濃度、測定溶液のｐＨなどによって異なることから、金属微粒子９２の粒子径、測定溶液に配合された電解質の種類や濃度などに応じて適宜決定することが望ましい。また、電位の印加時間は、印加する電位の大きさ金属微粒子９２の粒子径、測定溶液に配合された電解質の種類や濃度などによって異なることから、金属微粒子９２の粒子径、測定溶液に配合された電解質の種類や濃度などに応じて適宜決定することが好ましい。金属微粒子９２を電気化学的に酸化する際には、電位を一定の値に保持してもよいし、時間経過に伴い変化させてもよい。
金属微粒子９２を電気化学的に酸化し溶出させた後、金属イオンを電気化学的に還元させ、作用電極本体６２の表面に金属を析出させる。本発明においては、還元させた際に生じる電流を測定し、得られた測定結果を指標として用いて被検物質の検出を行なってもよい。金属イオンを電気化学的に還元する際には、作用電極本体６２に金属イオンが還元される電位を印加することにより、測定溶液中の金属イオンを当該作用電極本体６２の表面上で電気化学的に還元して金属を析出させることができる。金属イオンを還元する際には、例えば、金属イオンが電気化学的に還元される一定電位を印加し維持し、金属イオンを電気化学的に還元させて金属を析出させてもよく、作用電極本体６２の電位を時間経過に伴い負方向に変化させ、金属イオンを電気化学的に還元させて金属を析出させてもよい。金属イオンを還元させた際に生じる電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー法やサイクリックボルタンメトリー法、クロノアンペロメトリー法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
さらに、本発明の一実施形態に係る検出方法においては、作用電極本体６２の表面に析出された金属を電気化学的に酸化し、当該金属を酸化させた際に生じる電流を測定し、得られた測定結果を指標として用いて被検物質の検出を行なってもよい。
作用電極本体６２の表面に析出された金属を電気化学的に酸化し、酸化電流を測定する方法としては、例えば、作用電極本体６２の電位を正方向に変化させていき、電位変化に伴う電流の変化を測定する方法、作用電極本体６２に一定電位を印加して時間に対する電流変化を測定する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。金属を酸化させた際に生じる電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリーやクロノアンペロメトリーなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
具体的には、金属微粒子９２が、例えば、銀微粒子である場合、作用電極６１の作用電極本体６２上の捕捉物質によって捕捉された標識複合体９０の銀粒子９２ａ〔図６（Ａ）の（ａ）を参照〕を酸化させて測定溶液中に銀イオン９２ａ１（Ａｇ＋）を得〔図６（Ａ）の（ｂ）を参照〕、さらに、得られた銀イオン９２ａ１を還元して作用電極基板本体の表面に銀９２ａ２を析出させる。その後、銀９２ａ２を酸化させて銀イオン９２ａ１とするときに生じる電流をディファレンシャルパルスボルタメトリー（ＤＰＶ）法などの電気化学的測定法によって測定する。また、金属微粒子９２が、例えば、金微粒子である場合、作用電極６１の作用電極本体６２上の捕捉物質によって捕捉された標識複合体９０の金粒子９２ｂ〔図６（Ｂ）の（ａ）を参照〕を酸化させて測定溶液中に金イオン９２ｂ１（Ａｕ3＋）を得る〔図６（Ｂ）の（ｂ）を参照〕。その後、得られた金イオン９２ｂ１を還元して作用電極基板本体の表面に金９２ａ２を析出させたときに生じる電流をディファレンシャルパルスボルタメトリー（ＤＰＶ）法などの電気化学的測定法によって測定する。
なお、本発明においては、金属の酸化還元により生じる電気エネルギーとして、電流を測定する代わりに電圧や電荷を測定してもよい。
また、本発明において、検出方法は、作用電極と、対極とを用い、試料中に含まれる被検物質を検出する被検物質の検出方法であって、
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液のｐＨが、３．５以上であることを特徴とする方法であってもよい。かかる検出方法においては、ｐＨ３．５以上の測定溶液が用いられているので、ノイズを生じる原因となる非特異的な金属微粒子の作用電極への吸着を抑制することができ、十分な検出感度を確保することができる。この場合、耐薬品性が高く、かつ電位窓が広いことから、前記作用電極は炭素材料を含むものであることが好ましい。
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液のｐＨが、３．５以上であることを特徴とする方法であってもよい。かかる検出方法においては、ｐＨ３．５以上の測定溶液が用いられているので、ノイズを生じる原因となる非特異的な金属微粒子の作用電極への吸着を抑制することができ、十分な検出感度を確保することができる。この場合、耐薬品性が高く、かつ電位窓が広いことから、前記作用電極は炭素材料を含むものであることが好ましい。
以下、実施例などにより、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下において、ＨＢｓ抗原を認識する抗体を「ＨＢｓ抗原認識抗体」と表記する。
製造例１
グラファイト粉末（シグマアルドリッチ社製、商品名：Ｇｒａｐｈｉｔｅ ｐｏｗｄｅｒ）１ｍｇに炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を９００μＬ添加し、得られた混合物に超音波をあてることにより、グラファイト粉末を分散させた後、６０００ｒｐｍで室温での５分間の遠心分離に供して上澄み液を除去した。得られたグラファイト粉末に１００μｇ／ｍＬ ＨＢｓ抗原認識抗体を含有する炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１００μＬを添加し、得られた混合物を室温で２時間静置することにより、捕捉物質８１としての抗ＨＢｓ抗原抗体をグラファイトに固定化した。つぎに、ＨＢｓ抗原認識抗体が固定化されたグラファイトをリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。その後、３質量％ウシ胎仔血清アルブミン−５質量％ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝２００００）含有リン酸緩衝化生理食塩水１０００μＬを前記グラファイトに添加し、得られた混合物を４℃で一晩静置することにより、グラファイトの表面をブロッキングし、抗体固定化グラファイト粉末を得た。
グラファイト粉末（シグマアルドリッチ社製、商品名：Ｇｒａｐｈｉｔｅ ｐｏｗｄｅｒ）１ｍｇに炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を９００μＬ添加し、得られた混合物に超音波をあてることにより、グラファイト粉末を分散させた後、６０００ｒｐｍで室温での５分間の遠心分離に供して上澄み液を除去した。得られたグラファイト粉末に１００μｇ／ｍＬ ＨＢｓ抗原認識抗体を含有する炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１００μＬを添加し、得られた混合物を室温で２時間静置することにより、捕捉物質８１としての抗ＨＢｓ抗原抗体をグラファイトに固定化した。つぎに、ＨＢｓ抗原認識抗体が固定化されたグラファイトをリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。その後、３質量％ウシ胎仔血清アルブミン−５質量％ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝２００００）含有リン酸緩衝化生理食塩水１０００μＬを前記グラファイトに添加し、得られた混合物を４℃で一晩静置することにより、グラファイトの表面をブロッキングし、抗体固定化グラファイト粉末を得た。
製造例２
銀ナノ粒子分散水溶液(銀ナノ粒子の含有量：１．７×１０10個／ｍＬ、平均粒子径６０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)９００μＬに、１Ｍ塩酸水溶液または１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって当該銀ナノ粒子分散水溶液(平均粒子径６０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)のｐＨを７に調整した後、１００μｇ／ｍＬ ＨＢｓ抗原認識抗体含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加した。その後、得られた溶液に１０体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート溶液〔Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）〕１０．１μＬを添加し、４℃で１時間静置することにより、銀ナノ粒子の表面にＨＢｓ抗原認識抗体を固定し、標識結合物質を含む懸濁液を得た。
銀ナノ粒子分散水溶液(銀ナノ粒子の含有量：１．７×１０10個／ｍＬ、平均粒子径６０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)９００μＬに、１Ｍ塩酸水溶液または１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって当該銀ナノ粒子分散水溶液(平均粒子径６０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)のｐＨを７に調整した後、１００μｇ／ｍＬ ＨＢｓ抗原認識抗体含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加した。その後、得られた溶液に１０体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート溶液〔Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）〕１０．１μＬを添加し、４℃で１時間静置することにより、銀ナノ粒子の表面にＨＢｓ抗原認識抗体を固定し、標識結合物質を含む懸濁液を得た。
得られた懸濁液に、１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液４００μＬを添加し、得られた混合液を４℃で２時間静置することにより、標識結合物質をブロッキングした。ブロッキング後の標識結合物質を含む混合液を、７０００×ｇで４℃で２０分間の遠心分離に供して上澄み液を除去した。得られた残渣に１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液１ｍＬを添加した。得られた混合液を、７０００×ｇで４℃で２０分間の遠心分離に供して上澄み液を除去した後、得られた残渣に１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液を添加する作業を３回繰り返した。その後、得られた混合液を、７０００×ｇで４℃で２０分間の遠心分離に供して上澄みを除去した。得られた残渣に、１質量％ウシ胎仔血清アルブミン−０．０１体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート含有生理食塩水緩衝化リン酸緩衝液２００μＬを添加することにより、標識結合物質含有液を得た。
試験例１
作用電極本体および対極の構成成分であるグラファイト粉末および製造例１で得られた抗体固定化グラファイト粉末を、ｐＨ１．４、３、３．７、４．１、５．２または１０．１に調整された測定溶液（０．０５Ｍ塩素イオンと、ナトリウムイオンとを含む溶液）２００μＬに添加した。得られた各溶液をゼータサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、マルバーン社）を用いてグラファイト粉末および抗体固定化グラファイト粉末のゼータ電位を測定した。試験例１において、グラファイト粉末および抗体固定化グラファイト粉末それぞれのゼータ電位（ζ電位）と測定溶液のｐＨとの関係を調べた結果を図７（Ａ）に示す。図中、白丸はグラファイト粉末でζ電位、黒丸は抗体固定化グラファイト粉末のζ電位を示す。
作用電極本体および対極の構成成分であるグラファイト粉末および製造例１で得られた抗体固定化グラファイト粉末を、ｐＨ１．４、３、３．７、４．１、５．２または１０．１に調整された測定溶液（０．０５Ｍ塩素イオンと、ナトリウムイオンとを含む溶液）２００μＬに添加した。得られた各溶液をゼータサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、マルバーン社）を用いてグラファイト粉末および抗体固定化グラファイト粉末のゼータ電位を測定した。試験例１において、グラファイト粉末および抗体固定化グラファイト粉末それぞれのゼータ電位（ζ電位）と測定溶液のｐＨとの関係を調べた結果を図７（Ａ）に示す。図中、白丸はグラファイト粉末でζ電位、黒丸は抗体固定化グラファイト粉末のζ電位を示す。
製造例２で得られた標識結合物質含有液５μＬを、ｐＨ１．４、３、３．７、４．１、５．２、５．４、６．５、８．５、１０．１または１１．７に調整された測定溶液（０．０５Ｍ塩素イオンと、ナトリウムイオンとを含む溶液）１９５μＬに添加し、ゼータサイザーを用いて標識結合物質の金属微粒子である銀微粒子のゼータ電位を測定した。試験例１において、標識結合物質のゼータ電位（ζ電位）と測定溶液のｐＨとの関係を調べた結果を図７（Ｂ）に示す。図中、黒三角は銀微粒子のζ電位を示す。
図７（Ａ）に示された結果から、作用電極本体６２および対極６３の構成成分であるグラファイト粉末または抗体固定化グラファイト粉末は、測定溶液のｐＨが３．５より低い場合、正電位を帯びていることがわかる。また、測定溶液のｐＨが３．５付近である場合、作用電極本体６２および対極６３の構成成分であるグラファイト粉末または抗体固定化グラファイト粉末は、等電点（電位が０）を示すことがわかる。さらに、測定溶液のｐＨが３．５より高い場合、作用電極本体６２および対極６３の構成成分であるグラファイト粉末または抗体固定化グラファイト粉末は負電位を帯びていることが確認された。一方、図７（Ｂ）に示された結果から、標識結合物質は負電位を帯びていることがわかる。これらの結果から、ｐＨ３．５未満のｐＨを有する測定溶液を用いた場合、作用電極本体６２は正電位であり、標識結合物質（銀粒子）は負電位であるので、作用電極本体６２と標識結合物質との間に静電的な引力が働く。ｐＨ３．５付近のｐＨを有する測定溶液を用いた場合、作用電極本体６２および標識結合物質の何れも負電位であるので、静電的相互作用は働かない。したがって、ｐＨが３．５より大きい場合、作用電極本体６２と標識結合物質との間に静電的な斥力が働くことが示唆される。
製造例３
（１）電極の形成
ガラスエポキシからなる基板本体３０ａの表面に、図４に示されるパターンとなるように、グラファイト粉末を含有するカーボンペーストを塗布し、乾燥させることによって作用電極６１および対極６３を形成させた。また、前記基板本体３０ａの表面に銀／塩化銀インクを塗布することによって銀／塩化銀からなる参照電極６５を形成させた。さらに、前記基板本体３０ａ上に形成された作用電極本体６２、対極６３および参照電極６５が露出するように、レジスト絶縁膜（図３中、４０参照）を配置した。
（１）電極の形成
ガラスエポキシからなる基板本体３０ａの表面に、図４に示されるパターンとなるように、グラファイト粉末を含有するカーボンペーストを塗布し、乾燥させることによって作用電極６１および対極６３を形成させた。また、前記基板本体３０ａの表面に銀／塩化銀インクを塗布することによって銀／塩化銀からなる参照電極６５を形成させた。さらに、前記基板本体３０ａ上に形成された作用電極本体６２、対極６３および参照電極６５が露出するように、レジスト絶縁膜（図３中、４０参照）を配置した。
（２）捕捉物質の固定
１００μｇ／ｍＬ ＨＢｓ抗原認識抗体含有炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）３μＬを前記（１）で得られた電極基板３０の作用電極本体６２上に滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で２時間静置することにより、捕捉物質８１としてのＨＢｓ抗原認識抗体を作用電極本体６２上に固定化した。なお、作用電極本体８１上に固定されたＨＢｓ抗原認識抗体は、製造例２において銀ナノ粒子に固定化された抗体とは異なる抗原部位を認識する抗体である。
１００μｇ／ｍＬ ＨＢｓ抗原認識抗体含有炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）３μＬを前記（１）で得られた電極基板３０の作用電極本体６２上に滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で２時間静置することにより、捕捉物質８１としてのＨＢｓ抗原認識抗体を作用電極本体６２上に固定化した。なお、作用電極本体８１上に固定されたＨＢｓ抗原認識抗体は、製造例２において銀ナノ粒子に固定化された抗体とは異なる抗原部位を認識する抗体である。
（３）ブロッキング
前記（２）において、ＨＢｓ抗原認識抗体が固定化された作用電極本体６２をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。その後、ブロッキング試薬〔３質量％ウシ胎仔血清アルブミン−５質量％ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝２００００）含有リン酸緩衝化生理食塩水〕を作用電極本体６２上に滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に４℃で一晩静置することにより、作用電極本体６２の表面をブロッキングした。つぎに、作用電極本体６２の表面からブロッキング試薬を除去した後、当該作用電極本体６２をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、電極基板３０を得た。
前記（２）において、ＨＢｓ抗原認識抗体が固定化された作用電極本体６２をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。その後、ブロッキング試薬〔３質量％ウシ胎仔血清アルブミン−５質量％ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝２００００）含有リン酸緩衝化生理食塩水〕を作用電極本体６２上に滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に４℃で一晩静置することにより、作用電極本体６２の表面をブロッキングした。つぎに、作用電極本体６２の表面からブロッキング試薬を除去した後、当該作用電極本体６２をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、電極基板３０を得た。
製造例４および５
ＨＢｓ抗原の濃度が０ＩＵ／ｍＬ（製造例４）または１０ＩＵ／ｍＬ（製造例５）となるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
ＨＢｓ抗原の濃度が０ＩＵ／ｍＬ（製造例４）または１０ＩＵ／ｍＬ（製造例５）となるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
試験例２
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例５で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例５で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。
前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１をｐＨ１．５，３，４．１，５．３，６．５または１０．１に調整された測定溶液（０．０５Ｍ塩素イオンと、ナトリウムイオンとを含む溶液）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した。なお、電流の測定は、作用電極本体６２に参照電極６５基準で＋２．１Ｖの電位を３０秒間印加した後、参照電極６５基準で−１Ｖの電位を１４０秒間印加し、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極本体６２の電位を−０．４〜＋０．４Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。
試験例２において、作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流と測定溶液のｐＨとの関係を調べた結果を図８（Ａ）、作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子の測定時におけるシグナル対ノイズ比と、測定溶液のｐＨとの関係を調べた結果を図８（Ｂ）に示す。図８（Ａ）中、白丸は製造例４で得られた模擬検体を用いたときの電流、黒丸は製造例５で得られた模擬検体を用いたときの電流を示す。また、図８（Ｂ）中、黒四角は製造例５で得られた模擬検体を用いたときのシグナル対ノイズ比を示す。
図８に示された結果から、ｐＨ３未満のｐＨを有する測定溶液を用いた場合、非特異的なノイズが高くなり、検出感度（シグナル対ノイズ比）が低くなることがわかる。一方、ｐＨ３を超えるｐＨを有する測定溶液を用いた場合、非特異的なノイズは低いことがわかる。なお、非特異的なノイズが少なければ、かける電位によってシグナルの大きさ（電流の大きさ）を増幅することができるので、図８に示された結果から、ｐＨ３を超えるｐＨを有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄することにより、検出感度（シグナル対ノイズ比）を高くすることができる。
製造例６
ＨＢｓ抗原の濃度が２５ＩＵ／ｍＬとなるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
ＨＢｓ抗原の濃度が２５ＩＵ／ｍＬとなるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
試験例３
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例６で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極本体６２から前記混合液の残部の液体を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液で当該作用電極本体６２を洗浄した。洗浄後の作用電極本体６２を風乾させた。その後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（比較例１）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例６で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極本体６２から前記混合液の残部の液体を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液で当該作用電極本体６２を洗浄した。洗浄後の作用電極本体６２を風乾させた。その後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（比較例１）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例６で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．１Ｍ塩酸水溶液からなる測定溶液（ｐＨ１．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（比較例２）。
なお、電流の測定は、作用電極本体６２に参照電極６５基準で＋１．８Ｖの電位を３０秒間印加した後、参照電極６５基準で−０．８Ｖの電位を６０秒間印加し、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極本体６２の電位を−０．４〜＋０．４Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。
試験例３において、作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流と洗浄専用液での洗浄および塩酸水溶液での洗浄それぞれとの関係を調べた結果を図９に示す。
図９に示された結果から、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液による洗浄、洗浄専用液の除去および乾燥を行なった場合（比較例１）に比べ、塩酸水溶液からなる従来の測定溶液を用いて洗浄を行なった場合、ノイズが増大することがわかる。これらの結果から、洗浄専用液と測定溶液とを共通化しようとして、単に、従来、測定溶液として用いられていた溶液を洗浄専用液として転用しただけでは精度よく被検物質を測定することができないことがわかる。
製造例７
ＨＢｓ抗原の濃度が５０ＩＵ／ｍＬとなるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
ＨＢｓ抗原の濃度が５０ＩＵ／ｍＬとなるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
試験例４
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例７で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０１Ｍ塩化カリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．３）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例１）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例７で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０１Ｍ塩化カリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．３）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例１）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例７で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極本体６２から前記混合液の残部の液体を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液で当該作用電極本体６２を洗浄した。洗浄後の作用電極本体６２を風乾させた。その後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（比較例３）。
なお、電流の測定は、作用電極本体６２に参照電極６５基準で＋１．８Ｖの電位を３０秒間印加した後、参照電極６５基準で−０．８Ｖの電位を６０秒間印加し、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極本体６２の電位を−０．４〜＋０．４Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。
試験例４において、作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流と洗浄専用液での洗浄および塩化カリウム水溶液での洗浄それぞれとの関係を調べた結果を図１０に示す。
図１０に示された結果から、塩化カリウム水溶液からなる測定溶液を用いて洗浄を行なった場合（実施例１）、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液による洗浄、洗浄専用液の除去および乾燥を行なった場合（比較例３）と同程度のノイズおよびシグナルが得られることが示唆される。
製造例８
ＨＢｓ抗原の濃度が１２．５ＩＵ／ｍＬとなるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
ＨＢｓ抗原の濃度が１２．５ＩＵ／ｍＬとなるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
試験例５
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例８で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例２）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例８で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例２）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例８で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極本体６２から前記混合液の残部の液体を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液で当該作用電極本体６２を洗浄した。洗浄後の作用電極本体６２を風乾させた。その後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（比較例４）。
なお、電流の測定は、作用電極本体６２に参照電極６５基準で＋２．１Ｖの電位を３０秒間印加した後、参照電極６５基準で−１．０Ｖの電位を１４０秒間印加し、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極本体６２の電位を−０．４〜＋０．４Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。
試験例５において、作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流と洗浄専用液での洗浄および塩化ナトリウム水溶液での洗浄それぞれとの関係を調べた結果を図１１に示す。
図１１に示された結果から、塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液を用いて洗浄を行なった場合（実施例２）、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液による洗浄、洗浄専用液の除去および乾燥を行なった場合（比較例４）と同程度のノイズであり、シグナルは高くなることが示唆される。
試験例６
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例８で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極本体６２から前記混合液の残部の液体を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液で当該作用電極本体６２を洗浄した。洗浄後の作用電極本体６２を風乾させた。その後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した。同様の実験をさらに２回行なった（比較例５）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例８で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極本体６２から前記混合液の残部の液体を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液で当該作用電極本体６２を洗浄した。洗浄後の作用電極本体６２を風乾させた。その後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した。同様の実験をさらに２回行なった（比較例５）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例８で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した。同様の実験をさらに２回行なった（実施例３）。
試験例６において、洗浄専用液による洗浄を行なったときの測定結果のばらつきと、測定溶液による洗浄を行なったときの測定結果のばらつきを調べた結果を図１２に示す。
図１２に示されるように、実施例３の測定結果のＣＶ値は１０％であり、比較例５の測定結果のＣＶ値は８５％であった。これらの結果から、リン酸緩衝化生理食塩水からなる洗浄専用液による洗浄、洗浄専用液の除去および乾燥を行なった場合（比較例５）には、測定結果のＣＶ値が高くなり測定ごとにシグナルのばらつきが生じることがわかる。これに対し、塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液を用いて洗浄を行なった場合（実施例３）には、ＣＶ値は低く、シグナルのばらつきが生じず、再現性に優れていることがわかる。
製造例９および１０
ＨＢｓ抗原の濃度が１．５６ＩＵ／ｍＬ（製造例９）または６．２５ＩＵ／ｍＬ（製造例１０）となるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
ＨＢｓ抗原の濃度が１．５６ＩＵ／ｍＬ（製造例９）または６．２５ＩＵ／ｍＬ（製造例１０）となるようにＨＢｓ抗原キャリブレータ〔シスメックス（株）製〕をウシ血清に添加し、模擬検体を調製した。
試験例７
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４（ＨＢｓ抗原濃度：０ＩＵ／ｍＬ）、製造例９（ＨＢｓ抗原濃度：１．５６ＩＵ／ｍＬ）、製造例９（ＨＢｓ抗原濃度：６．２５ＩＵ／ｍＬ）および製造例６（ＨＢｓ抗原濃度：２５ＩＵ／ｍＬ）で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例４）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４（ＨＢｓ抗原濃度：０ＩＵ／ｍＬ）、製造例９（ＨＢｓ抗原濃度：１．５６ＩＵ／ｍＬ）、製造例９（ＨＢｓ抗原濃度：６．２５ＩＵ／ｍＬ）および製造例６（ＨＢｓ抗原濃度：２５ＩＵ／ｍＬ）で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例４）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４（ＨＢｓ抗原濃度：０ＩＵ／ｍＬ）、製造例９（ＨＢｓ抗原濃度：１．５６ＩＵ／ｍＬ）、製造例１０（ＨＢｓ抗原濃度：６．２５ＩＵ／ｍＬ）および製造例６（ＨＢｓ抗原濃度：２５ＩＵ／ｍＬ）で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩酸水溶液からなる測定溶液（ｐＨ１．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（比較例６）。
なお、電流の測定は、作用電極本体６２に参照電極６５基準で＋２．１Ｖの電位を３０秒間印加した後、参照電極６５基準で−１．０Ｖの電位を１４０秒間印加し、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極本体６２の電位を−０．４〜＋０．４Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。
試験例７において、塩酸水溶液による洗浄を行なったときの作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流および塩化ナトリウム水溶液による洗浄を行なったときの作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流それぞれとＨＢｓ抗原の量との関係を調べた結果を図１３に示す。図中、黒丸は塩酸水溶液による洗浄を行なったときの作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流、黒四角は塩化ナトリウム水溶液による洗浄を行なったときの作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流を示す。
図１３に示された結果から、測定溶液として０．０５Ｍ塩酸水溶液からなる測定溶液を用いた場合（比較例６）、ノイズが大きく、ＨＢｓ抗原の量と電流の大きさとの間の比例関係が弱く、低濃度のＨＢｓ抗原を検出できないのが分かる。これに対し、測定溶液として０．０５Ｍ塩化ナトリウム溶液からなる測定溶液を用いた場合（実施例４）、ノイズが小さく、ＨＢｓ抗原の量と電流の大きさとに強い比例関係があり、低濃度のＨＢｓ抗原を検出できるのが分かる。
製造例１１
銀ナノ粒子分散水溶液(銀ナノ粒子の含有量：４．５×１０11個／ｍＬ、平均粒子径２０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)９００μＬに、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって当該銀ナノ粒子分散水溶液(平均粒子径２０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)のｐＨを９に調整した後、１００μｇ／ｍＬ ＣＲＰ認識抗体含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加した。その後、得られた溶液に１０体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート溶液〔Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）〕１０．１μＬを添加し、４℃で１時間静置することにより、銀ナノ粒子の表面にＣＲＰ認識抗体を固定し、標識結合物質を含む懸濁液を得た。
銀ナノ粒子分散水溶液(銀ナノ粒子の含有量：４．５×１０11個／ｍＬ、平均粒子径２０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)９００μＬに、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって当該銀ナノ粒子分散水溶液(平均粒子径２０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)のｐＨを９に調整した後、１００μｇ／ｍＬ ＣＲＰ認識抗体含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加した。その後、得られた溶液に１０体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート溶液〔Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）〕１０．１μＬを添加し、４℃で１時間静置することにより、銀ナノ粒子の表面にＣＲＰ認識抗体を固定し、標識結合物質を含む懸濁液を得た。
得られた懸濁液に、１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液４００μＬを添加し、得られた混合液を４℃で２時間静置することにより、標識結合物質をブロッキングした。ブロッキング後の標識結合物質を含む混合液を、１５０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離に供して上澄み液を除去した。得られた残渣に１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液１ｍＬを添加した。得られた混合液を、１５０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離に供して上澄み液を除去した後、得られた残渣に１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液を添加する作業を２回繰り返した。その後、得られた混合液を、１５０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離に供して上澄みを除去した。得られた残渣に、５質量％ウシ胎仔血清アルブミン−０．０１体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート含有生理食塩水緩衝化リン酸緩衝液２００μＬを添加することにより、標識結合物質含有液を得た。
製造例１２
（１）電極の形成
ガラスエポキシからなる基板本体３０ａの表面に、図４に示されるパターンとなるように、グラファイト粉末を含有するカーボンペーストを塗布し、乾燥させることによって作用電極６１および対極６３を形成させた。また、前記基板本体３０ａの表面に銀／塩化銀インクを塗布することによって銀／塩化銀からなる参照電極６５を形成させた。さらに、前記基板本体３０ａ上に形成された作用電極本体６２、対極６３および参照電極６５が露出するように、レジスト絶縁膜（図３中、４０参照）を配置した。
（１）電極の形成
ガラスエポキシからなる基板本体３０ａの表面に、図４に示されるパターンとなるように、グラファイト粉末を含有するカーボンペーストを塗布し、乾燥させることによって作用電極６１および対極６３を形成させた。また、前記基板本体３０ａの表面に銀／塩化銀インクを塗布することによって銀／塩化銀からなる参照電極６５を形成させた。さらに、前記基板本体３０ａ上に形成された作用電極本体６２、対極６３および参照電極６５が露出するように、レジスト絶縁膜（図３中、４０参照）を配置した。
（２）捕捉物質の固定
１００μｇ／ｍＬ ＣＲＰ認識抗体含有炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）３μＬを前記（１）で得られた電極基板３０の作用電極本体６２上に滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で２時間静置することにより、捕捉物質８１としてのＣＲＰ認識抗体を作用電極本体６２上に固定化した。なお、作用電極本体８１上に固定されたＣＲＰ認識抗体は、製造例１１において銀ナノ粒子に固定化された抗体とは異なる抗原部位を認識する抗体である。
１００μｇ／ｍＬ ＣＲＰ認識抗体含有炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）３μＬを前記（１）で得られた電極基板３０の作用電極本体６２上に滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で２時間静置することにより、捕捉物質８１としてのＣＲＰ認識抗体を作用電極本体６２上に固定化した。なお、作用電極本体８１上に固定されたＣＲＰ認識抗体は、製造例１１において銀ナノ粒子に固定化された抗体とは異なる抗原部位を認識する抗体である。
（３）ブロッキング
前記（２）において、ＣＲＰ認識抗体が固定化された作用電極本体６２をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。その後、ブロッキング試薬〔５質量％ウシ胎仔血清アルブミン−１質量％ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝２００００）含有リン酸緩衝化生理食塩水〕を作用電極本体６２上に滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に４℃で一晩静置することにより、作用電極本体６２の表面をブロッキングした。つぎに、作用電極本体６２の表面からブロッキング試薬を除去した後、当該作用電極本体６２をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、電極基板３０を得た。
前記（２）において、ＣＲＰ認識抗体が固定化された作用電極本体６２をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。その後、ブロッキング試薬〔５質量％ウシ胎仔血清アルブミン−１質量％ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝２００００）含有リン酸緩衝化生理食塩水〕を作用電極本体６２上に滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に４℃で一晩静置することにより、作用電極本体６２の表面をブロッキングした。つぎに、作用電極本体６２の表面からブロッキング試薬を除去した後、当該作用電極本体６２をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、電極基板３０を得た。
製造例１３〜２１
ＣＲＰ濃度が０ｍｇ／ｄＬ（製造例１３）、０．００１ｍｇ／ｄＬ（製造例１４）、０．００４ｍｇ／ｄＬ（製造例１５）、０．０１ｍｇ／ｄＬ（製造例１６）、０．０４ｍｇ／ｄＬ（製造例１７）、０．１ｍｇ／ｄＬ（製造例１８）、０．４ｍｇ／ｄＬ（製造例１９）、１．２ｍｇ／ｄＬ（製造例２０）または３．６ｍｇ／ｄＬ（製造例２１）となるようにＣＲＰキャリブレータ（積水メディカル社製）を生理食塩水に添加し、模擬検体を作製した。
ＣＲＰ濃度が０ｍｇ／ｄＬ（製造例１３）、０．００１ｍｇ／ｄＬ（製造例１４）、０．００４ｍｇ／ｄＬ（製造例１５）、０．０１ｍｇ／ｄＬ（製造例１６）、０．０４ｍｇ／ｄＬ（製造例１７）、０．１ｍｇ／ｄＬ（製造例１８）、０．４ｍｇ／ｄＬ（製造例１９）、１．２ｍｇ／ｄＬ（製造例２０）または３．６ｍｇ／ｄＬ（製造例２１）となるようにＣＲＰキャリブレータ（積水メディカル社製）を生理食塩水に添加し、模擬検体を作製した。
試験例８
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例１３（ＣＲＰ濃度：０ｍｇ／ｄＬ）、製造例１４（ＣＲＰ濃度：０．００１ｍｇ／ｄＬ）、製造例１５（ＣＲＰ濃度：０．００４ｍｇ／ｄＬ）、製造例１６（ＣＲＰ濃度：０．０１ｍｇ／ｄＬ）、製造例１７（ＣＲＰ濃度：０．０４ｍｇ／ｄＬ）、製造例１８（ＣＲＰ濃度：０．１ｍｇ／ｄＬ）、製造例１９（ＣＲＰ濃度：０．４ｍｇ／ｄＬ）、製造例２０（ＣＲＰ濃度：１．２ｍｇ／ｄＬ）または製造例２１（ＣＲＰ濃度：３．６ｍｇ／ｄＬ）で得られた模擬検体それぞれを希釈液〔積水メディカル（株）製、商品名：ｓｓピュアＲ１試薬〕で１０倍希釈した溶液（模擬検体）とを、標識結合物質含有液／模擬検体希釈液（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で２５分間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例５）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例１３（ＣＲＰ濃度：０ｍｇ／ｄＬ）、製造例１４（ＣＲＰ濃度：０．００１ｍｇ／ｄＬ）、製造例１５（ＣＲＰ濃度：０．００４ｍｇ／ｄＬ）、製造例１６（ＣＲＰ濃度：０．０１ｍｇ／ｄＬ）、製造例１７（ＣＲＰ濃度：０．０４ｍｇ／ｄＬ）、製造例１８（ＣＲＰ濃度：０．１ｍｇ／ｄＬ）、製造例１９（ＣＲＰ濃度：０．４ｍｇ／ｄＬ）、製造例２０（ＣＲＰ濃度：１．２ｍｇ／ｄＬ）または製造例２１（ＣＲＰ濃度：３．６ｍｇ／ｄＬ）で得られた模擬検体それぞれを希釈液〔積水メディカル（株）製、商品名：ｓｓピュアＲ１試薬〕で１０倍希釈した溶液（模擬検体）とを、標識結合物質含有液／模擬検体希釈液（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で２５分間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例５）。
なお、電流の測定は、作用電極本体６２に参照電極６５基準で＋２．１Ｖの電位を３０秒間印加した後、参照電極６５基準で−１．０Ｖの電位を１４０秒間印加し、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極本体６２の電位を−０．４〜＋０．４Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。
試験例８において、測定溶液による洗浄を行なったときの作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流とＣＲＰ濃度との関係を調べた結果を図１４に示す。
図１４に示された結果から、本実施例における測定溶液を用いて洗浄を行なうことにより、被検物質がＣＲＰである場合であっても、高い感度で定量的に検出することができることがわかる。
製造例２２
銀ナノ粒子分散水溶液(銀ナノ粒子の含有量：４．５×１０11粒子／ｍＬ、平均粒子径２０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）９００μＬに、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって当該銀ナノ粒子分散水溶液（平均粒子径２０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)のｐＨを９に調整した後、１００μｇ／ｍＬ ＣＲＰ認識抗体含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加した。その後、得られた溶液に１０体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート溶液〔Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）〕１０．１μＬを添加し、４℃で１時間静置することにより、銀ナノ粒子の表面にＣＲＰ認識抗体を固定し、標識結合物質を含む懸濁液を得た。
銀ナノ粒子分散水溶液(銀ナノ粒子の含有量：４．５×１０11粒子／ｍＬ、平均粒子径２０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）９００μＬに、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによって当該銀ナノ粒子分散水溶液（平均粒子径２０ｎｍ、シグマアルドリッチ社、商品名：Ｓｉｌｖｅｒ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ)のｐＨを９に調整した後、１００μｇ／ｍＬ ＣＲＰ認識抗体含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１００μＬを添加した。その後、得られた溶液に１０体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート溶液〔Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）〕１０．１μＬを添加し、４℃で１時間静置することにより、銀ナノ粒子の表面にＣＲＰ認識抗体を固定し、標識結合物質を含む懸濁液を得た。
得られた懸濁液に、１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液４００μＬを添加し、得られた混合液を４℃で２時間静置することにより、標識結合物質をブロッキングした。ブロッキング後の標識結合物質を含む混合液を、１５０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離に供して上澄み液を除去した。得られた残渣に１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液１ｍＬを添加した。得られた混合液を、１５０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離に供して上澄み液を除去した後、得られた残渣に１質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ＴＢＳ−Ｔ溶液を添加する作業を２回繰り返した。その後、得られた混合液を、１５０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離に供して上澄みを除去した。得られた残渣に、５質量％ウシ胎仔血清アルブミン−０．０１体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート含有生理食塩水緩衝化リン酸緩衝液２００μＬを添加した。得られた溶液１８０μＬを１５０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離に供して上澄み１５０μＬを除去し、標識結合物質含有液を得た。
試験例９
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例１３（ＣＲＰ濃度：０ｍｇ／ｄＬ）、製造例１５（ＣＲＰ濃度：０．００４ｍｇ／ｄＬ）、製造例１７（ＣＲＰ濃度：０．０４ｍｇ／ｄＬ）、製造例１９（ＣＲＰ濃度：０．４ｍｇ／ｄＬ）、製造例２０（ＣＲＰ濃度：１．２ｍｇ／ｄＬ）または製造例２１（ＣＲＰ濃度：３．６ｍｇ／ｄＬ）で得られた模擬検体それぞれを希釈液〔積水メディカル（株）製、商品名：ｓｓピュアＲ１試薬〕で１０倍希釈した溶液（模擬検体）とを、標識結合物質含有液／模擬検体希釈液（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で２５分間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例６）。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例１３（ＣＲＰ濃度：０ｍｇ／ｄＬ）、製造例１５（ＣＲＰ濃度：０．００４ｍｇ／ｄＬ）、製造例１７（ＣＲＰ濃度：０．０４ｍｇ／ｄＬ）、製造例１９（ＣＲＰ濃度：０．４ｍｇ／ｄＬ）、製造例２０（ＣＲＰ濃度：１．２ｍｇ／ｄＬ）または製造例２１（ＣＲＰ濃度：３．６ｍｇ／ｄＬ）で得られた模擬検体それぞれを希釈液〔積水メディカル（株）製、商品名：ｓｓピュアＲ１試薬〕で１０倍希釈した溶液（模擬検体）とを、標識結合物質含有液／模擬検体希釈液（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で２５分間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１を０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液からなる測定溶液（ｐＨ５．２）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した（実施例６）。
なお、電流の測定は、作用電極本体６２に参照電極６５基準で＋２．１Ｖの電位を３０秒間印加した後、参照電極６５基準で−１．０Ｖの電位を１４０秒間印加し、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極本体６２の電位を−０．４〜＋０．４Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。
試験例９において、高濃度の標識結合物質を用い、かつ測定溶液による洗浄を行なったときの作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因する電流とＣＲＰ濃度との関係を調べた結果を図１５に示す。
図１５に示された結果から、高濃度の標識結合物質を用いた場合であっても、本実施例における測定溶液で洗浄を行なうことにより、ノイズの増大が見られず、被検物質であるＣＲＰを高い感度で、かつ広い測定範囲で定量的に検出することができることがわかる。
試験例１０
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例６で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。
製造例２で得られた標識結合物質含有液と、製造例４および製造例６で得られた模擬検体とを、標識結合物質含有液／模擬検体（体積比）が１／１となるように混合し、混合液を得た。つぎに、製造例３で得られた電極基板３０の作用電極本体６２の表面に前記混合液４μＬを滴下し、相対湿度６０％以上の高湿度条件下に室温で１時間静置することにより、抗原抗体反応を行なった。
前記抗原抗体反応後の電極基板３０の作用電極６１をｐＨ３、３．７または４．１に調整された測定溶液（０．０５Ｍ塩化物イオンと、ナトリウムイオンとを含む溶液）２００μＬ中に浸漬させた後、電極基板３０をポテンショスタットに接続し、作用電極６１、対極６３および参照電極６５を覆うように前記測定溶液を滴下し、電流を測定した。なお、電流の測定は、作用電極本体６２に参照電極６５基準で＋２．１Ｖの電位を３０秒間印加した後、参照電極６５基準で−１．０Ｖの電位を１４０秒間印加し、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極本体６２の電位を−０．４〜＋０．４Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。
各測定溶液を用いて洗浄を行ない、作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子に起因するノイズおよびシグナルを測定した結果を表１に示す。また、試験例１０において、作用電極の表面近傍に集められた標識複合体中の銀微粒子の測定時におけるシグナル対ノイズ比と、測定溶液のｐＨとの関係を調べた結果を図１６に示す。
表１および図１６に示された結果から、ｐＨ３の測定溶液を用いた場合、ノイズが高くなり、検出感度（シグナル対ノイズ比）が低くなる。一方、ｐＨ３．５以上のｐＨを有する測定溶液を用いた場合、ノイズは低いため、検出感度が高いことがわかる。前述したように、非特異的なノイズが少なければ、かける電位によってシグナルの大きさ（電流の大きさ）を増幅することができるので、図８に示された結果から、ｐＨ３．５以上のｐＨを有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄することにより、検出感度（シグナル対ノイズ比）が高くすることができることがわかる。
以上の結果から、洗浄工程において、電流の測定に用いられる測定溶液と同じ組成を有し、かつ前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液である測定溶液を用いて作用電極を洗浄する本発明の被検物質の検出方法によれば、被検物質の検出の精度のばらつきの発生を抑制することができ、しかも測定溶液と異なる組成を有する洗浄専用液を用いることなく、洗浄専用液を用いた場合と同程度の検出感度を確保することができることが示唆される。
１ 検出装置
１１ 基板受入部
１２ ディスプレイ
１３ 電流計
１４ 電源
１５ 変換部
１６ 制御部
３０ 電極基板
３０ａ 基板本体
６１ 作用電極
６２ 作用電極本体
６３ 対極
６５ 参照電極
７１ 電極リード
７３ 電極リード
７５ 電極リード
８１ 捕捉物質
９０ 標識複合体
９０ａ 標識結合物質
９１ 結合物質
９２ 金属微粒子
９２ａ 銀粒子
９２ａ１ 銀イオン
９２ａ２ 銀
９２ｂ 金粒子
９２ｂ１ 金イオン
１１ 基板受入部
１２ ディスプレイ
１３ 電流計
１４ 電源
１５ 変換部
１６ 制御部
３０ 電極基板
３０ａ 基板本体
６１ 作用電極
６２ 作用電極本体
６３ 対極
６５ 参照電極
７１ 電極リード
７３ 電極リード
７５ 電極リード
８１ 捕捉物質
９０ 標識複合体
９０ａ 標識結合物質
９１ 結合物質
９２ 金属微粒子
９２ａ 銀粒子
９２ａ１ 銀イオン
９２ａ２ 銀
９２ｂ 金粒子
９２ｂ１ 金イオン
Claims (8)
- 作用電極と、対極とを用い、試料中に含まれる被検物質を検出する被検物質の検出方法であって、
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を、作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
を含み、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液が、前記金属微粒子および前記作用電極のゼータ電位に基づき、前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨに設定された溶液であることを特徴とする被検物質の検出方法。 - 前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的相互作用が生じないｐＨまたは前記金属微粒子と前記作用電極との間に静電気的に斥力を生じるｐＨが、前記金属微粒子のゼータ電位と前記作用電極のゼータ電位とが同符号の電位となるｐＨである、請求項１記載の方法。
- 前記測定溶液のｐＨが３．５以上である、請求項１または２に記載の方法。
- 作用電極と、対極とを用い、試料中に含まれる被検物質を検出する被検物質の検出方法であって、
（Ａ）前記試料中に含まれる被検物質と金属微粒子とを含む複合体を作用電極上に形成する工程、
（Ｂ）前記作用電極を洗浄する工程、
（Ｃ）前記作用電極に測定溶液を添加し、前記作用電極上の複合体に含まれる金属微粒子に起因する電流、電圧または電荷を電気化学的測定法によって前記測定溶液中で測定する工程、および
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて前記試料中の被検物質を検出する工程、
前記工程（Ｂ）が、前記工程（Ｃ）で用いられる測定溶液と同じ組成を有する測定溶液を用いて作用電極を洗浄する工程であり、
前記測定溶液のｐＨが、３．５以上であることを特徴とする被検物質の検出方法。 - 前記作用電極がカーボンを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 前記金属微粒子が、金、銀、銅、白金およびインジウムからなる群より選択される少なくとも1種の金属からなる微粒子である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 前記電気化学的測定法が、微分パルスボルタンメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法およびクロノアンペロメトリー法からなる群より選ばれた方法である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 前記工程（Ｃ）において、
前記作用電極に集められた金属微粒子の金属を、前記作用電極の表面に析出させ、
析出した金属イオンを酸化還元反応に供し、
前記酸化還元反応の際に生じる電流、電圧または電荷を測定する、
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
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