WO2008032534A1 - Ensemble microparticules semi-conductrices fluorescentes, ensemble agent de marquage fluorescent pour substances biologiques, et procédé de bio-imagerie et procédé d'analyse de substances biologiques au moyen de ces ensembles - Google Patents

Ensemble microparticules semi-conductrices fluorescentes, ensemble agent de marquage fluorescent pour substances biologiques, et procédé de bio-imagerie et procédé d'analyse de substances biologiques au moyen de ces ensembles Download PDF

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Kazuya Tsukada
Hisatake Okada
Hideki Hoshino
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Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
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Definitions

  • Fluorescent semiconductor fine particle assembly biological material fluorescent labeling agent assembly, bioimaging method and biological material analysis method using these
  • the present invention relates to a fluorescent semiconductor fine particle assembly, a biological material fluorescent labeling agent assembly, a bioimaging method and a biological material analysis method using these.
  • the present invention relates to a biological substance fluorescent labeling agent assembly composed of three or more types of fluorescent semiconductor fine particles having different particle sizes and different maximum emission wavelengths of emission spectra but having substantially uniform emission intensity. Furthermore, the present invention relates to a biological material fluorescent labeling agent assembly effective for biological imaging for analyzing cell dynamics and dynamic imaging in the field of immunological analysis, a bioimaging method and a flow cytometry method using the same.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-329686
  • Patent Document 2 JP-A-2005-172429
  • Patent Document 3 Japanese Translation of Special Publication 2003-524147
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-287498
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and the problem to be solved is fluorescence that realizes dynamic imaging properties with high accuracy for simultaneous detection (multi-detection) of three or more types of multiple targets.
  • An object is to provide an aggregate of semiconductor fine particles, a method for producing the same, an aggregate of fluorescent labeling agents using the same, an imaging method, and a flow cytometry analysis method.
  • Fluorescent semiconductor composed of three or more kinds of fluorescent semiconductor fine particles having the same chemical composition and different particle sizes in the range of 1 to; Onm and having different maximum emission wavelengths of the emission spectrum A fluorescent semiconductor fine particle aggregate, wherein the standard deviation of the emission intensity of each fluorescent semiconductor fine particle is 15% or less.
  • a biological material fluorescent labeling agent assembly comprising a surface modifying compound having a functional group capable of
  • a bioimaging method characterized in that three or more types of tracking and target substance fluorescence dynamic imaging are simultaneously performed using the biological substance fluorescent labeling agent assembly as described in 5 or 6 above
  • Biological substance analysis method comprising performing multiflow cytometry of a biological substance using the polymer beads embedded with the fluorescent semiconductor fine particle aggregate according to any one of;! To 3 above .
  • the above-described means of the present invention enables simultaneous detection (multi-detection) of a plurality of three or more types of fluorescent semiconductor fine particle aggregates that realize highly accurate dynamic imaging properties, a method for producing the same, and a living body using the same Fluorescent labeling agent assembly, imaging method, flow cytometry Lee analysis method can be provided.
  • the present invention can provide a highly sensitive and accurate measurement method particularly in the field of single-molecule imaging research.
  • the fluorescent semiconductor fine particle aggregate of the present invention is composed of three or more kinds of fluorescent semiconductor fine particles having the same chemical composition, and having different particle diameters in the particle diameter range of! -10 nm and having different maximum emission wavelengths in the emission spectrum.
  • the standard deviation of the emission intensity of each fluorescent semiconductor fine particle is 15% or less.
  • the "aggregate of fluorescent semiconductor particles” refers to a collection of a plurality of fluorescent semiconductor particle types having different average particle diameters in the range of! ⁇ LOnm for the purpose of one biological examination.
  • the particles of each particle size in the aggregate are used as a label for one biological substance, and multiple biological substances are detected in one test at the same time.
  • the aggregate itself can be used as a plurality of fractionated beads, and can be used as a label by modifying the beads embedded with fluorescent semiconductor fine particles to impart biocompatibility.
  • the average particle size of the fluorescent semiconductor fine particles according to the present invention is 1 to! Onm, and if it is a fluorescent semiconductor fine particle having a core structure, it means the average particle size of the core particles.
  • the standard deviation of the particle size distribution in which the particle size distribution of each of the fluorescent semiconductor fine particle species having different average particle sizes is preferably monodisperse is 20% or less, more preferably 10% or less.
  • the emission intensity of each size of the fluorescent semiconductor fine particles constituting the fluorescent semiconductor fine particle aggregate of the present invention it is necessary to show uniformity so that the standard deviation is 15% or less. This is because when the emission intensity varies! /, The emission intensity is high, the emission intensity is weak, the emission intensity is hidden, and the discrimination and accuracy are reduced.
  • the maximum emission wavelength of the emission spectrum of the fluorescent semiconductor fine particles according to the present invention needs to be in the range of 380 to 800 nm. Infrared and near-infrared regions are included because it has the advantage of being able to increase the number of multis and detecting biological substances deep in the living body if the light has a high transmission ability. .
  • Three or more types of fluorescent semiconductor fine particles having different maximum emission wavelengths in the emission spectrum are irradiated with a kind of excitation light (which may be a single wavelength or may include light of a plurality of wavelengths). It is preferable to emit light. In other words, it is preferable to emit light when irradiated with a kind of excitation light from one excitation light source. If only one excitation light source is used, the detection device can be simplified, no extra filter is required, and detection or observation can be simplified, and the characteristic effects of the present invention can be further exhibited.
  • the crystallinity of the fluorescent semiconductor fine particles is increased, surface defects and internal It is to control the defects. This is because on the large particle side, the surface area per particle is large and the number of particles is small, so the effect on light emission per particle is large.
  • the present invention can be achieved by adding these ideas.
  • the fluorescent semiconductor fine particles constituting the fluorescent semiconductor fine particle aggregate of the present invention can be formed using various semiconductor materials.
  • compounds of Group IV, II VI and III V of the Periodic Table of Elements can be used.
  • Group II-VI semiconductors MgS, MgSe, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe , HgS, HgSe and HgTe.
  • GaAs, GaN, GaPGaSb, InGaAs, InP, InN, InSb, InAs, AlAs, A1P, AlSb, and A1S are preferable.
  • Group VI semiconductors Ge, Pb and Si are particularly suitable.
  • the fluorescent semiconductor fine particles are preferably made into particles having a core / shell structure.
  • the fluorescent semiconductor fine particles are fluorescent semiconductor fine particles having a core / shell structure composed of core particles composed of the fluorescent semiconductor fine particles and a shell layer that covers the core particles, and the chemistry of the core particles and the shell layer. That the composition is different preferable.
  • Various semiconductor materials can be used as the semiconductor material used for the core particles. Specific examples include, for example, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, GaAs, GaP, GaSb, InGaAs, Examples include InP, InN, InSb, InAs, AlAs, A1P, AlSb, A1S, PbS, PbSe, Ge, Si, or a mixture thereof. In the present invention, a particularly preferable semiconductor material is Si.
  • a very small amount of a doping material such as Ga may be included.
  • the average particle size of the core according to the present invention needs to be 1 to! Onm in order to achieve the effect of the invention.
  • the average particle size to ! to lOnm, it is possible to label and detect biomolecules with a small particle size. Furthermore, if it is from! It becomes. Therefore, particularly preferred is l-5 nm.
  • the "average particle diameter" of the core according to the present invention is an accumulated value measured by a laser scattering method.
  • semiconductor materials can be used as the semiconductor material used for the shell. Specific examples include, for example, ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdO, CdS, CdSe, CdTe,
  • the material of the shell is preferably a semiconductor material having a band gap energy higher than that of the semiconductor nanocrystal core.
  • suitable materials for shells are good conductivity and valence band offsets for core semiconducting nanocrystals. Should have.
  • the conduction band is desirably higher than that of the core semiconducting nanocrystal and the valence band is the original of the core semiconducting nanocrystal. Desirably lower than the subvalence band.
  • Materials with band gap energy in the ultraviolet region for semiconducting nanocrystal cores that emit energy in the visible (eg Si, Ge, GaP) or in the near infrared (eg InP, InN, PbS, PbSe) Can be used. Specific examples include, for example, ZnS, GaN, and magnesium chalcogenide (for example, MgS, MgSe, and MgTe).
  • Materials that are visible and have bandgap energy can also be used for semiconducting nanocrystal cores emitting in the near infrared.
  • the semiconductor material is SiO or ZnS.
  • the shell layer according to the present invention may not completely cover the entire surface of the core particle as long as the core particle is not partially exposed to cause a harmful effect.
  • Examples of the production method of the liquid phase method include a precipitation method such as a coprecipitation method, a sol-gel method, a uniform precipitation method, and a reduction method.
  • the reverse micelle method, the supercritical hydrothermal synthesis method, and the like are also excellent methods for producing nanoparticles (for example, JP 2002-322468, JP 2005-239775, JP 10-10). (See 310770, JP 2000-104058, etc.).
  • the manufacturing method of the vapor phase method includes (1) a second high temperature generated by electrodeless discharge in a reduced pressure atmosphere by evaporating opposing raw material semiconductors by a first high temperature plasma generated between electrodes. (2) A method of separating and removing nanoparticles from an anode made of a raw material semiconductor by electrochemical etching (for example, JP 2003-515459). And a laser ablation method (for example, see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-356163). In addition, a method of synthesizing powder containing particles by reacting a raw material gas in a gas phase in a low pressure state is also preferably used.
  • the production method of the fluorescent semiconductor fine particles of the present invention is particularly preferably a production method by a liquid phase method.
  • the purity of the raw materials, the synthesis concentration, the synthesis temperature and time, the annealing temperature after the particle formation is It is necessary to optimize the conditions such as the interval to obtain fluorescent semiconductor fine particles with few lattice defects and high crystallinity.
  • the fluorescent semiconductor fine particles of the present invention As a labeling agent for living organisms, it is necessary to modify the surface of the fluorescent semiconductor fine particles with a surface modifying compound.
  • the surface of the fluorescent semiconductor fine particles constituting the fluorescent semiconductor fine particle aggregate has different surface modification compounds suitable for different biological target substances for different particle size species.
  • the surface modifying compound is preferably a compound having at least one functional group and at least one group bonded to the fluorescent semiconductor fine particles.
  • the latter is a group that can be adsorbed to hydrophobic fluorescent semiconductor particles, and the other is a functional group that has affinity for biological substances and binds to biomolecules.
  • the surface modification compounds of each other may use various linkers that connect each other.
  • the group bonded to the fluorescent semiconductor fine particles may be a functional group bonded to the semiconductor material for forming the shell layer or core particle. Therefore, it is preferable to select a functional group according to the composition of the shell layer or the core particle.
  • the functional group is particularly preferably a thiol group.
  • Examples of the functional group that binds to a biological substance with affinity include a carboxyl group, an amino group, a phosphonic acid group, and a sulfonic acid group.
  • biological substance refers to cells, DNA, RNA, oligonucleotides, proteins, antibodies, antigens, endoplasmic reticulums, nuclei, Golgi bodies, and the like.
  • the mercapto group can be bonded to the particles by adjusting the pH to be suitable for surface modification.
  • An aldehyde group, an amino group, and a carboxyl group are introduced into the other end, respectively, and can be peptide-bonded to an amino group and a carboxyl group in a living body.
  • an amino group, an aldehyde group, or a carboxyl group is introduced into DNA, oligonucleotide, etc., it can be similarly bonded.
  • Specific preparations for surface modification of fluorescent semiconductor fine particles include, for example, Dabbousi et al. (1997) J. Phys. Chem. B101: 9463, Hines et al. (1996) J. Phys. Chem. 100: 468. — 471, Peng et al. (1997) J. Am. Chem. Soc. 119: 7019— 7029, and Kuno et al. (1 997) J. Phys. Chem. 106: 9869. Can
  • the fluorescent semiconductor fine particle aggregate of the present invention can be applied to a biological substance fluorescent labeling agent based on the reasons described below. Further, by adding the biological material fluorescent labeling agent according to the present invention to a living cell or living body having a target (tracking) substance, it binds to or adsorbs to the target substance, and the conjugate or adsorbent has a predetermined wavelength. By irradiating excitation light and detecting fluorescence of a predetermined wavelength generated from the fluorescent semiconductor fine particles in response to the excitation light, fluorescence dynamic imaging of the target (tracking) substance can be performed. That is, the biological material fluorescent labeling agent assembly according to the present invention can be used for a bioimaging method (technical means for visualizing biological molecules constituting the biological material and dynamic phenomena thereof).
  • multi-flow cytometry of biological materials can be performed using polymer beads embedded with the fluorescent semiconductor fine particle aggregate of the present invention.
  • the surface-modified fluorescent semiconductor fine particles (hereinafter, also referred to as "surface-modified semiconductor fine particles") according to the present invention are used as functional molecules of the surface-modifying compound as affinity molecules that serve as the first member of the binding pair. Can be combined.
  • ionizable groups present in the hydrophilic structural portion of the surface modifying compound can provide a means for binding to an affinity molecule.
  • the “conjugate” with such surface-modified semiconductor microparticles by affinity molecules is the presence and / or amount of biological materials, ie, biological compounds and chemical compounds, biological systems, biological processes. It can be used to detect interactions in, changes in biological processes or changes in the structure of biological compounds. That is, when bound to surface-modified semiconductor particles, the affinity molecule acts as a second member of the binding pair. The ability to interact with a target and detect a biological process or response, or a biological molecule or process.
  • the interaction between the affinity molecule and the biological target involves specific binding and is a covalent, non-covalent, hydrophobic, hydrophilic, van der Waals or magnetic interaction. Can be accompanied by action.
  • affinity molecules can physically interact with biological targets.
  • Affinity molecules that bind to surface-modified semiconductor microparticles can be naturally occurring or chemically synthesized and may have the desired physical, chemical or biological properties. Can be selected.
  • Such properties include proteins, nucleic acids, signaling molecules, prokaryotic or eukaryotic cells, viruses, intracellular organelles, and any other biological compound and covalent bonds. However, it is not limited to these.
  • Other properties of such molecules include biological processes (eg, cell cycle, blood coagulation, cell death, transcription, translation, signal transduction, DNA damage or DNA cleavage, radical generation, radical removal, etc. ) And the ability to alter the structure of biological compounds (eg, cross-linking, proteolytic cleavage, radical damage, etc.), but are not limited to these.
  • biological processes eg, cell cycle, blood coagulation, cell death, transcription, translation, signal transduction, DNA damage or DNA cleavage, radical generation, radical removal, etc.
  • the ability to alter the structure of biological compounds eg, cross-linking, proteolytic cleavage, radical damage, etc.
  • the surface-modified semiconductor microparticle conjugate comprises semiconductor microparticles that emit light at a tunable wavelength and are bound to a nucleic acid.
  • the binding can be direct or indirect.
  • the nucleic acid can be any ribonucleic acid, deoxyribonucleic acid, dideoxy ribonucleic acid or any derivative and combinations thereof.
  • the nucleic acid can also be an oligonucleotide of any length. This oligonucleotide is a single-stranded, double-stranded, triple-stranded or higher configuration (eg, holiday binding, circular single-stranded DNA, circular double-stranded DNA, DNA cube (Seeman (1998) Ann. Rev Biophys. Biomol. Struct. 27: 225248))).
  • a particularly preferred use mode of the semiconductor fine particle conjugate according to the present invention is detection and / or quantification of nucleic acid as follows: (a) viral nucleic acid; (b) bacterial nucleic acid; and (c) Many human sequences (eg single-stranded nucleotide polymorphisms).
  • fluorescent semiconductor particulate conjugates can include fluorescent semiconductor particulates that bind to individual nucleotides, deoxynucleotides, dideoxynucleotides or any derivative and combinations thereof, and DNA polymerization reactions (eg, DNA Used in sequencing, reverse transcription of RNA into DNA and polymerase chain reaction (PCR)).
  • Nucleotides also include monophosphates, diphosphates and triphosphates and cyclic derivatives such as cyclic adenine monophosphate (cAMP).
  • cAMP cyclic adenine monophosphate
  • fluorescent in situ hybridization FISH
  • the fluorescent semiconductor microparticles are bound to an oligonucleotide designed to hybridize to a specific sequence in vivo.
  • fluorescent semiconductor particulate tags are used to visualize the location of desired DNA sequences in cells. For example, the subcellular localization of a gene whose DNA sequence is partially or completely known can be determined using FISH.
  • Any DNA or RNA whose sequence is partially or fully known can be visually labeled using FISH.
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • messenger RNA mRNA
  • DNA telomers other highly repetitive DNA sequences and other encoded! /, NA! /, DNA sequences are targeted by FISH Can be done.
  • Fluorescent semiconductor particulate conjugates also include biological compounds (eg, enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, intracellular organelles, lipids, phospholipids, fatty acids, sterols, cell membranes, signaling molecules, receptors and ions. Including surface-modified fluorescent semiconductor microparticles as provided herein in combination with molecules or reagents for the detection of (channel).
  • biological compounds eg, enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, intracellular organelles, lipids, phospholipids, fatty acids, sterols, cell membranes, signaling molecules, receptors and ions.
  • the conjugates also have cell morphology and fluid flow; cell viability, proliferation and function; endocytosis and exocytosis (Betz et al. (1996) Curr. Opin. Neurobiol. 6 (3): 365-71); and reactive oxygen species (eg, superoxide, nitrogen monoxide, hydroxy radicals, oxygen radicals). Furthermore, the conjugate can be used to detect hydrophobic or hydrophilic regions of biological systems.
  • Bio material fluorescent labeling agents are also used in many other biological applications. And find utility in non-biological applications, where luminescent markers, particularly fluorescent markers, are typically used.
  • luminescent markers particularly fluorescent markers
  • Haugland, RP Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Molecular Probes, Eugene, OR. No. 6 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 996; Website, www. Probes, com.
  • Examples of areas where the biological material fluorescent labeling agent according to the present invention is useful include fluorescent immunocytochemistry, fluorescence microscopy, DNA sequence analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH), fluorescence resonance energy Forces S include, but are not limited to, transfer (FRET), flow cytometry (fluorescence activated cell sorter; FACS), and diagnostic assays for biological systems.
  • the application range of the present invention includes immunostaining using fixed cells, cell observation, real-time tracking of receptor-ligand (low molecule, drug) interaction, single molecule fluorescence imaging, and the like. Can be mentioned.
  • Si semiconductor fine particles composed of Si (hereinafter also referred to as “Si semiconductor fine particles” or “Si core particles”) by dissolving heat-treated SiO 2 ( ⁇ -1.999) in hydrofluoric acid
  • SiO 2 (x-1.999) deposited on a silicon wafer is annealed at 1000 ° C for 2 hours in an inert gas atmosphere. Thereby, Si semiconductor fine particles (crystals) are precipitated in the SiO film.
  • this silicon wafer is treated with a 1% hydrofluoric acid solution at room temperature to remove the SiO film, and several nanometer-sized Si crystals aggregated on the liquid surface are recovered.
  • This hydrofluoric acid treatment dangling bonds of Si atoms on the crystal surface (not yet Bonds) are hydrogen-terminated and the Si core particles (crystals) are stabilized. After that, the surface of the collected Si semiconductor fine particles (crystals) is naturally oxidized in an oxygen atmosphere, or is heated and thermally oxidized,
  • a shell layer made of SiO is formed around the core made of Si crystal.
  • the particle diameter of the obtained particles was 2.5 nm (core) as measured using a Zetasizer manufactured by Sysmetas!
  • particles having different particle sizes were obtained by changing the annealing temperature, changing the time, and finely adjusting the HF aqueous solution treatment for the Si core particles.
  • the annealing temperature was increased and the annealing time was adjusted to be short.
  • the resulting core'shell structure is irradiated with monochromatic light (560 nm) in a photodissolving solution to apply size-selective photoetching to cadmium selenide (CdSe) nanoparticles inside the core / shell structure.
  • a phosphor having a core / shell structure in which the particle size of cadmium selenide (CdSe) nanoparticles was reduced to about 3.5 nm was obtained.
  • the CdSe core particles obtained above are dispersed in pyridine and kept at 100 ° C. Separately, Zn (C H) and ((CH 3) Si) S, P (C H) were slowly mixed in an argon gas atmosphere.
  • the carboxylate group is introduced into the Si fluorescent semiconductor fine particles by utilizing the bond between mercapto groups (SH groups).
  • SH groups mercapto groups
  • the above-mentioned Si fluorescent semiconductor particles are dispersed in 30% hydrogen peroxide water for 10 minutes to hydroxylate the crystal surface.
  • the solvent is replaced with toluene, and 2% of mercaptopyrtriethoxysilane is added to the toluene, and the SiO on the outermost surface of the Si fluorescent semiconductor particles is silanized and a mercapto group is introduced over about 2 hours.
  • the CdSei / ZnS core shell particles obtained above were dispersed in a buffer salt solution, and an appropriate amount of 11 mercabtundecanoic acid was added and stirred at an appropriate temperature for 2 hours to bind mercapto groups to the particle surface. This introduces carboxyl groups on the surface. This is labeled C C 5.
  • the fluorescence intensity was evaluated with a fluorescence spectrometer FP-6500 (JASCO) with excitation light at 405 nm for each label.
  • Table 1 shows the evaluation results in relative values with label A as the standard 100.
  • the label obtained above was mixed with sheep serum albumin (SSA) at an equal concentration in advance and individually incorporated into Vero cells. After culturing at 37 ° C. for 2 hours, trypsinization was performed, 5% FBS-added DME M was resuspended, and seeded on the same glass bottom dish. The cells cultured at 37 ° C and sputum were fixed with 4% formalin, nuclei were stained with DAPI, and fluorescence was observed with a confocal laser scanning microscope (excitation 405 nm).
  • SSA sheep serum albumin
  • a method for clarifying multicolor simultaneous bioimaging of a biological material can be provided by using an aggregate of semiconductor fluorescent fine particles containing three or more particle sizes having a standard deviation within 15% of the standard deviation.

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Description

明 細 書
蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用い たバイオイメージング法及び生体物質解析方法
技術分野
[0001] 本発明は、蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用い たバイオイメージング法及び生体物質解析方法に関する。
[0002] より詳しくは、粒径が異なり発光スペクトルの極大発光波長が異なりながら、発光強 度が実質上均一な 3種類以上の蛍光半導体微粒子からなる生体物質蛍光標識剤集 合体に関する。更には、細胞の動態解析を行う生物学や免疫解析分野における動 態イメージングに有効な生体物質蛍光標識剤集合体及びそれを用いたバイオィメー ジング法及びフローサイトメトリー法に関する。
背景技術
[0003] 近年、粒径により蛍光波長を制御可能である半導体ナノ粒子の研究が盛んに行わ れている。半導体ナノ粒子は蛍光波長の制御性、高退光性、表面修飾の自由度の 高さを有することから生体内外の蛍光マーカとして応用され、研究されている（例えば 、特許文献；!〜 3参照。）。
[0004] 特に最近、バルタの生体認識で定性的なアツセィから、より分子レベルで動態を解 析することにより生細胞内生体分子の反応機構を掴む基礎医学的研究や、疾病の 原因となるウィルス ·細菌の生態作用、薬の生体作用を解明しょうとするバイオィメー ジングの研究が盛んであり、特に分子イメージングに代表されるように蛍光標識剤 1 分子又は数分子に対し標識される生体物質 (細胞内の核、小胞体、ゴルジ体、蛋白 、抗体、 DNA、 RNA、 ) 1分子が結合し、所定の励起光を照射することによる発光を 検知することで、これまで得られな力、つた生体情報（DNA転写 mRNA*蛋白形成に 至る動態や細胞アポトーシス動態等）が得られようになっている。この場合、生細胞や 小動物などの生体内の標的物質を追跡、定性、定量分析しょうとする際には、複数 の標的物質を同時に解析できることが望まれている。例えば細胞内の複数の分子が 関わった生体機構、ウィルスの発現機構、エンドサイト一シスなどの機構を解析する には同時標識による追跡が必須となっている。
[0005] しかし、従来標識に使われてきた有機蛍光色素や蛍光タンパクにおいては励起光 波長と蛍光波長の差のスト一タスシフトが短ぐさらに有機色素毎に適する励起光を 照射することが必要であることから、同時マルチ（多数 ·多様)解析をしょうとした場合 に標識の数だけ励起光源を準備するために装置が複雑化し高コスト化する問題ゃス トークスシフトが短いために必要となる励起 蛍光の分離のフィルターが複数標識で は他標識蛍光を阻害する問題、複数励起光が蛍光ノイズとなる問題がありマルチ解 析は困難となっていた (例えば、特許文献 4参照。）。
[0006] また最近、基礎医学分野で研究が盛んになってきている分子の動態追跡に関して は、従来から 1検体当りの検知する発光量が乏しくマルチ解析の場合に識別できる 精度が乏しいことが問題として指摘されており、更なる精度向上も望まれていた。
[0007] 一方、上記マルチ解析に関する問題を解決するにあたっては、粒径サイズごとに発 光波長の異なる量子効果を発現する半導体量子サイズ粒子を、マルチ検出に必要 な数に応じて、精度よく作製することが必要であるが、これ自体が困難な問題である。 特許文献 1 :特開 2003— 329686号公報
特許文献 2：特開 2005— 172429号公報
特許文献 3：特表 2003— 524147号公報
特許文献 4：特開 2003— 287498号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、 3種以上の複 数の標的を同時に検出（マルチ検出）する精度の高い動態イメージング性を実現す る蛍光半導体微粒子集合体、その製造方法、それを用いた生体物質蛍光標識剤の 集合体、イメージング方法、フローサイトメトリー解析法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明に係る上記課題は下記の手段により解決される。
[0010] 1.同一化学組成であって、 1〜； !Onmの粒径範囲で粒径が異なり、かつ発光スぺ タトルの極大発光波長が異なる 3種類以上の蛍光半導体微粒子からなる蛍光半導体 微粒子集合体において、各々の蛍光半導体微粒子の発光強度の標準偏差が 15% 以下であることを特徴とする蛍光半導体微粒子集合体。
[0011] 2.前記発光スペクトルの極大発光波長が 380〜800nmの範囲内にあることを特 徴とする前記 1に記載の蛍光半導体微粒子集合体。
[0012] 3.前記発光スペクトルの極大発光波長が異なる 3種類以上の蛍光半導体微粒子 力、一種の励起光の照射により発光することを特徴とする前記 1又は 2に記載の蛍光 半導体微粒子集合体。
[0013] 4.前記;!〜 3のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体の製造方法であ つて、液相法により蛍光半導体微粒子を製造することを特徴とする蛍光半導体微粒 子集合体の製造方法。
[0014] 5.前記;!〜 4のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光 半導体微粒子の表面上に生体物質に結合する官能基と該蛍光半導体微粒子の表 面に結合する官能基をもつ表面修飾化合物を有することを特徴とする生体物質蛍光 標識剤集合体。
[0015] 6.前記;!〜 4のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光 半導体微粒子の表面上に、異なる粒径種ごとに異なる生体標的物質に適した異なる 表面修飾物化合物を有することを特徴とする前記 5に記載の生体物質蛍光標識剤 集合体。
[0016] 7.前記 5又は 6に記載の生体物質蛍光標識剤集合体を用いて同時に 3種以上の 追跡 ·標的物質の蛍光動態イメージングを行うことを特徴とするバイオイメージング法
〇
[0017] 8.前記;!〜 3のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を埋め込んだポ リマービーズを利用して生体物質のマルチフローサイトメトリーを行うことを特徴とする 生体物質解析方法。
発明の効果
[0018] 本発明の上記手段により、 3種以上の複数の標的を同時に検出（マルチ検出）する 精度の高い動態イメージング性を実現する蛍光半導体微粒子集合体、その製造方 法、それを用いた生体物質蛍光標識剤の集合体、イメージング方法、フローサイトメト リー解析法を提供することができる。
[0019] なお、本発明により、特に 1分子イメージングの研究分野において高感度高精度測 定法を提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下、本発明とその構成要素等について詳細な説明をする。
[0021] (蛍光半導体微粒子集合体）
本発明の蛍光半導体微粒子集合体は、同一化学組成であって、；!〜 10nmの粒径 範囲で粒径が異なり、かつ発光スペクトルの極大発光波長が異なる 3種類以上の蛍 光半導体微粒子からなる蛍光半導体微粒子集合体において、各々の蛍光半導体微 粒子の発光強度の標準偏差が 15%以下であることを特徴とする。
[0022] ここで、「蛍光半導体微粒子集合体」とは、；!〜 lOnmの範囲で平均粒径の異なる 蛍光半導体微粒子種を 1生体検査目的のために複数集めたものを指す。集合体の 中の個々の粒径の粒子を 1生体物質の標識として利用し、同時に 1検査の中で複数 生体物質の検出を行う。または集合体そのものを複数分別のビーズに使用することも でき、蛍光半導体微粒子を埋め込んだビーズを修飾して生体親和性を持たせること で標識として利用できる。
[0023] なお、本発明に係る蛍光半導体微粒子の平均粒径は 1〜； !Onmであり、コア ンェ ル構造の蛍光半導体微粒子であればコア粒子の平均粒径を指す。平均粒径の異な る蛍光半導体微粒子種の各々の粒径分布は単分散性であることが好ましぐ粒径分 布の標準偏差は 20 %以下、より好ましくは 10 %以下である。
[0024] 本発明の蛍光半導体微粒子集合体を構成する各サイズの蛍光半導体微粒子の発 光強度については標準偏差が 15%以下となる均一性を示すことを要する。これは発 光強度がばらつ!/、て!/、る場合に発光強度が高!、発光に弱レ、発光が隠れてしまレ、、 識別性および精度がおちてしまうからである。
[0025] 本発明に係る蛍光半導体微粒子の発光スペクトルの極大発光波長は、 380〜800 nmの範囲内にあることを要する。赤外および近赤外領域が含まれているのは、よりマ ルチ数を増やすことができること及び透過能力の高い光であれば生体の深い位置に ある生体物質も検出できるメリットがあるからである。 [0026] 前記発光スペクトルの極大発光波長が異なる 3種類以上の蛍光半導体微粒子が、 一種の（単一の波長であっても複数の波長の光を含んでいても良い。）励起光の照 射により発光することが好ましい。すなわち、一つの励起光源からの一種の励起光の 照射により発光することが好ましレ、。一つの励起光源であれば検出装置を簡易できる だけでなぐ余計なフィルターが不要であり、検出又は観察を簡易にできるなどのメリ ットがあり、本発明の特徴的効果を一層発現できる。
[0027] なお、本発明において、同組成で各種蛍光半導体微粒子を標準偏差 15%以下の 分布に均一な発光強度を実現する手段としては、蛍光半導体微粒子の結晶性を高 め、表面欠陥および内部欠陥を制御することにある。これは大粒経側では 1個当たり の表面積が大きぐ粒子数が少なくなるため 1個当たりの発光への影響が大きぐ小 粒経側より欠陥を少なくする工夫 (後述する蛍光半導体微粒子の製造の際に、原材 料の純度、合成濃度、合成温度と時間、粒子形成後のァニール温度 ·時間を最適化 する工夫）を施すことが必要であり、このような粒経毎に最適な合成条件と工夫を加 えることで本発明を達成できる。
[0028] 〈蛍光半導体微粒子の形成材料〉
本発明の蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光半導体微粒子は種々の半導 体材料を用いて形成することができる。例えば、元素の周期表の IV族、 II VI族、及 び III V族のはんどうたい化合物を用いることができる。
[0029] II— VI族の半導体の中では、特に、 MgS、 MgSe、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 SrS、 SrSe、 SrTe、 BaS、 BaSe、 BaTe、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 CdS、 CdSe 、 HgS、 HgSe及び HgTeを挙げることができる。
[0030] m—V族の半導体の中では、 GaAs、 GaN、 GaPGaSb, InGaAs, InP、 InN、 InS b、 InAs、 AlAs、 A1P、 AlSb及び A1Sが好ましい。
[0031] VI族の半導体の中では、 Ge、 Pb及び Siは特に適している。
[0032] 本発明においては、蛍光半導体微粒子をコア/シェル構造を有する粒子にするこ とが好ましい。この場合、蛍光半導体微粒子は蛍光半導体微粒子からなるコア粒子 と該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア/シェル構造を有する蛍光半 導体微粒子であって、該コア粒子とシェル層の化学組成が相異するものであることが 好ましい。
[0033] 以下、コア粒子とシェル層について説明する。
[0034] 〈コア粒子〉
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができ る。具体例としては、例えば、 MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 SrS、 Sr Se、 SrTe、 BaS、 BaTe、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 CdS、 CdSe、 CdTe、 GaAs、 GaP、 GaSb、 InGaAs, InP、 InN、 InSb、 InAs、 AlAs、 A1P、 AlSb、 A1S、 PbS、 PbSe、 Ge、 Si、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導 体材料は、 Siである。
[0035] なお、必要があれば Gaなどのドープ材料を極微量含んでもよい。
[0036] 本発明に係るコアの平均粒径に関しては、発明の効果発現のために、 1〜； !Onmで あることを要する。なお、平均粒径を;!〜 lOnmとすることにより小粒径の生体分子の 標識及び検知が可能となり、更に、；!〜 5nmであれば、十分に生体 1分子に対する 標識並びに動態イメージングが可能となる。従って、特に好ましいのは l〜5nmであ
[0037] なお、本発明に係るコアの「平均粒径」とは、レーザー散乱法により測定される累積
50%体積粒径をいう。
[0038] 〈シェル層〉
シェルに用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。 具体例としては、例えば、 ZnO、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 CdO、 CdS、 CdSe、 CdTe、
MgS、 MgSe、 GaS、 GaN、 GaP、 GaAs、 GaSb、 InAs、 InN、 InP、 InSb、 AlAs、
A1N、 A1P、 AlSb、又はこれらの混合物等が挙げられる。
[0039] なお、好まし!/、シェルの材料としては、半導性ナノ結晶コアより高!/、バンドギャップ エネルギーを有する半導性材料が挙げられる。
[0040] 半導性微粒子結晶コアより高!/、バンドギャップエネルギーを有することに加えて、シ エルに適切な材料は、コア半導性ナノ結晶に関して、良好な伝導性および原子価バ ンドオフセットを有するべきである。従って、伝導性バンドは、コア半導性ナノ結晶の 伝導性バンドよりも望ましくは高ぐそして原子価バンドは、コア半導性ナノ結晶の原 子価バンドよりも望ましくは低い。可視で (例えば、 Si、 Ge、 GaP、）または近赤外で（ 例えば、 InP、 InN、 PbS、 PbSe)エネルギーを放出する半導性ナノ結晶コアについ て、紫外線領域でバンドギャップエネルギーを有する材料が使用され得る。具体例と しては、例えば、 ZnS、 GaNおよびマグネシウムカルコゲニド（例えば、 MgS、 MgSe および MgTe)が挙げられる。
[0041] 近赤外で放出する半導性ナノ結晶コアにつ!/、て、可視でバンドギャップエネルギー を有する材料もまた使用され得る。
[0042] 本発明にお!/、て、特に好まし!/、半導体材料は、 SiO、 ZnSである。
[0043] なお、本発明に係るシェル層は、コア粒子が部分的に露出して弊害を生じない限り 、コア粒子の全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。
[0044] 〈蛍光半導体微粒子の製造方法〉
本発明の蛍光半導体微粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いる こと力 Sでさる。
[0045] 液相法の製造方法としては、沈殿法である、共沈法、ゾルーゲル法、均一沈殿法、 還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を 作製する上で優れた方法である（例えば、特開 2002— 322468号、特開 2005— 23 9775号、特開平 10— 310770号、特開 2000— 104058号公報等を参照。）。
[0046] 気相法の製造方法としては、（1)対向する原料半導体を電極間で発生させた第一 の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた 第二の高温プラズマ中に通過させる方法 (例えば特開平 6— 279015号公報参照。 ) 、 （2)電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離 •除去する方法（例えば特表 2003— 515459号公報参照。）、レーザーアブレーショ ン法 (例えば特開 2004— 356163号参照。）などが用いられる。また、原料ガスを低 圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。
[0047] 本発明の蛍光半導体微粒子の製造方法としては、特に液相法による製造方法が 好ましい。
[0048] なお、本発明に係る蛍光半導体微粒子の粒径や発光強度の均一性を実現するた めに、原材料の純度、合成濃度、合成温度と時間、粒子形成後のァニール温度 '時 間等の条件を最適化して、格子欠陥が少なく結晶性の高い蛍光半導体微粒子とす ることを要する。
[0049] 〈蛍光半導体微粒子の表面修飾〉
本発明の蛍光半導体微粒子を生体適用の標識剤とするためには、当該蛍光半導 体微粒子の表面を表面修飾化合物を用いて修飾することを要する。
[0050] なお、蛍光半導体微粒子集合体を構成する蛍光半導体微粒子の表面上に、異な る粒径種ごとに異なる生体標的物質に適した異なる表面修飾物化合物を有すること が好ましい。
[0051] 表面修飾化合物としては、少なくとも 1つの官能基と少なくとも 1つの蛍光半導体微 粒子に結合する基を有する化合物であることが好ましい。後者は疎水性の蛍光半導 体微粒子に吸着できる基であり、他方は生体物質に親和性があり生体分子に結合す る官能基である。互いの表面修飾化合物は互いをつなぐ各種のリンカ一を使用して あよい。
[0052] 蛍光半導体微粒子に結合する基としては、前記のシェル層若しくはコア粒子を形 成するための半導体材料に結合する官能基であれば良い。従って、シェル層若しく はコア粒子の組成に応じて好ましレ、官能基を選択することが好ましレ、。本発明におレヽ ては、当該官能基として、特にチオール基が好ましい。
[0053] 生体物質に親和的に結合する官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、フォスフ オン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。
[0054] なお、ここで、「生体物質」とは、細胞、 DNA、 RNA、オリゴヌクレオチド、蛋白質、 抗体、抗原、小胞体、核、ゴルジ体等を指す。
[0055] 又、蛍光半導体微粒子に結合させる方法としては、表面修飾に適する pHに調整す ることによりメルカプト基を粒子に結合させることができる。それぞれ他端にはアルデヒ ド基、アミノ基、カルボキシル基が導入され、生体のアミノ基、カルボキシル基とぺプ チド結合することができる。また、 DNA、オリゴヌクレオチドなどにアミノ基、アルデヒド 基、カルボキシル基を導入しても同様に結合させることができる。
[0056] 蛍光半導体微粒子の表面修飾のための具体的調製は、例えば、 Dabbousiら（19 97)J. Phys. Chem. B101： 9463、 Hinesら（1996)J. Phys. Chem. 100 : 468 — 471、 Pengら（1997)J. Am. Chem. Soc. 119 : 7019— 7029、及び Kunoら（1 997)J. Phys. Chem. 106 : 9869に記載されている方法に準拠して fiうことカでき
[0057] (生体物質蛍光標識剤集合体とそれを用いるバイオイメージング法）
本発明の蛍光半導体微粒子集合体は、以下に説明する事由に基づき、生体物質 蛍光標識剤に適応することができる。また、標的（追跡)物質を有する生細胞もしくは 生体に本発明に係る生体物質蛍光標識剤を添加することで、標的物質と結合もしく は吸着し、該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に 応じて蛍光半導体微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上 記標的 (追跡)物質の蛍光動態イメージングを行うことができる。すなわち、本発明に 係る生体物質蛍光標識剤集合体は、バイオイメージング法 (生体物質を構成する生 体分子やその動的現象を可視化する技術手段）に利用することができる。
[0058] また、生体物質解析方法として、本発明の蛍光半導体微粒子集合体を埋め込んだ ポリマービーズを利用して生体物質のマルチフローサイトメトリーを行うことなどもでき
[0059] 以下、生体物質蛍光標識剤及び関連技術等について詳しく説明する。
[0060] 本発明に係る表面修飾した蛍光半導体微粒子（以下「表面修飾半導体微粒子」と もいう。）は、表面修飾化合物の官能基により、結合対の第 1のメンバーとして働く親 和性分子に結合させ得る。例えば、表面修飾化合物の親水性構造部分内に存在す るイオン化可能基は、親和性分子への結合手段を提供し得る。
[0061] なお、親和性分子に分子および分子セグメントを結合する適切な方法については、 例えば、 Hermanson、 Bioconjugate Techniques (Academic Press, NY, 19 96)に記載されている。
[0062] 親和性分子によるこのような表面修飾半導体微粒子との「結合体」は、生体物質す なわち生物学的化合物および化学的化合物の存在および/または量、生物系、生 物学的プロセスにおける相互作用、生物学的プロセスの変更あるいは生物学的化合 物の構造における変化を検出するために使用され得る。すなわち、表面修飾半導体 微粒子に結合した場合、親和性分子は、結合対の第 2のメンバーとして働く生物学 的標的と相互作用し、生物学的プロセスまたは応答を検出する力、、あるいは生物学 的分子またはプロセスを変化させ得る。
[0063] 好ましい態様としては、親和性分子および生物学的標的の相互作用は、特異的結 合を伴い、そして共有結合、非共有結合、疎水性、親水性、ファンデルワールスまた は磁性の相互作用を伴い得る。更に、親和性分子は生物学的標的と物理的に相互 作用させ得る。
[0064] 表面修飾半導体微粒子に結合する親和性分子は、天然に存在し得る力、または化 学的に合成され得、そして所望の物理学的、化学的または生物学的特性を有するこ とが選択され得る。
[0065] このような特性としては、タンパク質、核酸、シグナル伝達分子、原核生物細胞また は真核生物細胞、ウィルス、細胞内オルガネラおよび他の任意の生物学的化合物と の共有結合および非共有結合等が挙げられるが、これらに制限されない。
[0066] このような分子の他の特性としては、生物学的プロセス（例えば、細胞周期、血液凝 固、細胞死、転写、翻訳、シグナル伝達、 DNA損傷または DNA切断、ラジカル生成 、ラジカル除去など）に影響を与える能力、および生物学的化合物の構造 (例えば、 架橋、タンパク質分解切断、ラジカル損傷など)を変化させる能力等が挙げられるが、 これらに制限されない。
[0067] 好ましい実施形態において、表面修飾半導体微粒子結合体は、調整可能な波長 で光を放射する半導体微粒子を含み、そして核酸に結合される。当該結合は、直接 的または間接的であり得る。核酸は、任意のリボ核酸、デォキシリボ核酸、ジデォキシ リボ核酸または任意の誘導体およびその組み合わせであり得る。核酸はまた、任意 の長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、 三本鎖またはより高位の立体配置 (例えば、ホリデー結合、環状一本鎖 DNA、環状 二本鎖 DNA、 DNA立方体（Seeman (1998)Ann. Rev. Biophys. Biomol. Str uct. 27 : 225248を参照のこと））であり得る。
[0068] 本発明に係る半導体微粒子結合体のとりわけ好ましい使用態様は、以下のような 核酸の検出および/または定量である：（a)ウィルス核酸；（b)細菌核酸；および (c) 目的の多くのヒトの配列（例えば、単鎖ヌクレオチド多型)。本発明の範囲を制限する ことなしに、蛍光半導体微粒子結合体は、個々のヌクレオチド、デォキシヌクレオチド 、ジデォキシヌクレオチドまたは任意の誘導体およびその組み合わせに結合する蛍 光半導体微粒子を含み得、そして DNA重合反応（例えば、 DNA配列決定、 DNA への RNAの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR) )において使用される。
[0069] ヌクレオチドとしてはまた、一リン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩ならびに環状誘 導体 (例えば、環状アデニン一リン酸 (cAMP) )が挙げられる。
[0070] 核酸に結合した蛍光半導体微粒子の他の使用態様としては、蛍光インサイチュハ イブリダィゼーシヨン (FISH)が含まれる。この好ましい実施形態において、蛍光半導 体微粒子はインビボで特異的な配列にハイブリダィズするように設計されたオリゴヌク レオチドに結合される。ハイブリダィゼーシヨンに関して、蛍光半導体微粒子タグは、 細胞において所望の DNA配列の位置を可視化するために使用される。例えば、そ の DNA配列が部分的または完全に既知である遺伝子の細胞内局在は、 FISHを用 いて決定され得る。
[0071] その配列が部分的または完全に既知である任意の DNAまたは RNAは、 FISHを 用いて視覚的に標識され得る。例えば、本発明の範囲を制限することなしに、メッセ ンジャー RNA(mRNA)、 DNAテロメァ、他の高反復 DNA配列および他のコードさ れて!/、な!/、DNA配列が FISHにより標的化され得る。
[0072] 蛍光半導体微粒子結合体はまた、生物学的化合物（例えば、酵素、酵素基質、酵 素インヒビター、細胞内オルガネラ、脂質、リン脂質、脂肪酸、ステロール、細胞膜、 シグナル伝達に関する分子、レセプターおよびイオンチャネル）の検出のための分子 または試薬と結合して、本明細書中で提供されるような表面修飾蛍光半導体微粒子 を含む。
[0073] 当該結合体はまた、細胞形態および流体の流れ；細胞生存能力、増殖および機能 ；エンドサイト一シスおよびェキソサイト一シス（Betzら（1996) Curr. Opin. Neurob iol. 6 (3) : 365- 71)；および反応性酸素種 (例えば、スーパーォキシド、一酸化窒 素、ヒドロキシラジカル、酸素ラジカル)を検出するために使用され得る。さらに、結合 体は、生物系の疎水性領域または親水性領域を検出するために使用され得る。
[0074] 生体物質蛍光標識剤 (蛍光半導体微粒子結合体）はまた、他の多くの生物学的お よび非生物学的な用途における有用性を見い出し、ここで、発光マーカー、特に蛍 光マーカーが代表的に使用される。例えば、 Haugland, R. P. Handbook of Fl uorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes、 Eug ene、 OR.第 6}¾丄 996 ; Website, www. probes, com. )力《参考になる。
[0075] 本発明に係る生体物質蛍光標識剤が有用である領域の例としては、蛍光免疫細胞 化学、蛍光顕微鏡法、 DNA配列分析、蛍光インサイチュハイブリダィゼーシヨン (FI SH)、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET)、フローサイトメトリー（蛍光活性化セルソー ター； FACS)および生物系についての診断アツセィ等が挙げられる力 S、これらに制 限されない。
[0076] 上記の領域におけるナノ結晶結合体の有用性に関するさらなる議論については、
Bawendiらに対する国際特許公開 WO 00/17642力 S参考になる。
[0077] また、ポリマービーズに関しては、特表 2006— 512929号、同 2005— 518402号
、特開 2006— 131771号公報等が参考になる。
[0078] 以上、上述のように、本発明の応用範囲は固定細胞を用いた免疫染色、細胞観察 やレセプター'リガンド (低分子、薬物）相互作用のリアルタイムトラッキング、 1分子蛍 光イメージングでなどが挙げられる。
実施例
[0079] 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるも のではない。
[0080] <実施例 1〉
(蛍光半導体微粒子（Si/SIO 'コア/シェル粒子)集合体の製造）
熱処理した SiO (χ- 1. 999)のフッ酸中溶解により Siからなる蛍光半導体微粒子（ 以下において「Si半導体微粒子」又は「Siコア粒子」ともいう。）を製造する場合、先ず 、プラズマ CVDによりシリコンウェハー上に成膜した SiO (x- 1. 999)を不活性ガス 雰囲気中で 1000°C、 2時間程度ァニールを行う。これにより、 SiO膜中に Si半導体 微粒子（結晶）が析出する。次に、このシリコンウェハーを室温で 1 %程度のフッ酸水 溶液で処理することにより SiO膜を除去し、液面に凝集した数 nmサイズの Si結晶を 回収する。なお、このフッ酸処理により、結晶表面の Si原子のダングリングボンド (未 結合手）が水素終端され、 Siコア粒子（結晶）が安定化する。その後、回収した Si半 導体微粒子（結晶）の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、又は加熱して熱酸化し、
Si結晶からなるコアの周囲に SiOからなるシェル層を形成する。
[0081] 得た粒子の粒径はシスメッタス社製ゼータサイザ一を使!/、測定し 2· 5nm (コア）で あった。
[0082] 同様にして Siコア粒子をァニール温度変更や、時間を変更、及び HF水溶液処理 の微調整で粒経の異なる粒子を得た。
[0083] 特に大サイズ側ではァニール温度を高めにし、ァニール時間を短く調整した。
[0084] 上記のようにして、 3· Onm、 3. 4nm、 3. 8nm、 4. 4nmのコア粒子を含有するコア
/シェル粒子を得た。
[0085] (比較粒子 l : CdSe/SiO ·コア/シェル粒子の調製） スコに入れ、アルゴンで系内を満たした後、所定の温度（150〜250°C)まで加熱し た。この溶液に、 25mg/cm3の濃度となるようにセレンを溶解させたトリ n—オタチル フォスフィン溶液 1. 44cm3を、激しく撹拌しながら素早く注入し、さらに 1時間撹拌す ることにより TOPO安定化 CdSe (以下、「TOPO/CdSe」と呼ぶ。）を得た。 290°C、 250°C、 200°C及び 150°Cで各々停滞時間を調整し TOPO/CdSeを合成した場 合、 CdSeナノ粒子の吸収スペクトルの立ち上がり波長は、それぞれ、 660nm、 610 應、 580應と 550應であり、その粒子サイズは、それぞれ 7. 5應、 6. 2應、 5. 5 nmと 4. 5nmであった。この TOPO/CdSe粉末を用いて、 3—メルカプトプロビルト リメトキシシランで CdSeナノ粒子表面を修飾しさらに加水分解することにより粒子表 面にシリカ薄膜を形成させ CdSeコア/シリカシェル構造体（以下、「CdSe/SiO」と 呼ぶ。）を得た。得られたコア'シェル構造体を光溶解液中で単色光（560nm)を照 射することで、コア/シェル構造体内部のセレン化カドミウム（CdSe)ナノ粒子にサイ ズ選択光エッチングを適用し、セレン化カドミウム（CdSe)ナノ粒子の粒径を約 3· 5n mにまで減少させた、コア/シェル構造体からなる蛍光体を得た。
[0086] (比較粒子 2： CdSe/ZnS 'コア/シェル粒子の調製） スコに入れ、アルゴンで系内を満たした後、所定の温度（150〜250°C)まで加熱し た。この溶液に、 25mg/cm3の濃度となるようにセレンを溶解させたトリ n—オタチル フォスフィン溶液 1. 44cm3を、激しく撹拌しながら素早く注入し、さらに 1時間撹拌す ることにより TOPO安定化 CdSe (以下、「TOPO/CdSe」と呼ぶ。）を得た。比較粒 子 1と同様な粒径粒子を得た。
上記で得られた CdSeコア粒子をピリジン中に分散させ 100°Cに保温。別途、 Zn (C H ) と（（CH ) Si) S、 P (C H )をアルゴンガス雰囲気下、ゆっくり混合した。
[0087] これをピリジン分散液に滴下して添加。添加後、温度を適正に制御し、 pHを一定（
25°Cにおいて 8. 5)に保ちゆっくり 30分攪拌した。これの遠心分離を行い沈降した 粒子を捕集した。得た粒子の元素分析を行ってみたところ CdSeと ZnSが確認され、 XPS分析により ZnSが CdSeの表面に被覆していることが分かった。
[0088] 以上のように製造されたコア及びコアシェル粒子の粒径をシスメッタス社製：ゼータ サイザ一 ZSで測定した。
[0089] (修飾官能基の導入）
上記蛍光半導体微粒子により生体物質を標識する場合、当該粒子と生体物質のど ちらかもしくは双方に、互いに結合する官能基等を導入する必要があるが、下記のよ うに fiつた。
[0090] く Si/SiO 'コア/シェル粒子への修飾官能基の導入〉
メルカプト基（SH基）同士の結合を利用して Si蛍光半導体微粒子にカルボキシノレ 基を導入する。先ず、上述の Si蛍光半導体微粒子を 30%過酸化水素水中に 10分 間分散させ、結晶表面を水酸化させる。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプ 口ピルトリエトキシシランをトルエンの 2%加えて、 2時間程度かけて Si蛍光半導体微 粒子の最表面の SiOをシラン化すると共にメルカプト基を導入する。続いて、溶剤を 純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入された 11ーメ ルカプトゥンデカン酸を適量加えて 3時間攪拌することで、 SiSi蛍光半導体微粒子と 11 メルカプトゥンデカン酸とを結合させる。これは、本発明においては生体に対し 親和結合する修飾基を導入した例である。これを標識 A (A— 1、 A— 2、 A— 3、 A— 4、 A— 5)とする。 [0091] (CdSe/SiO 'コア/シェル粒子への修飾官能基の導入〉
上記標識 Aと同様な方法で 11 メルカプトゥンデカン酸を表面に結合し、カルボキ シル基を導入した。標識 B—；! B— 5とする。
[0092] く CdSe/ZnS 'コア/シェル粒子への修飾官能基の導入〉
上記で得た CdSei/ZnSコア 'シェル粒子をバッファ塩溶液に分散して、 11 メル カブトゥンデカン酸を適量加えて適温で 2時間攪拌し、粒子表面にメルカプト基を結 合させた。これにより表面にカルボキシル基が導入される。これを標識 C C 5 とする。
[0093] <発光強度の評価〉
各標識について励起光 405nmとし、蛍光スぺクトロメーター FP— 6500 (日本分光 )にて蛍光強度を評価した。標識 Aを基準 100として相対値で表し表 1に評価結果を 示した。
[0094] <細胞への取り込み染色解析〉
上記で得た標識を事前に羊血清アルブミン（SSA)と等濃度で混和し、個別に Ver o細胞へ取り込ませた。 37°C2時間培養した後、トリプシン処理して 5%FBS加 DME M再浮遊させ、同一ガラスボトムディッシュに播種した。 37°C—晚培養した細胞は 4 %ホルマリンで固定し D APIで核を染色して、共焦点レーザースキャン顕微鏡 (励起 405nm)で蛍光観察を行った。
[0095] 次の観点で蛍光観察の評価を行った。色の識別性を観点に多色同時解析ができ ているかどうかをポイントにして評価を行った。即ち、全ての色が見えるか、色の面積 も均一か、蛍光強度は均一かについて評価し、結果を表 1 3に記した。
[0096] [表 1] (本発明)
Figure imgf000017_0001
[0097] [表 2]
(比較例 1 )
Figure imgf000017_0002
[0098] [表 3]
(比較例 2 )
Figure imgf000017_0003
表 1〜3に示した結果から明らかなように、色毎の発光強度の差がある場合には、 高レ、発光強度の色の粒子のスペクトルの裾野が他色のスペクトルまで漏出し、識別 十生を下げて!/、ることが大きな原因となって!/、ること力 Sわ力、る。
以上により、発光強度が標準偏差 15%以内となる 3種以上の粒径を含む半導体蛍 光微粒子集合体を用いることにより生体物質の多色同時バイオイメージングを鮮明 にする方法提供できることが分かる。

Claims

請求の範囲
[1] 同一化学組成であって、 1〜； !Onmの粒径範囲で粒径が異なり、かつ発光スぺクトノレ の極大発光波長が異なる 3種類以上の蛍光半導体微粒子からなる蛍光半導体微粒 子集合体において、各々の蛍光半導体微粒子の発光強度の標準偏差が 15%以下 であることを特徴とする蛍光半導体微粒子集合体。
[2] 前記発光スペクトルの極大発光波長が 380〜800nmの範囲内にあることを特徴とす る請求の範囲第 1項に記載の蛍光半導体微粒子集合体。
[3] 前記発光スペクトルの極大発光波長が異なる 3種類以上の蛍光半導体微粒子が、一 種の励起光の照射により発光することを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に 記載の蛍光半導体微粒子集合体。
[4] 請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体の 製造方法であって、液相法により蛍光半導体微粒子を製造することを特徴とする蛍 光半導体微粒子集合体の製造方法。
[5] 請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を 構成する蛍光半導体微粒子の表面上に生体物質に結合する官能基と該蛍光半導 体微粒子の表面に結合する官能基をもつ表面修飾化合物を有することを特徴とする 生体物質蛍光標識剤集合体。
[6] 請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を 構成する蛍光半導体微粒子の表面上に、異なる粒径種ごとに異なる生体標的物質 に適した異なる表面修飾物化合物を有することを特徴とする請求の範囲第 5項に記 載の生体物質蛍光標識剤集合体。
[7] 請求の範囲第 5項又は第 6項に記載の生体物質蛍光標識剤集合体を用いて同時に 3種以上の追跡 ·標的物質の蛍光動態イメージングを行うことを特徴とするバイオィメ 一ジング法。
[8] 請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか一項に記載の蛍光半導体微粒子集合体を 埋め込んだポリマービーズを利用して生体物質のマルチフローサイトメトリーを行うこ とを特徴とする生体物質解析方法。
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