WO2007086501A1 - 生体物質の蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法 - Google Patents

生体物質の蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007086501A1
WO2007086501A1 PCT/JP2007/051255 JP2007051255W WO2007086501A1 WO 2007086501 A1 WO2007086501 A1 WO 2007086501A1 JP 2007051255 W JP2007051255 W JP 2007051255W WO 2007086501 A1 WO2007086501 A1 WO 2007086501A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inorganic fluorescent
substance
fluorescent
nanoparticles
inorganic
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/051255
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuya Tsukada
Naoko Furusawa
Kazuyoshi Goan
Hideki Hoshino
Original Assignee
Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. filed Critical Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
Priority to JP2007556011A priority Critical patent/JPWO2007086501A1/ja
Priority to EP07707487A priority patent/EP1978366A4/en
Publication of WO2007086501A1 publication Critical patent/WO2007086501A1/ja

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent labeling agent for biological materials and a fluorescent labeling method for biological materials.
  • Organic fluorescent dyes that have been generally used for analysis of biological materials, for example, bioluminescence using the reaction of luciferin, which is a fluorescent protein, and luciferase, organic using luminescent molecules, etc.
  • the fluorescent dye is not sufficient in terms of the emission life and emission intensity as described above. Therefore, in the field of single-molecule imaging technology, fluorescent labeling substances using inorganic fluorescent nanoparticles are being developed as an alternative to these organic fluorescent dyes.
  • Inorganic fluorescent nanoparticles have a sharp emission spectrum (narrow width at half maximum), strong emission intensity, high detection accuracy because the excitation wavelength and emission wavelength are separated, and excitation according to particle size It has advantages over organic fluorescent dyes, such as the ability to control the wavelength and a longer fluorescence lifetime.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-172429
  • An object of the present invention is to provide a fluorescent labeling substance and a fluorescent labeling method for a biological substance, which can increase the binding property to a biological substance using inorganic fluorescent nanoparticles and realize a more suitable labeling. To do.
  • the site that specifically binds to the biological material contains at least one of bases, nucleotides, polynucleotides, and intercalators that constitute DNA or RNA, and is the furthest away from the surface of the inorganic fluorescent nanoparticles.
  • a fluorescent labeling substance of biological material characterized by being located at a different position.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are inorganic fluorescent nanoparticles having a core-shell structure composed of a semiconductor core and a layered shell covering the core with a compositional force different from that of the core.
  • the core of the inorganic fluorescent nanoparticles having the core-shell structure is Si, and the shell is SiO
  • a link consisting of an inorganic fluorescent nanoparticle, a modifying group having a site that specifically binds to a biological substance on the surface of the inorganic fluorescent nanoparticle, and a modifying group for connecting the inorganic fluorescent nanoparticle to each other
  • a fluorescent labeling substance for biological material characterized by having a modification group
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are inorganic fluorescent nanoparticles having a core-shell structure composed of a semiconductor core and a layered shell covering the core with a compositional force different from that of the core.
  • the biologically labeled fluorescent substance according to any one of 6 to 8.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are connected to each other by hydrogen bonds, ionic bonds, covalent bonds, or van der Waalska via the link-forming modifying groups 6 to: any force in the L0 term 1
  • the fluorescent labeling substance for biological substances according to Item is connected to each other by hydrogen bonds, ionic bonds, covalent bonds, or van der Waalska via the link-forming modifying groups 6 to: any force in the L0 term 1
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are connected to each other to form a cluster of inorganic fluorescent nanoparticles having 2 to 20 particles, 6 to: L 1 The fluorescent labeling substance of the biological substance described.
  • a fluorescent labeling method for a biological material wherein the fluorescent labeling material of the biological material according to any one of 1 to 12 is used, and a site for specifically binding the inorganic fluorescent nanoparticles to the biological material
  • a fluorescent labeling method for a biological material which comprises binding to the biological material via a modifying group having the same.
  • the inventors of the present invention are the positions farthest from the surface of the inorganic fluorescent nanoparticle in the site that specifically binds to biological substances including bases, nucleotides or polynucleotides that constitute DNA or RNA, and intercalators.
  • a modifying group having a site that binds to a biological material is also simply referred to as a biological material-binding modifying group.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are preferably inorganic fluorescent nanoparticles having a spherical shape with a particle size of 1 to: LOnm.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are inorganic fluorescent nanoparticles having a core-shell structure composed of a semiconductor core and a layered shell having a composition different from that of the core and covering the core. Is more preferable Si core, SiO
  • Inorganic fluorescent nanoparticles are particularly preferred.
  • the fluorescent labeling agent can be suitably bound to a biological substance.
  • the present inventors introduced a modifying group for linking the fluorescent labeling substances to the surface of the inorganic fluorescent nanoparticles used as the fluorescent labeling substance, and the clusters obtained by binding the fluorescent labeling substances to each other As a result, it has been found that the emission intensity for detecting the analysis target can be improved as compared with the prior art, and the present invention has been completed.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles according to Configuration 6 of the present invention have, on their surfaces, a modifying group having a site that binds to a biological substance (biological substance-binding modifying group) and the inorganic fluorescent nanoparticles mutually. And a modifying group for linking (link-forming modifying group).
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are preferably linked to each other by hydrogen bonding, ionic bonding, covalent bonding, or van der Waalska via the above-mentioned link-forming modifying group.
  • the surface coverage of the inorganic fluorescent nanoparticles by the molecules forming the link-forming modifying group is preferably 10 to 50%.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are preferably linked to each other to form an inorganic fluorescent nanoparticle cluster having 2 to 20 particles. The number of particles is adjusted by temperature or pH. Is desirable.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are spheres having a particle size of 1 to: LOnm. It is preferable that it is an inorganic fluorescent nanoparticle which is in a shape.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are more preferably inorganic fluorescent nanoparticles having a core-shell structure composed of a semiconductor core and a layered shell covering the core with a compositional force different from that of the core.
  • Inorganic fluorescent nanoparticles having Si as a core and SiO as a shell are particularly preferable.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles used in the fluorescent labeling substance of the present invention are fluorescent substances that spatially confine excitons in nano-order particles, and have a so-called quantum confinement effect and a light emission intensity higher than Balta.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are known to change the emission intensity and the fluorescence wavelength depending on the particle size, and it is possible to appropriately prepare particles having a desired particle size.
  • inorganic fluorescent nanoparticles have a spherical shape with a particle size of 0.5 to 20 nm, preferably 1 to 10 nm, more preferably 2 to 5 nm from the viewpoint of developing fluorescence suitable for analysis by single-molecule imaging. Or it is preferable that it is a substantially spherical semiconductor nanoparticle.
  • Such a particle diameter can be confirmed by observation with a TEM (transmission electron microscope), and an average of measured values obtained by observing at least 200 particle images is used.
  • the inorganic fluorescent nanoparticle is composed of a semiconductor core and a layered shell having a compositional force different from that of the core and covering the core. Desirable to be inorganic fluorescent nanoparticles having. By using a shell with a material having a larger band gap than the core material, the quantum confinement effect can be stabilized, and the emission intensity can be increased compared to inorganic fluorescent nanoparticles of the same size that do not have a core-shell structure. It is.
  • the particle size of the inorganic fluorescent nanoparticles having such a core-shell structure refers to the particle size of the portion including the shell layer.
  • the semiconductor nanoparticles constituting the inorganic fluorescent nanoparticles are not particularly limited.
  • I-VII compound semiconductors such as Cu C1, II-VI compound semiconductors such as CdS and CdSe, and III- Crystals such as Group V compound semiconductors, Group IV semiconductors such as Si and Ge, or these compound semiconductors can be appropriately selected and used.
  • the core and shell configurations described above are, for example, CdSe as the core, ZZnS as the shell, Si as the core, ZSiO as the shell, etc.
  • a suitable combination can be appropriately selected according to the semiconductor nanoparticles used.
  • Si is the core ZSiO
  • Ge is the core ZGeO.
  • semiconductor nanoparticles having a core-shell structure with 2 2 as a shell It is preferable to use semiconductor nanoparticles having a core-shell structure with 2 2 as a shell.
  • the fluorescent labeling substance of the present invention is obtained by introducing a specific “modifying group” on the surface of inorganic fluorescent nanoparticles as described above.
  • This modifying group has a site capable of specifically binding to a biological material (hereinafter referred to as “biological material binding site”). For example, it directly binds to a biological material binding site or the surface of an inorganic fluorescent nanoparticle! /, A site (hereinafter referred to as “surface binding site” t), and an intermediate site (hereinafter referred to as “spacer 1”) connecting these biological material binding site and surface binding site.
  • biological material binding site A site capable of specifically binding to a biological material binding site or the surface of an inorganic fluorescent nanoparticle! /
  • a site hereinafter referred to as “surface binding site” t
  • spacer 1 an intermediate site connecting these biological material binding site and surface binding site.
  • Examples of the biological substance-binding site include bases constituting DNA or RNA in combination with adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil, and polynucleotides (oligonucleotides) to which a single nucleotide or a plurality of nucleotides are bonded. And intercalator). Any of these substances can specifically bind to a target biological substance (gene site).
  • the bases constituting the DNA or RNA bind to the corresponding complementary bases, and the nucleotide or polynucleotide binds to the nucleotide or polynucleotide having a complementary base sequence. Since the above-mentioned polynucleotide has a plurality of bases, it can form a more stable bond as compared with the case where the bases constituting DNA or RNA are singular.
  • the intercalator is a compound that is inserted and bonded between base pairs of ds (double-stranded) DNA.
  • an intercalator used in the present invention for example, as a fluorescent agent
  • compounds having a heterocyclic structure such as ethidium bromide and atalidine. Since such an intercalator is inserted and bonded between base pairs when dsDNA is formed, it can be used, for example, as a fluorescent labeling substance for detecting dsDNA in a hybridization method.
  • Such a biological material binding site is present at a position of the modifying group that is farthest from the surface of the inorganic fluorescent nanoparticle.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles can be bound to the target biological substance without causing steric hindrance and labeled.
  • a biological material binding site when a biological material binding site is introduced into a compound having a rigid and linear molecular structure to form a modifying group, the biological material binding site is bonded to the end of the compound, whereby the inorganic fluorescent nanoparticle is bonded.
  • the surface force of the particles can be positioned farthest away.
  • a biological material binding site when a biological material binding site is introduced into a long-chain compound having a structure of polyethylene glycol or the like as described later, a reactive functional group is located on the carbon atom farthest from the surface of the inorganic fluorescent nanoparticle.
  • the biological material binding site may be bound via the functional group.
  • the presence of the biological material binding site at the most distant position of the surface modification force of the inorganic fluorescent nanoparticles of the modifying group creates a calibration curve between the introduction site of the biological material binding site and the binding property to the biological material. This can be confirmed.
  • a modification group is introduced into inorganic fluorescent nanoparticles using a compound in which a reactive functional group is located at each carbon atom in a long chain molecular structure, and each fluorescent labeling substance is bound to a biological substance. Measure fluorescence intensity.
  • the modifying group used in the fluorescent labeling substance in which the strongest fluorescence was detected is a modifying group in which a biological material binding site exists at a position farthest from the surface of the inorganic fluorescent nanoparticle. is there.
  • the fluorescent labeling substance of the present invention uses other modifying groups other than those described above, for example, a phosphate group, an amino group, or a polyoxyethylene group, as necessary, as long as the effects of the present invention are not inhibited. It is also possible to have a modifying group for improving the hydrophilicity.
  • the fluorescent labeling substance of the above constitution 6 of the present invention includes two kinds of inorganic fluorescent nanoparticles as described above. At least one “modifying group” is introduced.
  • One of the modifying groups of the present invention is capable of specifically binding to a biological substance or the like, and this is hereinafter referred to as “biological substance binding modifying group”.
  • Another modifying group of the present invention is for linking (linking) the fluorescent labeling substances of the present invention, and is hereinafter referred to as “link-forming modifying group”.
  • the fluorescent labeling substance of the present invention can have other modifying groups as necessary within the range not inhibiting the effects of the present invention.
  • the surface coverage of the inorganic fluorescent nano-particles of the molecules forming the link-forming modifying group is preferably 10 to 50% from the viewpoint of enabling preferable clusters to be formed. 15 to 40 % Is more preferable.
  • the “surface coverage” as described above in the present invention is the ratio of the area of the region covered with the molecules forming the link-forming modifying group to the entire surface area of the inorganic fluorescent nanoparticles, for example, TEM It can be measured by the observation used.
  • the aspect of the biological substance binding modifying group is not particularly limited as long as a biological substance binding modifying group is introduced according to the use of a fluorescent label in a target analysis by a known method.
  • modified groups to which ss (l-strand) DNA is conjugated such as those used to detect DNA by hybrid formation methods, and conjugated piotin or avidin, such as those used to detect proteins by ELISA.
  • a modifying group or a modifying group to which a lectin or a specific antibody is bound as used for detection of cancer cells can be used as the biological substance-binding modifying group of the present invention.
  • link-forming modifying group a compound that can be linked to each other by a hydrogen bond, an ionic bond, a covalent bond, or van der Waalska can be used.
  • examples of the above-mentioned shared bond include disulfide bond between thiol groups, peptide bond with amino group and carboxyl group, and a compound having these functional groups may be introduced on the surface of inorganic fluorescent nanoparticles.
  • the number of reaction sites such as hydrogen bond, ionic bond, and covalent bond in the link-forming modifying group is not particularly limited and can be adjusted as appropriate.
  • link formation The modifying group may be one in which one covalent bond having a relatively strong binding force is formed or relatively weak in a binding force, or one in which a plurality of hydrogen bonds are formed.
  • link-forming modifying groups can be linked to each other, a single type may be used or a plurality of types may be used in combination.
  • the same modifying group having a thiol group can be introduced as a link-forming modifying group into all fluorescent labeling substances.
  • two types of link-forming modification groups such as a link-forming modification group having an amino group and a link-forming modification group having a carboxyl group are introduced into one fluorescent labeling substance is also included in the embodiment of the present invention.
  • a link-forming modifying group a fluorescent labeling substance into which the same or plural kinds of modifying groups having an amino group are introduced, and the same or plural kinds of modifying groups having a carboxyl group are introduced. It can be used in combination with a fluorescent labeling substance so that it can be linked by peptide bonds. It is more preferable that the viewpoints that do not affect the link formation between the fluorescent labeling substances are such that the functional groups present in the same fluorescent labeling substance do not bind to each other.
  • the biological substance-binding modifying group and the link-forming modifying group as described above are usually introduced into the surface of the inorganic fluorescent nanoparticle as different molecules, but as one embodiment of the present invention, a branched structure is used. It is also possible to introduce the same molecule having both a biological substance-binding modifying group and a link-forming modifying group.
  • an embodiment having the above-described configuration 1 and having the configuration of configuration 6, that is, the above-described configuration 5 is a particularly preferable embodiment because the effect of the present invention is great.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles used in the present invention can be produced according to a known method.
  • the production method is not particularly limited, and examples thereof include vapor phase methods such as CVD method, laser ablation method, silane decomposition method, Si electrode evaporation method, and liquid phase methods such as electrolysis method and reverse micelle method.
  • Inorganic fluorescent nanoparticles produced by these methods may exist in a state of being suspended and dispersed in a liquid, a state of being immobilized on a plate, or the like. There is no particular limitation as long as it can be performed.
  • an amorphous SiO film is deposited on a Si substrate by using a plasma CVD method or a sputtering method, and this is annealed at a high temperature to form Si nanoparticles in the SiO film.
  • the SiO film is dissolved with HF to obtain S nanoparticles aggregated on the liquid surface.
  • the surface is naturally oxidized in an oxygen atmosphere, or if it is heated and thermally oxidized, it becomes inorganic fluorescent nanoparticles having si as a core Zsio as a shell.
  • the modifying group of the present invention is introduced by forming the surface binding site using a compound capable of binding to the surface of the inorganic fluorescent nanoparticle, and binding the substance that forms the biological material binding site to this compound. It is possible. Alternatively, the compound that forms the surface binding site may be bound to the compound that forms the spacer, and then the substance that forms the biological material binding site may be bound.
  • a silane coupling agent which is a compound widely used for binding an inorganic substance and an organic substance
  • This silane coupling agent has an ethoxy group or a methoxy group that gives a silanol group (Si-OH) by hydrolysis at one end of the molecule, and a thiol group (mercapto group), amino group, or epoxy group at the other end.
  • Si-OH silanol group
  • mercapto group a compound having a functional group such as an aldehyde group, and bonded to an inorganic substance through an oxygen atom of the silanol group.
  • Examples of conventionally used silane coupling agents include mercaptopropyltriethoxysilane.
  • the silane coupling agent can be bonded to the fluorescent nanoparticle via an oxygen atom by reacting using a known method.
  • the procedure is as shown below. First, prepare inorganic fluorescent nanoparticles with Si as the core and ZSiO as the shell.
  • mercaptopropyltriethoxysilane is introduced onto the surface of the shell by replacing the solvent with toluene and adding mercaptopropyltriethoxysilane and reacting for about 2 hours.
  • a surface binding site may be formed using dimercaptosuccinic acid or 11 mercaptoundecanoic acid.
  • dimercaptosuccinic acid or 11 mercaptoundecanoic acid For example, when semiconductor nanoparticles are produced by the reverse micelle method as described later, the surface is coated with TOPO (tri-n-oc tylphosphine oxide), etc. This is combined with dimercaptosuccinic acid or 11- It is possible to carry out a substitution reaction with mercaptodecanoic acid. As a result, dimercaptocono, succinic acid or 11-mercaptodecanoic acid binds to the surface of inorganic fluorescent nanoparticles via a sulfur atom, and has a carboxyl group at the other end. A compound for forming can be bound.
  • a surface binding site such as a compound that directly binds to inorganic fluorescent nanoparticles, a compound for forming a biological substance binding modifying group and Z or a link forming modifying group, and the silane coupling agent described above is provided.
  • the compound force to be formed may be an embodiment in which the compounds are bonded via an intermediate site (also referred to as “spacer”). That is, the spacer includes a site that can bind to a compound that directly binds to inorganic fluorescent nanoparticles, and a site that can bind to a compound for forming a biological substance-binding modifying group and Z or a link-forming modifying group.
  • a hino-anionic crosslinker such as sulfo-SMCC (maleimidomethylcyclohexanecalboxylic acid sulfohydroxysuccinimide ester sodium salt).
  • the sulfo-SMCC has two reaction sites having directivity with respect to amino groups or thiol groups, so that one of them is bonded to, for example, a silane coupling agent and the other is bonded to a biological material binding site. It can be used for bonding with compounds to form.
  • the biological substance binding site is capable of binding to a target biological substance, for example, a surface binding site or a spacer on a part of a base, polynucleotide, or intercalator constituting DNA or RNA. It is possible to bond to a compound by forming a functional group that can be bonded to the functional group of the compound to be formed according to a known method. For example, when a silane coupling agent having a thiol group is reacted with a nucleotide having the same thiol group introduced, a nucleotide is introduced into the modifying group by a disulfide bond.
  • the link-forming modifying group includes, for example, a thiol group, an amino group, and a carboxyl group. It can be introduced by using a compound having two or more reactive functional groups such as a group. Of these functional groups, one is used to link to each other by hydrogen bonds, ionic bonds, covalent bonds or van der Waals forces as described above, and the other is a surface binding site or Used to bind to the functional group of the compound that forms the spacer. Examples of the compound for forming such a link-forming modifying group include dicarboxylic acids and amino acids that are compounds having at least an amino group and a carboxyl group.
  • the biological substance-binding modifying group and the link-forming modifying group are introduced as different molecules onto the surface of the inorganic fluorescent nanoparticle, for example, two kinds of silane coupling agents are mixed. It is possible to adjust the surface coverage of each molecule by using the method.
  • a silane coupling agent that can bind only to inorganic fluorescent nanoparticles and a compound that forms a biological substance-binding modifying group is bound only to a compound that forms inorganic fluorescent nanoparticles and a link-forming modifying group.
  • the silane strength coupling agent is mixed in the same ratio as the target surface coverage ratio, the mixed solution containing these two types of silane coupling agents and the inorganic fluorescent nanoparticles are reacted, and then the biomaterial is bound. It should be allowed to react with a solution containing the modifying group and the link-forming modifying group.
  • the ratio of surface modification in the equilibrium state can be controlled by selecting the binding site of the functional group according to the order of the binding strength to bind to the inorganic fluorescent particles.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles are connected to each other through the link-forming modifying group as described above to form a cluster. It is desirable that the number of inorganic fluorescent nanoparticles constituting this cluster can be adjusted by temperature or pH.
  • the binding force between the link-forming modifying groups can be adjusted by changing the environment such as temperature or pH, or by introducing and controlling the number of modifying groups that prevent the linkage-forming modifying group from binding.
  • an oligonucleotide as a link-forming modifying group, it is possible to adjust the binding strength of the link-forming modifying group by mixing the base sequence with a complementary base sequence that is not complementary. It is.
  • the number of inorganic fluorescent nanoparticles constituting the cluster can be appropriately adjusted.
  • the number is preferably 2 to 20 from the standpoint of sufficiently increasing the emission intensity and preventing the movement in the living body.
  • the number of inorganic fluorescent nanoparticles in the cluster can be confirmed by observation with a TEM (transmission electron microscope).
  • the fluorescent labeling substance of the present invention described above can be suitably used in various analyzes performed using conventional fluorescent labeling substances. Examples of such analysis include immunostaining using fixed cells, real-time tracking of receptor 'ligand, and single molecule imaging. In these analyses, since the cluster formed by the fluorescent labeling substance of the present invention emits stronger fluorescence compared to the case where the fluorescent labeling substance is alone, the detection accuracy of the biological substance is improved. Is possible.
  • the fluorescent labeling agent of the present invention can be suitably used for the following analyzes that have a genetic information such as DNA or RNA and that can be used for various analyzes on biological substances.
  • ssDNA of unknown base sequence is cleaved one molecule at a time with an enzyme having 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity or 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity, and each nucleotide is cleaved one after another.
  • an enzyme having 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity or 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity each nucleotide is cleaved one after another.
  • the fluorescence emitted by the combined fluorescent labeling agent is detected over time using a highly sensitive fluorescence detector, thereby allowing the base sequence of ssDNA to be detected. Can be determined.
  • this silicon wafer was treated with a 1% hydrofluoric acid aqueous solution at room temperature to remove the SiO film, and several nm-sized Si crystals aggregated on the liquid surface were recovered. In addition, this
  • the inorganic fluorescent nanoparticles produced as described above and having Si as the core and ZSiO as the shell are:
  • the deviation was 3.5 mm in average grain size.
  • inorganic fluorescent nanoparticles prepared by the HF etching method were placed in 30% H 2 O for 10 minutes.
  • the crystal surface was hydroxylated by dispersing for 2 2. Next, the solvent was replaced with toluene, and 2% of mercaptopyrtriethoxysilane was added to toluene, and SiO on the outermost surface of the inorganic fluorescent nanoparticles was silanized and a mercapto group was introduced over 2 hours. Next, place the solvent in pure water.
  • sample A The fluorescent labeling substance thus obtained was designated as sample A.
  • inorganic fluorescent nanoparticles prepared by HF etching instead of inorganic fluorescent nanoparticles prepared by HF etching, inorganic fluorescent nanoparticles prepared by an anodic oxidation method are used, and a fluorescent labeling substance is applied by the same method as described above. This was manufactured as sample c.
  • inorganic fluorescent nanoparticles prepared by the HF etching method were placed in 30% H 2 O for 10 minutes.
  • the crystal surface was hydroxylated by dispersing for 2 2. Next, the solvent was replaced with toluene, 2% of mercaptotritriethoxysilane was added to toluene, and SiO on the outermost surface of the inorganic fluorescent nanoparticles was silanized and a mercapto group was introduced over 2 hours. Next, place the solvent in pure water.
  • the fluorescent fluorescent substance is manufactured by the same method as described above using the inorganic fluorescent nanoparticles prepared by the anodic oxidation method, and this is used as a sample. D.
  • inorganic fluorescent nanoparticles obtained by the HF etching method were divided into four sizes: average particle size 1.5 nm, 2.0 ⁇ m, 2.5 nm, and 3. Onm.
  • the outermost SiO was silanized and a mercapto group was introduced in the same manner as in the preparation of Sample A.
  • Oligonucleotide was attached to the end of the microarray slide well Inorganic fluorescent nanoparticles were placed, and the DNA to be detected was dropped, transferred to a thermostatic layer, etc., the inside of the well was heated to several tens of degrees, and incubated for 1 day under humidified conditions. At this time, if the oligonucleotide corresponding to each other's base sequence and the DNA to be detected are in the same well, they cause an hybridization reaction.
  • Samples B, C and D were also measured in the same manner as in sample A above.
  • Table 1 shows the results of fluorescence intensity and visual detection accuracy. The fluorescence intensity is shown as a relative value when Sample B is 100!
  • the base sequence of the DNA can be expressed in a different color sequence. You can know the information.
  • the adenine base-modified inorganic fluorescent nanoparticles were blue, the guanine base-modified inorganic fluorescent nanoparticles were blue-green, the cytosine base-modified inorganic fluorescent nanoparticles were green, and the thymine base-modified inorganic fluorescent nanoparticles were red.
  • a mercapto group and an amino group were introduced.
  • the solvent is replaced with pure water, and a nofa salt is added.
  • the mercapto group-introduced oligonucleotide is held at one end so as to be ⁇ and left for 1 hour, so that the mercapto groups are bonded to each other.
  • inorganic fluorescent nanoparticles and oligonucleotides were bonded.
  • mercapto with a surface area of 4: 1 in the same manner as above except that a silane coupling agent having an aldehyde group introduced therein was used instead of the aminopropyltriethoxysilane. A group and an aldehyde group were introduced, and an oligonucleotide having a mercapto group introduced was bonded to one end.
  • sample A The two types of inorganic fluorescent nanoparticles were mixed at 30 ° C for 2 hours, and the resulting fluorescently labeled substance was used as sample A2.
  • sample A the amino group and aldehyde group reacted to form a link by IR and molecular weight analysis, forming a cluster of an average of 6 inorganic fluorescent nanoparticle nanoparticles.
  • the fluorescent fluorescent substance is manufactured by the same method as described above using the inorganic fluorescent nanoparticles prepared by the anodic oxidation method, and this is used as a sample. C2.
  • inorganic fluorescent nanoparticles prepared by the HF etching method were placed in 30% H 2 O for 10 minutes.
  • the crystal surface was hydroxylated by dispersing for 2 2. Next, the solvent was replaced with toluene, 2% of mercaptotritriethoxysilane was added to toluene, and SiO on the outermost surface of the inorganic fluorescent nanoparticles was silanized and a mercapto group was introduced over 2 hours. Next, place the solvent in pure water.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles prepared by the HF etching method are used to produce a fluorescent labeling substance by the same method as described above, and this is used as a sample. D2.
  • a mercapto group and an amino group were introduced. Subsequently, the solvent is replaced with pure water, and a nofa salt is added. Further, a mercapto group is introduced at one end, and an oligonucleotide having a methyloxyl group introduced at the other end becomes ⁇ . In addition, by leaving it to stand for 1 hour, inorganic fluorescent nanoparticles and oligonucleotides were bound by sulfidic bonding of mercapto groups.
  • mercapto was obtained in the same manner as described above except that a silane coupling agent into which an aldehyde group was introduced was used instead of the aminopropyltriethoxysilane with a surface area of 4: 1.
  • a silane coupling agent into which an aldehyde group was introduced was used instead of the aminopropyltriethoxysilane with a surface area of 4: 1.
  • Group and an aldehyde group, a mercapto group introduced at one end, and a methyloxycarbonyl group introduced at the other end are placed so that the oligonucleotide becomes ⁇ and left for 1 hour.
  • the inorganic fluorescent nanoparticles and the oligonucleotide were bonded by sulfid bonding of the mercapto group.
  • sample E2 The two types of inorganic fluorescent nanoparticles were mixed at 30 ° C for 2 hours, and the resulting fluorescently labeled substance was used as sample E2.
  • sample A the amino group and aldehyde group reacted to form a link by IR and molecular weight analysis, forming a cluster consisting of an average of 6 inorganic fluorescent nanoparticles.
  • A2-E2 prepared by the method described above was subjected to DNA analysis in the same manner as in Example 1. It was.
  • Table 2 shows the results of fluorescence intensity and visual detection accuracy.
  • the fluorescence intensity is shown as a relative value when sample B2 is 100.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

　本発明は、無機蛍光ナノ粒子からなる生体物質の蛍光標識物質であって、該無機蛍光ナノ粒子の表面に結合した修飾基を有し、該修飾基は生体物質と特異的に結合する部位を有し、該生体物質と特異的に結合する部位は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを構成する塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびインターカレーターの少なくとも１つを含み、かつ該無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた位置に位置することを特徴とする。本発明により、ハイブリッド形成法でのＤＮＡ、ＲＮＡの検出や、ＤＮＡの塩基配列の決定などの生体物質を対象とした分析、ＥＬＩＳＡ法での抗原の検出を行う分析などにおいて、より高感度で、より高精度の分析を行うことが可能となる。

Description

明 細 書
生体物質の蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法
技術分野
[0001] 本発明は、生体物質を対象とした蛍光標識剤および生体物質の蛍光標識方法に 関する。
背景技術
[0002] 近年、バイオインフォマティクス、プロテオミタスの観点から、 mRNAやタンパク質の 生体内での作用、動態を解析するために、ゲノムの機能、遺伝子の発現調節または 個々の生体分子の振る舞いを分子レベルで把握する、いわゆる「1分子イメージング」 なる方法概念が提起されている。これに基づき病気の原因や医薬の作用を解明しよ うとする 1分子イメージング技術の研究開発が進められている。このような 1分子ィメー ジング技術においては、標的とする生体物質 (タンパク質、例えば抗体、 DNA、 RN A、オリゴヌクレオチドなど)の 1分子に対して蛍光標識物質 1分子を結合させ、これに 所定の励起光を照射し、蛍光標識物質の発光を検出することにより、生体物質の動 態などに関する情報を得ることが試みられる。蛍光標識物質の発光寿命が短く退色 が早い場合や、発光強度が不足している場合には、 1分子イメージングとして充分な 観察が行えないことは明らかである。
[0003] これまで生体物質を対象とした分析に一般的に用いられている有機蛍光色素、例 えば蛍光タンパク質であるルシフェリンとルシフェラーゼとの反応を利用した生物発 光、発光分子などを利用した有機蛍光色素は、上記のような発光寿命や発光強度の 点で充分ではなかった。そこで 1分子イメージング技術分野においては、これらの有 機蛍光色素に替わるものとして、無機蛍光ナノ粒子を利用した蛍光標識物質が開発 の途にある。無機蛍光ナノ粒子は、発光スペクトルがシャープな形状である（半値幅 が狭い)こと、発光強度が強いこと、励起波長と発光波長が離れているため検出精度 が高いこと、粒子サイズに応じて励起波長を制御できること、ならびに蛍光寿命が長 いことなど、有機蛍光色素と比較して有利な点をもっている。
[0004] このような、 1分子イメージング技術分野における無機蛍光ナノ粒子を利用した蛍光 標識剤については、上記のような事項だけでなぐ標的とする生体物質との結合性、 すなわち特異性、結合力も重要視される。ところが、従来の無機蛍光ナノ粒子を利用 した蛍光標識剤 (例えは特許文献 1参照）においては、結合性に大きく関与する立体 障害などの面力 修飾基に関する結合性を改善することについて、何ら検討されてこ なかった。また、無機蛍光ナノ粒子を利用した蛍光標識物質については、検出精度 を改善するため、発光強度の向上が追求されている。従来は、個々の無機蛍光ナノ 粒子の粒径や材質、またはコアシェル構造などの粒子の構造の面から、発光強度を 向上させようとすることが試みられてきた (例えば特許文献 1参照）が、さらなる改善の 余地が残されていた。
特許文献 1 :特開 2005— 172429号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、無機蛍光ナノ粒子を用いた、生体物質への結合性を高め、より好適な 標識を実現しうる蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法を提供することを目 的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 上記目的は、下記構成により達成される。
1.無機蛍光ナノ粒子からなる生体物質の蛍光標識物質であって、該無機蛍光ナノ 粒子の表面に結合した修飾基を有し、該修飾基は生体物質と特異的に結合する部 位を有し、該生体物質と特異的に結合する部位は、 DNAもしくは RNAを構成する 塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびインターカレーターの少なくとも 1つを含 み、かつ該無機蛍光ナノ粒子の表面カゝら最も離れた位置に位置することを特徴とす る生体物質の蛍光標識物質。
2.前記無機蛍光ナノ粒子が、粒径力^〜 lOnmの球状の半導体ナノ粒子であること を特徴とする 1に記載の生体物質の蛍光標識物質。
3.前記無機蛍光ナノ粒子が、半導体のコアと、該コアとは異なる組成力 なり該コア を被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子 であることを特徴とする 2に記載の生体物質の蛍光標識物質。 4.前記コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子のコアが Siであり、シェルが SiO
2 であることを特徴とする 3に記載の生体物質の蛍光標識物質。
5.前記無機蛍光ナノ粒子が、無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結するための修飾 基であるリンク形成修飾基を有することを特徴とする 1〜4のいずれか 1項に記載の生 体物質の蛍光標識物質。
6.無機蛍光ナノ粒子からなり、該無機蛍光ナノ粒子の表面に、生体物質と特異的に 結合する部位を有する修飾基と、該無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結するための 修飾基であるリンク形成修飾基とを有することを特徴とする生体物質の蛍光標識物質
7.前記リンク形成修飾基を形成する分子の無機蛍光ナノ粒子における表面被覆率 が 10〜50%であることを特徴とする 6に記載の生体物質の蛍光標識物質。
8.前記無機蛍光ナノ粒子は、粒径が 1〜： LOnmの球状の無機蛍光ナノ粒子であるこ とを特徴とする 6または 7に記載の生体物質の蛍光標識物質。
9.前記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと、該コアとは異なる組成力 なり該コア を被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子 であることを特徴とする 6〜8のいずれか 1項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
10.前記コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子のコアが Siであり、シェルが SiO であることを特徴とする 9に記載の生体物質の蛍光標識物質。
2
11.前記リンク形成修飾基を介して水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデ ルヮールスカにより前記無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結して ヽることを特徴とす る 6〜： L0項のいずれ力 1項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
12.前記無機蛍光ナノ粒子が互いに連結することによって、粒子数が 2〜20の無機 蛍光ナノ粒子クラスターを形成して 、ることを特徴とする、 6〜： L 1の 、ずれか 1項に記 載の生体物質の蛍光標識物質。
13.生体物質の蛍光標識方法であって、 1〜12のいずれか 1項に記載の生体物質 の蛍光標識物質を用い、前記無機蛍光ナノ粒子を前記生体物質と特異的に結合す る部位を有する修飾基を介して生体物質に結合させることを特徴とする生体物質の 蛍光標識方法。 [0007] 本発明者らは、 DNAもしくは RNAを構成する塩基、ヌクレオチドもしくはポリヌクレ ォチド、インターカレーターを含む生体物質に特異的に結合する部位を無機蛍光ナ ノ粒子の表面カゝら最も離れた位置に有する修飾基を、該無機蛍光ナノ粒子の表面に 導入することにより、立体障害などの問題が回避され、分析の対象とする生体物質へ の結合性が従来よりも向上した蛍光標識剤が得られることを見出し、本発明を完成さ せるに至った。以下、生体物資に結合する部位を有する修飾基を、単に生体物質結 合修飾基ともいう。
[0008] 本発明において、上記無機蛍光ナノ粒子は、粒径が 1〜： LOnmの球状である無機 蛍光ナノ粒子であることが好ましい。また、上記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと 、該コアとは異なる組成カゝらなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、コア シェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることがより好ましぐ Siをコア、 SiOをシ
2 エルとする無機蛍光ナノ粒子が特に好まし 、。
[0009] 上記のような修飾基を介することにより、蛍光標識剤を生体物質に好適に結合させ ることが可能となる。
[0010] また、本発明者らは、蛍光標識物質として用いられる無機蛍光ナノ粒子の表面に、 該蛍光標識物質同士を連結させるための修飾基を導入し、該蛍光標識物質同士が 結合したクラスターを形成させることにより、分析対象を検出するための発光強度が 従来よりも向上しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
[0011] 本発明の上記構成 6に係る無機蛍光ナノ粒子は、その表面に、生体物質に結合す る部位を有する修飾基 (生体物質結合修飾基)と、該無機蛍光ナノ粒子同士を互い に連結させるための修飾基 (リンク形成修飾基)とを有する。無機蛍光ナノ粒子同士 は、上記リンク形成修飾基を介した水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデ ルヮールスカにより互いにリンクすることが好まし 、。
[0012] 上記リンク形成修飾基を形成する分子による無機蛍光ナノ粒子の表面被覆率は、 1 0〜50%であることが好ましい。また、上記無機蛍光ナノ粒子は、互いにリンクするこ とによって粒子数が 2〜20の無機蛍光ナノ粒子クラスターを形成することが好ましぐ 該粒子数は温度もしくは pHによって調整されるものであることが望ましい。
[0013] 本発明の上記構成 6において、上記無機蛍光ナノ粒子は、粒径が 1〜： LOnmの球 状である無機蛍光ナノ粒子であることが好ましい。また、上記無機蛍光ナノ粒子は、 半導体のコアと、該コアとは異なる組成力 なり該コアを被覆する層状のシェルとで構 成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることがより好ましぐ Siをコ ァ、 SiOをシェルとする無機蛍光ナノ粒子が特に好ましい。
2
発明の効果
[0014] 本発明により、ハイブリッド形成法での DNA、 RNAの検出や、 DNAの塩基配列の 決定などの生体物質を対象とした分析、 ELISA法での抗原の検出を行う分析などに おいて、蛍光標識剤の結合性が改善され、 1分子イメージング技術により、より高感度 およびより高精度の分析を行うことが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0015] (無機蛍光ナノ粒子）
本発明の蛍光標識物質に用いられる無機蛍光ナノ粒子は、ナノオーダーの粒子中 に空間的に励起子を閉じ込め、いわゆる量子閉じ込め効果により、バルタ以上の発 光強度が得られる蛍光物質である。この無機蛍光ナノ粒子は、その粒径により発光 強度や蛍光波長が変化することが知られており、所望の粒径のものを適宜調製する ことが可能である。本発明においては、 1分子イメージングによる分析に好適な蛍光 を発色するなどの点から、無機蛍光ナノ粒子は、粒径が 0.5〜20nm、好ましくは 1〜 10nm、より好ましくは 2〜5nmの、球状またはほぼ球状の半導体ナノ粒子であること が好ましい。なお、このような粒径は、 TEM (透過型電子顕微鏡)での観察により確 認することが可能であり、少なくとも 200個の粒子像を観察した測定値の平均を用い るちのとする。
[0016] さらに、本発明において、上記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと、該コアとは異 なる組成力もなり該コアを被覆する層状のシェルとで構成される、 V、わゆるコアシェル 構造を有する無機蛍光ナノ粒子であることが望まし 、。コアとなる物質よりも大きなバ ンドギャップを有する物質をシェルとすることにより、量子閉じ込め効果を安定化させ 、コアシェル構造をもたない同サイズの無機蛍光ナノ粒子よりも発光強度を高めること が可能である。なお、このようなコアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子について の粒径は、シェル層を含めた部分の粒径をさす。 [0017] 上記無機蛍光ナノ粒子を構成する半導体ナノ粒子は特に制限されず、例えば、 Cu C1等の I-VII族化合物半導体、 CdS、 CdSe等の II-VI族化合物半導体、 InAs等の III -V族化合物半導体または Si、 Ge等の IV族半導体もしくはこれらの化合物半導体な どの結晶を適宜選択して用いることができる。また、上記コアおよびシェルの構成に ついては、例えば、 CdSeをコア ZZnSをシェル、 Siをコア ZSiOをシェルとするなど
2
、用いる半導体ナノ粒子に応じて好適な組み合わせを適宜選択することができる。本 発明では、環境汚染や人体に対する毒性が懸念される物質を用いることなぐしかも 発光が良好であることから、 Siをコア ZSiOをシェルとする、または Geをコア ZGeO
2 2 をシェルとするコアシェル構造を有する半導体ナノ粒子を用いることが好適である。
[0018] (上記構成 1に係る修飾基）
本発明の蛍光標識物質は、上述したような無機蛍光ナノ粒子の表面に、特定の「修 飾基」が導入されたものである。この修飾基は、生体物質と特異的に結合しうる部位（ 以下「生体物質結合部位」という。）を有し、例えば、生体物質結合部位、無機蛍光ナ ノ粒子の表面に直接結合して!/、る部位 (以下「表面結合部位」 t 、う。）およびこれら の生体物質結合部位と表面結合部位を連結して 、る中間部位 (以下「スぺーサ一」と いう。）から構成される。このような修飾基を介して、上記無機蛍光ナノ粒子は、標識 の対象とする生体物質に結合することが可能となる。
[0019] 上記生体物質結合部位としては、例えば、アデニン、グァニン、シトシン、チミン、ゥ ラシルと ヽつた DNAまたは RNAを構成する塩基や、単独のヌクレオチドまたは複数 のヌクレオチドが結合したポリヌクレオチド (オリゴヌクレオチドを含む）、インターカレ 一ター、が挙げられる。これらの物質は、いずれも標的とする生体物質 (遺伝子部位） に特異的に結合しうるものである。上記 DNAまたは RNAを構成する塩基はそれぞ れに対応する相補的となる塩基に結合し、上記ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド はそれと相補的な塩基配列を有するヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドと結合する。 上記ポリヌクレオチドは複数の塩基を有するため、 DNAまたは RNAを構成する塩基 が単独である場合と比較し、より安定した結合を形成することができる。
[0020] また、上記インターカレーターは、 ds (二本鎖) DNAの塩基対間に挿入結合する化 合物である。本発明で用いられるインターカレーターとしては、例えば、蛍光剤として も用いられるェチジゥムブロマイドやアタリジンなどの、ヘテロ環構造を有する化合物 を用いることができる。このようなインターカレーターは、 dsDNAが形成される際に塩 基対間に挿入結合するため、例えばハイブリッド形成法において dsDNAを検出する ための蛍光標識物質に用いることが可能である。
[0021] このような生体物質結合部位は、修飾基の、無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離 れた位置に存在する。これにより、無機蛍光ナノ粒子は立体障害を起こすことなく対 象とする生体物質に結合し、これを標識することが可能となる。
[0022] 例えば、分子の構造が剛直で直線的な化合物に生体物質結合部位を導入して修 飾基とする場合、その化合物の末端に生体物質結合部位を結合させることにより、無 機蛍光ナノ粒子の表面力も最も遠ざけて位置させることが可能となる。また、後述す るようなポリエチレングリコールなどによる構造を有する長鎖状の化合物に生体物質 結合部位を導入する場合は、無機蛍光ナノ粒子の表面から最も離れた炭素原子に 反応性官能基を位置させ、その官能基を介して生体物質結合部位を結合させれば よい。
[0023] 生体物質結合部位が、修飾基の無機蛍光ナノ粒子の表面力 最も離れた位置に 存在することは、生体物質結合部位の導入位置と、生体物質との結合性との検量線 を作成することで確認できる。例えば、長鎖状の分子構造におけるそれぞれの炭素 原子に反応性官能基を位置させた化合物を用いて無機蛍光ナノ粒子に修飾基を導 入し、それぞれの蛍光標識物質を生体物質に結合させて蛍光の強度を測定する。こ の際、最も強い蛍光が検出された蛍光標識物質に用いられている修飾基が、無機蛍 光ナノ粒子の表面カゝら最も離れた位置に生体物質結合部位が存在している修飾基 である。
[0024] なお、本発明の蛍光標識物質は、本発明による効果を阻害しない範囲において、 必要に応じて上述した以外のその他の修飾基、例えばリン酸基、アミノ基またはポリ ォキシエチレン基などを用いた親水性を向上させるための修飾基などを有することも 可能である。
[0025] (上記構成 6に係る修飾基）
本発明の上記構成 6の蛍光標識物質は、上述したような無機蛍光ナノ粒子に 2種 類の「修飾基」がそれぞれ少なくとも 1個以上導入されたものである。本発明の修飾基 の 1つは、生体物質などに特異的に結合しうるものであり、以下これを「生体物質結合 修飾基」とよぶ。もう 1つの本発明の修飾基は、本発明の蛍光標識物質同士をリンク（ 連結）させるためのものであり、以下これを「リンク形成修飾基」とよぶ。なお、本発明 の蛍光標識物質は、本発明による効果を阻害しない範囲において、必要に応じてそ の他の修飾基を有することも可能である。
[0026] 上記リンク形成修飾基を形成する分子の無機蛍光ナノ粒子における表面被覆率は 、好ましいクラスターを形成できるようにするなどの点から、 10〜50%であることが好 ましぐ 15〜40%であることがより好ましい。なお、本発明における上述のような「表 面被覆率」は、リンク形成修飾基を形成する分子が被覆している領域の面積の、無機 蛍光ナノ粒子の表面積全体に対する割合であり、例えば TEMを用いた観察により測 定することが可能である。
[0027] 上記生体物質結合修飾基は、公知の手法により、対象とする分析における蛍光標 識の用途に応じたものを導入すればよぐその態様は特に限定されない。例えば、ハ イブリツド形成法による DNAの検出に用いられるような、 ss (l本鎖) DNAを結合させ た修飾基、 ELISA法によるタンパク質の検出に用いられるような、ピオチンまたはァ ビジンを結合させた修飾基、あるいは、ガン細胞の検出に用いられるような、レクチン または特異的抗体を結合させた修飾基などを、本発明の生体物質結合修飾基とする ことができる。
[0028] 上記リンク形成修飾基としては、水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデル ワールスカなどにより相互に連結しうる化合物を用いることができる。例えば、上記共 有結合としては、チオール基同士によるジスルフイド結合、アミノ基およびカルボキシ ル基によるペプチド結合などが挙げられ、これらの官能基を有する化合物を無機蛍 光ナノ粒子の表面に導入すればよい。また、リンク形成修飾基としてヌクレオチド鎖を 用いて、相補的なヌクレオチド鎖を有する無機蛍光ナノ粒子同士を連結させるように することも可會である。
[0029] なお、リンク形成修飾基における、上記水素結合、イオン結合、共有結合などの反 応部位の数は特に限定されず、適宜調節することが可能である。例えば、リンク形成 修飾基は、結合力の比較的強い共有結合が 1つ形成されるものでもよぐ結合力の 比較的弱 、水素結合が複数形成されるものでもよ 、。
[0030] 本発明において、リンク形成修飾基は相互にリンクしあえるものであれば、単独の種 類を用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。例えば、本発明の一態様 において、すべての蛍光標識物質には、リンク形成修飾基として、チオール基を有す る同一の修飾基を導入することができる。また、アミノ基を有するリンク形成修飾基と カルボキシル基を有するリンク形成修飾基のような、 2種類のリンク形成修飾基を 1つ の蛍光標識物質に導入したものも本発明の態様に含まれる。さらに、本発明の別の 態様において、リンク形成修飾基として、アミノ基を有する同一または複数種の修飾 基が導入された蛍光標識物質と、カルボキシル基を有する同一または複数種の修飾 基が導入された蛍光標識物質とを組み合わせ、ペプチド結合によりリンクできるよう用 いることができる。蛍光標識物質同士のリンク形成に影響を及ぼさないようにする観 点力らは、同一の蛍光標識物質に存在する官能基同士は互いに結合しないもので あることがより好ましい。
[0031] 以上のような生体物質結合修飾基およびリンク形成修飾基は、通常、それぞれが 異なる分子として無機蛍光ナノ粒子の表面に導入されるものであるが、本発明の一 態様として、分岐構造を有する同一の分子に生体物質結合修飾基およびリンク形成 修飾基の両方が備えられたものを導入することも可能である。
[0032] また本発明においては、上記構成 1の構成であり、かつ構成 6の構成を有する態様 即ち、上記構成 5の態様が本発明の効果が大きく特に好ましい態様である。
[0033] (蛍光標識物質の製造方法：無機蛍光ナノ粒子の調製）
本発明で用いられる無機蛍光ナノ粒子は、公知の方法に従って製造することがで きる。その製造方法は特に制限されないが、例えば、 CVD法、レーザーアブレーショ ン法、シラン分解法、 Si電極蒸発法などの気相法や、電気分解法、逆ミセル法などの 液相法が挙げられる。これらの方法により製造された無機蛍光ナノ粒子は、液体中に 懸濁分散した状態、プレート上に固定化された状態などの態様で存在する場合があ る力 後述するような修飾基の導入が行える態様であればとくに限定されるものでは ない。 [0034] より具体的には、例えば、プラズマ CVD法やスパッタ法を用いて Si基板上にァモル ファスの SiO膜を堆積させ、これを高温でァニールし、 SiO膜内に Siナノ粒子を形
2 2
成させた後、 HFで SiO膜を溶解することにより、液面に凝集した Sけノ粒子が得ら
2
れる。さらに、その表面を酸素雰囲気下で自然酸化させれば、または加熱して熱酸 化させれば、 siをコア Zsioをシェルとする無機蛍光ナノ粒子となる。
2
[0035] (修飾基の導入）
本発明の修飾基は、無機蛍光ナノ粒子の表面に結合しうる化合物を用いて前記表 面結合部位を形成し、この化合物に前記生体物質結合部位を形成する物質を結合 させることにより、導入することが可能である。また、表面結合部位を形成する化合物 に、スぺーサーを形成する化合物を結合させた後、前記生体物質結合部位を形成 する物質を結合させてもょ ヽ。
[0036] 表面結合部位を形成する化合物としては、例えば、無機物と有機物とを結合させる ために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。こ のシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基 (Si-OH)を与える エトキシ基またはメトキシ基を有し、他端にチオール基 (メルカプト基）、アミノ基、ェポ キシ基 (グリシジル基)、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノ ール基の酸素原子を介して無機物に結合する。従来用いられているシランカップリン グ剤としては、例えば、メルカプトプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。
[0037] シランカップリング剤は、公知の手法を用いて反応させることにより、酸素原子を介 して蛍光ナノ粒子と結合させることが可能である。例えば、以下に示すような手順の 通りである。まず、 Siをコア ZSiOをシェルとする無機蛍光ナノ粒子を調整し、これを
2
過酸化水素水中に分散させ、シェルの表面を水酸ィ匕させる。続いて、溶剤をトルエン に置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランを添カ卩して 2時間程度かけて反応させ ることにより、シェルの表面にメルカプトプロピルトリエトキシシランが導入される。
[0038] また、上記シランカップリング剤の代わりに、ジメルカプトコハク酸や 11 メルカプト ゥンデカン酸などを用いて表面結合部位を形成することもできる。例えば、後述する ような逆ミセル法により半導体ナノ粒子を製造した場合、その表面は TOPO (tri-n-oc tylphosphine oxide)などで被覆されている力 これとジメルカプトコハク酸または 11— メルカプトゥンデカン酸とを置換反応させることが可能である。これにより、ジメルカプ トコノ、ク酸または 11—メルカプトゥンデカン酸は硫黄原子を介して無機蛍光ナノ粒子 の表面に結合する力 他端にはカルボキシル基を有するため、後述するような生体 物質結合部位を形成するための化合物を結合させることができる。
[0039] さらに、本発明において、無機蛍光ナノ粒子に直接結合する化合物と、生体物質 結合修飾基および Zまたはリンク形成修飾基を形成するための化合物、上記シラン カップリング剤などの表面結合部位を形成する化合物力 中間部位（「スぺーサ一」と もいう。）を介して結合するような態様であっても構わない。すなわち、該スぺーサー は、無機蛍光ナノ粒子に直接結合する化合物と結合しうる部位と、生体物質結合修 飾基および Zまたはリンク形成修飾基を形成するための化合物と結合しうる部位とを 有する化合物であり、このような化合物としては、 sulfo— SMCC (maleimidomethylcy clohexanecalboxylic acid sulfohydroxysuccinimide ester sodium salt)などのヒノアンク ショナルクロスリンカ一と呼ばれる有機分子を用いることが可能である。
[0040] 例えば、上記 sulfo— SMCCは、アミノ基またはチオール基に対する指向性を有す る反応部位を 2つ有するので、その片方を例えばシランカップリング剤に結合させ、 他方を生体物質結合部位を形成するための化合物との結合に用いることができる。 また、ビファンクショナルクロスリンカ一としては、ポリエチレングリコール（PEG)などの ォキシアルキレンの両端に、表面結合部位を形成する物質に結合しうる機能性官能 基と、生体物質結合部位を形成する物質とに結合しうる機能性官能基とが導入され た構造のものを用いることもできる。
[0041] 一方、生体物質結合部位は、標的とする生体物質に結合しうる、例えば DNAまた は RNAを構成する塩基やポリヌクレオチド、インターカレーターなどの一部に、表面 結合部位またはスぺーサーを形成する化合物が有する官能基と結合しうる官能基を あら力じめ公知の方法に従って導入することにより、それらの化合物に結合させること が可能である。例えば、チオール基を有するシランカップリング剤と、同じくチオール 基を導入したヌクレオチドとを反応させた場合、ジスルフイド結合により、修飾基にヌク レオチドが導入される。
[0042] また、リンク形成修飾基にっ 、ては、例えば、チオール基、アミノ基、カルボキシル 基などの反応性官能基を 2つ以上有する化合物を用いることにより導入することがで きる。これらの官能基のうち、 1つは、前述したような水素結合、イオン結合、共有結 合またはファンデルワールス力などにより相互に連結するために用いられ、もう 1つは 、表面結合部位またはスぺーサーを形成する化合物が有する官能基と結合するため に用いられる。このようなリンク形成修飾基を形成するための化合物としては、例えば 、ジカルボン酸類や、アミノ基およびカルボキシル基を少なくとも有する化合物である アミノ酸などが挙げられる。
[0043] 本発明にお ヽて、上記生体物質結合修飾基およびリンク形成修飾基がそれぞれ異 なる分子として無機蛍光ナノ粒子の表面に導入される場合、例えば、 2種類のシラン カップリング剤を混合して用いるなどの手法により、それぞれの分子の表面被覆率を 調整することが可能である。例えば、この手法においては、無機蛍光ナノ粒子および 生体物質結合修飾基を形成する化合物とのみ結合しうるシランカップリング剤と、無 機蛍光ナノ粒子およびリンク形成修飾基を形成する化合物とのみ結合しうるシラン力 ップリング剤を、目的とする表面被覆率の割合と同じ割合で混合し、これら 2種類のシ ランカップリング剤を含む混合溶液と無機蛍光ナノ粒子とを反応させ、その後に生体 物質結合修飾基およびリンク形成修飾基を含む溶液と反応させるようにすればょ ヽ。 無機蛍光粒子へ結合する、結合力の順位に従って官能基の結合部位を選択するこ とにより平衡状態での表面修飾の割合をコントロールできる。
[0044] (クラスター）
本発明の蛍光標識物質において、上述したようなリンク形成修飾基を介して無機蛍 光ナノ粒子同士は互いに連結し、クラスターを形成する。このクラスターを構成する無 機蛍光ナノ粒子の数は、温度または pHにより調整することが可能であることが望まし い。リンク形成修飾基同志の結合力は、例えば温度、または pHなどの環境を変更し たり、リンク形成修飾基の結合を妨げる修飾基を導入しその数をコントロールすること によって調整することができる。また、リンク形成修飾基として例えばオリゴヌクレオチ ドを利用する場合、相補的な塩基配列と相補的でな 、塩基配列とを混在させることに より、リンク形成修飾基の結合力を調整することも可能である。
[0045] また、上記クラスターを構成する無機蛍光ナノ粒子の数は適宜調整することができ るが発光強度を充分に高めると共に、生体内の移動を妨げないようにするなどの点 から、その数は 2〜20であることが好ましい。なお、クラスタ一中の無機蛍光ナノ粒子 の数は、 TEM (透過型電子顕微鏡)での観察により確認することが可能である。
[0046] 標的とする生体物質に結合した無機蛍光ナノ粒子に、生体物質には直接的に結合 していない無機蛍光ナノ粒子が連結するような態様のクラスターが形成されることによ り、 1分子の生体物質を従来より多数の無機蛍光ナノ粒子で標識することが可能であ る。
[0047] 上述した本発明の蛍光標識物質は、従来の蛍光標識物質を用いて行われていた 各種分析において好適に利用することが可能である。このような分析としては、例え ば、固定細胞を用いた免疫染色、レセプター'リガンドのリアルタイムトラッキング、 1分 子イメージングなどが挙げられる。これらの分析において、本発明の蛍光標識物質に より形成されたクラスタ一は、蛍光標識物質が単独である場合と比較して、より強力な 蛍光を発するため、生体物質の検出精度を向上させることが可能となる。
[0048] (蛍光標識物質を用いた分析方法）
本発明の蛍光標識剤は、 DNAまたは RNAなどの遺伝子情報を持つ、生体物質を 対象とした各種分析に用いることができる力 とりわけ下記のような分析に好適に用い ることがでさる。
[0049] 例えば、生体物質結合部位にアデニン、グァニン、シトシン、チミンまたはそれぞれ の塩基を有するヌクレオチドを導入した、異なる波長の蛍光を発する 4種類の蛍光標 識剤は、それぞれの対応する塩基を有する ssDNAまたはヌクレオチドに結合する。 したがって、それらの 4種類の結合標識剤を用いて、未知の塩基配列の ssDNAの個 々の塩基に蛍光標識剤を結合させた場合、これに励起光を照射し、蛍光の配列を読 みとることにより、 ssDNAの塩基配列を決定することが可能となる。また、未知の塩基 配列の ssDNAを、 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ活性または 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活 性を有する酵素でヌクレオチドを 1分子ずつ切断し、次々と切り離されるヌクレオチド のそれぞれに上記 4種類の蛍光標識剤の 、ずれかを結合させるようにした場合、結 合した蛍光標識剤が発する蛍光を高感度の蛍光検出器を用いて経時的に検出する ことにより、 ssDNAの塩基配列を決定することが可能となる。 実施例
[0050] 実施例 1
(HFエッチング法による無機蛍光ナノ粒子の調製）
プラズマ CVDによりシリコンウェハー上に成膜した SiOx (x= 1. 999)を不活性ガ ス雰囲気中で 1100°C、 1時間度ァニールを行った。これにより、 SiO膜中に Si結晶
2
が析出した。次に、このシリコンウェハーを室温で 1%のフッ酸水溶液で処理すること により SiO膜を除去し、液面に凝集した数 nmサイズの Si結晶を回収した。なお、この
2
フッ酸処理により、結晶表面の Si原子のダングリングボンド (未結合手）が水素終端さ れ、 Si結晶が安定化する。その後、回収した Si結晶の表面を酸素雰囲気中で自然 酸化し、 Si結晶カゝらなるコアの周囲に SiOカゝらなるシェル層を形成させた。
2
[0051] (陽極酸化法による無機蛍光ナノ粒子の調製）
フッ酸 (46%)、メタノール（100%)及び過酸化水素水（30%)を 1： 2 : 2の割合で 混合した溶液中で、 p型シリコンウェハー及び白金を対向電極として 320mAZcm2 で約 1時間通電し、 Si結晶を析出させた。このようにして得られた Si結晶の表面を酸 素雰囲気中で自然酸化し、 Si結晶からなるコアの周囲に SiO力もなるシェル層を形
2
成させた。
[0052] 以上のように製造された、 Siをコア ZSiOをシェルとする無機蛍光ナノ粒子は、 ヽ
2
ずれも平均粒経 3.5mmであった。
[0053] (オリゴヌクレオチド末端修飾基の導入：サンプル Aおよび C)
先ず、 HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を 30%H O中に 10分
2 2 間分散させ、結晶表面を水酸化させた。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプ 口ピルトリエトキシシランをトルエンの 2%加えて、 2時間かけて無機蛍光ナノ粒子の最 表面の SiOをシランィ匕すると共にメルカプト基を導入した。続いて、溶剤を純水に置
2
換してバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入されたオリゴヌクレオチド を ΙΟΟηΜとなるように加えて 1時間放置することで、無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌタレ ォチドとを結合させた。このようにして得られた蛍光標識物質をサンプル Aとした。
[0054] また、 HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子に代えて、陽極酸化法 により調製された無機蛍光ナノ粒子を用いて、上述と同じ方法により蛍光標識物質を 製造し、これをサンプル cとした。
[0055] (オリゴヌクレオチドを中間位置させた修飾基の導入：サンプル Bおよび D)
先ず、 HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を 30%H O中に 10分
2 2 間分散させ、結晶表面を水酸化させた。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトェ チルトリエトキシシランをトルエンの 2%加えて、 2時間かけて無機蛍光ナノ粒子の最 表面の SiOをシランィ匕すると共にメルカプト基を導入した。続いて、溶剤を純水に置
2
換してバッファ塩を添加し、さらに一方の末端にメルカプト基を導入し、他方の末端に メチルォキシカルボ-ル基を導入したオリゴヌクレオチドを ΙΟΟηΜとなるように加えて 1時間放置することで、メルカプト基をスルフイド結合させることにより無機蛍光ナノ粒 子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。この無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドと が結合して ヽる状態は、サンプル Aの修飾基の末端部にさらにメチルォキシカルボ- ル基が結合している状態に相当する。このようにして得られた蛍光標識物質をサンプ ル Bとした。
[0056] また、 HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子に代えて、陽極酸化法 により調製された無機蛍光ナノ粒子を用いて、上述と同じ方法により蛍光標識物質を 製造し、これをサンプル Dとした。
[0057] (DNA塩基末端修飾基の導入:サンプル E)
まず、 HFエッチング法により得られた無機蛍光ナノ粒子を平均粒径 1.5nm、 2.0η m、 2.5nm、 3. Onmの 4つのサイズ別に分けた。それぞれについて、サンプル Aの調 製の場合と同様に最表面の SiOをシランィ匕するとともにメルカプト基を導入した。続
2
いて、溶剤を純水に置換しバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入され たアデニン塩基を ΙΟΟηΜになるように加えて 1時間放置し、メルカプト基同志でスル フイドを形成することで、末端にアデニン塩基を結合させた。同様にしてグァニン塩基 、シトシン塩基、チミン塩基を末端にもつ修飾基を導入した無機蛍光ナノ粒子を調製 した。これら 4つの修飾基の異なりサイズの異なる Si量子ドットを混合することでサン プル Eとした。
[0058] (DNA解析方法）
マイクロアレイスライドのゥエルにあらカゝじめオリゴヌクレオチドが末端に結合された 無機蛍光ナノ粒子を入れておき、検出対象 DNAを滴下後、恒温層等に移し、ゥエル 内を数十度に加熱し、加湿化された条件で 1日インキュベーションした。この際、互い の塩基配列が対応したオリゴヌクレオチドと検出対象 DNAとが同一のゥエルにある場 合には、それらがノ、イブリダィゼーシヨン反応を起こす。
[0059] 続!、て、ゥエルを純水等で洗浄し、ハイブリダィゼーシヨン反応を起こして!/、な!/、ゥ エル内のオリゴヌクレオチドを結合した蛍光標識物質 (サンプル A)を除去する。この 結果、ゥエル内にはハイブリダィゼーシヨン反応を起こしたオリゴヌクレオチド結合無 機蛍光ナノ粒子が残存することとなる。
[0060] 続、て、蛍光顕微鏡 (ォリンパス社製)を用いて、 430nmの励起光を所定のゥエル に照射したときの、蛍光アドレス情報を検出し、 目視で検出精度を判断した。検出精 度は明らかに蛍光が明るくハイブリダィゼーシヨンを起こしているマップが明確わかる 場合は良好とし、蛍光強度が低く一見してわ力りづらい場合には検出不良とした。ま た、別途、インキュベートしてノ、イブリダィゼーシヨンを起こさせたサンプルを日本分 光社製 FP— 6500を用いて 400nm励起光を照射したときの蛍光強度を測定した。
[0061] サンプル B、 Cおよび Dについても上記サンプル Aの場合と同様に測定を行った。こ れらの蛍光強度、 目視検出精度に関する結果を表 1に示す。なお、蛍光強度はサン プル Bを 100とした時の相対値で示して!/、る。
[0062] 表 1に示されたように、本発明に従って末端部分に相補結合する部位を導入するこ とによって蛍光強度が増大し、 DNAに対する検出精度も大きく向上することがわかる
[0063] またサンプル Eにつ!/、ても検出対象 DNAとゥエル上で混合しマイクロアレイスライド のゥエル上で検出することにより DNAの塩基配列を異なる色の配列で表すことがで き、 DNA配列情報を知ることができる。アデニン塩基修飾無機蛍光ナノ粒子は青色 、グァニン塩基修飾無機蛍光ナノ粒子は青緑、シトシン塩基修飾無機蛍光ナノ粒子 は緑、チミン塩基修飾無機蛍光ナノ粒子は赤色であった。
[0064] [表 1]
Figure imgf000018_0001
実施例 2
(オリゴヌクレオチド末端修飾基の導入：サンプル A2およびサンプル C2) 実施例 1で作製した HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を 2つに分 [0066] まず一方を用いて、 30%H O中に 10分間分散させ、結晶表面を水酸化させた。
2 2
次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランとァミノプロビルト リエトキシシランとを 4 : 1の割合で混合した混合物をトルエンの 2%加えて、 2時間か けて無機蛍光ナノ粒子の最表面の SiOをシラン化すると共に、 4 : 1の割合の表面積
2
でメルカプト基およびアミノ基を導入した。続いて、溶剤を純水に置換してノ ッファ塩 を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入されたオリゴヌクレオチドを ΙΟΟηΜとなる ようにカ卩えて 1時間放置することで、メルカプト基同士をスルフイド結合させ、無機蛍 光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。
[0067] 残る他方については、上記アミノプロピルトリエトキシシランの代わりにアルデヒド基 が導入されたシランカップリング剤を用いた以外は上記と同様の方法にて、 4 : 1の割 合の表面積でメルカプト基およびアルデヒド基を導入し、さらに一端にメルカプト基の 導入されたオリゴヌクレオチドを結合させた。
[0068] この 2種類の無機蛍光ナノ粒子を 30°Cで 2時間混合させ、得られた蛍光標識物質 をサンプル A2とした。サンプル Aは IR、分子量解析によりアミノ基とアルデヒド基が反 応してリンクを形成し、無機蛍光ナノ粒子ナノ粒子が平均 6つ集ったクラスターを形成 していることが分力つた。
[0069] また、 HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子に代えて、陽極酸化法 により調製された無機蛍光ナノ粒子を用いて、上述と同じ方法により蛍光標識物質を 製造し、これをサンプル C2とした。
[0070] (オリゴヌクレオチドを中間位置させた修飾基の導入：サンプル B2)
先ず、 HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を 30%H O中に 10分
2 2 間分散させ、結晶表面を水酸化させた。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトェ チルトリエトキシシランをトルエンの 2%加えて、 2時間かけて無機蛍光ナノ粒子の最 表面の SiOをシランィ匕すると共にメルカプト基を導入した。続いて、溶剤を純水に置
2
換してバッファ塩を添加し、さらに一方の末端にメルカプト基を導入し、他方の末端に メチルォキシカルボ-ル基を導入したオリゴヌクレオチドを ΙΟΟηΜとなるように加えて 1時間放置することで、メルカプト基をスルフイド結合させることにより無機蛍光ナノ粒 子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。このようにして得られた蛍光標識物質をサン プル B2とした。これは、本発明における生体物質結合修飾基のみが導入された状態 のものである。
[0071] また、 HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子に代えて、陽極酸化法 により調製された無機蛍光ナノ粒子を用いて、上述と同じ方法により蛍光標識物質を 製造し、これをサンプル D2とした。
(オリゴヌクレオチドを中間に位置させ、リンクされた修飾基の導入、：サンプル E2) 実施例 1で作製した HFエッチング法により調製された無機蛍光ナノ粒子を 2つに分 けた。
[0072] まず一方を用いて、 30%H O中に 10分間分散させ、結晶表面を水酸化させた。
2 2
次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランとァミノプロビルト リエトキシシランとを 4 : 1の割合で混合した混合物をトルエンの 2%加えて、 2時間か けて無機蛍光ナノ粒子の最表面の SiOをシラン化すると共に、 4 : 1の割合の表面積
2
でメルカプト基およびアミノ基を導入した。続いて、溶剤を純水に置換してノ ッファ塩 を添加し、さらに一方の末端にメルカプト基を導入し、他方の末端にメチルォキシ力 ルポ二ル基を導入したオリゴヌクレオチドを ΙΟΟηΜとなるように加えて 1時間放置す ることで、メルカプト基をスルフイド結合させることにより無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌク レオチドとを結合させた。
[0073] 残る他方については、上記アミノプロピルトリエトキシシランの代わりにアルデヒド基 が導入されたシランカップリング剤を用いた以外は上記と同様の方法にて、 4 : 1の割 合の表面積でメルカプト基およびアルデヒド基を導入し、さらに一方の末端にメルカ ブト基を導入し、他方の末端にメチルォキシカルボ二ル基を導入したオリゴヌクレオ チドを ΙΟΟηΜとなるようにカ卩えて 1時間放置することで、メルカプト基をスルフイド結 合させることにより無機蛍光ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとを結合させた。
[0074] この 2種類の無機蛍光ナノ粒子を 30°Cで 2時間混合させ、得られた蛍光標識物質 をサンプル E2とした。サンプル Aは IR、分子量解析によりアミノ基とアルデヒド基が反 応してリンクを形成し、無機蛍光ナノ粒子が平均 6つ集ったクラスターを形成している ことが分力つた。
[0075] 上記に記載の方法で作製した A2-E2を実施例 1と同様の方法で DNA解析を行つ た。
これらの蛍光強度、目視検出精度に関する結果を表 2に示す。なお、蛍光強度はサ ンプル B2を 100としたときの相対値で示している。
[0076] 表 2に示されたように、本発明に従ってリンク形成修飾基を導入した蛍光標識物質 を用いることにより蛍光強度が増大し、 DNAに対する検出精度も大きく向上すること がわカゝる。
[0077] [表 2]
Figure imgf000022_0001

Claims

請求の範囲
[1] 無機蛍光ナノ粒子からなる生体物質の蛍光標識物質であって、該無機蛍光ナノ粒子 の表面に結合した修飾基を有し、該修飾基は生体物質と特異的に結合する部位を 有し、該生体物質と特異的に結合する部位は、 DNAもしくは RNAを構成する塩基、 ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびインターカレーターの少なくとも 1つを含み、かつ 該無機蛍光ナノ粒子の表面カゝら最も離れた位置に位置することを特徴とする生体物 質の蛍光標識物質。
[2] 前記無機蛍光ナノ粒子が、粒径力^〜 lOnmの球状の半導体ナノ粒子であることを 特徴とする請求の範囲第 1項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
[3] 前記無機蛍光ナノ粒子が、半導体のコアと、該コアとは異なる組成力 なり該コアを 被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子で あることを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
[4] 前記コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子のコアが Siであり、シェルが SiOで
2 あることを特徴とする請求の範囲第 3項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
[5] 前記無機蛍光ナノ粒子が、無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結するための修飾 基であるリンク形成修飾基を有することを特徴とする請求の範囲第 1〜4項のいずれ 力 1項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
[6] 無機蛍光ナノ粒子からなり、該無機蛍光ナノ粒子の表面に、生体物質と特異的に 結合する部位を有する修飾基と、該無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結するための 修飾基であるリンク形成修飾基とを有することを特徴とする生体物質の蛍光標識物質
[7] 前記リンク形成修飾基を形成する分子の無機蛍光ナノ粒子における表面被覆率が 10〜50%であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の生体物質の蛍光標識 物質。
[8] 前記無機蛍光ナノ粒子は、粒径力^〜 lOnmの球状の無機蛍光ナノ粒子であること を特徴とする請求の範囲第 6または 7項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
[9] 前記無機蛍光ナノ粒子は、半導体のコアと、該コアとは異なる組成力 なり該コアを 被覆する層状のシェルとで構成される、コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子で あることを特徴とする請求の範囲第 6〜8項のいずれ力 1項に記載の生体物質の蛍 光標識物質。
[10] 前記コアシェル構造を有する無機蛍光ナノ粒子のコアが Siであり、シェルが SiOで
2 あることを特徴とする請求の範囲第 9項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
[11] 前記リンク形成修飾基を介して水素結合、イオン結合、共有結合またはファンデル ワールスカにより前記無機蛍光ナノ粒子同士が互いに連結して!/ヽることを特徴とする 請求の範囲第 6〜10項のいずれか 1項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
[12] 前記無機蛍光ナノ粒子が互いに連結することによって、粒子数が 2〜20の無機蛍 光ナノ粒子クラスターを形成して 、ることを特徴とする、請求の範囲第 6〜 11の 、ず れか 1項に記載の生体物質の蛍光標識物質。
[13] 生体物質の蛍光標識方法であって、請求の範囲第 1〜12項のいずれか 1項に記 載の生体物質の蛍光標識物質を用い、前記無機蛍光ナノ粒子を前記生体物質と特 異的に結合する部位を有する修飾基を介して生体物質に結合させることを特徴とす る生体物質の蛍光標識方法。
PCT/JP2007/051255 2006-01-27 2007-01-26 生体物質の蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法 WO2007086501A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007556011A JPWO2007086501A1 (ja) 2006-01-27 2007-01-26 生体物質の蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法
EP07707487A EP1978366A4 (en) 2006-01-27 2007-01-26 FLUORESCENT MARKER FOR BIOLOGICAL MATERIAL AND METHOD FOR MARKING BIOLOGICAL MATERIAL WITH FLUORESCENCE MARKER

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006019459 2006-01-27
JP2006019458 2006-01-27
JP2006-019458 2006-01-27
JP2006-019459 2006-01-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007086501A1 true WO2007086501A1 (ja) 2007-08-02

Family

ID=38309287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/051255 WO2007086501A1 (ja) 2006-01-27 2007-01-26 生体物質の蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100255462A1 (ja)
EP (2) EP1978366A4 (ja)
JP (1) JPWO2007086501A1 (ja)
WO (1) WO2007086501A1 (ja)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009048039A1 (ja) * 2007-10-12 2009-04-16 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 分子・細胞イメージング方法及び半導体ナノ粒子
WO2009066548A1 (ja) * 2007-11-21 2009-05-28 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 半導体ナノ粒子、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法
WO2009069416A1 (ja) * 2007-11-29 2009-06-04 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 半導体ナノ粒子とその製造方法
WO2009081680A1 (ja) * 2007-12-21 2009-07-02 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 腎症の検査方法及びそれを用いた検査キット
WO2009144983A1 (ja) * 2008-05-28 2009-12-03 コニカミノルタエムジー株式会社 無機ナノ粒子標識剤
JP2010008194A (ja) * 2008-06-26 2010-01-14 Konica Minolta Medical & Graphic Inc Ｇｅナノ粒子、及び生体物質標識剤
WO2010004777A1 (ja) * 2008-07-07 2010-01-14 コニカミノルタエムジー株式会社 無機ナノ粒子標識剤
JPWO2008032534A1 (ja) * 2006-09-14 2010-01-21 コニカミノルタエムジー株式会社 蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用いたバイオイメージング法及び生体物質解析方法
US20110020241A1 (en) * 2008-08-06 2011-01-27 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. Fluorescent labeling agent containing quantum dots
JP2011519812A (ja) * 2008-05-06 2011-07-14 コミサリア ア レネルジ アトミク エ オ ゼネルジ アルテルナティヴ シリコンナノパーティクルの表面処理
JP2013204005A (ja) * 2012-03-29 2013-10-07 Konica Minolta Inc 半導体ナノ粒子集積体
WO2020110481A1 (ja) * 2018-11-30 2020-06-04 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 複合体及び検出装置
JP2022099742A (ja) * 2020-12-23 2022-07-05 昇陽國際半導體股▲ふん▼有限公司 バイオプローブのリンカー

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5082860B2 (ja) * 2006-01-27 2012-11-28 コニカミノルタエムジー株式会社 Ｓｉ／Ｓｉ３Ｎ４型ナノ粒子、該ナノ粒子を用いた生体物質標識剤及び前記ナノ粒子の製造方法
EP3020086A1 (en) * 2013-07-10 2016-05-18 Umicore Silicon-based powder and electrode containing the same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002539454A (ja) * 1999-03-01 2002-11-19 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア 生物学的用途のための半導体ナノクリスタルプローブ
JP2005172429A (ja) 2003-12-05 2005-06-30 Sony Corp 生体物質蛍光標識剤及び生体物質蛍光標識方法、並びにバイオアッセイ方法及び装置

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582921B2 (en) * 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US6306610B1 (en) * 1998-09-18 2001-10-23 Massachusetts Institute Of Technology Biological applications of quantum dots
JP4630459B2 (ja) * 1998-09-24 2011-02-09 インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション 水溶性発光量子ドットおよびその生体分子コンジュゲート
US20030066998A1 (en) * 2001-08-02 2003-04-10 Lee Howard Wing Hoon Quantum dots of Group IV semiconductor materials
JP4107873B2 (ja) * 2002-05-09 2008-06-25 賢一 花木 発光性微粒子
US7507530B2 (en) * 2002-08-27 2009-03-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nanoparticle complexes having a defined number of ligands
US20050136483A1 (en) * 2003-09-03 2005-06-23 Receptors Llc Nanodevices employing combinatorial artificial receptors
JP4181435B2 (ja) * 2003-03-31 2008-11-12 日油株式会社 ポリエチレングリコール修飾半導体微粒子、その製造法及び生物学的診断用材料
CA2529898C (en) * 2003-06-27 2017-12-05 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
ES2322061T3 (es) * 2003-07-28 2009-06-16 Jsr Corporation Superficie de material de base que se inhibe en adsorcion no especifica.
US7431867B2 (en) * 2006-01-27 2008-10-07 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. Nanosized semiconductor particles

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002539454A (ja) * 1999-03-01 2002-11-19 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア 生物学的用途のための半導体ナノクリスタルプローブ
JP2005172429A (ja) 2003-12-05 2005-06-30 Sony Corp 生体物質蛍光標識剤及び生体物質蛍光標識方法、並びにバイオアッセイ方法及び装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1978366A4

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2008032534A1 (ja) * 2006-09-14 2010-01-21 コニカミノルタエムジー株式会社 蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用いたバイオイメージング法及び生体物質解析方法
WO2009048039A1 (ja) * 2007-10-12 2009-04-16 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 分子・細胞イメージング方法及び半導体ナノ粒子
WO2009066548A1 (ja) * 2007-11-21 2009-05-28 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 半導体ナノ粒子、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法
JPWO2009066548A1 (ja) * 2007-11-21 2011-04-07 コニカミノルタエムジー株式会社 半導体ナノ粒子、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法
WO2009069416A1 (ja) * 2007-11-29 2009-06-04 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 半導体ナノ粒子とその製造方法
JP5359885B2 (ja) * 2007-12-21 2013-12-04 コニカミノルタ株式会社 腎症の検査方法及びそれを用いた検査キット
WO2009081680A1 (ja) * 2007-12-21 2009-07-02 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 腎症の検査方法及びそれを用いた検査キット
JP2011519812A (ja) * 2008-05-06 2011-07-14 コミサリア ア レネルジ アトミク エ オ ゼネルジ アルテルナティヴ シリコンナノパーティクルの表面処理
WO2009144983A1 (ja) * 2008-05-28 2009-12-03 コニカミノルタエムジー株式会社 無機ナノ粒子標識剤
JP2010008194A (ja) * 2008-06-26 2010-01-14 Konica Minolta Medical & Graphic Inc Ｇｅナノ粒子、及び生体物質標識剤
WO2010004777A1 (ja) * 2008-07-07 2010-01-14 コニカミノルタエムジー株式会社 無機ナノ粒子標識剤
JPWO2010004777A1 (ja) * 2008-07-07 2011-12-22 コニカミノルタエムジー株式会社 無機ナノ粒子標識剤
US20110020241A1 (en) * 2008-08-06 2011-01-27 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. Fluorescent labeling agent containing quantum dots
JP2013204005A (ja) * 2012-03-29 2013-10-07 Konica Minolta Inc 半導体ナノ粒子集積体
WO2020110481A1 (ja) * 2018-11-30 2020-06-04 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 複合体及び検出装置
JP2022099742A (ja) * 2020-12-23 2022-07-05 昇陽國際半導體股▲ふん▼有限公司 バイオプローブのリンカー

Also Published As

Publication number Publication date
EP1978366A1 (en) 2008-10-08
EP1978366A4 (en) 2009-01-21
EP2053402A1 (en) 2009-04-29
JPWO2007086501A1 (ja) 2009-06-25
US20100255462A1 (en) 2010-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007086501A1 (ja) 生体物質の蛍光標識物質および生体物質の蛍光標識方法
Howes et al. Colloidal nanoparticles as advanced biological sensors
JP4985541B2 (ja) ナノ粒子内包シリカ、それを用いた生体物質の標識物質および生体物質の標識方法
Zhang et al. Quantum dot enabled molecular sensing and diagnostics
Jain Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics
Yao et al. FloDots: luminescent nanoparticles
Azzazy et al. From diagnostics to therapy: prospects of quantum dots
KR100755746B1 (ko) 중금속 흡착 단백질을 이용한 양자점의 제조방법 및 이를 위한 양자점 생성능을 가지는 재조합 미생물
KR101153748B1 (ko) 바이오센서로 유용한 새로운 형태의 금／은 코어쉘 복합체
US20090258355A1 (en) Nanoscale Clusters and Methods of Making Same
US20080293584A1 (en) Fluorescent silica nano-particle, fluorescent nano-material, and biochip and assay using the same
Oh et al. Recent advances in chemical functionalization of nanoparticles with biomolecules for analytical applications
Wang et al. Biosynthesized quantum dot for facile and ultrasensitive electrochemical and electrochemiluminescence immunoassay
Ahmad et al. Environmental applications and potential health implications of quantum dots
JP2007516426A (ja) オリゴヌクレオチドの検出のための比色法および蛍光法
Rodzik-Czałka et al. Nucleobases functionalized quantum dots and gold nanoparticles bioconjugates as a fluorescence resonance energy transfer (FRET) system–Synthesis, characterization and potential applications
Han et al. Inorganic nanoparticles as donors in resonance energy transfer for solid-phase bioassays and biosensors
Page et al. Synthesis and characterization of DNA–quantum dot conjugates for the fluorescence ratiometric detection of unlabelled DNA
Park et al. Subnanomolar FRET-based DNA assay using thermally stable phosphorothioated DNA-functionalized quantum dots
Zhao et al. Versatile Au nanoclusters/Au-MnO2 nanoflowers electrochemiluminescence energy transfer platform coupled with rolling circle amplification for dual-targets biosensing of PSA and Let-7a
JP2008527999A (ja) 長い１本鎖核酸および２本鎖核酸から短い１本鎖核酸を分離するための方法、ならびに関連した生体分子アッセイ法
CN113677805A (zh) 用于感测和定量分子事件的表面固定双稳态多核苷酸装置
Liu et al. One-pot synthesis of strongly fluorescent DNA-CuInS2 quantum dots for label-free and ultrasensitive detection of anthrax lethal factor DNA
Riegler et al. Blue shift of CdSe/ZnS nanocrystal-labels upon DNA-hybridization
Qiao et al. Antibody and DNA dual-labeled gold nanoparticles: Stability and reactivity

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007556011

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007707487

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE