JPWO2009054243A1 - 半導体ナノ粒子蛍光体の集合体、及びそれを用いた生体物質標識剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明に係る半導体ナノ粒子蛍光体は種々の半導体材料を用いて形成することができる。例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−V族の半導体化合物又はそれらの原料化合物を用いることができる。
本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体の製造方法としては、従来公知の液相法又は気相法による製造方法を用いることができる。
半導体前駆体を還元する還元剤としては、従来周知の種々の還元剤を反応条件に応じて選択し用いることができる。本発明においては、還元力の強さの観点から、水素化アルミニウムリチウム(LiAlH4)、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、水素化ビス(2−メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム、水素化トリ(sec−ブチル)ホウ素リチウム(LiBH(sec−C4H9)3)及び水素化トリ(sec−ブチル)ホウ素カリウム、水素化トリエチルホウ素リチウムなどの還元剤が好ましい。特に、還元力の強さから水素化アルミニウムリチウム(LiAlH4)が好ましい。
半導体前駆体の分散用溶媒としては、従来周知の種々の溶媒を使用できるが、エチルアルコール、sec−ブチルアルコール、t−ブチルアルコール等のアルコール類、トルエン、デカン、ヘキサンなどの炭化水素類溶媒を使用することが好ましい。本発明においては、特に、トルエン等の疎水性の溶媒が分散用溶媒として好ましい。
界面活性剤としては、従来周知の種々の界面活性剤を使用でき、陰イオン、非イオン、陽イオン、両性界面活性剤が含まれる。なかでも第四級アンモニウム塩系である、テトラブチルアンモニウムクロリド、ブロミド又はヘキサフルオロホスフェート、テトラオクチルアンモニウムブロミド(TOAB)、またはトリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミドが好ましい。特に、テトラオクチルアンモニウムブロミドが好ましい。
本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体は、物理化学的表面処理を施された半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であり、下記の細胞毒性指標の条件を満たすことを特徴とする。
ニュートラルレッドは生細胞膜を通りリソソームに蓄積されるが、細胞膜が損傷を受けるとニュートラルレッドの取り込みが阻害される。すなわち、ニュートラルレッドの取り込み総量が生細胞の数に比例するため、間接的に生細胞数を測定することができる。
本発明の半導体ナノ粒子は、種々の技術分野における単一分子分析に応用できる。例えば、上記単一分子観察方法において、異なる発光スペクトルをもつ半導体ナノ粒子で複数種類の分子をそれぞれ標識し、該分子に励起光を照射することによって、同時に複数種類の分子の同定を行うこともできる。なお、適用可能な複数種類の分子としては、化学組成は同じであるが化学構造の異なる構造異性体等も含む。
本発明の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体は、生体物質蛍光標識剤に適応することができる。また、標的(追跡)物質を有する生細胞もしくは生体に本発明に係る生体物質標識剤を添加することで、標的物質と結合もしくは吸着し、該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて蛍光半導体微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的(追跡)物質の蛍光動態イメージングを行うことができる。すなわち、本発明に係る生体物質標識剤は、バイオイメージング法(生体物質を構成する生体分子やその動的現象を可視化する技術手段)に利用することができる。
上述した半導体ナノ粒子蛍光体集合体表面は、一般的には、疎水性であるため、例えば生体物質標識剤として使用する場合は、このままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題があるため、コア/シェル型半導体ナノ粒子のシェルの表面を親水化処理することが好ましい。
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した親水化処理された半導体ナノ粒子蛍光体と分子標識物質とを、有機分子を介して、結合させて得られる。
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合および/または反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
本発明に係る生体物質標識剤は、親水化処理された半導体ナノ粒子蛍光体と、分子標識物質とが有機分子により結合されている。当該有機分子としては半導体ナノ粒子蛍光体と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
(CdSeナノ粒子蛍光体の調製)
5mlのオクタデセンに30mgのセレンを添加して攪拌した後、トリオクチルフォスフィン(TOP)0.4mlをさらに添加して十分に攪拌する(溶液A)。これとは別に酸化カドミニウム13mg、オレイン酸0.6ml、オクタデセン10mlを混合し、220℃まで昇温する(溶液B)。溶液Bに溶液A1mlをすばやく添加し、2分後に急冷することで、CdSeナノ粒子の試料を得た。
(液相法によるSiナノ粒子蛍光体の調製)
トルエン200mlにテトラオクチルアンモニウムブロマイド(TOAB)3gを溶解する。室温で攪拌しながらSiCl4を5ml滴下し、1時間後に、水素化リチウムアルミニウムをSiCl4の2倍モル滴下して還元反応させる。3時間後にメタノール40mlを添加して、余分な還元剤を失活させたのちに、アリルアミンを白金触媒とともに添加してから、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する。メチルホルムアミドと純水で数回洗浄し、水に分散したSiナノ粒子の試料を得た。
(気相法によるSiナノ粒子蛍光体の調製)
真空チャンバー内にアルゴンガスを導入し、高周波コントローラによりイオン化されたアルゴンイオンをシリコンチップと石英ガラスからなるターゲット材料に衝突させ、これから放出された原子および分子を半導体基板上に体積し、シリコン原子と酸素原子が混ざったアモルファス酸化ケイ素膜を形成する。
比較例3で得られた溶液を濾過することにより、Siナノ粒子を単離した後、得られたSiナノ粒子を10-1Paの真空中で100℃の加熱処理を10分間行った。その後、エタノールを添加して攪拌処理を行い、エタノールに再分散したSiナノ粒子蛍光体の試料を得た。
フッ酸処理を2分間行った後、純水洗浄、フッ酸処理3分間、純水洗浄と分割して処理を行う以外は、比較例3と同様に行い、エタノールに再分散したSiナノ粒子蛍光体の試料を得た。
比較例3において、熱処理を900℃で行った後、得られたシリコン含有酸化ケイ素膜を同様に40℃のフッ酸蒸気により表面処理を行う。その後、大気雰囲気中500℃で30分間の表面酸化処理を行い、さらにアルゴン雰囲気で900℃で1時間の熱処理を行う。
チャイニーズハムスター由来線維芽細胞V79細胞にリン酸緩衝液を加えて1000rpmで5分間遠心して洗浄後、5%ウシ胎児血清を含有させたEagle‘s MEM培地(FBS−MEM)に浮遊させた。96穴プレートに9000個/100μl/wellの割合で細胞をいれ、37℃、5%炭酸ガス培養器中で24時間培養後、上清を除き、得られた半導体ナノ粒子蛍光体を種々の濃度で含有させたFBS−MEMを200μlずつ加えた。1日および10日培養後、上清を除き、ニュートラルレッドを50μg/mlの濃度で含有させたFBS−MEMを200μlずつ加えてさらに3時間培養する。上清を除き、2.5%ホルマリン−1%CaCl2溶液を280μl入れて1分間静置して細胞を固定、洗浄し、上清を捨てた後、1%酢酸−50%エタノール溶液を100μl加えて、細胞内に取り込まれたニュートラルレッドを抽出した。540nmにおける吸光度を測定し、それぞれの濃度について吸光度の変化を計算し、これを元に各試料について吸光度が50%になる濃度IC50を求めた。
得られた半導体ナノ粒子のTEM像を撮影し、各1,000個の粒子を実測して、分散液中のナノ粒子の平均粒径を求めた。測定結果を表−1に示す。
得られた半導体ナノ粒子溶液について、波長280nmの励起光を照射して発生する蛍光スペクトルを測定した。発光スペクトルの半値幅、極大発光波長、相対発光強度を表1に示す。相対発光強度は、比較例1を100とすることにより求めた。
得られた半導体ナノ粒子蛍光体の集合体をメルカプトウンデカン酸0.2gを溶解した10ml純水中に1×10-5g再分散させ、40℃、10分間攪拌することで表面を親水化する。その後、これら半導体ナノ粒子の水溶液それぞれにアビジン25mgを添加し40℃で10分間攪拌を行い、アビジンコンジュゲートナノ粒子を作製した。
Claims (5)
- 物理化学的表面処理を施された半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であって、ニュートラルレッド法を用いた細胞毒性試験において、1日および10日培養後のニュートラルレッドの吸光度を50%にする濃度IC50が、いずれも1000μg/ml以上であることを特徴とする半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。
- 前記物理化学的表面処理が、溶媒による洗浄処理及び高温熱処理の少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。
- 請求の範囲第1項又は第2項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体であって、当該半導体ナノ粒子蛍光体の平均粒径が1〜10nmであることを特徴とする半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。
- 前記半導体ナノ粒子蛍光体が、その主要構成成分として、SiまたはGeを含有していることを特徴とする請求の範囲第1項乃至第3項のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体。
- 請求の範囲第1項乃至第4項のいずれか一項に記載の半導体ナノ粒子蛍光体の集合体を用いたことを特徴とする生体物質標識剤。
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