JPWO2008032534A1 - 蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用いたバイオイメージング法及び生体物質解析方法 - Google Patents

蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用いたバイオイメージング法及び生体物質解析方法 Download PDF

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Abstract

同一化学組成であって、１〜１０ｎｍの粒径範囲で粒径が異なり、かつ発光スペクトルの極大発光波長が異なる３種類以上の蛍光半導体微粒子からなる蛍光半導体微粒子集合体において、各々の蛍光半導体微粒子の発光強度の標準偏差が１５％以下であることを特徴とする蛍光半導体微粒子集合体。

Description

本発明は、蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用いたバイオイメージング法及び生体物質解析方法に関する。
より詳しくは、粒径が異なり発光スペクトルの極大発光波長が異なりながら、発光強度が実質上均一な３種類以上の蛍光半導体微粒子からなる生体物質蛍光標識剤集合体に関する。更には、細胞の動態解析を行う生物学や免疫解析分野における動態イメージングに有効な生体物質蛍光標識剤集合体及びそれを用いたバイオイメージング法及びフローサイトメトリー法に関する。
近年、粒径により蛍光波長を制御可能である半導体ナノ粒子の研究が盛んに行われている。半導体ナノ粒子は蛍光波長の制御性、高退光性、表面修飾の自由度の高さを有することから生体内外の蛍光マーカとして応用され、研究されている（例えば、特許文献１〜３参照。）。
特に最近、バルクの生体認識で定性的なアッセイから、より分子レベルで動態を解析することにより生細胞内生体分子の反応機構を掴む基礎医学的研究や、疾病の原因となるウイルス・細菌の生態作用、薬の生体作用を解明しようとするバイオイメージングの研究が盛んであり、特に分子イメージングに代表されるように蛍光標識剤１分子又は数分子に対し標識される生体物質（細胞内の核、小胞体、ゴルジ体、蛋白、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、）１分子が結合し、所定の励起光を照射することによる発光を検知することで、これまで得られなかった生体情報（ＤＮＡ転写ｍＲＮＡ・蛋白形成に至る動態や細胞アポトーシス動態等）が得られようになっている。この場合、生細胞や小動物などの生体内の標的物質を追跡、定性、定量分析しようとする際には、複数の標的物質を同時に解析できることが望まれている。例えば細胞内の複数の分子が関わった生体機構、ウイルスの発現機構、エンドサイトーシスなどの機構を解析するには同時標識による追跡が必須となっている。
しかし、従来標識に使われてきた有機蛍光色素や蛍光タンパクにおいては励起光波長と蛍光波長の差のストークスシフトが短く、さらに有機色素毎に適する励起光を照射することが必要であることから、同時マルチ（多数・多様）解析をしようとした場合に標識の数だけ励起光源を準備するために装置が複雑化し高コスト化する問題やストークスシフトが短いために必要となる励起−蛍光の分離のフィルターが複数標識では他標識蛍光を阻害する問題、複数励起光が蛍光ノイズとなる問題がありマルチ解析は困難となっていた（例えば、特許文献４参照。）。
また最近、基礎医学分野で研究が盛んになってきている分子の動態追跡に関しては、従来から１検体当りの検知する発光量が乏しくマルチ解析の場合に識別できる精度が乏しいことが問題として指摘されており、更なる精度向上も望まれていた。
一方、上記マルチ解析に関する問題を解決するにあたっては、粒径サイズごとに発光波長の異なる量子効果を発現する半導体量子サイズ粒子を、マルチ検出に必要な数に応じて、精度よく作製することが必要であるが、これ自体が困難な問題である。
特開２００３−３２９６８６号公報 特開２００５−１７２４２９号公報 特表２００３−５２４１４７号公報 特開２００３−２８７４９８号公報
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、３種以上の複数の標的を同時に検出（マルチ検出）する精度の高い動態イメージング性を実現する蛍光半導体微粒子集合体、その製造方法、それを用いた生体物質蛍光標識剤の集合体、イメージング方法、フローサイトメトリー解析法を提供することである。
本発明に係る上記課題は下記の手段により解決される。
１．同一化学組成であって、１〜１０ｎｍの粒径範囲で粒径が異なり、かつ発光スペクトルの極大発光波長が異なる３種類以上の蛍光半導体微粒子からなる蛍光半導体微粒子集合体において、各々の蛍光半導体微粒子の発光強度の標準偏差が１５％以下であることを特徴とする蛍光半導体微粒子集合体。
２．前記発光スペクトルの極大発光波長が３８０〜８００ｎｍの範囲内にあることを特徴とする前記１に記載の蛍光半導体微粒子集合体。
３．前記発光スペクトルの極大発光波長が異なる３種類以上の蛍光半導体微粒子が、一種の励起光の照射により発光することを特徴とする前記１又は２に記載の蛍光半導体微粒子集合体。
４．前記１〜３のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体の製造方法であって、液相法により蛍光半導体微粒子を製造することを特徴とする蛍光半導体微粒子集合体の製造方法。
５．前記１〜４のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光半導体微粒子の表面上に生体物質に結合する官能基と該蛍光半導体微粒子の表面に結合する官能基をもつ表面修飾化合物を有することを特徴とする生体物質蛍光標識剤集合体。
６．前記１〜４のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光半導体微粒子の表面上に、異なる粒径種ごとに異なる生体標的物質に適した異なる表面修飾物化合物を有することを特徴とする前記５に記載の生体物質蛍光標識剤集合体。
７．前記５又は６に記載の生体物質蛍光標識剤集合体を用いて同時に３種以上の追跡・標的物質の蛍光動態イメージングを行うことを特徴とするバイオイメージング法。
８．前記１〜３のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を埋め込んだポリマービーズを利用して生体物質のマルチフローサイトメトリーを行うことを特徴とする生体物質解析方法。
本発明の上記手段により、３種以上の複数の標的を同時に検出（マルチ検出）する精度の高い動態イメージング性を実現する蛍光半導体微粒子集合体、その製造方法、それを用いた生体物質蛍光標識剤の集合体、イメージング方法、フローサイトメトリー解析法を提供することができる。
なお、本発明により、特に１分子イメージングの研究分野において高感度高精度測定法を提供することができる。
以下、本発明とその構成要素等について詳細な説明をする。
（蛍光半導体微粒子集合体）
本発明の蛍光半導体微粒子集合体は、同一化学組成であって、１〜１０ｎｍの粒径範囲で粒径が異なり、かつ発光スペクトルの極大発光波長が異なる３種類以上の蛍光半導体微粒子からなる蛍光半導体微粒子集合体において、各々の蛍光半導体微粒子の発光強度の標準偏差が１５％以下であることを特徴とする。
ここで、「蛍光半導体微粒子集合体」とは、１〜１０ｎｍの範囲で平均粒径の異なる蛍光半導体微粒子種を１生体検査目的のために複数集めたものを指す。集合体の中の個々の粒径の粒子を１生体物質の標識として利用し、同時に１検査の中で複数生体物質の検出を行う。または集合体そのものを複数分別のビーズに使用することもでき、蛍光半導体微粒子を埋め込んだビーズを修飾して生体親和性を持たせることで標識として利用できる。
なお、本発明に係る蛍光半導体微粒子の平均粒径は１〜１０ｎｍであり、コア／シエル構造の蛍光半導体微粒子であればコア粒子の平均粒径を指す。平均粒径の異なる蛍光半導体微粒子種の各々の粒径分布は単分散性であることが好ましく、粒径分布の標準偏差は２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
本発明の蛍光半導体微粒子集合体を構成する各サイズの蛍光半導体微粒子の発光強度については標準偏差が１５％以下となる均一性を示すことを要する。これは発光強度がばらついている場合に発光強度が高い発光に弱い発光が隠れてしまい、識別性および精度がおちてしまうからである。
本発明に係る蛍光半導体微粒子の発光スペクトルの極大発光波長は、３８０〜８００ｎｍの範囲内にあることを要する。赤外および近赤外領域が含まれているのは、よりマルチ数を増やすことができること及び透過能力の高い光であれば生体の深い位置にある生体物質も検出できるメリットがあるからである。
前記発光スペクトルの極大発光波長が異なる３種類以上の蛍光半導体微粒子が、一種の（単一の波長であっても複数の波長の光を含んでいても良い。）励起光の照射により発光することが好ましい。すなわち、一つの励起光源からの一種の励起光の照射により発光することが好ましい。一つの励起光源であれば検出装置を簡易できるだけでなく、余計なフィルターが不要であり、検出又は観察を簡易にできるなどのメリットがあり、本発明の特徴的効果を一層発現できる。
なお、本発明において、同組成で各種蛍光半導体微粒子を標準偏差１５％以下の分布に均一な発光強度を実現する手段としては、蛍光半導体微粒子の結晶性を高め、表面欠陥および内部欠陥を制御することにある。これは大粒経側では１個当たりの表面積が大きく、粒子数が少なくなるため１個当たりの発光への影響が大きく、小粒経側より欠陥を少なくする工夫（後述する蛍光半導体微粒子の製造の際に、原材料の純度、合成濃度、合成温度と時間、粒子形成後のアニール温度・時間を最適化する工夫）を施すことが必要であり、このような粒経毎に最適な合成条件と工夫を加えることで本発明を達成できる。
〈蛍光半導体微粒子の形成材料〉
本発明の蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光半導体微粒子は種々の半導体材料を用いて形成することができる。例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−Ｖ族のはんどうたい化合物を用いることができる。
II−VI族の半導体の中では、特に、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ及びＨｇＴｅを挙げることができる。
III−Ｖ族の半導体の中では、ＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ及びＡｌＳが好ましい。
VI族の半導体の中では、Ｇｅ、Ｐｂ及びＳｉは特に適している。
本発明においては、蛍光半導体微粒子をコア／シェル構造を有する粒子にすることが好ましい。この場合、蛍光半導体微粒子は蛍光半導体微粒子からなるコア粒子と該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア／シエル構造を有する蛍光半導体微粒子であって、該コア粒子とシェル層の化学組成が相異するものであることが好ましい。
以下、コア粒子とシェル層について説明する。
〈コア粒子〉
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＡｌＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、Ｓｉである。
なお、必要があればＧａなどのドープ材料を極微量含んでもよい。
本発明に係るコアの平均粒径に関しては、発明の効果発現のために、１〜１０ｎｍであることを要する。なお、平均粒径を１〜１０ｎｍとすることにより小粒径の生体分子の標識及び検知が可能となり、更に、１〜５ｎｍであれば、十分に生体１分子に対する標識並びに動態イメージングが可能となる。従って、特に好ましいのは１〜５ｎｍである。
なお、本発明に係るコアの「平均粒径」とは、レーザー散乱法により測定される累積５０％体積粒径をいう。
〈シェル層〉
シェルに用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＧａＳ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＡｓ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＡｓ、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、又はこれらの混合物等が挙げられる。
なお、好ましいシェルの材料としては、半導性ナノ結晶コアより高いバンドギャップエネルギーを有する半導性材料が挙げられる。
半導性微粒子結晶コアより高いバンドギャップエネルギーを有することに加えて、シェルに適切な材料は、コア半導性ナノ結晶に関して、良好な伝導性および原子価バンドオフセットを有するべきである。従って、伝導性バンドは、コア半導性ナノ結晶の伝導性バンドよりも望ましくは高く、そして原子価バンドは、コア半導性ナノ結晶の原子価バンドよりも望ましくは低い。可視で（例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＰ、）または近赤外で（例えば、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ）エネルギーを放出する半導性ナノ結晶コアについて、紫外線領域でバンドギャップエネルギーを有する材料が使用され得る。具体例としては、例えば、ＺｎＳ、ＧａＮおよびマグネシウムカルコゲニド（例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅおよびＭｇＴｅ）が挙げられる。
近赤外で放出する半導性ナノ結晶コアについて、可視でバンドギャップエネルギーを有する材料もまた使用され得る。
本発明において、特に好ましい半導体材料は、ＳｉＯ2、ＺｎＳである。
なお、本発明に係るシェル層は、コア粒子が部分的に露出して弊害を生じない限り、コア粒子の全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。
〈蛍光半導体微粒子の製造方法〉
本発明の蛍光半導体微粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いることができる。
液相法の製造方法としては、沈殿法である、共沈法、ゾルーゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である（例えば、特開２００２−３２２４６８号、特開２００５−２３９７７５号、特開平１０−３１０７７０号、特開２０００−１０４０５８号公報等を参照。）。
気相法の製造方法としては、（１）対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法（例えば特開平６−２７９０１５号公報参照。）、（２）電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法（例えば特表２００３−５１５４５９号公報参照。）、レーザーアブレーション法（例えば特開２００４−３５６１６３号参照。）などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。
本発明の蛍光半導体微粒子の製造方法としては、特に液相法による製造方法が好ましい。
なお、本発明に係る蛍光半導体微粒子の粒径や発光強度の均一性を実現するために、原材料の純度、合成濃度、合成温度と時間、粒子形成後のアニール温度・時間等の条件を最適化して、格子欠陥が少なく結晶性の高い蛍光半導体微粒子とすることを要する。
〈蛍光半導体微粒子の表面修飾〉
本発明の蛍光半導体微粒子を生体適用の標識剤とするためには、当該蛍光半導体微粒子の表面を表面修飾化合物を用いて修飾することを要する。
なお、蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光半導体微粒子の表面上に、異なる粒径種ごとに異なる生体標的物質に適した異なる表面修飾物化合物を有することが好ましい。
表面修飾化合物としては、少なくとも１つの官能基と少なくとも１つの蛍光半導体微粒子に結合する基を有する化合物であることが好ましい。後者は疎水性の蛍光半導体微粒子に吸着できる基であり、他方は生体物質に親和性があり生体分子に結合する官能基である。互いの表面修飾化合物は互いをつなぐ各種のリンカーを使用してもよい。
蛍光半導体微粒子に結合する基としては、前記のシェル層若しくはコア粒子を形成するための半導体材料に結合する官能基であれば良い。従って、シエル層若しくはコア粒子の組成に応じて好ましい官能基を選択することが好ましい。本発明においては、当該官能基として、特にチオール基が好ましい。
生体物質に親和的に結合する官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、フォスフォン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。
なお、ここで、「生体物質」とは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、蛋白質、抗体、抗原、小胞体、核、ゴルジ体等を指す。
又、蛍光半導体微粒子に結合させる方法としては、表面修飾に適するｐＨに調整することによりメルカプト基を粒子に結合させることができる。それぞれ他端にはアルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基が導入され、生体のアミノ基、カルボキシル基とペプチド結合することができる。また、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドなどにアミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基を導入しても同様に結合させることができる。
蛍光半導体微粒子の表面修飾のための具体的調製は、例えば、Ｄａｂｂｏｕｓｉら（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０１：９４６３、Ｈｉｎｅｓら（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：４６８−４７１、Ｐｅｎｇら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：７０１９−７０２９、及びＫｕｎｏら（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０６：９８６９に記載されている方法に準拠して行うことができる。
（生体物質蛍光標識剤集合体とそれを用いるバイオイメージング法）
本発明の蛍光半導体微粒子集合体は、以下に説明する事由に基づき、生体物質蛍光標識剤に適応することができる。また、標的（追跡）物質を有する生細胞もしくは生体に本発明に係る生体物質蛍光標識剤を添加することで、標的物質と結合もしくは吸着し、該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて蛍光半導体微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的（追跡）物質の蛍光動態イメージングを行うことができる。すなわち、本発明に係る生体物質蛍光標識剤集合体は、バイオイメージング法（生体物質を構成する生体分子やその動的現象を可視化する技術手段）に利用することができる。
また、生体物質解析方法として、本発明の蛍光半導体微粒子集合体を埋め込んだポリマービーズを利用して生体物質のマルチフローサイトメトリーを行うことなどもできる。
以下、生体物質蛍光標識剤及び関連技術等について詳しく説明する。
本発明に係る表面修飾した蛍光半導体微粒子（以下「表面修飾半導体微粒子」ともいう。）は、表面修飾化合物の官能基により、結合対の第１のメンバーとして働く親和性分子に結合させ得る。例えば、表面修飾化合物の親水性構造部分内に存在するイオン化可能基は、親和性分子への結合手段を提供し得る。
なお、親和性分子に分子および分子セグメントを結合する適切な方法については、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９６）に記載されている。
親和性分子によるこのような表面修飾半導体微粒子との「結合体」は、生体物質すなわち生物学的化合物および化学的化合物の存在および／または量、生物系、生物学的プロセスにおける相互作用、生物学的プロセスの変更あるいは生物学的化合物の構造における変化を検出するために使用され得る。すなわち、表面修飾半導体微粒子に結合した場合、親和性分子は、結合対の第２のメンバーとして働く生物学的標的と相互作用し、生物学的プロセスまたは応答を検出するか、あるいは生物学的分子またはプロセスを変化させ得る。
好ましい態様としては、親和性分子および生物学的標的の相互作用は、特異的結合を伴い、そして共有結合、非共有結合、疎水性、親水性、ファンデルワールスまたは磁性の相互作用を伴い得る。更に、親和性分子は生物学的標的と物理的に相互作用させ得る。
表面修飾半導体微粒子に結合する親和性分子は、天然に存在し得るかまたは化学的に合成され得、そして所望の物理学的、化学的または生物学的特性を有することが選択され得る。
このような特性としては、タンパク質、核酸、シグナル伝達分子、原核生物細胞または真核生物細胞、ウイルス、細胞内オルガネラおよび他の任意の生物学的化合物との共有結合および非共有結合等が挙げられるが、これらに制限されない。
このような分子の他の特性としては、生物学的プロセス（例えば、細胞周期、血液凝固、細胞死、転写、翻訳、シグナル伝達、ＤＮＡ損傷またはＤＮＡ切断、ラジカル生成、ラジカル除去など）に影響を与える能力、および生物学的化合物の構造（例えば、架橋、タンパク質分解切断、ラジカル損傷など）を変化させる能力等が挙げられるが、これらに制限されない。
好ましい実施形態において、表面修飾半導体微粒子結合体は、調整可能な波長で光を放射する半導体微粒子を含み、そして核酸に結合される。当該結合は、直接的または間接的であり得る。核酸は、任意のリボ核酸、デオキシリボ核酸、ジデオキシリボ核酸または任意の誘導体およびその組み合わせであり得る。核酸はまた、任意の長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、三本鎖またはより高位の立体配置（例えば、ホリデー結合、環状一本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ立方体（Ｓｅｅｍａｎ（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２７：２２５２４８を参照のこと））であり得る。
本発明に係る半導体微粒子結合体のとりわけ好ましい使用態様は、以下のような核酸の検出および／または定量である：（ａ）ウイルス核酸；（ｂ）細菌核酸；および（ｃ）目的の多くのヒトの配列（例えば、単鎖ヌクレオチド多型）。本発明の範囲を制限することなしに、蛍光半導体微粒子結合体は、個々のヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチドまたは任意の誘導体およびその組み合わせに結合する蛍光半導体微粒子を含み得、そしてＤＮＡ重合反応（例えば、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））において使用される。
ヌクレオチドとしてはまた、一リン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩ならびに環状誘導体（例えば、環状アデニン一リン酸（ｃＡＭＰ））が挙げられる。
核酸に結合した蛍光半導体微粒子の他の使用態様としては、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が含まれる。この好ましい実施形態において、蛍光半導体微粒子はインビボで特異的な配列にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドに結合される。ハイブリダイゼーションに関して、蛍光半導体微粒子タグは、細胞において所望のＤＮＡ配列の位置を可視化するために使用される。例えば、そのＤＮＡ配列が部分的または完全に既知である遺伝子の細胞内局在は、ＦＩＳＨを用いて決定され得る。
その配列が部分的または完全に既知である任意のＤＮＡまたはＲＮＡは、ＦＩＳＨを用いて視覚的に標識され得る。例えば、本発明の範囲を制限することなしに、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡテロメア、他の高反復ＤＮＡ配列および他のコードされていないＤＮＡ配列がＦＩＳＨにより標的化され得る。
蛍光半導体微粒子結合体はまた、生物学的化合物（例えば、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、細胞内オルガネラ、脂質、リン脂質、脂肪酸、ステロール、細胞膜、シグナル伝達に関する分子、レセプターおよびイオンチャネル）の検出のための分子または試薬と結合して、本明細書中で提供されるような表面修飾蛍光半導体微粒子を含む。
当該結合体はまた、細胞形態および流体の流れ；細胞生存能力、増殖および機能；エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス（Ｂｅｔｚら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６（３）：３６５−７１）；および反応性酸素種（例えば、スーパーオキシド、一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、酸素ラジカル）を検出するために使用され得る。さらに、結合体は、生物系の疎水性領域または親水性領域を検出するために使用され得る。
生体物質蛍光標識剤（蛍光半導体微粒子結合体）はまた、他の多くの生物学的および非生物学的な用途における有用性を見い出し、ここで、発光マーカー、特に蛍光マーカーが代表的に使用される。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ．第６版１９９６；Ｗｅｂｓｉｔｅ，ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ．）が参考になる。
本発明に係る生体物質蛍光標識剤が有用である領域の例としては、蛍光免疫細胞化学、蛍光顕微鏡法、ＤＮＡ配列分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、フローサイトメトリー（蛍光活性化セルソーター；ＦＡＣＳ）および生物系についての診断アッセイ等が挙げられるが、これらに制限されない。
上記の領域におけるナノ結晶結合体の有用性に関するさらなる議論については、Ｂａｗｅｎｄｉらに対する国際特許公開ＷＯ ００／１７６４２が参考になる。
また、ポリマービーズに関しては、特表２００６−５１２９２９号、同２００５−５１８４０２号、特開２００６−１３１７７１号公報等が参考になる。
以上、上述のように、本発明の応用範囲は固定細胞を用いた免疫染色、細胞観察やレセプター・リガンド（低分子、薬物）相互作用のリアルタイムトラッキング、１分子蛍光イメージングでなどが挙げられる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（蛍光半導体微粒子（Ｓｉ／ＳＩＯ2・コア／シエル粒子）集合体の製造）
熱処理したＳｉＯx（ｘ−１．９９９）のフッ酸中溶解によりＳｉからなる蛍光半導体微粒子（以下において「Ｓｉ半導体微粒子」又は「Ｓｉコア粒子」ともいう。）を製造する場合、先ず、プラズマＣＶＤによりシリコンウエハー上に成膜したＳｉＯx（ｘ−１．９９９）を不活性ガス雰囲気中で１０００℃、２時間程度アニールを行う。これにより、ＳｉＯ2膜中にＳｉ半導体微粒子（結晶）が析出する。次に、このシリコンウエハーを室温で１％程度のフッ酸水溶液で処理することによりＳｉＯ2膜を除去し、液面に凝集した数ｎｍサイズのＳｉ結晶を回収する。なお、このフッ酸処理により、結晶表面のＳｉ原子のダングリングボンド（未結合手）が水素終端され、Ｓｉコア粒子（結晶）が安定化する。その後、回収したＳｉ半導体微粒子（結晶）の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、又は加熱して熱酸化し、Ｓｉ結晶からなるコアの周囲にＳｉＯ2からなるシェル層を形成する。
得た粒子の粒径はシスメックス社製ゼータサイザーを使い測定し２．５ｎｍ（コア）であった。
同様にしてＳｉコア粒子をアニール温度変更や、時間を変更、及びＨＦ水溶液処理の微調整で粒経の異なる粒子を得た。
特に大サイズ側ではアニール温度を高めにし、アニール時間を短く調整した。
上記のようにして、３．０ｎｍ、３．４ｎｍ、３．８ｎｍ、４．４ｎｍのコア粒子を含有するコア／シエル粒子を得た。
（比較粒子１：ＣｄＳｅ／ＳｉＯ2・コア／シェル粒子の調製）
酢酸カドミウム０．１４ｇとトリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）５．０ｇをナスフラスコに入れ、アルゴンで系内を満たした後、所定の温度（１５０〜２５０℃）まで加熱した。この溶液に、２５ｍｇ／ｃｍ3の濃度となるようにセレンを溶解させたトリｎ−オクチルフォスフィン溶液１．４４ｃｍ3を、激しく撹拌しながら素早く注入し、さらに１時間撹拌することによりＴＯＰＯ安定化ＣｄＳｅ（以下、「ＴＯＰＯ／ＣｄＳｅ」と呼ぶ。）を得た。２９０℃、２５０℃、２００℃及び１５０℃で各々停滞時間を調整しＴＯＰＯ／ＣｄＳｅを合成した場合、ＣｄＳｅナノ粒子の吸収スペクトルの立ち上がり波長は、それぞれ、６６０ｎｍ、６１０ｎｍ、５８０ｎｍと５５０ｎｍであり、その粒子サイズは、それぞれ７．５ｎｍ、６．２ｎｍ、５．５ｎｍと４．５ｎｍであった。このＴＯＰＯ／ＣｄＳｅ粉末を用いて、３−メルカプトプロピルトリメトキシシランでＣｄＳｅナノ粒子表面を修飾しさらに加水分解することにより粒子表面にシリカ薄膜を形成させＣｄＳｅコア／シリカシェル構造体（以下、「ＣｄＳｅ／ＳｉＯ2」と呼ぶ。）を得た。得られたコア・シェル構造体を光溶解液中で単色光（５６０ｎｍ）を照射することで、コア／シェル構造体内部のセレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子にサイズ選択光エッチングを適用し、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）ナノ粒子の粒径を約３．５ｎｍにまで減少させた、コア／シェル構造体からなる蛍光体を得た。
（比較粒子２：ＣｄＳｅ／ＺｎＳ・コア／シェル粒子の調製）
酢酸カドミウム０．１４ｇとトリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）５．０ｇをナスフラスコに入れ、アルゴンで系内を満たした後、所定の温度（１５０〜２５０℃）まで加熱した。この溶液に、２５ｍｇ／ｃｍ3の濃度となるようにセレンを溶解させたトリｎ−オクチルフォスフィン溶液１．４４ｃｍ3を、激しく撹拌しながら素早く注入し、さらに１時間撹拌することによりＴＯＰＯ安定化ＣｄＳｅ（以下、「ＴＯＰＯ／ＣｄＳｅ」と呼ぶ。）を得た。比較粒子１と同様な粒径粒子を得た。
上記で得られたＣｄＳｅコア粒子をピリジン中に分散させ１００℃に保温。別途、Ｚｎ（Ｃ2Ｈ5）2と（（ＣＨ3）3Ｓｉ）2Ｓ、Ｐ（Ｃ4Ｈ9）3をアルゴンガス雰囲気下、ゆっくり混合した。
これをピリジン分散液に滴下して添加。添加後、温度を適正に制御し、ｐＨを一定（２５℃において８．５）に保ちゆっくり３０分攪拌した。これの遠心分離を行い沈降した粒子を捕集した。得た粒子の元素分析を行ってみたところＣｄＳｅとＺｎＳが確認され、ＸＰＳ分析によりＺｎＳがＣｄＳｅの表面に被覆していることが分かった。
以上のように製造されたコア及びコアシエル粒子の粒径をシスメックス社製：ゼータサイザーＺＳで測定した。
（修飾官能基の導入）
上記蛍光半導体微粒子により生体物質を標識する場合、当該粒子と生体物質のどちらかもしくは双方に、互いに結合する官能基等を導入する必要があるが、下記のように行った。
〈Ｓｉ／ＳｉＯ2・コア／シエル粒子への修飾官能基の導入〉
メルカプト基（ＳＨ基）同士の結合を利用してＳｉ蛍光半導体微粒子にカルボキシル基を導入する。先ず、上述のＳｉ蛍光半導体微粒子を３０％過酸化水素水中に１０分間分散させ、結晶表面を水酸化させる。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランをトルエンの２％加えて、２時間程度かけてＳｉ蛍光半導体微粒子の最表面のＳｉＯ2をシラン化すると共にメルカプト基を導入する。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入された１１−メルカプトウンデカン酸を適量加えて３時間攪拌することで、ＳｉＳｉ蛍光半導体微粒子と１１−メルカプトウンデカン酸とを結合させる。これは、本発明においては生体に対し親和結合する修飾基を導入した例である。これを標識Ａ（Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５）とする。
〈ＣｄＳｅ／ＳｉＯ2・コア／シエル粒子への修飾官能基の導入〉
上記標識Ａと同様な方法で１１−メルカプトウンデカン酸を表面に結合し、カルボキシル基を導入した。標識Ｂ−１〜Ｂ−５とする。
〈ＣｄＳｅ／ＺｎＳ・コア／シエル粒子への修飾官能基の導入〉
上記で得たＣｄＳｅｉ／ＺｎＳコア・シエル粒子をバッファ塩溶液に分散して、１１−メルカプトウンデカン酸を適量加えて適温で２時間攪拌し、粒子表面にメルカプト基を結合させた。これにより表面にカルボキシル基が導入される。これを標識Ｃ−１〜Ｃ−５とする。
＜発光強度の評価＞
各標識について励起光４０５ｎｍとし、蛍光スペクトロメーターＦＰ−６５００（日本分光）にて蛍光強度を評価した。標識Ａを基準１００として相対値で表し表１に評価結果を示した。
＜細胞への取り込み染色解析＞
上記で得た標識を事前に羊血清アルブミン（ＳＳＡ）と等濃度で混和し、個別にＶｅｒｏ細胞へ取り込ませた。３７℃２時間培養した後、トリプシン処理して５％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ再浮遊させ、同一ガラスボトムディッシュに播種した。３７℃一晩培養した細胞は４％ホルマリンで固定しＤＡＰＩで核を染色して、共焦点レーザースキャン顕微鏡（励起４０５ｎｍ）で蛍光観察を行った。
次の観点で蛍光観察の評価を行った。色の識別性を観点に多色同時解析ができているかどうかをポイントにして評価を行った。即ち、全ての色が見えるか、色の面積も均一か、蛍光強度は均一かについて評価し、結果を表１〜３に記した。
表１〜３に示した結果から明らかなように、色毎の発光強度の差がある場合には、高い発光強度の色の粒子のスペクトルの裾野が他色のスペクトルまで漏出し、識別性を下げていることが大きな原因となっていることがわかる。
以上により、発光強度が標準偏差１５％以内となる３種以上の粒径を含む半導体蛍光微粒子集合体を用いることにより生体物質の多色同時バイオイメージングを鮮明にする方法提供できることが分かる。

Claims (8)

  1. 同一化学組成であって、１〜１０ｎｍの粒径範囲で粒径が異なり、かつ発光スペクトルの極大発光波長が異なる３種類以上の蛍光半導体微粒子からなる蛍光半導体微粒子集合体において、各々の蛍光半導体微粒子の発光強度の標準偏差が１５％以下であることを特徴とする蛍光半導体微粒子集合体。
  2. 前記発光スペクトルの極大発光波長が３８０〜８００ｎｍの範囲内にあることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の蛍光半導体微粒子集合体。
  3. 前記発光スペクトルの極大発光波長が異なる３種類以上の蛍光半導体微粒子が、一種の励起光の照射により発光することを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛍光半導体微粒子集合体。
  4. 請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体の製造方法であって、液相法により蛍光半導体微粒子を製造することを特徴とする蛍光半導体微粒子集合体の製造方法。
  5. 請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光半導体微粒子の表面上に生体物質に結合する官能基と該蛍光半導体微粒子の表面に結合する官能基をもつ表面修飾化合物を有することを特徴とする生体物質蛍光標識剤集合体。
  6. 請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光半導体微粒子の表面上に、異なる粒径種ごとに異なる生体標的物質に適した異なる表面修飾物化合物を有することを特徴とする請求の範囲第５項に記載の生体物質蛍光標識剤集合体。
  7. 請求の範囲第５項又は第６項に記載の生体物質蛍光標識剤集合体を用いて同時に３種以上の追跡・標的物質の蛍光動態イメージングを行うことを特徴とするバイオイメージング法。
  8. 請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を埋め込んだポリマービーズを利用して生体物質のマルチフローサイトメトリーを行うことを特徴とする生体物質解析方法。
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