WO2009081680A1 - 腎症の検査方法及びそれを用いた検査キット - Google Patents

腎症の検査方法及びそれを用いた検査キット Download PDF

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test
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Kazuya Tsukada
Natsuki Ito
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Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
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    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining nephropathy by an immunochromatography method using a probe labeled with quantum dots and a kit for testing the same. More specifically, the present invention relates to L-FABP, which is a liver-type fatty acid binding protein derived from kidney tissue present in a test sample, by an immunochromatography method using an ultrasensitive probe labeled with a quantum dot. The present invention relates to an inspection method that can be detected easily and quickly and an inspection kit using the same.
  • a contrast agent is an in-vivo diagnostic agent that is indispensable for diagnostic imaging such as angiography and CT imaging, and is frequently used in regular health examinations and is widely used in medical settings.
  • contrast agents often cause acute kidney damage called contrast agent nephropathy, which is one of the problems in clinical practice.
  • Patent Document 1 discloses a diagnostic kit capable of early diagnosis of nephropathy by measuring cystatin C excreted in urine indirectly related to infiltration of inflammatory cells into renal glomeruli.
  • an inspection method by ELISA is described.
  • Patent Document 2 describes that a fatty acid-binding protein derived from kidney tissue can be detected using an antibody that specifically binds to the protein, but there is no specific description of the method of its execution.
  • the present invention has been made in view of the above problems and situations, and has established a marker for predicting the risk of developing contrast media nephropathy before administration of contrast media, and can detect it easily and quickly. It is an object to provide an inspection method and an inspection kit thereof.
  • the inventors of the present invention have intensively studied to develop a simple and quick examination method for determining the risk of developing contrast nephropathy before administration of contrast medium.
  • L-FABP which is a fatty acid binding protein derived from renal tissue
  • the present invention was completed using an immunochromatography method using an ultrasensitive probe labeled with a quantum dot.
  • a method for examining nephropathy which comprises detecting L-FABP (liver-type fatty acid binding protein) derived from kidney tissue in a test sample using a probe labeled with a quantum dot.
  • L-FABP liver-type fatty acid binding protein
  • test kit used for the nephropathy test method according to any one of 1 to 6 above.
  • the present invention uses L-FABP, which is a liver-type fatty acid-binding protein derived from kidney tissue, as a marker of nephropathy in a test sample, by using a probe labeled with quantum dots having a long luminescence lifetime.
  • a method of detecting with high sensitivity can be provided.
  • an immunochromatography method is used to provide a nephropathy test method and a test kit thereof that can be detected easily and quickly. be able to.
  • a represents a plan view of the immunochromatographic strip
  • b represents a longitudinal sectional view of the immunochromatographic strip shown in a.
  • the nephropathy test method of the present invention is characterized in that L-FABP (liver-type fatty acid binding protein) derived from kidney tissue present in a test sample is detected using a probe labeled with a quantum dot. .
  • L-FABP liver-type fatty acid binding protein
  • the nephropathy is contrast medium nephropathy from the viewpoint of expression of the effect of the present invention.
  • the examination method of the said nephropathy is an aspect which provides the data for estimating the risk of developing contrast agent nephropathy before contrast agent administration.
  • the probe includes an antibody that specifically binds to the L-FABP.
  • the quantum dots are preferably quantum dots made of shelled Si or Ge.
  • the nephropathy test method of the present invention can be suitably used in a test kit.
  • L-FABP Liver Type Fatty Acid Binding Protein
  • L-FABP Liver Type Fatty Acid Binding Protein
  • a marker for nephropathy described later refers to intracellular energy / lipid metabolism and transport of hydrophobic ligands. It is a soluble protein with a molecular weight of about 14 kDa and is specifically expressed in the liver, proximal small intestine and renal proximal tubule. Since L-FABP gene expression is induced in response to renal injury, L- in a test sample collected from urine, feces, blood (whole blood or serum / plasma), body fluid, kidney tissue, etc. as samples. A very slight increase or decrease in FABP concentration is believed to reflect the extent of kidney damage.
  • ⁇ Nephropathy> As the disease classification of nephropathy, the first stage (early nephropathy stage), the second stage (early nephropathy stage), the third stage (apparent nephropathy stage), the fourth stage (renal failure stage) and the fifth stage (Dialysis therapy stage) is common, and “early” in the case of early diagnosis refers to the first stage or the second stage, but it is preferable that the first stage can be examined and diagnosed. In particular, the risk diagnosis prior to the administration of the contrast agent is preferably performed in the first stage.
  • the nephropathy may be contrast medium nephropathy
  • the contrast medium nephropathy is a renal disorder caused by a contrast medium, and the serum creatinine level that occurs within 48 hours after administration of the contrast medium. It is defined as an increase of more than 25%.
  • a “quantum dot” of a probe labeled with a quantum dot used in the inspection method of the present invention is a semiconductor nanoparticle that exhibits bandgap light emission with high quantum efficiency, and has several hundred to several atoms constituting the semiconductor. Thousands of particles with a diameter of several nanometers.
  • the shape of the semiconductor nanoparticles may be spherical, rod-like, plate-like, tube-like, etc., but the semiconductor nanoparticles used in the present invention are considered to be spherical or substantially spherical, and the particle diameter represents the diameter. Yes.
  • Quantum dots have high fluorescence emission intensity due to the quantum size effect, and the fluorescence emission wavelength can be changed depending on the size of the particle size. Unlike conventional fluorescent dyes, quantum dots are semiconductors, and therefore can be efficiently excited by irradiation with light having energy greater than or equal to the band gap regardless of the wavelength of irradiation light. Furthermore, since the quantum dots exhibit good light absorption characteristics, they can be excited by a low-luminance light source such as a light emitting diode (LED). Therefore, a plurality of quantum dots can be excited by a single excitation light, and multicolor imaging can be realized easily.
  • LED light emitting diode
  • Quantum dots used in the present invention are preferably provided with a shell because when the surface is exposed, a large number of defects on the surface act as light emission killer and the light emission intensity decreases.
  • a quantum dot provided with a shell has a core-shell structure. That is, it has a double structure in which the layer covering the surface of the central nanoparticle serving as the core portion is the shell portion.
  • the material for the shell portion compounds of Group II to Group VI are usually preferred.
  • the shell portion needs to be composed of a composition having a larger band gap than the core portion.
  • the core part is preferably a single crystal. This is because by using a single crystal, high luminous efficiency can be obtained in the case of an optical element such as phosphor fine particles.
  • the quantum dot is at least one selected from the group consisting of B, C, N, Al, Si, P, S, Zn, Ga, Ge, As, Se, Cd, In, Sb, and Te.
  • grains containing these elements are mentioned. Since it is desired to avoid the use of Cd or the like, which is an extremely toxic element, it contains at least a Si or Ge element, and Si or a compound thereof, or Ge or a compound thereof is preferable.
  • the quantum dots of Si or Ge are reduced in size to a region where the quantum confinement effect occurs, the band gap energy is expanded to the visible region, and a light emission phenomenon is observed.
  • a core part is a silicon nucleus and a shell part is a layer mainly composed of silicon oxide.
  • the layer mainly composed of silicon oxide is a shell layer mainly composed of silicon oxide (SiO 2 ).
  • the silicon nucleus of the core part is preferably a single crystal.
  • the excitation energy of Si in the core part is 1.1 eV
  • the excitation energy of silicon oxide (SiO 2 ) in the shell part is 8 eV
  • the band gap energy is CdSe / It is larger than ZnS particles (shell part (ZnS) 3.6 eV; core part (CdSe) 1.7 eV).
  • silicon-silica-based quantum dots have a low environmental impact and are excellent in biological safety when applied to living bodies.
  • Reference 1 describes a method for preparing solid solution rare earth element doped nanoparticles by a processing technique combined with either a reaction atmosphere method or a solution synthesis method at a temperature considerably lower than the melting temperature of the material.
  • a method of heating metal halide nano-sized particles doped with one or more rare earth elements in a halogenated atmosphere of a halogenated gas, or an aqueous solution of a rare earth element salt and a water-soluble salt of a halide-forming metal A method for precipitating nanoparticles from is disclosed.
  • a solution method in which nanoparticles of a host material doped with rare earth elements are prepared from a solution is desirable.
  • the manufacturing method of the quantum dot which has a core-shell structure is based on the well-known technique and the method described in literature.
  • nanocomposite particles with a silicon dioxide (SiO 2 ) shell and a metal core structure are described by Mulvaney et al. (Langmuir, 12: 4329-4335, 1996) and Adair et al. (Materials Sci. & Eng. R. 23: 139- 242 (1998)) and was first synthesized and reported.
  • Most of the quantum dots coated with SiO 2 with a core-shell structure fall into two categories based on the synthesis method used.
  • probes of probes labeled with quantum dots include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, fatty acids, enzymes / antigens, avidin / biotin, ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid or oligomers thereof, and binding in an equilibrium state. Antibodies are particularly preferred because of their high strength and high specificity and versatility. As an antibody used as a probe in the present invention, an anti-L-FABP monoclonal antibody or an anti-L-FABP polyclonal antibody, which is an antibody that specifically binds to L-FABP described later, can be used.
  • Many methods are known as a method for labeling a semiconductor nanoparticle on a probe.
  • a reaction for labeling an antibody with a semiconductor nanoparticle having SiO 2 as a shell layer is shown.
  • the SiO 2 coated semiconductor nanoparticles are reacted with 3-aminopropyltriethoxysilane (Pierce) followed by SMCC (succinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane 1-carboxylate) activation.
  • SMCC succinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane 1-carboxylate
  • the protein-bound thiol group required for reacting with the activated semiconductor nanoparticles can be formed by reacting a protein containing a lysine residue with 2-iminothiolane.
  • the lysine side chain of the protein to be bound reacts with 2-iminothiolane with ring opening and thioamidine formation.
  • the thiol group formed at that time and covalently bonded to the protein then reacts with the maleimide group bonded to the surface of the semiconductor nanoparticle by a hetero-Michael addition reaction, and the antibody as a protein and the SiO 2 -coated semiconductor nano A covalent bond can be formed with a reactive group on the surface of the particle.
  • the probe labeled with quantum dots used in the present invention includes a shell-labeled Si-labeled anti-L-FABP monoclonal antibody, a shell-labeled Ge-labeled anti-L-FABP monoclonal antibody, and a shell-labeled antibody.
  • Anti-L-FABP polyclonal antibodies labeled with Si and anti-L-FABP polyclonal antibodies labeled with Ge with shells are preferred.
  • the test sample in the test method of the present invention is collected from urine, feces, blood (whole blood or serum / plasma), body fluid, kidney tissue, etc. If necessary, sample lysate, diluent, buffer It can be pretreated with a liquid or a cleaning liquid.
  • sample lysate, diluent, buffer It can be pretreated with a liquid or a cleaning liquid.
  • the test sample is mixed with a probe labeled with a quantum dot and bonded.
  • the bound complex and the free probe are separated by a treatment such as washing.
  • the complex is irradiated with excitation light, and fluorescence from the quantum dots is detected.
  • the detection may be performed with the naked eye, or an apparatus for quantifying the amount of fluorescence may be used. By processing the result, it is possible to predict the risk of developing contrast nephropathy as described later.
  • immunochromatography method (hereinafter also referred to as “immunochromatography method”) suitably used in the present invention can be easily carried out according to the configuration of a known immunochromatography test strip (hereinafter also referred to as “immunochromatography strip”).
  • an immunochromatographic strip comprises a first antibody capable of reacting with an antibody with a first antigenic determinant of an antigen, and a second antibody capable of reacting with an antibody with a second antigenic determinant of the antigen and labeled.
  • the first antibody is fixed in advance at a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site, and the second antibody is chromatographed on the membrane carrier at a position separated from the capture site. Arranged as possible.
  • the first antibody and the second antibody may each be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but at least one of them is preferably a monoclonal antibody.
  • the first antibody and the second antibody are used in a “hetero” combination, that is, the first antibody and the second antibody each recognizing each antigenic determinant that differs in both position and structure on the antigen. These antibodies are used in combination.
  • the first antigenic determinant and the second antigenic determinant may be structurally the same as long as the positions on the antigen are different.
  • the first antibody and the second antibody It can be a “homo” combination of monoclonal antibodies, ie the same monoclonal antibody can be used for both the first antibody and the second antibody.
  • FIG. 1 shows a specific example of an immunochromatographic strip (described in FIG. 3 of cited document 2).
  • numeral 1 is an adhesive sheet
  • 2 is an impregnation member
  • 3 is a membrane carrier
  • 31 is a capture site
  • 4 is an absorption member
  • 5 is a sample addition member.
  • the membrane carrier 3 of the immunochromatographic strip is produced as an elongated strip-shaped nitrocellulose membrane filter having a width of 5 mm and a length of 36 mm.
  • the first antibody is immobilized on the membrane carrier 3 at a position 7.5 mm from the end on the side of the chromatography exhibition start point, and a capture site 31 is produced.
  • the membrane carrier 3 uses a membrane filter made of nitrocellulose, but the specimen contained in the test sample can be developed by chromatography and the antibody forming the capture site 31 is fixed. As long as it is possible, it may be anything, and other cellulose membranes, nylon membranes, glass fiber membranes and the like can also be used.
  • the impregnated member 2 is composed of a member impregnated with a second antibody that recognizes the second antigenic determinant located at a site different from the first antigenic determinant.
  • the second antibody is preferably pre-labeled with an appropriate labeling substance.
  • Cited Document 2 a 5 mm ⁇ 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric is used as the impregnating member 2, but is not limited to this in the present invention.
  • cellulose cloth filter paper, nitrocellulose membrane, etc.
  • Porous plastic cloths such as polyethylene and polypropylene can also be used.
  • immunochromatographic strip is not limited to this, and those skilled in the art may appropriately modify or change it.
  • ⁇ Risk prediction> it is possible to provide data for predicting the risk of developing a contrast agent nephropathy before administration of a contrast agent. That is, by processing the result obtained by the above-described inspection method, it is possible to detect the degree of deviation from the normal level and perform risk evaluation such as no problem, observation required, and high risk of developing nephropathy.
  • the test kit used in the test method of the present invention comprises a microplate (such as a 96-well microplate) using a probe labeled with quantum dots capable of binding to L-FABP derived from renal tissue, an affinity bead,
  • An immunochromatographic strip or the like may be an essential component, and a lysis solution, a reaction reagent, and a detection reagent for dissolving the specimen may be included as necessary.
  • various equipment or materials and reagents required for carrying out the method of the present invention may be included.
  • the reagent can also include a sample solution, a diluent, a buffer solution, a washing solution, a reaction terminator, a (product) extract, and the like.
  • kits for preparing a calibration curve, a manual, a microplate capable of simultaneously processing a large number of samples, and a set of necessary equipment such as a plate reader as a detection device thereof may be included.
  • test kit used in the test method of the present invention is at least an immunochromatographic strip using an antibody labeled with a quantum dot capable of binding to L-FABP derived from renal tissue, a specimen dilution, And a light source for exciting the quantum dots.
  • test samples A, B, C and D urine before contrast medium administration
  • test samples a, b, c and d urine 24 hours after contrast medium administration
  • the test samples A and a, B and b, C and c and D and d are urine collected from the same subject.
  • Si heat-treated SiO x (x ⁇ 1.999) was dissolved in hydrofluoric acid to prepare Si fluorescent semiconductor fine particles (hereinafter also referred to as “Si semiconductor fine particles” or “Si core particles”). That is, first, SiO x (x ⁇ 1.999) formed on a silicon wafer by plasma chemical vapor deposition (CVD) was annealed at 1100 ° C. in an inert gas atmosphere. Thereby, Si semiconductor fine particles (crystals) were deposited in the SiO x (x ⁇ 1.999) film. Si fine particles having different sizes were precipitated by adjusting the annealing time.
  • Si semiconductor fine particles Si fluorescent semiconductor fine particles
  • this silicon wafer is treated with about 1% hydrofluoric acid at room temperature to remove the SiO x (x ⁇ 1.999) film and collect several nanometer-sized Si semiconductor fine particles aggregated on the liquid surface. did.
  • hydrofluoric acid treatment dangling bonds (unbonded hands) of Si atoms on the surface of the semiconductor fine particles (crystals) were terminated with hydrogen, and the Si crystals were stabilized.
  • the obtained Si core particles were subjected to high-performance liquid chromatography (HPLC) separation to completely remove residual hydrogen fluoride and by-products having different sizes and composition ratios.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • the surface of the recovered monodisperse Si semiconductor fine particles was naturally oxidized in an oxygen atmosphere to form a shell layer made of SiO x (x ⁇ 1.999) around the core made of the Si semiconductor fine particles.
  • the average particle size of the core / shell particles was 3.5 nm.
  • Polyethylene glycol having an amino group at the terminal is introduced into the shell surface of the core / shell particles (molecular weight: 1000), and 4- (maleimidomethyl) -1-cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester as a crosslinker reagent (4- (maleimidomethyl) -1-cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester (SMCC)) was reacted to introduce a maleimide group at the end to prepare a NaCl solution of 1 ⁇ M quantum dots.
  • 4- (maleimidomethyl) -1-cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester 4- (maleimidomethyl) -1-cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester (SMCC)
  • a 10% bovine serum albumin (hereinafter also referred to as “BSA”) aqueous solution was added so that the final concentration was 0.1%, and the remaining surface of the quantum dot particles was blocked with BSA and labeled with quantum dots.
  • An anti-mouse L-FABP monoclonal antibody (hereinafter also referred to as “quantum dot-labeled Mab”) solution was prepared. This solution was centrifuged (5600 ⁇ G, 30 minutes) to precipitate the quantum dot-labeled Mab, and the supernatant liquid was removed to obtain a quantum dot-labeled Mab. This quantum dot label was suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 10% saccharose, 1% BSA and 0.5% Triton-X100 to obtain a quantum dot labeled Mab solution.
  • Quantum dot-labeled Mab As a capture site for a complex of L-FABP and an anti-mouse L-FABP monoclonal antibody (hereinafter also referred to as “quantum dot-labeled Mab”) labeled with a quantum dot as the second antibody, a width of 5 mm and a length of 36 mm An elongated belt-like nitrocellulose membrane was prepared as a membrane carrier 3 for chromatographic development.
  • 0.5 ⁇ l of a 1.0 mg / ml solution of anti-mouse L-FABP polyclonal antibody (IgG), which is the first antibody, is 7.5 mm from the end of the chromatography development starting point side on the above-mentioned chromatography development membrane carrier 3.
  • the film was applied in a line shape at a position and dried at room temperature to obtain a capture site 31 for a complex of L-FABP and quantum dot-labeled Mab.
  • a quantum dot-labeled Mab-impregnated member As a quantum dot-labeled Mab-impregnated member, a 5 mm ⁇ 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric was impregnated with 37.5 ⁇ l of the quantum dot-labeled Mab solution and dried at room temperature to obtain a quantum dot-labeled Mab-impregnated member 2.
  • Examples 1 to 4 100 ⁇ l of each of the test samples A to D was dropped with a micropipette onto the sample addition member 5 of each of the prepared immunochromatographic strips, developed by chromatography, and allowed to stand at room temperature for 15 minutes (Examples 1 to 4).
  • ⁇ Preparation of colloidal gold solution 1 ml of 1% (v / w) chloroauric acid aqueous solution is added to 99 ml of ultrapure water boiled by heating, and 1.5 ml of 1% (v / w) sodium citrate aqueous solution is further added 1 minute later and heated. The mixture was boiled for 5 minutes and then allowed to cool to room temperature. Subsequently, 200 mM potassium carbonate aqueous solution was added to this solution to adjust to pH 9.0, and ultrapure water was added thereto to make a total amount of 100 ml to obtain a colloidal gold solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • gold colloid-labeled Mab an anti-mouse L-FABP monoclonal antibody (hereinafter also referred to as “gold colloid-labeled Mab”) solution labeled with gold colloid is prepared.
  • This solution was centrifuged (5600 ⁇ G, 30 minutes) to precipitate the gold colloid-labeled Mab, and the supernatant was removed to obtain a gold colloid-labeled Mab.
  • This gold colloid-labeled Mab was suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 10% saccharose, 1% BSA, 0.5% Triton-X100 to obtain a gold colloid-labeled Mab solution.
  • An elongated strip-shaped nitrocellulose membrane having a width of 5 mm and a length of 36 mm was prepared as the membrane carrier 3 as a capture site for the complex of L-FABP and colloidal gold-labeled Mab.
  • 0.5 ⁇ l of a 1.0 mg / ml solution of anti-mouse L-FABP polyclonal antibody (IgG), which is the first antibody, is linearly formed at a position 7.5 mm from the end of the membrane carrier 3 on the side of the chromatography expansion start side. This was coated and dried at room temperature, and used as a capture site 31 for the complex of L-FABP and gold colloid-labeled Mab.
  • IgG anti-mouse L-FABP polyclonal antibody
  • colloidal gold labeled Mab-impregnated member 37.5 ⁇ l of a colloidal gold-labeled Mab solution was impregnated into a 5 mm ⁇ 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric, which was dried at room temperature to obtain a colloidal gold-labeled Mab-impregnated member 2.
  • a cotton cloth was prepared as the sample addition member 5 and a filter paper was prepared as the absorption member 4. And using these members, the same immunochromatographic strip as FIG. 1 was produced.
  • the L-FABP amount contained in the test samples a, b, c and d is calculated from the fluorescence amount measured by the inspection method of the present invention based on the calibration curve between the fluorescence amount and the L-FABP amount prepared in advance.
  • -Quantified FABP to guide the risk of nephropathy.
  • Table 2 shows quantitative values of L-FABP in the test samples a, b, c and d. Note that “Cr” in the unit of the quantitative value represents creatine.
  • the test method of the present invention is suitable for the risk diagnosis of contrast nephropathy. It turned out to be a method.

Abstract

　本発明は、造影剤投与前の造影剤腎症の発症リスクを予測するためのマーカーを確立し、それを簡便かつ迅速に検出できる腎症の検査方法およびその検査キットを提供することを課題とする。本発明の腎症の検査方法は、被検試料中に存在する腎臓組織由来のＬ－ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク質）を、量子ドットにより標識されたプローブを用いて検出することを特徴とする。

Description

腎症の検査方法及びそれを用いた検査キット
　本発明は、量子ドットにより標識されたプローブを用いるイムノクロマトグラフィー法による腎症の検査方法およびその検査キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、被検試料中に存在する腎臓組織由来の肝臓型脂肪酸結合タンパク質であるＬ－ＦＡＢＰを、量子ドットにより標識された超高感度のプローブを用いたイムノクロマトグラフィー法により、簡便かつ迅速に検出できる検査方法及びそれを用いた検査キットに関する。
　造影剤は、血管造影やＣＴ造影などの画像診断において必要不可欠な体内診断薬であって、定期健康診断などでも頻繁に使用され、医療現場に広く普及している。その一方で、造影剤は、造影剤腎症と呼ばれる急性な腎障害を引き起こすことも少なくなく、臨床現場の問題の１つとなっている。
　とりわけ、糖尿病、心不全などの疾患を有する者および高齢者では造影剤腎症の発症のリスクが高く、このため、造影剤投与の前に腎機能をチェックすることが必要とされている。そうしたチェックにより腎症のリスクをあらかじめ把握し、必要な投与前処置を施すことで、造影剤腎症の発症を回避できる。
　特許文献１には、腎糸球体への炎症細胞の浸潤と間接的に関連して尿中へ排泄されるシスタチンＣを測定することにより、腎症を早期に診断できる診断キットが開示され、実施例においてＥＬＩＳＡによる検査法が記載されている。
　また、特許文献２には、腎臓組織由来の脂肪酸結合タンパク質を、そのタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて検出できることが記載されているが、その実施方法については具体的な記載がない。
　したがって、造影剤投与の前の腎機能を的確に診断し、投与後も腎機能をモニター診断するための決定的な方法は未だ確立されていないのが現状であり、有用な診断・検査方法が望まれている。
特開平１１－６４３３３号公報 特開平１１－２４２０２６号公報
　本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、造影剤投与前の造影剤腎症の発症リスクを予測するためのマーカーを確立し、それを簡便かつ迅速に検出できる腎症の検査方法およびその検査キットを提供することを課題とする。
　本発明者らは、造影剤投与前における造影剤腎症の発症リスクの判断に対する簡便かつ迅速な検査方法を開発すべく鋭意研究を進めた。その結果、腎組織に由来する脂肪酸結合タンパク質であるＬ－ＦＡＢＰの発現が腎疾患に深く関連し、その発現量が少ないほど腎機能は良好であると判断されることから、Ｌ－ＦＡＢＰをマーカーとして着目し、量子ドットにより標識された超高感度のプローブを用いたイムノクロマトグラフィー法を用いる本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明に係る上記課題は、下記の手段により解決される。
　１．被検試料中に存在する腎臓組織由来のＬ－ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク質）を、量子ドットにより標識されたプローブを用いて検出することを特徴とする腎症の検査方法。
　２．前記腎症が、造影剤腎症であることを特徴とする前記１に記載の腎症の検査方法。
　３．造影剤投与の前に、造影剤腎症を発症するリスクを予測するためのデータを提供することを特徴とする前記２に記載の腎症の検査方法。
　４．前記プローブが、前記Ｌ－ＦＡＢＰに特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする前記１項から３のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
　５．イムノクロマトグラフィー法を用いることを特徴とする前記１項から４のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
　６．前記量子ドットが、シェルを施したＳｉまたはＧｅであることを特徴とする前記１から５のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
　７．前記１から６のいずれか一項に記載の腎症の検査方法に用いることを特徴とする検査キット。
　本発明は、腎症のマーカーとしての、被検試料中に存在する腎臓組織由来の肝臓型脂肪酸結合タンパク質であるＬ－ＦＡＢＰを、発光寿命の長い量子ドットにより標識されたプローブを用いることにより超高感度で検出する方法を提供することができる。さらに、造影剤投与の前の造影剤腎症の発症リスクを短時間で予測するために、イムノクロマトグラフィー法を用いることによって、簡便かつ迅速に検出できる腎症の検査方法およびその検査キットを提供することができる。
図１中、ａは、イムノクロマトストリップの平面図を表し、ｂは、ａに示されたイムノクロマトストリップの縦断面図を表す。
符号の説明
　１　粘着シート
　２　含浸部材
　３　膜担体
　３１　捕捉部位
　４　吸収用部材
　５　試料添加用部材
　本発明の腎症の検査方法は、被検試料中に存在する腎臓組織由来のＬ－ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク質）を、量子ドットにより標識されたプローブを用いて検出することを特徴とする。この特徴は、請求の範囲第１項から第７項に係る発明に共通する技術的特徴である。
　本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記腎症が、造影剤腎症であることが好ましい。また、当該腎症の検査方法は、造影剤投与の前に、造影剤腎症を発症するリスクを予測するためのデータを提供する態様であることが好ましい。更に、前記プローブが、前記Ｌ－ＦＡＢＰに特異的に結合する抗体を含む態様であることが好ましい。
　本発明の腎症の検査方法においては、イムノクロマトグラフィー法を用いることが好ましい。また、前記量子ドットが、シェルを施したＳｉまたはＧｅからなる量子ドットであることが好ましい。
　本発明の腎症の検査方法は、検査キットにおいて好適に用いることができる。
　以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための最良の形態・態様について詳細な説明をする。
　＜Ｌ－ＦＡＢＰ＞
　本発明の検査方法において、後述する腎症のマーカーとして着目したＬ－ＦＡＢＰ（Ｌｉｖｅｒ　ｔｙｐｅ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ；肝臓型脂肪酸結合タンパク質）とは、細胞内のエネルギー・脂質代謝および疎水性リガンドの輸送を担う、分子量約１４ｋＤａの可溶性タンパク質であり、肝臓、近位小腸および腎近位尿細管に特異的に発現している。Ｌ－ＦＡＢＰ遺伝子発現が、腎障害に応答し誘導されることから、検体として、尿、便、血液（全血または血清・血漿）、体液および腎組織などから採取した被検試料中のＬ－ＦＡＢＰ濃度のごく僅かな増減が、腎障害の程度を反映するものと考えられている。すなわち、従来の尿中α1－ミクログロブリンや尿中ＮＡＧなどの腎症のマーカーが近位尿細管の構造的な障害という“結果”を検出しているのに対し、Ｌ－ＦＡＢＰは腎疾患進行の“原因”となる種々のストレスを反映するものと考えられることから、これまでにない腎疾患早期の診断マーカーとして注目されている。
　＜腎症＞
　腎症の病気分類としては、第１期（腎症前期）、第２期（早期腎症期）、第３期（顕性腎症期）、第４期（腎不全期）および第５期（透析療法期）が一般的であって、早期診断という場合の「早期」とは、第１期または第２期を指すが、第１期において検査し診断できることが好ましい。特に、造影剤の投与前のリスク診断は第１期に行うことが好ましい。
　本発明において、腎症は、造影剤腎症であってもよく、その造影剤腎症とは、造影剤による腎障害のことであり、造影剤投与後４８時間以内に生じた血清クレアチニンレベルの２５％以上の上昇と定義されている。
　＜量子ドットにより標識されたプローブ＞
　本発明の検査方法において用いられる、量子ドットにより標識されたプローブの「量子ドット」とは、高い量子効率によりバンドギャップ発光を示す半導体ナノ粒子であって、半導体を構成する原子が数百～数千個集まった直径数ナノメートルの粒子である。半導体ナノ粒子の形状は、球状、棒状、板状、チューブ状などが考えられるが、本発明において用いられる半導体ナノ粒子は、球状または略球状であると考えられ、粒子径はその直径を表している。
　量子ドットは、量子サイズ効果により高い蛍光発光強度が得られ、また粒径の大きさにより蛍光の発光波長を変えられる。従来の蛍光色素とは異なり、量子ドットは半導体であるため、バンドギャップ以上のエネルギーを有する光の照射により、照射光の波長に関わらず効率よく励起することができる。さらに、量子ドットは良好な光吸収特性を示すことから、発光ダイオード（ＬＥＤ）などの低輝度の光源によっても励起することができる。したがって、単一の励起光により複数の量子ドットを励起でき、マルチカラーイメージングが簡便に実現できる。
　本発明において用いられる量子ドットは、該表面が露出した場合、該表面上の多数の欠陥が発光キラーとして働き、発光強度が低下してしまうため、シェルを施すことが好ましい。シェルを施した量子ドットは、コア・シェル構造を有する。つまり、コア部となる中心部ナノ粒子の表面を覆う層をシェル部とする二重構造を有する。該シェル部の材料として、通常はＩＩ族～ＶＩ族の化合物が好適である。この場合、上記のコア・シェル構造の観点からシェル部がコア部よりもバンドギャップが大きい組成から構成されていることが必要である。また、該コア部は単結晶であることが好ましい。単結晶とすることにより、光学素子、例えば、蛍光体微粒子の場合、高い発光効率が得られるからである。
　量子ドットは、具体的に、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｃｄ、Ｉｎ、ＳｂおよびＴｅよりなる群から選ばれる、少なくとも1つ以上の元素を含有する粒子が挙げられる。極めて毒性の高い元素であるＣｄ等を用いることを避けたいことから、少なくともＳｉまたはＧｅの元素を含み、Ｓｉまたはその化合物、あるいはＧｅまたはその化合物が好ましい。ＳｉまたはＧｅである量子ドットは、そのサイズが量子閉じ込め効果の生じる領域まで縮小することによりバンドギャップエネルギーが可視領域まで広がって発光現象が見られる。
　このような量子ドットとしては特に限定されないが、コア部がシリコン核、シェル部が酸化シリコン主体の層であること好ましい。酸化シリコン主体の層とは、酸化ケイ素（ＳｉＯ2）が主成分であるシェル層である。さらにコア部のシリコン核は、単結晶であることが好ましい。このようなコア・シェル構造を有する半導体ナノ粒子では、コア部のＳｉの励起エネルギーは１．１ｅＶ、シェル部の酸化ケイ素（ＳｉＯ2）の励起エネルギーは、８ｅＶとなり、バンドギャップエネルギーは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳなの粒子（シェル部（ＺｎＳ）３．６ｅＶ；コア部（ＣｄＳｅ）１．７ｅＶ）よりも大きい。またシリコン・シリカ系の量子ドットは、環境への負荷が少なく、生体への適用時には生体安全性にも優れる。
　上記量子ドットは、各種の公知技術、文献に記載された方法に基づいて製造してもよい。たとえば引用文献１には、材料の融解温度よりも相当に低い温度での反応雰囲気方法および溶液合成方法のいずれかと組合わされた処理技術により、固溶体希土類元素ドープナノ粒子の調製方法が記載されている。具体的には一種類以上の希土類元素でドープされた金属ハロゲン化物のナノサイズ粒子を、ハロゲン化ガスのハロゲン化雰囲気で加熱する方法、あるいは希土類元素塩およびハロゲン化物形成金属の水溶性塩の水溶液からナノ粒子を沈殿させる方法が開示されている。特に希土類元素がドープされたホスト物質のナノ粒子を溶液から調製する溶液法が望ましい。
　また、コア・シェル構造を有する量子ドットの製造方法は、公知技術、文献に記載された方法に基づく。たとえば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）シェルと金属コア構造のナノコンポジット粒子が、Ｍｕｌｖａｎｅｙら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１２：４３２９～４３３５頁、１９９６年）およびＡｄａｉｒら（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｓｃｉ．＆　Ｅｎｇ．Ｒ．２３：１３９～２４２頁、１９９８年）によって最初に合成され、報告された。コア・シェル構造を有する、ＳｉＯ2でコーティングされた量子ドットのほとんどは、使用された合成法に基づき２種のカテゴリーに分類される。
　Ｍｕｌｖａｎｅｙらによって開発された手法は、シリカシェルの形成前にシランカップリング剤の３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）による金属クラスター表面の改質を必要とする。ＡＰＳは、ガラス質との親和性に欠けた金属クラスターコアとＳｉＯ2との間の接着促進剤として使用される。Ａｄａｉｒらは、水相を有するシクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ／水の三成分系におけるテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）の単純な加水分解および縮合によって、金属およびＣｄＳのクラスターをＳｉＯ2でコーティングすることに成功した。この系により、油中に水の小滴が閉じ込められるので、コアとシェルとの両方の厚みが調整可能であるとともに極めて均一なシリカ－シェルコーティングが可能になる。
　また、量子ドットにより標識されたプローブの「プローブ」としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、脂肪酸、酵素／抗原、アビジン／ビオチン、リボ核酸およびデオキシリボ核酸またはこれらのオリゴマーなどが挙げられ、平衡状態における結合力が強く、特異性および汎用性が高いことから、特に抗体が好ましい。本発明においてプローブとして使用する抗体としては、後述するＬ－ＦＡＢＰと特異的に結合する抗体である抗Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体または抗Ｌ－ＦＡＢＰポリクローナル抗体を使用できる。
　半導体ナノ粒子をプローブに標識する方法として、多くの方法が知られているが、具体例として、ＳｉＯ2をシェル層として有する半導体ナノ粒子を抗体に標識させる反応を示す。ＳｉＯ2被覆半導体ナノ粒子を、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｐｉｅｒｃｅ社製）と反応させ、引き続きＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－［Ｎ－マレインイミドメチル］シクロヘキサン１－カルボキシレート）活性化を行う。この活性化した半導体ナノ粒子と反応させるために必要となる、タンパク質に結合したチオール基は、リジン残基を含有するタンパク質を２－イミノチオランと反応させることにより形成することができる。この反応において、結合させるタンパク質のリジン側鎖は、２－イミノチオランと開環およびチオアミジンの形成を伴って反応する。その際に形成され、タンパク質と共有結合したチオール基は、次いで、ヘテロマイケル付加反応により、上記半導体ナノ粒子表面に結合したマレインイミド基と反応して、タンパク質としての抗体と上記ＳｉＯ2被覆半導体ナノ粒子の表面にある反応性基との間に共有結合を形成することができる。
　本発明において用いられる、量子ドットにより標識されたプローブは、シェルを施したＳｉにより標識された抗Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体、シェルを施したＧｅにより標識された抗Ｌ-ＦＡＢＰモノクローナル抗体、シェルを施したＳｉにより標識された抗Ｌ－ＦＡＢＰポリクローナル抗体およびシェルを施したＧｅにより標識された抗Ｌ－ＦＡＢＰポリクローナル抗体が好ましい。
　＜検査方法＞
　本発明の検査方法における被検試料は、尿、便、血液（全血または血清・血漿）、体液および腎組織などから採取したものであって、必要ならば、試料溶解液、希釈液、緩衝液、洗浄液などにより前処理することができる。検査の手順として、まず上記被検試料を、量子ドットにより標識されたプローブと混合し結合させる。次に、洗浄などの処置により結合した複合体と遊離のプローブとを分離する。該複合体に励起光を照射し、量子ドットからの蛍光を検出する。その検出は、肉眼でもよく、また蛍光量を定量する機器を使用してもよい。その結果をデータ処理することによって、後述するように造影剤腎症を発症するリスクを予測することができる。
　上記検出を簡便かつ迅速に行えるように、次のイムノクロマトグラフィー法を利用する態様が望ましい。
　＜イムノクロマトグラフィー法＞
　本発明に好適に用いられるイムノクロマトグラフィー法（以下「イムノクロマト法」ともいう。）は、公知のイムノクロマト法テストストリップ（以下「イムノクロマトストリップ」ともいう。）の構成に準拠して容易に実施できる。
　一般に、イムノクロマトストリップは、抗原の第１の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第１の抗体と、抗原の第２の抗原決定基にて抗体抗原反応可能かつ標識された第２の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、第１の抗体が膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、第２の抗体が該捕捉部位から離隔した位置で該膜担体にてクロマトグラフィー展開可能なように配置されて構成される。
　上記第１の抗体および上記第２の抗体は、それぞれポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、少なくともいずれか一方がモノクローナル抗体であることが好ましい。通常は、第１の抗体および第２の抗体は「ヘテロ」の組み合わせで用いられ、すなわち、抗原上の位置および構造のいずれもが異なる各抗原決定基をそれぞれ認識する第１の抗体および第２の抗体が組み合わせて用いられる。しかしながら、第１の抗原決定基および第２の抗原決定基は抗原上の位置が異なっていれば構造的に同一であってもよく、その場合、第１の抗体および第２の抗体は、「ホモ」の組み合わせのモノクローナル抗体であってよく、すなわち、第１の抗体および第２の抗体の両方に同一のモノクローナル抗体を使用できる。
　イムノクロマトストリップの具体例（引用文献２の図３に記載）を、図１に示す。図中、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を表している。
　引用文献２では、上記イムノクロマトストリップの膜担体３を、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターとして作製している。
　上記膜担体３上の、クロマトグラフィー展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第１の抗体が固定され、捕捉部位３１が作製される。
　引用文献２において、上記膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被検試料中に含まれる検体がクロマトグラフィー展開可能であって、かつ上記捕捉部位３１を形成する抗体が固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
　含浸部材２は、第１の抗原決定基とは異なる部位に位置する第２の抗原決定基を認識する第２の抗体を含浸した部材からなる。該第２の抗体は、適当な標識物質であらかじめ標識されていることが好ましい。
　引用文献２では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
　上記イムノクロマトストリップはこれに限定されず、当業者は適宜変形・変更を加えてもよい。
　＜リスクの予測＞
　本発明の検査方法によって、造影剤投与の前に、造影剤腎症を発症するリスクを予測するためのデータを提供することができる。すなわち、前述の検査方法により得られた結果をデータ処理することによって、正常レベルからの逸脱の程度を検出し、問題無し・要観察・腎症発症リスク高い等のリスク評価を行うことができる。
　＜検査キット＞
　本発明の検査方法に使用される検査キットは、腎組織由来のＬ－ＦＡＢＰに結合することができる、量子ドットにより標識されたプローブを用いたマイクロプレート（９６穴マイクロプレート等）、アフィニティビーズ、イムノクロマトストリップなどを必須の構成要素とし、必要に応じて検体を溶解するための溶解液、反応試薬、検出試薬を含んでもよい。さらに、本発明の方法を実施するために必要とされる各種器材または資材、試薬を含んでもよい。該試薬は、試料溶解液、希釈液、緩衝液、洗浄液、反応停止剤、（生成物）抽出液なども含むことができる。
　さらに、キットの構成要素として、検量線作成用の標準物質、説明書さらに多数検体の同時処理が可能なマイクロプレートおよびその検出装置であるプレートリーダーなどの必要な器材一式なども含んでよい。
　本発明の検査方法に使用される検査キットの好ましい態様は、少なくとも、腎組織由来のＬ－ＦＡＢＰに結合することができる、量子ドットにより標識された抗体を用いたイムノクロマトストリップ、検体の希釈液、および量子ドットを励起する光源を含む。
　　〔引用文献１〕特開平５－２２４２６１号公報
　　〔引用文献２〕特開２００６－６７９７９号公報
　次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　＜被検試料の調製＞
　ランダムに選択した被験者４人に対し、造影剤投与前に尿を採取し、造影剤投与し２４時間後にさらに尿を採取した。造影剤投与前の尿を、それぞれ被検試料Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとし、造影剤投与２４時間後の尿を、それぞれ被検試料ａ、ｂ、ｃおよびｄとした。上記被検試料Ａならびにａ、Ｂならびにｂ、ＣならびにｃおよびＤならびにｄは、同一の被験者から採取した尿である。
　＜量子ドットとしてのシェルを施したＳｉナノ粒子の調製＞
　熱処理したＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）をフッ化水素酸中に溶解することによって、Ｓｉの蛍光半導体微粒子（以下「Ｓｉ半導体微粒子」または「Ｓｉコア粒子」ともいう。）を調製した。すなわち、まず、プラズマ化学気相成長（ＣＶＤ）法によりシリコンウエハー上に成膜したＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）を不活性ガス雰囲気中で１１００℃、アニールを行った。これにより、ＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）膜中にＳｉ半導体微粒子（結晶）が析出した。アニール時間を調整することによりサイズの異なるＳｉ微粒子を析出させた。
　次に、このシリコンウエハーを室温で１％程度のフッ化水素酸で処理することによりＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）膜を除去し、液面に凝集した数ｎｍサイズのＳｉ半導体微粒子を回収した。なお、このフッ酸処理により、半導体微粒子（結晶）表面のＳｉ原子のダングリングボンド（未結合手）が水素終端され、Ｓｉ結晶を安定化させた。得られたＳｉコア粒子を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分離処理を行い、残留するフッ化水素およびサイズ・構成比率が異なる副生成物を完全に除いた。回収した単分散性のＳｉ半導体微粒子の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、Ｓｉ半導体微粒子からなるコアの周囲にＳｉＯx（ｘ≦１．９９９）からなるシェル層を形成した。このコア・シェルからなる粒子の平均粒径は３．５ｎｍであった。このコア・シェル粒子に対しシェル表面に末端にアミノ基をもつポリエチレングリコール（分子量：１０００）を導入し、さらにクロスリンカー試薬である４－（マレイミドメチル）－１－シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（４－（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）－１－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ；ＳＭＣＣ）を反応させ末端にマレイミド基を導入し、量子ドット１μＭのＮａＣｌ溶液を調製した。
　＜量子ドットにより標識された抗Ｌ－ＦＡＢＰ抗体の調製＞
　第２の抗体である抗マウスＬ－ＦＡＢＰモノクローナル抗体のタンパク質換算質量１μｇ（以下、抗体のタンパク質換算質量を示すとき、単に、その精製タンパク質の質量分析による質量数値で示す。）をジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理後に上記のマレイミド基を末端に導入したコア・シェル量子ドット溶液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置し、この抗体を量子ドット粒子表面に結合させた後、量子ドット溶液における最終濃度が０．１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」ともいう。）水溶液を加え、この量子ドット粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、量子ドットにより標識された抗マウスＬ－ＦＡＢＰモノクローナル抗体（以下「量子ドット標識Ｍａｂ」ともいう。）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（５６００×Ｇ、３０分間）して量子ドット標識Ｍａｂを沈殿させ、上清液を除いて量子ドット標識Ｍａｂを得た。この量子ドット標識を、１０％サッカロース、１％ＢＳＡおよび０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）－Ｘ１００を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して量子ドット標識Ｍａｂ溶液を得た。
　＜量子ドットにより標識された抗体を含むイムノクロマトストリップの作製＞
　標記イムノクロマトストリップは、図１に示されるイムノクロマトストリップと同様のものを下記の手順により作製した。
　Ｌ－ＦＡＢＰと、第２の抗体である量子ドットにより標識した抗マウスＬ－ＦＡＢＰモノクローナル抗体（以下「量子ドット標識Ｍａｂ」ともいう。）との複合体の捕捉部位として、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜を、クロマトグラフィー展開用膜担体３として用意した。
　第１の抗体である抗マウスＬ－ＦＡＢＰポリクローナル抗体（ＩｇＧ）１．０ｍｇ／ｍｌの溶液０．５μｌを、上記クロマトグラフィー展開用膜担体３上のクロマトグラフィー展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、Ｌ－ＦＡＢＰと量子ドット標識Ｍａｂとの複合体の捕捉部位３１とした。
　量子ドット標識Ｍａｂ含浸部材として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、量子ドット標識Ｍａｂ溶液３７．５μｌを含浸し、これを室温で乾燥させて量子ドット標識Ｍａｂ含浸部材２とした。
　上記膜担体３、上記含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図１同様のイムノクロマトストリップを作製した。
　〔実施例１～４〕
　被検試料Ａ～Ｄそれぞれ１００μｌを、作製したイムノクロマトストリップそれぞれの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマトグラフィー展開し、室温で１５分間放置した（実施例１～４）。上記捕捉部位３１で捕捉されたＬ－ＦＡＢＰと量子ドット標識Ｍａｂとの複合体の捕捉量を、励起光（波長：３５０ｎｍ）を照射したときの赤色蛍光を肉眼で観察した。該捕捉量は、その量に比例して増減する赤色の呈色度合いを肉眼により、－（着色なし）、±（極微弱な着色）、＋（微弱な着色）、＋＋（明確な着色）および＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。同様の試験を３回（Ｎ＝１～３）繰返し、その結果を表１に示す。
　＜金コロイド溶液の調製＞
　加熱によって沸騰させた超純水９９ｍｌに、１％（ｖ／ｗ）塩化金酸水溶液１ｍｌを加え、さらに、その１分後に１％（ｖ／ｗ）クエン酸ナトリウム水溶液１．５ｍｌを加えて加熱し５分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に２００ｍＭ炭酸カリウム水溶液を加えてｐＨ９．０に調整し、これに超純水を加えて全量を１００ｍｌとして金コロイド溶液を得た。
　＜金コロイドにより標識された抗マウスＬ－ＦＡＢＰモノクローナル抗体溶液の調製＞
　第２の抗体である抗マウスＬ－ＦＡＢＰモノクローナル抗体のタンパク質換算質量１μｇ（以下、抗体のタンパク質換算質量を示すとき、単に、その精製タンパク質の質量分析による重量数値で示す。）と上記金コロイド溶液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が１％となるように１０％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」ともいう。）水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をＢＳＡでブロッキングして、金コロイドにより標識された抗マウスＬ－ＦＡＢＰモノクローナル抗体（以下「金コロイド標識Ｍａｂ」ともいう。）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（５６００×Ｇ、３０分間）して金コロイド標識Ｍａｂを沈殿させ、上清液を除いて金コロイド標識Ｍａｂを得た。この金コロイド標識Ｍａｂを１０％サッカロース・１％ＢＳＡ・０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）－Ｘ１００を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁して金コロイド標識Ｍａｂ溶液を得た。
　＜金コロイド標識Ｍａｂを含むイムノクロマトストリップの作製＞
　標記イムノクロマトストリップは、図１に示されるイムノクロマトストリップと同様のものを下記の手順により作製した。
　Ｌ－ＦＡＢＰと金コロイド標識Ｍａｂとの複合体の捕捉部位として、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜を膜担体３として用意した。
　第１の抗体である抗マウスＬ－ＦＡＢＰポリクローナル抗体（ＩｇＧ）１．０ｍｇ／ｍｌの溶液０．５μｌを、上記膜担体３におけるクロマトグラフィー展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、Ｌ－ＦＡＢＰと金コロイド標識Ｍａｂとの複合体の捕捉部位３１とした。
　金コロイド標識Ｍａｂ含浸部材として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識Ｍａｂ溶液３７．５μｌを含浸し、これを室温で乾燥させて金コロイド標識Ｍａｂ含浸部材２とした。
　上記膜担体３、上記金コロイド標識Ｍａｂ含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙とを用意した。そして、これらの部材を用いて、図１と同様のイムノクロマトストリップを作製した。
　〔比較例１～４〕
　被検試料Ａ～Ｄそれぞれ１００μｌを、作製したイムノクロマトストリップそれぞれの試料添加用部材５にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で１５分間放置した（比較例１～４）。上記捕捉部位３１で捕捉されたＬ－ＦＡＢＰと金コロイド標識Ｍａｂとの複合体の捕捉量を肉眼で観察した。該捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、－（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（顕著な着色）の４段階に区分して判定した。同様の試験を３回（Ｎ＝１～３）繰返し、その結果を表１に示す。
　〔実施例５～８〕
　また、被検試料ａ、ｂ、ｃおよびｄに含まれるＬ－ＦＡＢＰ量を、あらかじめ作製した蛍光量とＬ－ＦＡＢＰ量との検量線に基づき、本発明の検査方法によって測定した蛍光量からＬ－ＦＡＢＰを定量し、腎症リスクの指針とした。被験試料ａ、ｂ、ｃおよびｄ中のＬ－ＦＡＢＰの定量値を表２に示す。なお、定量値の単位中の「Ｃｒ」は、クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１～４と実施例５～８との本発明の検査方法による判定結果から、造影剤投与前のＬ－ＦＡＢＰの判定が定量的に出ており、造影剤投与後の腎症リスク度に比例した結果を与えたことから、造影剤腎症の造影剤投与前のリスク診断が充分に可能であることがわかる。しかも、実施例１～４は、再現性にも優れることがわかる。
　一方、比較例１～４では陰性判定がほとんどであり、実施例１～４によって検出できたＬ－ＦＡＢＰの微量検出が全く不能であり、再現性も悪かった。したがって、比較例１～４の金コロイド標識抗体を用いた方法では、造影剤投与前診断が困難であることがわかる。
　よって、量子ドット標識抗体を使用した実施例と、金コロイド標識抗体を使用した比較例との検出性能に著しい差があることから、本発明の検査方法は、造影剤腎症のリスク診断にふさわしい方法であることがわかった。

Claims (7)

  1. 被検試料中に存在する腎臓組織由来のＬ－ＦＡＢＰ（肝臓型脂肪酸結合タンパク質）を、量子ドットにより標識されたプローブを用いて検出することを特徴とする腎症の検査方法。
  2. 前記腎症が、造影剤腎症であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の腎症の検査方法。
  3. 造影剤投与の前に、造影剤腎症を発症するリスクを予測するためのデータを提供することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の腎症の検査方法。
  4. 前記プローブが、前記Ｌ－ＦＡＢＰに特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
  5. イムノクロマトグラフィー法を用いることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
  6. 前記量子ドットが、シェルを施したＳｉまたはＧｅであることを特徴とする請求の範囲第１項から第５項のいずれか一項に記載の腎症の検査方法。
  7. 請求の範囲第１項から第６項のいずれか一項に記載の腎症の検査方法に用いることを特徴とする検査キット。
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