KR102114734B1 - 미세유체 분석 장치용 마이크로튜브 입자 및 제조방법 - Google Patents

미세유체 분석 장치용 마이크로튜브 입자 및 제조방법 Download PDF

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KR102114734B1
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마틴 에이. 퍼트넘
제프리 티. 브란치포르테
찰스 오. 스탠우드
제인 엠. 티유
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싸이벡, 아이엔씨
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Abstract

일련의 개별적으로, 축방향으로 이격된, 투명한 중공 유동 엘리먼트(hollow flow element)(32)가 고정된 위치에 장착되고, 각각의 유동 엘리먼트는 그 내측을 통해 적어도 하나의 축방향으로 연장된 유동 통로(flow passage)를 갖고, 분석 포획제는 상기 유동 엘리먼트의 내측을 통해 흐르는 액체 내의 분석물질의 포획을 위하여 상기 엘리먼트의 내표면에 고정되는, 유동축을 갖는 미세유체 유동 채널(micro-fluidic flow channel)(44)로 정의되는 미세유체 분석 장치로서,
상기 장치는 포획된 분석물질로부터 형광을 리딩하기 위해 빛이 상기 엘리먼트의 밖으로 투과되도록 구성되고;
상기 유동 엘리먼트 외측의 축방향으로 연장되는 면은 활성 포획제를 포함하지 않지만, 상기 내표면의 적어도 일부는 상기 엘리먼트를 통해 흐르도록 노출된 활성 포획제의 침적물을 전달하는 것인, 미세유체 분석 장치.

Description

미세유체 분석 장치용 마이크로튜브 입자 및 제조방법{MICRO-TUBE PARTICLES FOR MICROFLUIDIC ASSAYS AND METHODS OF MANUFACTURE}
본 발명은 휴대용 미세유체 장치를 적용하는 시스템을 포함하는 미세유체 시스템의 분석에 관한 것이다. 미세유체 장치의 일부 버전은, 카트리지 내에 분석 프로토콜을 수행하고 그 결과를 리딩하는 벤치-탑(bench-top) 기기와 같은 관련 장치에 의해 조작 및 리딩되는 미세유체 카트리지(카셋)의 형태이다.
또한, 본 발명은, 미세유체 시스템에서 수행되는 다중 분석이 에피 형광으로 리딩 또는 스캐팅되는 멀티플렉스 미세유체 분석에 관한 것이다.
본 발명은 특히 미세유체 분석이 주행(수행)된 후 분석 결과를 검출하고, 정확하게 모니터링 또는 검출을 수행하기 위하여 정확한 검출 시스템에 대한 미세유체 시스템의 정확한 상대적인 위치를 결정하도록, 미세유체 시스템 내에 수행되는 모니터링 분석에 관한 것이다.
본 발명은 미세유체 분석 시스템에 적용 가능한 넓은 실시형태를 갖고, 일반적으로 휴대용 미세유체 카트리지, 특히 카트리지의 상대적인 위치 및 정확한 외측 스캐닝 시스템이 정확하게 결정되지 않은 카트리지 내에서 수행되는 분석과 관련되는 더욱 구체적인 실시형태를 갖는다. 본 발명의 특히 중요한 용도는, 카트리지 내에서 수행할 분석을 야기하고 그 결과가 검출되는 다기능 장치로 삽입되는 미세유체 분석 카트리지에 관한 것이다.
잘 알려진 바와 같이, 임의의 미세유체 시스템의 사용은 고장의 가능성이 있고, 복합 시스템의 사용은 일반적으로 고장 모드의 수많은 가능성이 있다. 미세유체 분석 시스템용 고장 모드의 일례는, 미세유체 채널에서의 유동 및 소정의 분석 프로토콜에 따른 유동을 제어하는 밸브 및 피스톤에 관한 것이다. 고장 모드는 임의의 미세유체 시스템에 발생되지만, 분석이 미세유체 카트리지 내에서 수행되는 경우에 특정 문제일 수 있다. 미세유체 채널의 폐색 및 밸브의 개폐 불능은 그 고장의 일례이다. 밸브가 개방되지 않는 경우에는, 유동이 억제되고; 밸브가 완전히 폐쇄되지 않는 경우에는, 밸브의 누출이 시기 적절하지 않게 일어날 수 있다. 또한, 미세유체 채널의 오염의 가능성이 있다.
또한, 인적 오류의 가능성이 있다. 예컨대, 인간 플라즈마 또는 인간 혈청 샘플과 같은 대부분의 면역분석용 샘플은 규정된 비율, 예컨대 1:1(일부분 희석액에 대한 일부분 샘플) 또는 1:5로 희석액과 희석된다. 적절한 비율로 공급하는 것이 중요하지만, 사람은 샘플을 부적절하게 제조할 수 있다.
미세유체 분석, 일반적으로 휴대용 카트리지 내에서 수행되는 자동 미세유체 면역분석의 사용은, 특정 타이밍 및 특정 시약에 일어날 필요가 있는 분석 프로토콜에 많은 단계가 있다. 예컨대, 완충 액체 또는 시약이 미세유체 채널을 통해 유동되는 경우에, 샘플이 유동되는 경우에, 각각의 경우에 적절한 속도 및/또는 적절한 기간 동안 유동되었는지 알 필요가 있다. 또한, 유동이 허용될 수 없는 영역으로 유동 또는 누출이 있는지 알 필요가 있다. 또한, 액체 체적이, 예컨대 왕복동식 피스톤 펌프가 채널을 통해 순차적으로 액체의 소형 슬러그(부분)를 푸시하는 것과 같은 펄스 유동형 미세유체 시스템으로 대체되는 경우에, 각각의 슬러그에서 소정량의 유체를 갖는 것이 중요하다.
이러한 정보를 얻으려는 시도에 문제가 발생한다. 예컨대, 미세유체 채널에서 액체 유동은 매우 작기 때문에(예컨대 100-200 미크론 단면 폭 및 깊이, 단지 밀리미터의 길이), 유동을 예상하는 것은 어렵다. 채널은 너무 작아, 인간의 눈으로 액체가 의도하는 곳으로 유동하지 않는 사실을 관찰하기가 어렵다. 분석 시약은 일반적으로 투명하고, 시각 또는 광학 관측의 어려움을 악화시킨다.
이러한 문제는 특히 미세유체 분석에서 고정밀 정량화를 구하는 경우에 극심하다. 정량 분석에서, 노출되는 소정량의 고정된 포획제는 정의된 시간에 걸쳐 반응을 가능하게 하는 다양한 유체의 소정량에 노출되어, 정량화를 가능하게 하는 표준체와 결과가 비교될 수 있는 것이 바람직하다. 결과는 10% 미만(10% 내의 정확도), 바람직하게는 더 적은 총 변동 계수로 측정될 필요가 있다.
따라서, 정량화하기 위해, 분석은 일관된 런투런(run-to-run) 수행이 요구된다. 예컨대, 고정된, 포획된 부위와 연결되는 형광 염료를 적용하는 분석에서, 이전 칼리브레이팅 주행으로부터 정확하게 발생되는 표준 칼리브레이팅 곡선에 대한 결과를 비교하려는 경우에, 항체와 같은 2차 시약 및 형광 염료의 버퍼 또는 세정액의 농도 및 체적은 주행 간(from run to run) 동일할 필요가 있다. 이는 특히 환자 인간 플라즈마 또는 혈청 샘플에서, 특정 건강 관련 분석물질, 예컨대 IL5 또는 IL6과 같은 인터루킨(사이토킨이라고도 하는 항체류)과 같은 항체의 존재 또는 양을 측정하는 혈액 시험에서 사실이다.
이러한 이유로, 분석 종결 시에, 결과가 얻어지는지, 결과가 바람직한 프로토콜에 따라 정확하게 생성되는지를 확인하는 것은 중요하다.
분석 결과는 일반적으로 반응 부위로부터 형광 강도와 같은 발산을 검출함으로써 측정된다. 발산은 비드, 미세입자 또는 고정된 스팟으로부터 비롯될 수 있다. 현재 바람직한 바와 같이, 분석 결과는, 그 내부 표면 상에 고정된 항체와 같은 포획제를 갖는 1000 미크론 미만, 일반적으로 500 미크론 미만의 길이의 작은 중공 튜브 또는 미세튜브의 형태로 고정된 유리 나노-리엑터(GNR)로부터 비롯될 수 있다.
포획제의 영역으로부터 형광 강도는 필수적으로 많은 분석의 완료 시에 측정되는 것 모두이다. 이러한 형광 강도는 칼리브레이션 곡선과 비교된다. 칼리브레이션 곡선으로부터, 분석물질의 미지의 농도는 결정된다. 특정 주행에 유효한 칼리브레이션 곡선에서, 분석이 반복되는 동안 모든 조건은 주행 간 구체적으로, 재생되도록 반복될 필요가 있다. 이러한 조건을 측정하기 위한 개선된 수단은 매우 요망될 것이다.
미세유체 분석을 모니터링하기 위한 신규 기술의 이하 설명에서, 미세유체 카셋 상의 특징의 정확한 위치를 아는 것은 중요하다. 이것을 하기 위한 신규 기술은 여기서 추후에 설명된다.
제1실시형태에 있어서, 본 발명은 일련의 개별적으로, 축방향으로 이격된, 투명한 중공 유동 엘리먼트(hollow flow element)(32)가 고정된 위치에 장착되고, 각각의 유동 엘리먼트는 그 내측을 통해 적어도 하나의 축방향으로 연장된 유동 통로(flow passage)를 갖고, 분석 포획제는 상기 유동 엘리먼트의 내측을 통해 흐르는 액체 내의 분석물질의 포획을 위하여 상기 엘리먼트의 내표면에 고정되는, 유동축을 갖는 미세유체 유동 채널(micro-fluidic flow channel)(44)로 정의되는 미세유체 분석 장치로서, 상기 장치는 포획된 분석물질로부터 형광을 리딩하기 위해 빛이 상기 엘리먼트의 밖으로 투과되도록 구성되고; 상기 유동 엘리먼트 외측의 축방향으로 연장되는 면은 활성 포획제를 포함하지 않지만, 상기 내표면의 적어도 일부는 상기 엘리먼트를 통해 흐르도록 노출된 활성 포획제의 침적물을 전달하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 이러한 실시형태의 바람직한 실시는 이하 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
적어도 하나의 유동 경로(flow path)는 상기 각각의 엘리먼트의 축방향으로 연장되는 외측을 따라 연장될 수 있다. 상기 적어도 하나의 유동 경로는 상기 엘리먼트의 내측을 통해 적어도 총 유동 단면(A1)만큼 큰 총 바이패스(by-pass) 유동 단면적(A2)을 가질 수 있다. 상기 중공 유동 엘리먼트는 채널 축 방향으로 평행하게 연장되는 내표면 및 외표면, 및 상기 축에 가로로 연장되는 말단면을 갖고, 상기 엘리먼트의 표면은 상기 채널 내 액체에 노출되고, 상기 장치는 포획된 분석물질로부터 형광을 여기 및 리딩하기 위해 상기 유동 축에 가로로 상기 엘리먼트 안팎으로 빛을 투과시키도록 구성될 수 있다. 상기 각각의 엘리먼트의 말단면은 활성 포획제를 포함하지 않을 수 있다. 적어도 하나의 바이패스 유동 경로는 각각의 엘리먼트의 축방향으로 연장되는 외측을 따라 연장되고, 상기 바이패스 유동 단면 A2는 상기 중공 엘리먼트를 통해 상기 총 유동 단면 A1보다 적어도 1.5배만큼 클 수 있다. 상기 중공 유동 엘리먼트는 약 700 ㎛ 미만의 길이 L을 갖는 미세길이 튜브 엘리먼트를 포함할 수 있다. 상기 길이 L은 약 250 ㎛일 수 있다. 중공 유동 엘리먼트는 유리 또는 유리와 유사한 물질로 이루어지고, 1 나노리터의 내부 체적(internal volume)으로 정의되고, 상기 엘리먼트는 분석 반응을 위한 유리 나노 리엑터로 이루어질 수 있다. 중공 유동 엘리먼트는 75 ± 50 ㎛ 사이의 내측 유동 단면 폭을 가질 수 있다. 중공 유동 엘리먼트는 동축의 원통형 내표면 및 외표면을 갖고, 상기 내표면은 약 75 ± 50 ㎛ 사이의 직경을 가질 수 있다. 상기 엘리먼트의 내측 폭 또는 직경 각각에 대한 상기 중공 엘리먼트의 외측 폭(제1항 내지 제10항에 따른) 또는 직경(제11항에 따른)의 비는 약 1 내지 4일 수 있다. 중공 엘리먼트는 용융된 실리카로 이루어지고, 내측 직경이 약 70 um, 외측 직경이 약 125 um, 축 길이가 약 250 um인 곧은 원통 형태이고, 말단면은 평면이고, 상기 엘리먼트 축에 상당한 각도로 놓여 있을 수 있다. 상기 중공 엘리먼트는 드로잉 튜브(drawn tubing)의 세그먼트일 수 있다. 드로잉 튜브를 커팅함으로써 상기 엘리먼트 축에 상당한 각도로 놓이는 말단면을 가질 수 있다. 유동 채널은 이격된, 반대 방향 측벽에 의해 정의되고, 상기 채널은 그 안에 고정된 유동 엘리먼트의 폭 또는 직경보다 큰 폭을 갖고, 상기 엘리먼트는 측벽 중 하나와 접촉되고, 그것과 접촉하는 벽과 반대 방향 엘리먼트의 측의 바이패스 유동 단면적이 엘리먼트가 접촉하는 측보다 클 수 있다. 상기 유동 엘리먼트와 접촉하는 유동 채널의 적어도 일측은 상기 엘리먼트의 외표면에 대해 정전기적 인력의 특성을 갖는 물질에 의해 정의될 수 있다. 상기 유동 채널은, 단단한 베이스면, 바람직하게는 저형광 유리에 의해 바닥이 정의되고, 엘라스토머 시트의 반대 방향 커팅면에 의해 측면이 정의될 수 있다. 채널의 측벽은 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어질 수 있다. 유동 채널은 상기 중공 엘리먼트의 대응하는 치수보다 얕은 깊이의 개방 채널(open channel)에 의해 정의되고, 상기 중공 엘리먼트는 이러한 개방 채널에 위치하고, 투명한 탄력적인 폐쇄 멤버(closing member)는 상기 개방 채널의 개방측 상에 배치되어 상기 개방 채널의 개방측을 폐쇄하고, 상기 유동 채널을 형성하고 동시에 상기 유동 채널 내에 고정된 위치에 상기 엘리먼트를 장착하도록 상기 폐쇄 멤버는 개방 채널의 외측에 놓이는 엘리먼트의 일부에 대해 탄력적으로 지지할 수 있다. 상기 탄력적인 폐쇄 멤버는 상기 유동 채널 내에서 다중 유동 엘리먼트 상에 놓이고, 상기 유동 채널 내의 상대적인 위치에 고정되는 엘라스토머 시트의 부분일 수 있다. 관통, 개방-슬롯이 커팅된 엘라스토머의 평행한 제1시트의 일측에 고정된 평면, 상기 슬롯을 결합하는 측면과 상기 개방 채널을 형성하는 베이스 플레이트의 대응하는 노출면을 갖는 경성 베이스 플레이트를 포함하고, 상기 폐쇄 멤버는 상기 제1시트의 반대측에 부착되고 이에 대해 평행으로 놓인 투명한 제2엘라스토머 시트를 포함하고, 상기 엘리먼트는 상기 엘리먼트에 대해 제2시트를 국부적으로 변형하는 방식으로 상기 개방 채널을 돌출시켜, 상기 베이스 플레이트에 대해 엘리먼트를 탄력적으로 누르도록 하여 그 위치를 고정할 수 있다. 상기 동일한 시트의 각각의 부분은 상기 유동 채널에서 상기 복수의 엘리먼트 각각에 대해 놓이고, 고정될 수 있다. 액체 샘플의 세그먼트를 도입하고, 상기 엘리먼트의 내표면에만 분석물질을 포획하기 위해 샘플을 앞뒤로 움직이게 하고, 액체 샘플의 연속적인 세그먼트에 대해 이러한 조작을 반복하도록 배열되는 양-변위 펌프(positive-displacement pump)와 연결될 수 있다. 상기 엘리먼트 내표면의 적어도 말단 경계에는 활성 포획제가 없을 수 있다. 상기 엘리먼트의 말단으로부터 안쪽으로 놓이는 엘리먼트의 내표면의 부분에는 활성 포획제가 없을 수 있다. 상기 엘리먼트의 내표면 상에 활성 포획제는 코드를 정의하도록 설정될 수 있다. 상기 코드는 바코드일 수 있다. 상기 활성 포획제는 항체일 수 있다. 상기 활성 포획제는 항원일 수 있다. 상기 활성 포획제는 올리고머일 수 있다.
제2실시형태에 있어서, 본 발명은 유동 축을 갖는 미세유체 유동 채널(44) 내에서 고정된 위치에 장착되도록 적용된 투명한 중공 유동 엘리먼트(32)의 용도로, 상기 유동 엘리먼트는 그 내측을 통해 적어도 하나의 축방향으로 연장된 유동 통로를 갖고, 분석 포획제는 상기 유동 엘리먼트의 내측을 통해 흐르는 액체 내 분석물질의 포획을 위한 엘리먼트의 내표면에 고정되고, 상기 엘리먼트는 포획된 분석물질로부터 형광을 리딩하기 위해 빛을 엘리먼트의 밖으로 투과시키도록 구성되고, 상기 유동 엘리먼트 외측의 축방향으로 연장된 면은 활성 포획제를 포함하지 않지만, 상기 내표면의 적어도 일부는 노출을 위해 활성 포획제의 침적물을 상기 엘리먼트를 통해 흐르도록 전달하는 것인 것을 특징으로 한다.
제3실시형태에 있어서, 본 발명은 액체 유동을 위한 관통 통로를 갖는 중공체를 포함하는 분석 장치에 사용되는 미세길이 튜브 엘리먼트로, 제공되는 분석 물질용 활성 포획제는 유체 샘플과 상호작용하기 위해 상기 중공체의 내표면의 일부 상에만 위치하고, 상기 미세길이 튜브 엘리먼트의 외표면에는 활성 포획제가 없고 샘플 내 분석물질과 반응하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 이러한 실시형태의 바람직한 실시는 이하 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
상기 엘리먼트의 내표면의 경계에는 활성 포획제가 없고, 샘플 내 분석물질과 반응하지 않을 수 있다. 길이 L이 약 700 ㎛ 미만일 수 있다. 길이 L이 약 250 ㎛일 수 있다. 상기 엘리먼트는 약 75 ± 50 ㎛ 사이의 내측 유동 단면 폭을 가질 수 있다. 상기 엘리먼트는 동축의 원통형 내표면 및 외표면을 갖고, 상기 내표면은 약 75 ± 50 ㎛ 사이의 직경을 가질 수 있다. 내측 폭 또는 직경에 대한 상기 중공 엘리먼트의 외측 폭 또는 직경의 비는 약 1 내지 4일 수 있다. 상기 엘리먼트는 용융된 실리카로 이루어지고, 내측 직경이 약 70 um, 외측 직경이 약 125 um, 축 길이가 약 250 um인 곧은 원통 형태이고, 말단면은 평면이고, 관형 축에 상당한 각도로 놓여 있을 수 있다. 상기 엘리먼트는 드로잉 튜브의 세그먼트일 수 있다. 드로잉 튜브를 커팅함으로써 상기 엘리먼트 축에 상당한 각도로 놓이는 말단면을 가질 수 있다. 상기 엘리먼트의 내표면 상의 포획제는 코드를 정의하도록 설정될 수 있다. 상기 코드는 바코드일 수 있다. 상기 활성 포획제는 항체일 수 있다. 상기 활성 포획제는 항원일 수 있다. 상기 활성 포획제는 올리고머일 수 있다. 앞선 청구항의 임의의 장치 및 엘리먼트의 제조방법. 앞선 청구항의 임의의 장치 및 엘리먼트의 사용 방법. 상기 중공 유동 엘리먼트는 픽 앤 플레이스 모션(pick-and-place motion)에 의해 미세유체 채널로 삽입될 수 있다. 폐쇄장 정전기적 인력은 중공 유동 엘리먼트의 위치를 정의하고, 플레이싱 기기의 철수가 가능하도록 적용될 수 있다. 상기 채널은 상기 중공 엘리먼트에 대응하는 치수보다 넓고, 상기 채널의 측벽 쪽으로의 플레이싱 기기의 측면 조작은 폐쇄장 정전기적 인력이 상기 플레이싱 기기로부터 엘리먼트를 끌어당기는 것이 가능하도록 채널의 벽 근처로 엘리먼트를 가져가도록 적용될 수 있다. 상기 엘리먼트가 놓이는 미세유체 채널은 엘라스토머 물질로 형성된 적어도 하나의 측벽을 갖고, 상기 채널은 상기 엘리먼트에 대응하는 치수 미만의 폭을 갖고, 플레이싱 기기로부터 엘리먼트를 분리하고 기기의 철수가 가능하도록 엘라스토머 물질의 압착이 엘리먼트를 충분히 끌어당길 때까지, 맞춤 압력에 의해 상기 엘리먼트를 채널로 힘을 가하는 플레이싱 조작할 수 있다. 상기 엘리먼트는, 상기 엘리먼트의 반대 방향 부분과 연결되는 자동 트위져 핑거(automated tweezer finger)에 의해 영향받는 픽 앤 플레이스 모션에 의해 미세유체 채널로 삽입될 수 있다. 상기 반대 방향 부분은 평행한 평면일 수 있다. 상기 엘리먼트는 자동 진공 픽업에 의해 영향 받는 픽 앤 플레이스 모션에 의해 미세유체 채널로 삽입될 수 있다. 상기 진공 픽업은 상기 엘리먼트의 외부(outer) 원통 표면과 연결되는 장치에 의해 영향받을 수 있다. 상당한 면적의 위치에서 유연한 시트는 그 채널 내에 중공 유동 엘리먼트의 위치를 고정하기 위해 반대 방향 표면에 효율적으로 결합함으로써 연결되고, 시트의 다른 부분 또는 면적의 일부분은, 미세유체 장치 내에서의 다른 기능을 수행하고, 유동 채널 폐쇄를 포함하거나, 유체-조작 밸브용 유연한 격막(diaphragm)을 제공하거나 또는 온-보드(on-board) 펌프 격막을 제공하고, 바람직하게는 세 가지 모두를 수행하는 부분일 수 있다. 상기 유연한 시트는 엘라스토머, 바람직하게는 PDMS를 포함할 수 있다. 상기 장치는 단일 휴대용 분석 카트리지(칩) 내에 멀티플렉스 분석을 수행하도록 구성될 수 있다. 상기 장치의 적어도 일부 부품은 결합 가능한 물질의 활성화면의 공유 결합에 의해 연결되고, 동일한 시트의 인접 부분은 그 유동 채널 내에서 상기 검출 엘리먼트의 위치를 고정할 수 있다. 상기 장치의 적어도 일부 부품은 결합 가능한 물질의 활성화면의 공유 결합에 의해 연결되고, 동일한 시트의 인접 부분은 유연한 펌프 격막을 형성할 수 있다. 상기 장치의 적어도 일부 부품은 결합 가능한 물질의 활성화면의 공유 결합에 의해 연결되고, 동일한 시트의 인접 부분은 유연한 밸브 격막을 형성할 수 있다. 상기 유연한 밸브 격막 부분은, 반대 방향 시트와 밸브 격막 부분의 공유 결합을 방해하는 일련의 메이크 앤 브레이크(make and break) 접촉이 수행되는 표면-활성 결합가능한 물질로 원래부터 형성된 밸브 시트와 맞물릴 수 있다. 상기 장치의 적어도 일부 부분은 결합 가능한 물질의 활성화면의 공유 결합에 의해 연결되고, 동일한 시트의 각각의 인접 부분은 유동 채널의 개방측을 밀봉하고, 유동 채널 내에 상기 검출 엘리먼트의 위치를 고정하고, 유연한 펌프 격막이나 유연한 밸브 격막을 형성하고, 바람직하게는 상기 시트의 각각의 부분이 이들 기능 모두를 수행할 수 있다. 분석 장치는 2개의 서브어셈블리의 제조에 의해 형성될 수 있고, 각각은 비교적 경성 물질의 배킹(backing) 및 다른 서브어셈블리의 매칭 면과의 결합하기에 적합한 반대 방향의 면을 갖고, 어셈블리가 마주보도록(face-to-face) 결합함으로써 중공 유동 엘리먼트의 포획 및 이들이 놓여진 채널의 폐쇄에 영향을 줄 수 있다. 상기 포획제는 ELISA를 수행하기 위한 항체일 수 있다. 상기 장치는 포획된 분석물질에 형광 라벨을 제공하는 수단을 함유하고, 상기 검출 엘리먼트는 검출을 위해 형광 방출이 진행하는 바깥쪽으로 투명한 윈도우에 노출될 수 있다. 상기 윈도우은 에피-형광 검출이 가능하도록 외측 발생된 자극 광 방출에 투명할 수 있다.
제4실시형태에 있어서, 본 발명은 용액 중 중공 유동 엘리먼트를 배치 코팅하고, 건조하고, 그 후에 미세유체 장치의 유동 채널에서 엘리먼트를 픽 앤 플레이싱하고, 바람직하게는 유동 채널을 밀봉하면서 상기 엘리먼트를 포획하는 2개의 반대 방향 층을 결합함으로써 유동 엘리먼트를 포획하는 것을 포함하는 앞선 청구항 중 어느 한 항에 기재된 분석용 중공 유동 검출 엘리먼트의 제조방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 이러한 실시형태의 바람직한 실시는 이하 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
분석용 중공 유동 엘리먼트의 제조방법은 상기 중공 엘리먼트의 외표면 상에 활성 포획제의 발생을 제거 또는 억제하는 것을 포함하는, 포획제로 상기 엘리먼트를 코팅하기 위해 검출 엘리먼트를 배치 코팅하는 것을 포함할 수 있다. 상기 포획제를 갖는 유체 내 중공 엘리먼트의 현탁액은, 상기 엘리먼트의 외표면에 파괴 전단력을 부여하기 위해 강하게 교반되고(바람직하게는 볼텍싱함), 상기 전단력은 상기 엘리먼트의 외표면에 포획제의 결합을 억제하도록 작용될 수 있다. 상기 중공 엘리먼트의 외표면은 상기 외표면 상에 코팅의 형성을 억제하는 처리 조건 하에 있을 수 있다. 연속 튜브는, 상기 튜브의 외표면이 외부면(outer surface)의 기능화를 억제하도록 처리되는 동안 인출 또는 압출 공정에 의해 형성된 후, 미세길이 중공 튜브를 제조하도록 상기 튜브를 절삭하고, 배치 공정에 의해 상기 중공 튜브를 기능화할 수 있다. 코팅된 포획제는, 코팅된 엘리먼트의 표면으로부터 포획제를 제거 또는 비활성화하는 레이저 제거 공정에 선택적으로 노출되어 제거 또는 불활성화되도록 될 수 있다. 상기 엘리먼트의 기능화에 이어, 상기 엘리먼트는 슈가 베이스의 안정화액 내에 현탁되고, 픽킹될 것으로부터 픽업 플레이트 상에 유동되고, 상기 엘리먼트와 위킹 물질(wicking substance)의 물리적 접촉 없이 흡수력 있는 위킹 물질을 갖는 플레이트로부터 과도한 유동을 위킹하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 엘리먼트가 유동된 픽업 플레이트는, 엘리먼트가 얼라인먼트에 박히는 홈을 갖는 플레이트이고, 상기 위킹은 상기 엘리먼트로부터 떨어진 위치에서 홈과 연결되도록 상기 위킹 물질을 위치시킴으로써 행해질 수 있다. 상기 엘리먼트는 각각 박히는 홈을 따라 형성되는 일련의 포켓일 수 있다. 상기 픽업 플레이트는 평평한 엘리먼트-수신면(element-receiving surface)으로 정의되고, 상기 위킹은 구멍의 반대 방향 측 상의 위치에서 용액의 구멍과 접촉함으로써 수행될 수 있다. 상기 픽업 플레이트는 배수될 엘리먼트의 집합의 둘레보다 큰 내부 직경을 갖는 흡수체 물질의 링과 접촉될 수 있다. 상기 엘리먼트의 기능화에 이어, 상기 엘리먼트는 상대습도가 적어도 50%인 통제된 습도 조건 하에서 슈가 베이스의 안정화액으로 코팅된 픽업 플레이트 상에 저장될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 설명은 이하의 상세한 설명 및 첨부하는 도면으로 시작된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 개별의 미세길이 튜브 유동 엘리먼트가 고정되는 유동 채널을 갖는 분석 카셋의 어셈블리 단계의 도식이다;
도 2는 유동 채널에 연속하여 고정된 4개의 미세길이 튜브 엘리먼트를 나타낸 확대된 개략 평면도이고, 도 2a는 엘리먼트의 외측 상에 유동 엘리먼트를 통해, 바이패스 통로를 통해 바이패스 유동으로 상당한 액체의 유동을 나타내지만, 도 2b는 하나의 미세길이 튜브가 차단되는 경우에 연속 유동 조건을 나타내고, 도 2c는 미세길이 튜브 엘리먼트가 막히게 되는(즉, 차단되는) 유동 조건을 나타내는 확대된 단면도이다;
도 3은 각각이 6개의 미세길이 튜브 유동 엘리먼트에 고정되는 4개의 평행한 채널을 나타내는 카셋 부분의 크게 확대된 투시도이다;
도 4는 앞선 도에 따라 구성되는 카셋(즉, "유동 칩")의 제조 빛 사용시의 A 내지 K 단계의 흐름 도식이다;
도 6은 엘리먼트의 표면의 다른 조건 하에서 활성 포획제의 퍼센트 감소를 나타내는, 유동 엘리먼트 및 미세길이 튜브 엘리먼트의 예를 나타낸다;
도 7은 항체, 항원 또는 올리고머 함유 액체와 같은 포획제에서 미세길이 튜브 엘리먼트의 현탁액을 강하게 교반하기 위해 적용되는 장치를 나타낸다;
도 8은 미세튜브 엘리먼트의 외부면 및 내부면이 노출되는 벡터, 전단력 T에 의해 도식으로 나타낸다;
도 9는 마이크로보어 드로운 필라멘트(micro-bore drawn filament)로부터 미세 튜브 엘리먼트의 제조 단계를 나타낸다;
도 10은 미세 튜브 엘리먼트용 얼라인먼트 플레이트의 부분의 평면도이다;
도 10a
도 10b
도 10c
도 10c'
도 11은 미세길이 튜브 엘리먼트를 건조하기 위해 얼라인먼트 플레이트와 협조되는 원심성 드라이어를 나타낸다;
도 12는 미세길이 튜브 엘리먼트의 말단 및 내부면 상에 포획제의 선택된 영역을 제거(없애거나 비활성화 하는)하는 레이저 빔의 확대된 개략 도식이다;
도 13은 미세길이 튜브 유동 엘리먼트의 내부면 상에 포획제의 코드의 형성을 나타내는 도 12와 유사한 도식이다;
도 14는 도 12 또는 13의 단계를 수행하는, 큰 레이저 빔을 빔릿으로 형성하기 위한 포토 마스크 노출 도식을 나타낸다;
도 15는 미세유체 분석 장치의 개방 채널로 개별의 미세길이 튜브 엘리먼트를 플레이싱하기 위한 시스템의 상면도이다;
도 16은 미세길이 튜브 엘리먼트의 연결 말단면에 트위져 기기를 적용하는 픽 앤 플레이스 장치의 측면도이다;
도 17은 얼라인먼트 플레이트에 위치되는 미세길이 튜브 엘리먼트의 마주보도록 지정된 말단면에 접근하는 트위져 가지(tweezer tines)의 말단을 나타낸다;
도 19는 미세유체 장치의 유동 채널에 위치되는 미세길이 튜브 엘리먼트의 마주보도록 지정된 말단면을 떨어뜨리는 트위져 가지의 말단을 나타낸다;
도 21a-e는 분석 장치에서 미세 엘리먼트의 위치를 플레이싱 및 픽싱하고, 장치에서 유동 채널의 동봉을 완성하는 것과 관련된 일련의 단계의 확대된 단면도를 나타낸다;
도 22a 및 b는 제자리에 미세길이 튜브 엘리먼트를 갖는 유동 채널의 유동 단면을 나타낸다.
도 23a
도 23b
도 23c
도 23d
도 23e
도 23f
도 24는 확대된 유체 서브 어셈블리의 평면도이다;
도 25는 이들이 함께 모임에 따라 공압의 서브-어셈블리의 일부의 투시도이다;
도 26은 그 투명한 멤브레인을 통해 공압의 서브어셈블리의 아래측에서 위로 바라보는 평면도이다;
도 27은 공압의 서브-어셈블리의 아래측 및 유체 서브-어셈블리의 짝이 되는 상부면의 평면도이다;
도 28은 2개의 서브-어셈블리의 짝 짓는 조작을 개략적으로 설명하는 투시도이다;
도 28a는 2개의 서브어셈블리의 짝이되는 면이 약간의 압력으로 함께 눌려지는 것을 설명하는 측면도이다;
도 28b는 도 28a의 부분의 확대도이다;
도 28c는 위로부터 보이는 완전한 어셈블리의 투시도이다;
도 28d는 아래로부터 보이는 완전한 어셈블리의 투시도이다;
도 29는 완전한 어셈블리의 상면도이다;
도 30은 다른 미세유체 분석 장치용 어셈블리 단계의 전체적인 시야의 도식이다;
도 30a는 도 24의 장치의 분해 조립된 투시도이다;
도 31a는 도 24 및 25의 유체 채널의 투시도이다;
도 31b는 유동 채널, 중공 유동 엘리먼트, 밸브 시트 및 펌프 챔버를 도시한 도 25a의 부분의 확대도이다;
도 31c는 도 25a 및 b의 채널에 배치되는 단일의 초소형 중공 유동 엘리먼트의 매우 확대된 도이다;
도 32는 각각에 배치된 4개의 중공 유동 엘리먼트를 갖는 2개의 채널을 도시하는, 채널 구조의 부분의 매우 확대된 도이다;
도 33은 중공 유동 엘리먼트와 나란히 그리고 이를 통하는 유동 경로를 도시하고, 온-보드 펌프 및 베일(vale)을 개략적으로 나타내는 단일 채널의 평면도이다;
도 33a는 도 12의 밸브의 도식이다;
도 33a'
도 33b
도 33c
도 33d
도 33e
도 34는 유동 엘리먼트 외측에 이를 통과하는 유동의 라인을 나타내고, 장치의 채널의 이탈된 부분을 갖는 개략 단면이다;
도 34a는 2개의 층이 채널을 폐쇄하고 중공 유동 엘리먼트를 고정하기 위해 공유 결합에 의해 용융되는 도식이다;
도 41은 도 24-34의 장치용 어셈블리 공정의 단계의 도식이다;
도 41a, b, c, d~I는 액밀성 채널을 형성하고, 채널의 제자리에 초소형 중공 유동 엘리먼트를 고정하기 위해 공유 결합을 적용하는 단계를 나타낸다;
도 42는 X, Y 변환 테이블 위에 위치된 픽 앤 플레이스 기기, 개별의 소형 중공 유동 엘리먼트 및 앞선 도의 멀티플렉스 미세유체 분석 장치의 수신 채널(receiving channel)의 도식이다;
도 43, 44는 각각 트위져 형태의 픽 앤 플레이스 디바이스 및 그 지지 타워의 전면도 및 측면도이다;
도 45는 엘리먼트와 채널 벽 사이에 가까운 공간의 정전기적 인력의 이용이 전달되는 것을 개략적으로 나타내는, ns 유동 엘리먼트의 플레이싱 동안의 위치 순서이다; 45는 시스템의 픽 앤 플레이스 전면도이다;
도 46 및 47은 각각 진공 픽업 장치의 픽 앤 플레이싱 도식이다;
도 48, 49 및 49a는 엘리먼트와 채널 벽 사이에 가까운 공간의 정전기적 인력의 이용이 전달되는 것을 개략적으로 나타내는, ns 진공 장치를 갖는 유동 엘리먼트의 플레이싱 동안의 위치의 순서이다;
도 49b 및 49c는 도 24의 장치의 어셈블리 동안 일어나는 엘리먼트-고정 및 채널 밀봉 조작을 나타낸다, 이하 참조.
도 50a, c, e, f & d 도시
도 50b
도 51은 각 측에 마주보는 구조로 결합되는 PDMS 층의 위에 놓인 부분에 의해 형성되는 격막의 반복된 사이클링을 나타내고, 3 psi 양압력으로 반복적으로 폐쇄되고 8 psi 음압력 (진공)으로 개방되는 상기 밸브는 격막과 밸브 시트 사이에 형성되는 분자 결합을 극복하여 접촉면-활성화된 면 사이에 형성하도록 영구적인 공유 결합의 경향을 오버 타임 무효화시켜, 이렇게 형성된 밸브가 적절히 조작되도록 만들어진다;
도 51a-1은 노출된 메틸기 말단을 갖는 소수성 상태인 PDMS의 중성 상태로 이들을 나타낸 PDMS 층과 마주보는 2개의 층을 나타내는 도식이다.
도 51a-2는 분리된 층이 OH 기로 끝나는 것을 나타내는 이하 플라즈마 산소 플라즈마 처리와 유사한 도식이다.
도 51a-3은 가교 산소 공유 산소를 제조하는 히드록실기들 사이에서 영구적인 결합을 나타내는 도식이다.
도 51a-4는 밸브 시트가 두면이 서로 변형되는 것 대신 도시되는 것을 제외하고 도 51a(4')와 유사하다. 또한, 단일 변형은 그 표면과 마주보는 밸브 시트에서 보인다.
도 51a-4b
도 51a-6
도 51c는 동시에 다중 밸브에 적용되는 시스템의 3가지 단계를 나타내는 도 51과 유사한 도이다.
도 51d-1 및 d-2는 개폐 공정(make and break process) 동안의 특성을 나타내는 그래프이다.
도 51b(i)는 유체를, 개략적으로 접촉 및 연결된 공압 도구에 압력 또는 진공이 가해진 시스템으로 보내는 도구를 나타낸다.
도 51b(ii)는 공압 도구 및 평면도 및 공압 도구에 진공 또는 압력이 가해지기 위한 공급 포트에의 연결을 나타낸다.
도 51a-4'는 영역 A에서 플라즈마 활성 및 접촉, 및 활성 또는 분리 후 PDMS의 2개의 영역을 설명하는 도면으로서, 하이드록실과의 영구적 결합 또는 영구적 결합의 개시, 및 축합 반응에 의해, 접촉 영역 및 비접촉 영역인 영역 A 내에서 산소를 가교하는 것을 설명하는 밸브 영역, 또는 접촉에 의해 일시적으로 발생한 후 제거해서 메틸기, 또는 비결합 또는 낮은 에너지 상태의 종의 수가 증가하는 표면을 형성하는 영역으로 칭하는 것이다.
도 51a-5
도 51a-4"는 마주보는 평면이 변형된 단일면을 나타내는 도면이다.
도 51a-7
도 51a-9
도 51a-10
도 51a-11
도 51a-12
도 52a1
도 52a1M
도 53은 액체 유동이 왼쪽으로부터 피스톤으로 당겨지고, 바람직한 방향의 맥동하는 유동을 제조하기 위해 오른쪽으로 배출될 수 있는 펌핑 및 밸브 상태 순서를 개략적으로 도시한 것이다.
도 54 및 54a는 고정된, 미세하게 초점 맞춰진 광학 검출 시스템에 대해 정확한 X, Y 단계 상에서 플레이트는 이동하지만 카세트는 고정되도록 의도된 캐리어 플레이트에 대한 미세유체 카트리지의 2가지 위치를 각각 나타낸다.
도 55는 고정된 히터 플레이트 및 광학 검출 시스템을 이동시키기 위해 이동 가능한 단계 상의 캐리어 플레이트에 고정된 도 6 및 6a의 카트리지의 단면도이고, 이 물체는 히터 플레이트 내 홀을 통해 카트리지에 노출된다. 도 55a는 도 55 부분의 확대도이다.
도 56은 도 54 및 54a의 미세유체 카트리지를 스캐닝하기 위한 벤치 탑(bench top) 조작 및 스캐닝 유닛의 어셈블리의 분해 조립된 도이다.
도 57a-57c는 도 54 및 54a의 카트리지의 미세유체 및 공압 채널 구조물의 평면도이다.
도 58은 도 54 및 54a의 카트리지의 단일 미세유체 서브유닛의 유체 구조물을 나타내고, 표의 형태로 카셋 내에 수행되는 면역분석의 단계를 나타낸다.
도 53a-k
도 61은, 예컨대 도 54, 54a, 55 및 56의 정확한 X, Y 단계 시스템 내에서 고정되는 경우에 미세유체 카트리지의 채널의 위치를 정확히 결정하는 절차를 개략적으로 나타낸다.
도 62는 모니터링을 위해 채널의 정확한 위치, 이후에 결과를 리딩하기 위해 채널 내에 엘리먼트의 검출의 위치가 동일한 시스템에서 수행될 수 있다는 사실을 나타낸다.
도 63 및 64는 트레이서 없이 위치 결정 동안 얻어지는 시그널을 나타내는, 이후 스캐닝 도면에서 반복되는 표시이다.
도 65는 에피-형광 스캐닝 현미경용 일반도이다.
도 66은 레이저 빔 형태 등각도(Laser Beam Shape Isometric View)를 나타낸다.
도 67은 레이저 빔 형태 레이아웃도를 나타낸다.
도 68은 미세길이 튜브 엘리먼트 스캔 도식을 나타낸다.
도 69는 수집 시간 시리즈를 나타낸다.
도 70은 전체 스캔 시퀀스를 나타낸다.
도 71은 스캔 시퀀스-이미지를 나타낸다.
도 72는 스캔 시퀀스-개별의 사진 검출기를 나타낸다.
도 73은 미세길이 튜브 유동 엘리먼트로부터의 코드 리딩을 나타낸다.
도 74는 이전 도의 제1 블럭의 바람직한 실행을 나타낸다.
도 75는 미세길이 튜브 유동 엘리먼트로부터 동시에 코드 및 분석물질의 양을 리딩하는 것을 나타낸다.
도 76은 통합된 코드를 리딩하는 것을 나타낸다.
도 77은 미세길이 튜브 엘리먼트의 바코드를 나타낸다.
도 78은 스캔 데이터 파일 정보를 나타낸다.
도 79는 칩 레이아웃을 나타낸다.
도 80은 파인드 채널 ROI(Find Channels ROI)를 나타낸다.
도 81은 파인드 채널 스캔 플롯(Find Channels Scan Plot)을 나타낸다.
도 82는 파인드 채널 데이터 시그먼트 플롯(Find Channels Data Segment Plot)을 나타낸다.
도 83은 파인드 채널 가공 플로우 챠트(Find Channels Processing Flowchart)를 나타낸다.
도 84는 파인드 엘리먼트 ROI(Find Elements ROI)를 나타낸다.
도 85는 파인드 엘리먼트 스캔 플롯(Find Elements Scan Plot)을 나타낸다.
도 86은 파인드 엘리먼트 가공 플로우 챠트(Find Elements Processing Flowchart)를 나타낸다.
도 87은 자동 포커스 스캔 플롯을 나타낸다.
도 88은 자동 포커스 가공 플로우 챠트를 나타낸다.
도 89는 자동 노출 도식을 나타낸다.
도 90은 자동 노출 전차 플로우 챠트를 나타낸다.
도 91은 레이저/ROI 얼라인먼트를 나타낸다.
도 92는 형광 스캔 ROI, 밝은 부분을 나타낸다.
도 93은 형광 스캔 ROI, 레이저 온 LED 오프를 나타낸다.
도 94는 형광 스캔 데이터, 풀 산(Full San)을 나타낸다.
도 95는 형광 스캔, 하나의 채널을 나타낸다.
도 96은 형광 스캔, 하나의 엘리먼트를 나타낸다.
도 97은 형광 스캔 데이터 가공을 나타낸다.
도 98은 미세유체 채널 및 모니터 위치를 갖는 미세유체 시스템을 나타낸다;
도 98a는 적절한 주행 분석을 나타내는 3가지 다른 조건 하에서 한 세트의 모니터링 위치에서 3가지 상으로 얻어지는 시그널을 나타낸다.
도 98a와 유사한 도 98b 및 98c는 적절한 주행 분석 동안 얻어지는 시그널을 나타낸다.
도 99는 유동이 변화하는 타임 오버의 짧은 기간에 걸쳐 단일 위치에서 미세유체 채널을 모니터링하는 것을 나타낸다.
도 100은 도 99와 유사하지만, 진동하는 유동을 만드는 많은 사이클에서 펌프의 조작을 검출하기 위한 유체의 모니터링을 나타낸다.
도 101은 검출 엘리먼트를 함유하지 않는 영역에서 채널과 얼라인되는 것으로 도시되는 미세유체 장치에 대한 스캐닝 시스템의 관계를 개략적으로 나타낸다.
도 102는 형광 여기 레이저 빔의 단면 프로파일 및 미세유체 채널에 대한 도 101의 광학 시스템의 관심 영역(ROI)의 단면을 나타낸다.
도 103은 도 54 및 54a의 카트리지의 단일 미세유체 서브유닛의 유체 구조물을 나타내고, 표의 형태로 카세트 내에 수행되는 면역분석의 단계를 나타낸다.
언급된 문제들 중 하나는 유동 채널에 고정되고, 유리 나노 리엑터 "GNR"과 같은 액체 샘플의 유동에 노출되는 미세길이 튜브 엘리먼트, 즉 길이가 700 미크론 미만, 마이크로보어 직경이 약 75 ± 50 미크론인 엘리먼트와 관련된 표면적에 관한 것이고, 이러한 장치는 일반적으로 모세관을 형성하는데 사용되는 것과 같이 끝없이 당겨지는 마이크로보어 필라멘트로 이루어지지만, 이 경우에 필라멘트는 개별의 더 짧은 미세유동 엘리먼트를 형성하기 위해 길이가 미세하게 촙드(chopped)된 것이다. 침지 기술에 의해 적용된 이러한 장치의 표면 상에 고정화된 포획제는 상당한 소모 문제를 일으킬 수 있다는 것을 깨달았다. 이는, 예컨대 소망되는 바와 같이 밀리리터 당 몇 피코그램과 같은 낮은 수준으로 분석물질의 농도를 특성화하려고 시도할 때 일어난다. "소모(depletion)"라 하는 현상은, 측정되는 샘플 내에 분석물질의 농도가 유동 엘리먼트의 큰 활성 면적과 결합함으로써 체적 측정으로 불리하게 감소될 수 있을 때 일어난다. 이는 분석 감도, 결과적으로 그의 유용성을 감소시킨다. 더욱 설명하기 위해, 항원에 대한 ELISA 또는 샌드위치 타입의 아미노 분석에서의 분석물질은 키네틱 반응, 역동적 공정에 의해 지배되는 방법으로 포획된 항체와 결합할 수 있다. 항원과 같은 분석물질은 항체와 같은 포획제와 결합하고, 그 반대도 일어나지만, 바운딩된 분석물질 분자는 포획제로부터 풀린다. 키네틱은 분석물질이 포획되고, 해산되는 "온" 속도 및 "오프" 속도에 관한 것이다. 포획 반응은, 시스템에서 결합 속도가 해리 속도와 동일한 평형에 도달할 때까지 포획의 전체 속도를 감소시키거나 주변 체적에서 분석물질을 소모하는 것을 계속할 것이다. 점진적인 활동은 상당히 지수 곡선에 따라 일어난다.
평형 조건의 절대값은 분석될 샘플의 체적에서 분석물질의 원래 농도에 따라 달라진다. 농도의 증가는 더 높은 시그널을 일으키고, 농도의 감소는 더 낮은 시그널을 일으킨다. 분석 소모가 일어나는 경우에, 샘플에서 분석물질의 농도는 시간에 걸쳐 불리하게 감소된다. 유동 채널에 고정되는 미세길이 튜브가 엘리먼트가 노출되는 액체 샘플의 체적에 과도한 포획제를 제공할 수 있고, 분석물질의 효과적인 농도를 감소시킨다는 것을 깨달았다. 농도는 측정된 최초, 개시점 농도에 상대적으로 과도한 속도로 감소된다. 이를 위해 칼리브레이트 하려는 노력은 도움이 되지만, 이러한 소모는, 시그널이 r로 감에 따라, 노이즈 레벨에 도달되고, 그 결과 낮은 시그널 투 노이즈 비율, 즉 분석의 유효성의 내재적인 감소를 일으키기 때문에 분석의 감도를 매우 낮춘다.(이미, 노이즈, 즉 백그라운드, 포획 항체의 비특이적 결합, 형광 노이즈, 전자 노이즈 등에 대해 많은 기여자가 있음). 따라서, 특히 낮은 농도를 검출하기 위해서, 분석 측정에 긍정적으로 기여하지 않는 방법으로 분석물질의 최초 체적을 소모하지 않는 것이 바람직하다. 노출된 면의 양을 어떻게든 제한함에 따라 그렇게 하는 효율적인 방법은 명백하지 않다. 이는, 면역분석 또는 샌드위치 분석 또는 분자 진단 형태의 분석에서 사용되고, 침지 등에 의해 코팅되는 다양한 설명의 미세 유동 엘리먼트를 사용함에 따른 내재적인 문제로서 보여질 수 있다. 일반적으로, 엘리먼트의 전체 표면을 균일하게 코팅하기 위해, 센싱 또는 검출되는 분석물질용 포획 분자인 일부 형태의 부위 또는 항체와 같은 포획제에서 엘리먼트를 침지하는 것이 소망된다. 본 발명의 하나의 목적은, 내표면 및 외표면, 또는 종종 두 말단면에 의해 특성화되는 미세길이 튜브 엘리먼트에 대한 이러한 문제를 극복하는 것이다. 포획 분자의 밀도가 코팅되는 모든 표면적의 증가는, 대략 100,000 스퀘어 미크론에 걸친 표면적까지 증가될 수 있다. 이는, 대략 200 미크론의 길이, 대략 125 미크론의 외부 직경 또는 폭, 대략 70 미크론의 내부 직경 또는 폭을 갖는 미세길이 튜브의 바람직한 형태의 경우이다. 여기서 언급하는 특정 문제는, 침지-코팅된 유동 분석 엘리먼트, 일반적으로, 특히 미세 유동 엘리먼트, 특히 미세길이 튜브 엘리먼트의 활성 면적을 정확히 감소시키는 것에 대한 실질적인 접근을 발견하는 것이다.
여기서 언급하는 다른 문제는, 샘플의 유동을 노출하기 위해 채널에서 고정된 위치가 될 처리된 미세 유동 엘리먼트에 관한 것이다. 엘리먼트 표면에 포획제 또는 항체를 적용한 후, 채널에서, 예컨대 멀티플렉스 미세유체 "칩"(또는 "카셋")의 채널에서 그 고정된 위치에 기계적으로 각각의 엘리먼트를 이동시키는 고정화 공정에 자유로운 상태에서 배치에 엘리먼트를 노출하는 것이 바람직하다. 빠르고 정확한 플레이싱 공정, 예컨대 정밀 X, Y 스테이지에서 마운팅되는 픽 앤 플레이스 장치를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 표면으로부터 그것을 픽킹하고 개방 채널에서 그것을 플레이싱하기 위해 작은 엘리먼트를 물리적으로 접촉한 후, 미세유체 경로를 형성하기 위해 폐쇄되는 것이 바람직하다. 장치의 외부면과 접촉하는 트위져 기기와 같은 그리퍼(gripper)를 적용하는 것이 바람직하다. 픽 앤 플레이스 조작은, 자유로운 엘리먼트가 자동 픽 앤 플레이스 기기에 공급되는 표면 및 미세 유동 엘리먼트를 수신(receive)하기 위해 개방 채널을 미리 얼라이닝함으로써 가능해진다. 이는, 그리퍼가 이들이 고정될 바람직한 유동 채널 위치에서 미세 유동 엘리먼트를 정확하게 픽업하고 플레이싱하게 할 수 있다. 문제는 엘리먼트의 외표면 상에 고정화되는 항체와 같은 활성 포획제를 갖는 것에서 발생한다는 것을 알았다. 이러한 코팅은, 기계적 조작 공정의 결과로 기계적 손상에 민감하다. 미세 유동 엘리먼트의 외부면은 (a) 공급면, 예컨대 얼라인된 포켓 또는 홈, (b) 이동하는 그리퍼, 및 (c) 그것이 증착되는 채널의 표면과 접촉하게 된다. 이들 접촉 기회 모두는, 일반적으로 유동 엘리먼트의 표면에 흡수되는 항체 등의 초박층인, 약한 코팅된 포획제에 손상을 발생시킬 수 있다. 이러한 코팅은 종종 단지 약 나노미터 또는 수십 나노미터의 두께의 몇 분자 두께이고, 매우 약하다. 위치된 미세 엘리먼트의 포획 표면의 손상의 최종 결과는 분석에서 리딩 동안 보여진다. 포획된 분석물질의 불규칙적인 농도 또는 제시를 일으킬 수 있는 임의의 방법으로 표면이 스크래치되거나 동요되는 경우에, 시그널은 불규칙해질 수 있고, 분석을 재생할 수 없거나 수행이 불량해지게 한다.
따라서, 손상에 민감하고, 소모에 기여하는 포획제 또는 항체의 총 표면적의 증가에 기여하는 미세 유동 엘리먼트, 특히 미세길이 튜브 엘리먼트의 외표면 상에 고정화된 활성 포획제를 갖지 않는 것이 바람직하다는 것을 알았다.
청구항 및 이하에 설명되는 특징은, 이러한 그리고 다른 중요한 문제를 다룬다.
개별의 미세 유동 엘리먼트는 항체 또는 항원과 같은 포획제를 함유하는 액체에 침지되고, 액체에 의해 코팅된 후 유동-통과 분석용 채널로 픽 앤 플레이싱된다. 미세 유동 엘리먼트는 약 700 ㎛ 미만의 길이, 70 ± 50 미크론의 보어 직경의 미세 유동 엘리먼트로 정의되는 개별의 미세길이 튜브의 형태가 바람직하다. 유동 엘리먼트는 포획 항체와 같은 활성 포획제로 표면 처리되고, 외측은 아니거나 외측 면적에 한정된다. 이러한 효과를 위해, 중공 유동 엘리먼트는 활성제의 베스에 배치되고, 격렬하게 교반되어, 보호된 내부면의 코팅을 야기하지만, 극심한 전단력에 기인하여 예컨대 라운드된 단면 개별의 엘리먼트의 전체 외측 원통면과 같은 외표면 상의 클린한 면적을 야기한다. 이러한 전단 절차 대신에 또는 이에 추가하여, 특별한 필라멘트-제조 공정이 도출되어, 소정의 포획제를 갖는 유동 엘리먼트의 외부면을 코팅하는 것을 억제하는 것을 야기한다. 선택된 코팅 면적 상의 포획제는, 다수의 엘리먼트의 동시 처리를 위한 마스크에 의해 제조되어, 미세 유동 엘리먼트의 내부면 상에 정의된 면적의 잔여 활성제를 남길 수 있는 것(leaving)과 같이 정확하게 위치된 레이저 빔으로 제거 또는 비활성화된다. 엘리먼트의 내부에 잔여 포획제는 일반적으로 필요한 분석에 관련된 리딩 가능한 코드로 정의된다. 유동 채널 형태는 (a) 제1엘리먼트가 막히는 경우에 채널에 엘리먼트를 도달 및 플러싱하기 위해 미세 유동 엘리먼트의 노출된 외측을 따라 바이패스 채널 유동과 함께, (b) 포획제 및 다른 분석 액체에 표면을 노출하기 위해 미세 유동 엘리먼트를 통해 샘플 및 분석 액체 유동을 시키는 채널 내에 고정된 유동 엘리먼트에 비례하여 치수가 달라진다. 외측을 밀봉하려는 시도의 필요성의 부족으로, 엘리먼트는 엘리먼트에 대해 가압된 엘라스토머 시트에 의함으로써 단순히 그리핑될 수 있다(Lacking the need to attempt to seal the outside, the element can simply be gripped, as by an elastomeric sheet pressed against the element.). 유동 엘리먼트와 채널 벽 사이의 정전기적 인력은, 엘리먼트의 전달 후 드로잉되기 때문에 플레이싱 기기의 임의의 기파력을 극복하는 위치에 엘리먼트를 고정하도록 적용된다. 분석 후, 형광은 미세 유동 엘리먼트 기하학으로 국한되는 특별한 스캐닝에 의해 여기 및 리딩된다. 로케이터(Locator)는 리코딩되는 데이터에 시딩되고, 미세길이 튜브와 같은 검출된 형광 데이터에서 관심있는 영역을 위치하기 위해 사용된다. 미세 유동 엘리먼트 내부에 포획제 물질로 읽히는 코드는 엘리먼트의 투명벽을 통해 리딩된다. 효율적인 어셈블리 및 도구적 특징이 개시된다. 모든 특징은 이들의 효율적인 사용을 가능하게 하는 미세길이 튜브에 적용 가능하다. 많은 특징은 예컨대 더 긴 미세 유동 엘리먼트의 다른 중공 엘리먼트에 유용한 것이 발견된다.
스캐닝에 대해서, 본 발명의 목적은 미세유체 칩에 함유된 다중 고정화된 엘리먼트의 형광 측정을 수행하기 위한 방법을 전달하는 것이다. 이러한 방법은, 스캐닝, 적절한 포커스 및 카메라 노출 동안 이어질 경로를 결정하기 위해 제공한다. 이러한 방법은 공지된 일반적인 칩 레이아웃에 근거한다. 제공된 방법은 스캐너로 측정할 칩을 플레이싱한 후 요구되는 임의의 추가적인 메뉴얼 세팅 없이 스캔을 시작하기 위한 능력을 야기한다. 이러한 방법은 나머지를 하고, 결과적으로 소망되는 형광 측정을 제공한다.
본 발명의 소정의 실시형태는 진동되지 않는 내부면 또는 소망되는 면적 또는 패턴 상에 활성 포획제를 남기지만(leaving), 미세유체 엘리먼트의 외부면, 예컨대 연장된 원통형 외표면 및/또는 말단면 상에 활성 포획제의 발생을 제거 또는 억제하는 것을 포함한다. 이러한 실시형태에서 다루는 특징은, 바람직한 결과를 얻기 위해 외부면 및 내부면과 함께 조작하는 단계 및 내부면 상의 포획제를 선택적으로 제한하기 위한 기술을 포함한다.
전체 포획 면적을 감소시키는 특정 이점을 위해, 본 발명의 2가지 실시형태는 우선 기술되고, 이들의 조합의 효과가 기술된다. 첫번째 기술은 중공 유동 엘리먼트, 특히 미세길이 튜브 엘리먼트의 외표면에 고정화하는 것으로부터 항체와 같은 포획제를 제거 또는 억제하기 위해 적용된다. 이는 배치 코팅 공정 동안 행해지고, 엘리먼트의 외부면에 파괴 전단력을 부여하기 위해 관심 있는 포획제를 갖는 에펜도르프 튜브 또는 다른 튜브에, 개별의 중공 엘리먼트, 특히 미세길이 튜브 엘리먼트를 현탁하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 이는, 예컨대 약 25 mm의 직경의 지지 시프트의 오비탈 경로, 오비터의 약 2000 rpm에서 용기의 궤도를 돌게하는 기기를 적용하여, 고속으로 유체를 볼텍싱(Vortexing)함으로써 수행된다.
마이크로튜브 엘리먼트는 항체와 같은 포획제의 밀리리터와 같은 체적으로 플레이싱된다. 적절한 볼텍싱 속도는 예컨대 선택되는 액체의 점도와 같은 현탁액의 특성에 따라 달라지고, 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 포획제가 외측, 미세길이 튜브 엘리먼트의 긴 면, 예컨대 바디가 원형 단면이 되는 경우 원통형 외표면에 효율적으로 실재하지 않는지를 관찰함으로써 정해진다.
관련된 물리적 원리는 흡수 공정을 통해 표면에 포획제의 결합을 억제하도록 작용하는 미세길이 튜브 엘리먼트의 외표면 상의 전단력에 관련된다. 격렬한 교반이 그 표면에 결합되는 항체와 같은 임의의 포획제를 전단하기에 충분한지 관측할 수 있다. 그때, 내부면은 관모양인, 미세 사이즈의 튜브의 보어인 기하학 덕분에 이러한 전단으로부터 환경적으로 보호된다. 이는 볼텍싱이 엘리먼트 내에서 일어나도록 임의의 격동을 야기하는 것을 억제한다. 단지 라미네이트 유동 조건이 존재한다. 마이크로 보어 엘리먼트를 사용하여, 레이놀드 수(Reynolds number)는 항상 층상(laminar) 유동 조건이 내부면 상에 존재하게 하도록 충분히 적다. 이러한 조건 하에서, 내부 벽 계면에서 미세길이 튜브 엘리먼트 내에 횡단하는 유체의 속도는 당연히 0이다. 따라서, 여기에 관련된 전단력은 없지만, 외측은 매우 격렬하고, 높은 전단력 환경이다.
강한 교반, 예컨대 볼텍싱의 관측 결과는, 샌드위치 분석을 수행함으로써 얻어지는 형광은 미세길이 튜브 엘리먼트의 외측 원통면에 완전히 없지만, 내부면 상에 식별 가능한 방법으로 존재한다는 것이다. 스퀘어 말단 미세길이 튜브 엘리먼트의 경우에, 형광은 엘리먼트의 말단면에 존재한다.
볼텍싱은 현재 전단력을 생성하기 위한 바람직한 기술이다. 여기에 나타낸 경우는 분당 약 2천번 회전 속도, 약 25 mm의 편위(excursion)로 작은 원으로 앞뒤로 매우 빠른 방법으로 미세관을 궤도를 돌도록 회전하는 것을 적용한다.
그러나, 높은 정도의 격동을 만드는 임의의 형태의 빠른 진동이 적용될 수 있어, 앞뒤로 움직이는 모션, 원형 회전, 매우 빠르게 유체를 혼합하고 고 전단력을 생성할 수 있는 어느 것이면 충분할 것이다.
요약에서, 강한 교반이 존재하는 미세길이 튜브 엘리먼트는 엘리먼트의 외표면으로부터 항체와 같은 포획제를 제거시키고, 포획제로의 코팅을 억제하지만, 샘플의 분석물질과 이후 상호작용을 위해 포획 항체와 같은 포획제를 고정화하는 조건으로 미세길이 튜브 엘리먼트의 내부면에 남는다.
고전단 기술의 대안으로서, 작은 보어 튜브의 원래의 드로잉(drawing) 동안, 보통의 제거 가능한 보호적 폴리머 코팅이 필라멘트에 적용되고, 비점착 코팅, 예컨대 스퍼터링된 금, 은 또는 그래파이트가 스퍼터링 챔버를 통해 통과시킴으로써 필라멘트에 적용되는 드로잉 경로(draw path)를 따르는 시점 전에, 다른 공정을 도출한다. 실란 또는 유사 코팅은 예컨대 항체와 같은 포획제가 부착되기 전에 수신면에 적용되어야 한다. 그러나, 스퍼터 코팅 등의 특성에 기인하여, 표면은 실란 또는 등가물, 마찬가지로 활성 포획제를 수신하지 못할 수 있다.
본 발명의 다른 특징은 내부면의 다른 부분 또는 경계 부분 및 유동 엘리먼트의 선택된 말단 표면으로부터 코팅된 포획제를 제거하는 기술 및 바람직한 상황을 실현화하는 것에 관한 것이다. 바람직하게는, 강한 교반 교반 공정 후에, 미세길이 튜브 엘리먼트는, 포획제가 고전단 공정에 의해 제거되지 않는 표면으로부터 항체와 같은 포획제를 제거 또는 비활성화시키는 레이저 제거 공정을 이용하여 더 가공된다. 이러한 면은, 샘플로부터 분석물질의 소모를 감소하기에 충분히 작지만, 분석을 가공하는데 충분히 사이즈 조정된 내부면 상에 고리 모양의 스트라이프만 남기고 내부면의 선택된 부분 및 횡단 말단면을 포함한다.
바람직한 형태에서, 제거 레이저는, 충분히 평행 방사 및 그 말단면이 정의되는 투명 물질에 의해 방사의 내부 반사 산란의 조사의 결과로, 에너지가 그 말단면에 평행하게 도달하는 효과가 그 말단면 상에 있는 포획제에 무효화 또는 제거 효과를 갖는 미세길이 튜브 엘리먼트의 연장축에 횡단하여 배열된다.
신규 조합이 사용되는 경우에, 기재되는 2개의 신규 공정의 전체 효과는, 미세길이 튜브 엘리먼트의 내표면 상에 고정화되는 포획제의 작아질 수 있는 선택된 치수의 밴드만이 남게 되는 것이다. 이는 포획제 없이 공간에 의해 분리되는 하나 이상의 밴드를 남게 하는 방법으로 행해질 수 있다. 따라서, 중앙에 단일 밴드 또는 미세길이 튜브 엘리먼트의 길이 방향으로 분산되는 하나의 말단 또는 다중 밴드에 가까이에 단일 밴드가 생성될 수 있다. 이러한 밴드는, 다른 폭을 가질 수 있고, 다른 공간을 가질 수 있고, 특정 유동 엘리먼트, 예컨대 미세길이 튜브 엘리먼트를 인코딩하는데 유용한 바코드와 같은 코드의 형태일 수 있다.
중요한 신규 특성을 갖는 제조 기술이 더 설명된다.
미세길이 튜브 엘리먼트는 이전에 공급된 연속된 작은 보어 필라멘트로부터 짧고, 개별의 미세길이 튜브 엘리먼트로 커팅, 즉 촙드된다. 그 후, 이들은 배치 방법으로 처리된다.
그 후, 미세길이 튜브 엘리먼트의 벌크는 버퍼를 세정하기 위해 에펜도르프 튜브에 노출된다. 세정 공정이 수행된 후, 버퍼는 제거되고, 실란으로 대체된다. 이러한 단순한 저비용 침지 단계에 의해, 실란은 미세길이 튜브 엘리먼트의 표면 전체에 결합된다. 일정 기간 후 과도한 실란은 버퍼 중 물로 세정된다. 그 후, 용액 중 항체와 같은 포획제는 미세길이 튜브 엘리먼트의 벌크와 에펜도르프 튜브에 첨가되고 밤새 배양된다. 배양은 1센티미터 직경의 오비탈 모션을 이용하여 분당 2000번의 회전으로 약 16시간 동안 오비탈 보텍서 상에서 수행된다. 많은 에펜도르프 튜브를 함유하는 오비탈 플레이트는 약 6인치의 직경이지만, 오비탈 모션은 원형 패턴의 시계 반대 방향으로 회전된 후, 약 2센티미터의 직경의 원형 패턴으로 시계 방향으로 회전된다.
볼텍싱 공정이 완료된 후, 전체 결과는 포획제는 미세길이 튜브 엘리먼트의 내부면 및 말단면에 고정되지만, 관형 엘리먼트의 원통형 외표면 상에 존재하지 않는 것이다. 포획제 용액은 에펜도르프 튜브로부터 제거되고, 세정 버퍼, 세정 버퍼 용액으로 대체되고, 그 후 세정 버퍼 용액은 블로킹 버퍼라고 불리는 안정화 버퍼로 대체된다. 바람직한 실시형태에서, StabilCoat® 용액이라고 불리는 시판 물질이 사용된다.
StabilCoat® 블로킹 용액은 미세길이 튜브 엘리먼트와 함께 에펜도르프 튜브에 도입된 후 엘리먼트의 부분이 StabilCoat®의 일부와 함께 피펫에 흡입되고 얼라인먼트 플레이트 상에 디스펜싱된다. 얼라인먼트 플레이트는, 작은 공간, 바람직하게는 미크론 사이즈로 허용 오차가 있는 미세길이 튜브 엘리먼트와 포켓의 벽 사이에 10 내지 50 미크론의 공간 내에 단일 미세튜브 엘리먼트를 각각 맞추고 배치하도록 배치된 일련의 직사각 형태의 포켓을 함유한다. 엘리먼트가 플레이트 상에 돌아다니도록 한 후, 이들은 버퍼 용액의 존재 하에 이러한 포켓으로 떨어진다. 과도한 버퍼 용액은, 엘리먼트를 갖는 그 플레이트를 원심분리기 또는 원심분리기 홀더로 플레이싱하고, 30초 동안 약 2천 rpm에서 원심분리하여 미세길이 튜브 엘리먼트 및 플레이트로부터 과도한 모든 StabilCoat® 용액을 제거함으로써 미세길이 튜브 엘리먼트를 함유하는 얼라인먼트 플레이트로부터 제거된다. 이러한 공정은, 배수 채널이 포켓으로부터 방사상으로 연장되는 것이 도시되는 플레이트의 신규 디자인에 의해 이용 가능해진다.
미세입자 상에, 특히 중공 유리 미세 입자 엘리먼트의 내부에 포획제로 작용하기 위해 고정화된 항체 또는 다른 활성 생물학적 종을 형성한 후, 본 발명에 따라 미세유체 장치의 채널에 기능화된 미세입자를 이동하는 공정은 많은 중요한 단계를 포함한다. 외측에 몇 미크론 두께의 폴리아미드 보호 코팅을 갖는 70 미크론 ID, 약 125 미크론 OD의 연속 모세관의 긴 스풀은 제조업체로부터 입수한다. 일반적으로 이들은 매우 연마되고 정확하게 치수화된 내부면 및 외부면을 갖는 섬유와 같은 필라멘트로 드로잉(drawn)된다. 스풀은 타이트한 단층 랩핑 방법으로 맨드릴 상에 리와인드되어, 맨드릴에 와인딩된 각각의 턴 또는 가닥은 인접한 가닥과 접촉된다. 랩핑된 일련의 가닥은 예컨대 100가닥으로 이루어진다. 그 후, 가닥이 어셈블리된 유닛에 포획되는 것에 의해 접착 테이프로 랩핑된다. 그 후, 테이프는 맨드릴 축과 평행하게 슬릿팅되고, 제거된 테이프는 이들과 함께 가닥에 제공한다. 이는 서로 밀접하게 접촉하는 모노필라멘트의 얇은 선형 배열을 제공한다. 모노필라멘트의 상대적으로 긴 배열은 웨이퍼 다이싱 소(박형 세라믹 웨이퍼를 다이싱하기 위한 반도체 산업에서 사용되는 것)에 제공된 후, 필라멘트는 약 250 미크론의 반복 거리에서 다이싱되어 그 길이의 원통 관형 미세 입자를 제조한다.
다이싱 공정 후, 테이프 상에 여전히 남아 있는 각각의 미세입자 엘리먼트는 테이프로부터 각각의 엘리먼트를 유리하는 뜨거운 세제 수용액을 이용하여 유리된다. 이들을 비커의 바닥으로 침전시키고, 테이프를 용액으로부터 제거한 후, 수용액을 제거하고, 유리 엘리먼트의 외표면으로부터 폴리아미드 코팅을 용해하기 위해 사용되는 뜨거운 황산 및 퍼옥시드 용액으로 대체했다. 잔여 황산 용액을 제거하기 위해 탈이온수로 여러번 플러싱하는 상당한 세정 사이클이 이어진다. 중공 유리 엘리먼트는 완전히 세정된 후, 아미노프로필트리에톡시실란("실란")에 견디는 APTES와 같은 실란 시약을 이용하여 실란화되었다. 미세 입자는, 이들이 린싱되고 오븐에서 경화된 후 약 한 시간, 에탄올 용액에서 저장된 후 또 다른 한 시간 동안 배양되었다. 실란이 관형 미세 입자의 내부면에 도달한 것을 보증하기 위해, 격렬한 볼텍싱이 중공 엘리먼트의 외측에 실란을 균일하게 분산시키기 위해 사용되었다. 그 후, 미세 입자는, 관심 있는 포획 분자, 예컨대 포획 항체를 함유하는 시약 용액에 이동되었다.
이러한 목적을 위해서, 실란화된 미세입자는 포획제, 예컨대 포획 항체를 함유하는 유리병으로 전달된다. 포획 항체는, 세정 사이클이 임의의 느슨하게 바운딩된 포획제를 제거하기 위해 수행된 후 16 내지 24시간의 기간 동안 활성 실란 표면에 결합되고, 마지막으로 기능화된 미세입자 엘리먼트는 SurModics의 브랜드 StabilCoat®와 같은 안정화 화합물을 함유하는 다른 유리병에 전달된다. 이들은, 이들을 미세유체 카트리지와 같은 미세유체 장치에 전달하는 것이 바람직할 때까지 StabilCoat® 용액에 유지된다. 이들은 사용할 준비가 완료될 때까지 냉장고에서 StabilCoat 용액으로 저장된다.
따라서, 미세 입자의 표면 또는 중공 유리 미세입자 엘리먼트의 내부면이 표면에 고정화된 활성 종을 갖도록 고정화 공정이 완료된 후, 필요할 때까지 저장을 위해, 입자는 StabilCoat(SurModics, Inc.의 상표) 과 같은 안정화 화합물에 재현탁된다. 안정화 화합물의 목적은, 미세 입자가 시약으로부터 꺼내져 대기에 노출되는 경우에 고정화된 종의 활성을 보호하는 것이다. 저장 동안 보호 코팅 없이 표면에 고정화된 항체는 분석 실행의 높은 변동 계수 때문에 그 기능이 저하되는 경향이 있고(부분적으로 변질되고), 심하면 분석의 정확도(반복성) 및 감도에 영향을 주어 정확한 정량 분석을 억제시킨다는 것을 발견했다.
안정화제는 고농도의 슈가 및 독점적 화합물(proprietary compound)로 이루어진다. 물 성분이 증발되는 경우에, 이러한 슈가계 화합물의 두꺼운 잔여물은 후에 남고, 저습도 조건 하에서 결정화하는 경향이 있고, 그것과 접촉하게 되고, 이러한 화합물 중 입자가 그것을 건조시키는 임의의 표면에 비가역적으로 부착되는 것을 야기할 수 있는 상당히 경성 구조가 될 수 있다는 것을 발견했다.
바람직한 단계에 따라, 미세 입자를 액체 상태에서 건조 상태로 이동하는 공정에서, 배열 패턴에서 미세입자를 수용하도록 구성된 포켓을 갖는 실리콘 미세-기계로 가공된 플레이트와 같은 미세-기계로 가공된 홈이 있는 포켓 플레이트와 같은 얼라인먼트 플레이트 상에 보호 코팅 용액, 예컨대 StabilCoat 중 미세 입자를 디스펜싱하는 것을 포함한다. 성형된 포켓은, 예컨대 모세관의 짧은 세그먼트가 중공 미세입자 엘리먼트를 형성하는 경우에 직사각형이다. 과도한 액체 화합물은 원심분리기에서 분리되거나 흡수체 패드를 이용하여 위킹되고, 예컨대, 중공 유리 미세입자 엘리먼트 내부 및 엘리먼트를 포획하는 포켓에 엘리먼트의 외측에서 미세입자에 대해 보호 화합물의 소량의 잔여물을 후에 남긴다.
상대 습도가 약 60% 미만인 상대 습도의 환경에서 안정화 화합물을 건조시키는 것은, 포켓으로 엘리먼트를 결합한 슈가 결정 구조를 통해 미세입자를 유지하는 유해한 효과를 갖는다는 것을 발견했다. 미세유체 장치의 채널에 미세입자를 플레이싱을 위해 픽 앤 플레이스 공정을 가능하게 하는 물의 점도 근처에 점도가 도달되는 점까지 55 내지 60% 또는 그 이상의 상대 습도를 유지하는 것은 안정화 화합물을 부드럽게 한다(수화된다)는 것을 발견했다. 이러한 조건 하에서, 포획 포켓 밖으로 미세입자를 잡고, 최종 목적지, 미세유체 장치의 미세유체 채널에 이들을 플레이싱 하기 위해 자동 트위져 또는 진공 픽킹 헤드를 사용할 수 있다.
미세입자의 어셈블리의 단계는 이하에 요약된다.
어셈블링하기 위한 준비가 완료되는 경우, 미국 출원 제 61/608,570 및 13/427, 857에 이미 개시된 픽 앤 플레이스 기술이 미세입자가 홈이 있는 로케이터 플레이트에 플레이싱하는 것에 적용된다.
그러나, 이러한 것이 행해질 수 있는 다른 방법이 있다. 이는 홈 또는 얼라인먼트 포켓을 갖지 않는 평평한 표면 상에 임의의 방법으로 미세 입자를 분산시키는 것을 포함한다. 이 공정의 이점은 제조 공정을 위해 미세 기계로 가공된 성분을 필요로 하지 않는 것이다. 단점은, 미세 입자가 더미 내에 임의적으로 분산되는 것이다. 이들에 임의의 배향이지만 표면 상에 단층에 남게 되는 경향이 있다. 또한, 과도한 안정화 용액을 원심분리 또는 위킹함으로써 과도한 StabilCoat를 제거한 결과, 미세 입자가 임의로 배향된 엘리먼트의 밀도 높은 팩으로 뭉쳐지는 경향이 있다.
용액에 이러한 문제가 존재한다는 것을 깨달았다. 개별 미세입자는, 개별 엘리먼트를 확인하기 위해 사용되는 비전 시스템과 X와 Y 좌표 및 각이 진 배향에서 진공 픽업 팁 및 미세입자의 상대적인 관계를 배향하는 비젼 시스템에 빠른 반응을 보이는 모션 시스템을 조합하여 엘리먼트의 상부면을 연결하는 진공 팁과 같은 플레이싱 도구를 사용함으로써 이러한 밀도 높은 팩으로부터 픽킹될 수 있다. 플레이싱 도구는, 하나의 측벽에 대해 GNR을 가져오는 채널 내에 약하게 측면으로 분 이동으로 이동될 수 있다. 바람직하게는, 유동층, 바람직하게는 채널을 사이드 업으로 옮기는 테이블은 컴퓨터 제어된 X, Y 및 Z로 움직이고, 플레이싱 도구는 정지되고, 컴퓨터 통제 하에 그리퍼(예컨대 트위져)만 이동한다.
CyVek는, 개방된 측 채널을 갖는 이러한 유체 성분이 유연한 멤브레인에 결합하기 위해 거꾸로 돌려지기 전에 개방 채널에서 미세 입자를 일시적으로 고정한다. 멤브레인은 어셈블리를 완성하기 위해 카트리지의 공압 성분에 의해 전달된다.
현재 이는 더 큰 폭(over-width), 더 작은 깊이(under-depth) 개방 미세 채널에서 행해진다. 정전기적 인력은 플레이싱 도구(도구가 철수되는 것을 가능하게 하는 것)로부터 GNR을 드로잉하고, 어셈블리가 멤브레인에 대해 결합하기 위해 뒤집힐 수 있는 충분한 확실성을 갖는 오버 사이즈 채널의 일측에 대해 이들을 홀딩한다. 그 후 정전기적 압축성 멤브레인의 압축력은 위치에서 영구적으로 GNR을 고정한다.
오버 사이즈 패널의 일측에 대해 측면으로 이동하기 위해 플레이싱 도구가 필요 없는 다른 기술이 고려된다. 이 경우에, 탄력있는 PDMs(실리콘 고무) 채널-정의층에서 개방 채널은 약간 폭이 적고, GNR에 상대적으로 깊이가 오버 사이즈될 수 있다.
이러한 경우에, 플레이싱 도구는 GNR을 채널로 압력 맞춤으로 하여 밀고(thrust), 채널측은 GNR에 수용되기 위해 약간, 탄력 있게 변형된다. 그 후, 채널측은 미세입자를 타이트하게 잡는다. GNRs은 채널로 너무 깊게 밀려, 유체층의 표면(face plane) 아래로 잠길 수 있다.
그 후, 최종 어셈블리가 진행된다: 유체층은 거꾸로 돌려지고, 이러한 위쪽을 보는(up-facing) 멤브레인과 결합된다.
일반적인 시스템에서, GNRs은 예컨대 외측 직경, 예컨대 125 미크론, 내측 직경 70 미크론, 길이 250 미크론인 모세관의 짧은 세그먼트이다.
일례에서 수용하는 미세유체 채널은 미세입자보다 (독특하게) 넓고, 더 얇다. 성공적인 플레이싱은, 플레이싱 기기로부터 미세입자를 끌어당기고, 오버 사이즈 채널을 거꾸로 돌리는 것과 관련되는 어셈블리 공정의 완료 동안 이들을 위치에 유지하기 위해, 실리콘 고무(PDMS, 전기 절연 물질)와 관련된 정전기력에 따라 달라진다. 이러한 경우에, 미세입자의 올라간 상부면의 부위에 멤브레인의 커버링의 정전기적 변형은 미세입자의 위치를 영구적으로 고정시킨다.
다른 기술에서, 미세유체 채널은 미세 입자 폭에 대해 가로로 사이즈가 작아지고, 플레이싱 도구는, 채널의 측면을 형성하는 엘라스토머 물질에 의해 기계적인 그립을 얻기 위해 채널로 미세 입자에 힘을 가한다. 다시, 미세유체 채널은 미세 입자 미만의 깊이를 가질 수 있어, 멤브레인은 그 위치를 더 고정하기 위해 늘어진다. 다른 예로, 채널 깊이는 미세 입자의 깊이를 초과할 수 있고, 플레이싱은 입자를 아래로 잠기게 하여 오버라잉 멤브레인은 미세 입자의 존재에 의해 국부적으로 분산되지 않는다.
미세 입자 상에, 특히 중공 미세 입자 엘리먼트(미세길이 튜브 엘리먼트)의 내부에 고정화된 항체 또는 다른 활성 분석 포획제를 형성하는 신규 공정은 특정 실시예를 참조함으로써 설명될 것이다. 이후에, 미세유체 장치 내에 가공되는 위치에, 예컨대 미세유체 채널에 기능화된 미세입자를 새롭게 전달하는 예가 이어진다.
미세길이 유리 튜브 엘리먼트의 바람직한 경우에서, 외측 상에 몇 미크론의 두꺼운 폴리아미드 보호 코팅을 갖고, 약 125 미크론 OD, 70 미크론 ID의 연속 유리 모세관의 긴 스풀은 제조업체로부터 입수된다. 일반적으로, 이들은 매우 연마되고 정확하게 치수화된 내부면 및 외부면을 갖는 섬유와 같은 필라멘트로 드로잉(drawn)된다. 스풀은 타이트한 단층 랩핑 방법으로 맨드릴 상에 리와인드되어, 맨드릴에 와인딩된 각각의 턴 또는 가닥은 인접한 가닥과 접촉된다. 랩핑된 일련의 가닥은 예컨대 100가닥으로 이루어진다. 그 후, 가닥이 어셈블리된 유닛에 포획되는 것에 의해, 가닥은 접착 테이프로 그 외측 상에 랩핑된다. 그 후, 테이프는 맨드릴 축과 평행한 한 점에서 슬릿팅되고, 가닥을 갖는 테이프는 제거된다. 이는 서로 밀접하게 접촉하는 모노필라멘트의 얇은 선형 배열을 제공한다. 그 후, 모노필라멘트의 상대적으로 긴 배열은 웨이퍼 다이싱 소(박형 세라믹 웨이퍼를 다이싱하기 위한 반도체 산업에서 사용되는 것)에 제공된다. 필라멘트는 약 1000 미크론 이하의 반복 거리에서 다이싱되어 미세길이 튜브 엘리먼트를 제조한다. 그 길이의 원통 미세길이 유리 튜브 입자를 제조하는, 바람직한 반복 거리는 700 미크론 미만이고, 더욱 바람직한 예는 약 250 미크론이다. 약 나노리터의 내부 체적을 갖는 이러한 튜브를 "유리 나노 리엑터" 또는 "GNR"이라고 한다.
다이싱 공정 후, 테이프 상에 여전히 남아 있는 각각의 미세길이 입자 또는 엘리먼트는 뜨거운 세제 수용액을 이용하여 테이프로부터 유리된다. 이들을 비커의 바닥으로 침전시키고, 테이프는 용액으로부터 제거된다. 그 후, 수용액은 제거되고, 유리 엘리먼트의 외표면으로부터 폴리아미드 코팅을 용해하기 위해, 뜨거운 황산 및 퍼옥시드 용액으로 대체되었다. 잔여 황산 용액을 제거하기 위해 탈이온수로 여러번 플러싱하는 상당한 세정 사이클이 이어진다. 중공 유리 엘리먼트는 완전히 세정된 후, APTES(아미노프로필트리에톡시실란, "실란")과 같은 실란 시약을 이용하여 실란화되었다. 미세 입자는 약 1시간 동안 실란 용액에서 배양되었다. 실란이 관형 미세 입자의 내부면에 도달한 것을 보증하기 위해, 실란 코팅을 형성하도록 그 내부에 실란을 균일하게 분산시키기 위해 격렬한 볼텍싱이 사용되었다. 그 후, 미세길이 튜브는 세정되고, 이들이 에탄올 용액에 저장된 후 1시간 동안 오븐에서 경화되어 기능화될 준비가 되었다(즉, 관심 있는 포획 분자, 예컨대 포획 항체를 표면-고정화시키도록 처리되었다).
기능화를 위해서, 실란화된 미세입자는 포획제, 예컨대 포획 항체를 함유하는 유리병으로 전달된다. 다시, 포획제가 관형 미세 입자의 내부면에 도달하는 것을 보증하기 위해, 격렬한 볼텍싱이 사용되고, 내표면의 길이에 걸쳐 포획제의 실질적으로 균일한 고정화를 생성하기 위해 미세길이 입자의 관형 내측에 포획제를 실질적으로 균일하게 분산시킬 수 있는 것이 발견된다. 이러한 조건 하에서, 포획 항체는 16 내지 24시간의 기간 동안 활성 실란 표면에 결합된다. 유리하게, 여기에 더 설명되는 바와 같이, 공정의 볼텍싱 조건은 격렬하게 교반된 미세길이 입자의 세로로 연장된 외표면에 포획제의 고정화가 일어나는 것을 억제한다.
중공 엘리먼트의 내부면이 고정화된 활성 종의 실질적으로 균일한 코팅을 전달하는 고정화 공정이 완료된 후, 기능화 미세 입자 엘리먼트응 트랜스퍼에 의해 다른 유리병으로 재현탁된다. 유리병은 SurModics 상표 StabilCoat™와 같은 안정화 화합물을 함유한다. 저장 동안, 보호 코팅 없이 표면에 고정화된 항체 또는 다른 생물학적 포획제는 분석 실행의 높은 변동 계수 때문에 그 기능이 저하되는 경향이 있다(부분적으로 변질되고)는 것을 발견했다. 이는 다양한 분석의 정확도(반복성) 및 감도에 심각한 영향을 줄 수 있고, 따라서 바람직한 정도로 정량화를 억제한다. 따라서, 안정화 화합물의 목적은, 미세 입자가 시약 밖으로 꺼내지고, 주변 조건에 노출되는 경우에 고정화된 종의 활성을 보호하는 것이다.
기능화된 미세길이 튜브 엘리먼트는 사용할 준비가 완료될 때까지, 즉 미세유체 카트리지와 같은 미세유체 장치 내에 건조 상태로 이들이 전달되는 것이 바람직할 때까지 냉장고에서 저장되는 안정화 용액에 남아 있다.
바람직한 단계에 따라, 미세 입자를 액체 상태에서 건조 상태로 이동하는 바람직한 단계는, 미세유체 채널에서 이후 픽 앤 플레이싱을 위한 미세 입자를 제공하기 위해 소위 "픽업 플레이트" 상에 StabilCoat와 같은 보호 코팅 용액에 미세길이 입자를 디스펜싱하는 것을 포함한다. 픽업 플레이트의 바람직한 예는, 배열 패턴에서 개별 미세입자를 포획하도록 구성된 포켓을 갖는 미세-기계로 가공된 홈이 있는 로케이터 플레이트, 바람직하게는 실리콘 미세-기계로 가공된 플레이트와 같은 포켓이 있는 로케이터 플레이트이다. 성형된 포켓은, 예컨대 모세관의 짧은 세그먼트가 중공 미세입자 엘리먼트(미세길이 튜브)를 형성하는 경우에 직사각형이다. 과도한 액체 화합물은 여기에 기재된 바와 같이 원심분리기에서 분리되거나 흡수체 패드를 이용하여 위킹된다. 이들 기술은, 예컨대 중공 유리 미세입자 엘리먼트 내부 및 엘리먼트의 외측, 즉 엘리먼트를 포획하는 포켓에서 미세입자에 대해 보호 화합물의 소량의 잔여물을 후에 남긴다. 평면 픽업 플레이트를 이용하는 것으로 이후에 기재된 경우에는, 엘리먼트가 디스플레이되는 평면 상에 구멍 내에 엘리먼트와 함께 소량의 잔여물이 남는다. 대량 생산에서, 픽업 플레이트에 미세 입자를 적용한 후, 미세유체 장치로 설치 전에 플레이트 및 입자를 저장하는 것이 일반적으로 바람직하다.
상대 습도가 약 55% 미만인 상대 습도의 환경에서 안정화 화합물을 건조시키는 것은, 엘리먼트를 그 지지 표면에 결합하는 슈가 결정 구조를 통해 미세입자를 유지하는 유해한 효과를 갖는다는 것을 발견했다. 앞서 언급한 바와 같이, 안정화 시약은 고농도 슈가과 독점적 화합물로 이루어진다. 물 성분이 증발되는 경우에, 이러한 슈가계 화합물의 두꺼운 잔여물은 후에 남고, 저습도 조건 하에서 결정화하는 경향이 있고, 그것과 접촉하게 되고, 건조시키는 임의의 표면에 거의 비가역적으로 부착되기 위해 이러한 화합물에 미세 입자를 야기할 수 있는 상당히 경성 구조가 될 수 있다는 것을 발견했다.
미세유체 장치에 미세입자를 플레이싱하기 위해 픽 앤 플레이스 공정을 가능하게 하는 물의 점도 근처에 점도가 도달되는 점까지 최소 약 55%, 바람직하게는 약 60% 이상의 상대 습도를 유지하는 것은 안정화 화합물을 부드럽게 한다(수화된다)는 것을 발견했다. 이러한 조건 하에서, 포획 포켓으로부터 이들을 철수하거나 픽업 플레이트의 표면을 지지하고, 이들을 최종 목적지, 예컨대 미세유체 장치의 미세유체 채널로 플레이싱하는 것과 같이 미세 입자를 잡기 위해 자동 트위져 또는 진공 픽킹 헤드를 사용할 수 있다.
어셈블링하기 위한 준비가 완료되는 경우, 여기에 기재된 픽 앤 플레이스 기술은, 미세 입자가 트위져 또는 진공 도구에 의해 픽킹되는 로케이터 플레이트의 홈 또는 포켓에 배치되도록 적용된다.
또한, 신규 기술은 홈 또는 얼라인먼트 포켓을 갖지 않는 평면 상에 임의의 방법으로 미세 입자를 분산시키는 방법을 포함한다. 이 공정의 이점은 제조 공정을 위해 미세 기계로 가공된 성분을 필요로 하지 않는 것이다. 단점은, 미세 입자가 더미 내에 임의적으로 분산되는 것이다. 이들에 임의의 배향이지만 표면 상에 단층에 남게 되는 경향이 있다. 또한, 과도한 안정화 용액을 원심분리 또는 위킹함으로써 과도한 StabilCoat를 제거한 결과, 미세 입자가 임의로 배향된 엘리먼트의 밀도 높은 단층 농도로 뭉쳐지는 경향이 있다는 것을 관측했다. 그러나, 용액에 이러한 문제가 존재한다는 것을 깨달았다. 개별 미세입자는, 개별 엘리먼트 및 검출된 이미지로부터 배향을 확인하기 위해 사용되는 컴퓨터 통제 비전 시스템과, X와 Y 좌표 및 각이 진 배향에서 진공 픽업 팁과 미세입자를 지지하는 플레이트의 상대적인 관계를 배향하는 비젼 시스템에 반응을 보이는 모션 시스템을 조합하여, 여기서 앞서 기재된 것 같은, 엘리먼트의 상부면을 연결하는 자동 진공 팁을 이용함으로써 이러한 밀도 높은 농도로부터 픽킹될 수 있다. 마찬가지로, 자동 트위져는 여기에 기재된 바와 같이, X 및 Y 좌표 및 각이 진 배향의 제어된 모션으로 조작될 수 있다.
고정화 직후, GNR은, GNR, 예컨대 StabilCoat®의 표면 상에 캐쳐 항체를 보호 또는 안정화할 수 있는 시약에서 안정화된다. GNR은 얼라인먼트 플레이트에 전달되고, 안정화제를 갖는 구멍 내에 얼라인먼트 플레이트에 디스펜싱되고, 안정화 시약의 액체 형태는 소정의 얼라인먼트 포켓으로 GNR의 어셈블리 또는 셀프 어셈블리를 돕기 위해 사용되었다. 안정화 화합물은 매우 높은 슈가 및 염 함량을 가지기 때문에, 임의의 잔여 시약을 증발시키기 전에 GNR의 표면 근처 또는 표면으로부터 그와 동일한 액체의 질량을 제거하는 것이 바람직하다. 증발은 슈가 함량 및 염 함량의 농축을 야기하기 때문에, 결정화 공정은 이들이 제공되는 어느 표면 상에 또는 안에 GNR을 홀딩 또는 접합시키도록 일어난다. 따라서, 가능하면 많은 잔여 시약을 제거하는 것이 중요하고, 원심분리를 포함하는 기술은 상기 기재되었고, 도 10d에 도시된 바와 같이, 과도한 물질은 원심분리기 내에서 회전되고 플레이트로부터 분리되고 GNR로부터 떠나게 된다. 제조 공정을 실행하기 상당히 더 쉬운 다른 공정은, GNR을 홀딩하는 포켓과 관련된 채널의 에지에 위치된 흡수체 패드를 이용하는 것을 포함하고, 모세관 조작 공정(a capillary working process)은 흡수체 패드로 잔여 StabilCoat®를 빨아드리고, 채널을 통해 채널 밖으로, GNR로부터 떠나 채널 밖으로 드로잉되기 위해 사용된다(draw out of the channels through the channels and out of the channels and away from the GNRs).
채널의 일반적인 치수는 도 10a-c에 도시된다. 채널의 평면도는 GNR을 유지한다. GNR은 약 75-80 미크론의 폭, 200 미크론의 길이의 더 좁은 채널에 의해 서로로부터 분리된 약 125 미크론 폭, 40 미크론 길이의 포켓에 위치된다. 도는 미세튜브 1, 2 및 n으로 나타내듯이 쪼개지고, 여기서 n은 약 50만큼 클 수 있다. 더 좁은 채널은, 채널을 통해 및 GNR로부터 위킹 패드로 과도한 시약이 유동하는 것을 돕기 위해 제공되고, 이들을 나누도록 의도된 고정된 포켓 밖으로 GNR이 이주하는 것을 억제하기 위해 더 좁아진다. 채널의 길이는 일반적으로 5 밀리미터 내지 25 밀리미터의 범위일 수 있고, 포함되는 제조 공정의 스케일 또는 사이즈에 따라 혹은 75 밀리미터로 달라질 수 있다. GNR의 수는 단면적에 따라 수백 내지 수천의 범위가 된다. 채널 당, GNR의 수는 약 50이다.
도 2는 플레이트를 둘러 플레이트 상에 함유되고, 채널을 둘러싸는 구멍 StabilCoat®을 갖는 채널 내에 또는 표면 상의 GNR의 측면도이다. 안정화 용액이 가득찬 채널의 말단 쪽으로 이동하게 되는 공정의 위킹 패드를 나타낸다. GNR은 완전히 물질 아래에 잠긴다.
도 3은 채널을 통해 GNR로부터 떨어진 과도한 StabilCoat®이 드로잉되고, 플레이트의 좌측 상부면 상에 도시되는 위킹 패드를 나타낸다.
플레이트 내에 있는 동안에 미세길이 튜브 엘리먼트는 레이저, 바람직하게는 엑시머 레이저, 간격이 있는 2개의 빔을 갖는 플루오라이드 또는 크립톤 플루오라이드 레이저일 수 있는 자외선 레이저로 더 가공될 수 있어, 미세길이 튜브 엘리먼트의 말단 및 말단 경계 부위 또는 부분은 엘리먼트의 말단 및 엘리먼트의 내부면의 부분으로부터 항체와 같은 포획제를 제거 또는 변성하는 방법으로 레이저 빔에 의해 엘리먼트 축과 직각으로 노출된다. 이는, 포획 항체 표면의 남아 있는 밴드의 바람직한 폭을 정의하는 고정된 거리에 의해 2개의 레이저 빔이 분리되는 레이저 형태의 특징이다. 얼라인먼트 플레이트의 포켓 내에 미세길이 튜브 엘리먼트는 자유도를 가지고 앞뒤로 움직여질 수 있지만, 레이저는 엘리먼트의 말단을 충분히 가공하고, 엘리먼트의 중앙 부근에 합리적인 약간의 허용 오차 윈도우를 플러스 또는 마이너스하여 고정된 폭 패턴을 남긴다.
대신, 갭을 가지고 3개 이상의 일련의 레이저 빔을 정의하는 것이 가능하여, 레이저 빔들 사이에 다양한 갭으로 레이저 빔의 다양한 폭에 의해 생성되는 패턴은 보이는 관형 엘리먼트에서의 노출 패턴을 정의하고, 바코드로 유용하다.
또한, 엘리먼트를 통해, 미세길이 엘리먼트의 채널 외측에 상당한 바이패스 유동을 갖는 것이 유용하다는 것을 깨달았다. 하나의 이점은, 엘리먼트를 채널 벽에 부착하기 위해 다루기 힘든 접착제를 사용할 필요가 없고 밀봉하지 않고 엘리먼트가 고정될 수 있기 때문에 제조가 간단해진다는 것이다. 다른 이점은, 액체 유동 경로에 연속적으로 배열되는 경우에, 우연한 입자가 미세 유동 엘리먼트 중 하나의 내부 유동을 중단하기 때문에 분석을 전체적으로 망치는 것을 회피한다는 것이다. 외측 상에 상당한 바이패스 유동, 예컨대 엘리먼트를 통하는 유동보다 큰 유동을 갖는 것, 따라서 엘리먼트를 "짧게 우회하는(short circuiting)" 것은, 하나의 엘리먼트가 막히거나 중단하게 되고 유동이 멈추더라도, 다른 엘리먼트가 유동을 받을 것이고, 분석은 중단 입자에 의해 부분적으로만 영향을 받게 될 것이라는 것을 보증한다. 여기에 제시된 개념을 이용하여, 미세길이 튜브 엘리먼트의 원통형 외측 또는 그 말단면 상에 활성 포획제를 갖는 것을 피할 수 있는 것은, 소모 문제를 일으키지 않는다는 것을 또한 깨달았다. 따라서, 미세길이 튜브의 외측 원통형 표면에 포획제가 점착되는 것을 피하고, 말단을 레이저 처리하는 앞서 기재한 기술은, 기재된 바이패스 유동을 적용하는 실현 가능성에 기여한다.
도 6을 참조하면, 특히 바이패스 흐름의 고려 사항에 관해서 소모를 줄이는, 미세길이 튜브 엘리먼트의 표면을 그렇게 처리하는 일반적인 이점은 합계 A+2B+C로 나타내는 코팅 용액으로 노출되는 총 표면적을 고려함으로써 이해될 수 있고, 여기서 A는 내부 원통형 표면이고, B는 말단면이고, C는 외부 원통형 표면적이다. 설명된 개념에 따르면, 소모 면적을 의미 있는 정보를 전달하는 면적 만인 A만으로 감소시키는 것이 가능하다는 것이 지적된다. 감소는, 활성제가 제거되거나 불활성화되는 내부 원통형 표면의 경계을 처리하기 위해 레이저 빔을 적당히 사이즈 조절함으로써 연장될 수 있고, 미리 선택된 길이가 되도록 할 수 있다. 예컨대, 희석 용액에서, 분석물질의 덜 희석 용액보다 더 큰 면적을 가지는 것이 바람직할 수 있다. 상술한 바와 같이, 내부 원통형 표면의 면적의 하나 이상의 중간 영역에 포획제에 따라 작용하는 레이저를 갖고, 코드를 형성하는 것조차 가능하다. 이러한 패턴은, 활성 포획제의 상태일 경우에만 보이지 않지만, 포획 형광 라벨링된 분석물질에 의해 보이거나 광 검출이 가능하다.
상술한 바와 같이, 분석 결과에 부정적인 영향을 끼치고, 기능 효면을 손상시킬 가능성을 피하는, 미세 튜브 엘리먼트의 외표면 상에 포획제가 없는 것이 매우 중요하다. 미세길이 튜브 엘리먼트를 얼라인먼트 플레이트로부터 미세유체 장치 또는 다른 채널로 이동시킨 결과, 기능화된 표면에 손상을 야기하는 다른 하드한 표면과 외표면이 접촉하는 것이 가능하다. 그래서, 외표면에 포획 항체의 결합을 억제하는 것이 유리하고, 따라서 외측으로부터 비롯되는 포획제로부터 발생할 수 있는 시그널를 제외한다. A, B 및 C의 예로서, C는 길이 치수 약 250 미크론, 내부 직경 75 미크론, 외측 직경 125 미크론을 갖는 미세길이 튜브의 외표면적이고, C는 외표면적이 약 98,000 스퀘어 미크론이다. 말단 표면적이 두배인 B는 약 15,600 스퀘어 미크론이고, A는 내측 표면적이 약 58,000 스퀘어 미크론이다. A, 2B, 및 C는 총 약 171,000 스퀘어 미크론이다.
공정의 조합에 의해, 미세길이 튜브 엘리먼트의 외표면적 및 미세길이 튜브 엘리먼트의 말단면과 관련된 표면적을 제거하는 것이 용이하여, 총 면적의 66%를 감소시킨다. 독단적으로 작은 표면적으로 외측 면 상에 포획제의 표면적을 더 감소시키는 것이 가능하다. 예로는, 내측 75 미크론 직경 튜브의 내측에 좁은 스트라이프일 수 있고, 총 면적이 약 10,000 스퀘어 미크론이 된다.
미세유체 장치에서의 분석 주행은 엘리먼트의 내표면 상에 존재하는 다양한 포획제를 갖는 다양한 형태의 미세길이 튜브 엘리먼트를 사용할 수 있다. 예컨대, 미세길이 튜브 엘리먼트 중 하나의 형태는 항체 인터루킨-6과 관련된 포획 항체를 함유할 것이다. 다른 하나는 인터루킨-2일 수 있고, 셋째로 인터루킨-12일 것이다. 각각의 형태의 미세길이 튜브 엘리먼트 중 각각은 채널 내에 위치 또는 다양한 채널로 위치될 수 있어, 어떤 형태 또는 어떤 특정 항체가 특정 위치에서 사용되는 분석을 수행하는 때에 결정된다. 이는, 표면 상에 결합되는 형태의 미세길이 튜브 엘리먼트를 식별하기 위한 방법이다. 미세길이 튜브 엘리먼트의 특정 형태를 식별하기 위한 방법으로 위치를 이용하는 것 이외에, 다른 방법은 코드를 제공하기 위해 미세길이 튜브 엘리먼트의 길이를 따라 선택적으로 제거하거나 또는 선택적으로 항체 기능을 변질함으로써 스트라이프된 코드 패턴을 이용하여, 특정 형태를 식별하기 위해 사용된다.
레이저 빔을 이용하여 미세길이 튜브 엘리먼트 내에서 제거된 패턴을 생성하거나 제거를 하는 다양한 가능한 방법이 있다. 약 193 나노미터 내지 250 나노미터 범위의 파장은 현재 바람직하다. 하나의 가능한 방법은, 특정 폭의 단일 레이저 빔을 만든 후, 미세길이 튜브 엘리먼트를 전환한 후, 엘리먼트에 레이저의 플루엔스를 디스펜싱하고, 레이저를 끄고, 새로운 위치로 전환한 후 다른 양의 플루엔스를 디스펜싱하여 특정 관형 엘리먼트의 일부만을 제거 또는 변형하는 것이다. 상술한 바와 같은 다른 방법은, 특정 패턴을 만들기 위해 불투명한 마스크를 이용하고, 동시에 자외광으로 전체 미세길이 튜브 면적을 비추는 것이다. 또 다른 방법은 X, Y 검류계의 동시통합화된 시스템을 이용하는 미세길이 튜브 엘리먼트를 스캔하는 것이다.
코드를 라이팅하는 것 이외에, 포획제를 제거하기 위해 미세길이 튜브 엘리먼트의 말단을 단순히 스캔할 수 있다. 30-40 미크론만큼 작은 최소 배선폭은 자외 레이저로 가능하다는 것이 예상된다. 예컨대, 30 미크론의 최소 배선폭을 갖는 250 미크론 길이의 미세길이 튜브 엘리먼트는 8개의 가능한 스트라이프 존과 8개의 가능한 스트라이프 존을 생성할 것이고, 하나는 많은 패턴을 생성할 수 있다. 예컨대, 2진법 코딩 시스템을 이용하는 패턴은 총 수 28개의 조합을 생성할 것이고, 256개의 가능한 조합이 된다. 이 방법은:
단계 (1): 미세길이 튜브 엘리먼트를 제공한다.
단계 (2): 코팅을 적용하고, 제조 공정, 포획 항체의 특정한 코팅을 제공한다.
단계 (3): 미세길이 튜브 엘리먼트의 내표면 만을 코팅하는 제조공정. 이를 수행하는 2개의 신규 방법: 하나는 미세길이 튜브 엘리먼트를 함유하는 용액 내에 포획제, 예컨대 항체를 제공하고, 강한 교반 방법으로 액체를 교반하고, 엘리먼트의 외측 상에 높은 전단력을 생성하여, 미세길이 튜브 엘리먼트의 보호된 내표면 상에만 결합이 일어난다. 미세길이 튜브 엘리먼트의 내측 만을 코팅하는 두번째 방법. 교반 공정은 말단면은 아니고, 외표면 상에만 항체의 코팅을 제공할 것이다. 그래서, 말단면 상에 표면 코팅을 더 감소하는 것은 레이저 공정을 이용하는 것을 포함할 것이다. 외표면(촙드된 말단면은 제외) 상에 코팅을 억제하는 두번째 방법은, 개별 미세 유동 엘리먼트 또는 미세길이 튜브 엘리먼트를 형성하기 위해 촙핑하기 전에, 끝이 없는 미세 보어 튜브를 드로잉 및 코팅하는 단계에서의 제조 공정에 관한 것이다. 일반적인 폴리머 코팅 전에 결합-억제 코팅을 추가함으로써, 외표면의 실란화를 억제하고, 실란이 외표면에 부착하는 것을 억제하여, 표면에 부착하는 것으로부터, 많은 포획제, 예컨대 항체 및 항원에 대한 능력을 격파한다. 이는 외표면에 항체가 결합되는 것을 더 억제한다. 각각의 경우에, 폴리머 코팅은 유리 필라멘트의 고유한 강도를 유기하기 위해 제조 공정 동안 유리 필라멘트에 첨가된다. 미세길이 튜브 엘리먼트, 코팅 없는 원료 엘리먼트를 제공 또는 제조하기 위한 공정은, 바람직한 형태가 약 250 미크론이기 위해 특정 길이 엘리먼트로 미세 보어 튜브를 촙드한 후, 산 및 염기 베스의 시퀀스를 이용하여 폴리머 코팅을 제거하는 것을 포함한다. 미세길이 튜브 엘리먼트의 내표면 만을 코팅하는 제조 공정에 이어서, 미세길이 튜브 엘리먼트가 미세유체 장치의 채널로 고정된다.
미세유체 장치의 체널은 형성되어, 유동의 부분은 미세길이 튜브 엘리먼트의 외측을 바이패스시킨다. 미세길이 튜브 엘리먼트는, 바람직하게는 약 2배의 유동 체적을 내표면을 통해 진행하는 체적과 비교하여 관형 엘리먼트의 외측에 진행시키는 방법으로 채널에 플레이싱된다. 그래서, 내측 직경에 대한 바이패스 유동의 단면적의 비는 2:1이다. 그 후, 미세길이 튜브 엘리먼트는 채널로 고정되어, 채널 벽은 엘라스토머이고, 이는 미세길이 튜브 엘리먼트가 채널에 위치하도록 하고, 채널로 엘리먼트를 위치시키기 위해 사용되는 그리퍼는, 엘라스토머의 접착이 엘리먼트를 채널에 고정하기에 충분하기 때문에 풀어질 수 있다. 미세길이 튜브 엘리먼트와 트위져 사이의 임의의 잔여 접착은 미세길이 튜브 엘리먼트와 패널 사이에 더 큰 접착력에 의해 극복된다. 이 단계에 이어서, 그 후 상부는 미세길이 튜브 엘리먼트를 함유하는 개방 채널 상에 고정된다. 또한, 상부는 엘라스토머 물질을 포함한다. 엘라스토머 물질은, 개방 채널 덕트가 관형 엘리먼트의 외측 직경보다 더 작은 깊이이기 때문에, 채널에 엘리먼트를 압축 및 고정하기 위해 사용된다. 따라서, 엘라스토머 "루프" 또는 상부는 그 채널에서의 그 위치에 미세길이 튜브 엘리먼트를 고정하는 도구로 제공된다.
도 9 이하 참조를 참조하여, 비영구적 결합 공정을 이용하는 것에 대한 2개의 미리 형성된 서브어셈블리들 사이에 어셈블리를 완성하는 상당한 이점을 갖는 다른 유용한 기술은, 영구적 결합을 형성하기 위한 것이다.
기술된 일반적인 조직 및 디자인에 의해 허가된 낮은 압력 조작은, 멤브레인을 영구적으로 하기 위해 공기 중에 구동한 압력을 감소시킬 수 있고, 버블의 문제는, PDMS와 같은 엘라스토머 멤브레인이 선행기술의 디자인보다 공기 투과 및 버블의 상당히 감소된 위험이 적용 가능한 정도로 감소된다는 것을 발견했다. 이는 제조의 저비용 및 단순성의 이점이 있고, 매우 일정하고 감도 있는 분석을 가능하게 한다.
이제 기재될 실행의 차이점은, 밸브 및 피스톤을 조작하기 위해 진공 또는 압력에 의해 엑츄에이트되는 멤브레인 또는 유연한 층은 엘라스토머 물질로 제조되고, 다양한, 유용한 기술이 장치를 제조하기 위해 사용된다는 것이다.
언급된 문제들 중 하나는, 유동 채널에 고정되고, 액체 샘플의 유동에 노출되는, 상기 기재되고 설명되는 중공 유동 엘리먼트, 즉 길이 700 미크론 미만, 바람직하게는 500 미크론 미만, 많은 경우에 약 200 미크론, 보어 직경이 약 75 +/- 50 미크론인 엘리먼트와 관련된 표면적에 관한 것이다.(이것에 기초한 이러한 중공 유동 엘리먼트 및 분석 장치는 상표명 "Micro-length tube TM, u-Tube TM, 및 Mu-Tube TM 하에서 코네티컷의 월링퍼드의 CyVek, Inc.로부터 입수된 것이다.) 이러한 장치는 모세관을 형성하기 위해 사용되는 것과 같은 끝없이 드로잉된 미세-보어 필라멘트로 효율적으로 제조되지만, 이 경우에, 필라멘트는 모세관 보다는 개별의 매우 짧은 중공 유동 엘리먼트를 형성하기 위한 길이로 잘게 촙드된다. 침지 기술에 의해 적용되는 이러한 장치의 표면 상에 고정화된 포획제는 상당한 소모 문제를 일으킬 수 있다는 것을 깨달았다. 이는, 예컨대, 밀리리터 당 몇 피코그램과 같은 낮은 수준으로 분석물질의 농도를 특성화하기 위해 시도되는 경우에 일어나고, s는 요구된다(s is desired). "소모"라는 현상은, 측정되는 샘플에서 분석물질의 농도가 유동 엘리먼트의 큰 활성 면적에 결합의 결과로 체적적으로 불리하게 소모될 수 있는 것이 발생한다. 이는 분석의 감도, 따라서 유용성의 감소를 일으키게 된다. 더 설명하기 위해, ELISA의 임의의 분석물질 또는 항원 상의 아미노 분석의 샌드위치형은, 키네틱 반응, 역동적 공정에 의해 지배되는 방법으로 포획 항체에 결합될 것이다. 이러한 항원과 같은 분석물질이 항체와 같은 포획제에 결합되지만, 반대로도 일어나고, 결합된 분석물질 분자는 포획제로부터 해방된다. 키네틱은 분석물질이 포획되고 분석물질이 해방되는 "온" 속도와 "오프"속도에 관한 것이다. 포획 반응은, 시스템이 결합 속도와 해방 속도가 동일해지는 평행에 도달할 때까지 전체 포획의 속도를 감소시키고, 주변 체적에 분석물질을 소모하는 것을 계속할 것이다. 점진적인 조작은 실질적으로 지수 곡선에 따라 일어난다.
평행 조건의 절대값은 샘플이 분석되는 체적에서 분석물질의 원래 농도에 따라 달라진다. 농도의 증가는 더 높은 시그널를 일으키고, 농도의 감소는 더 낮은 시그널를 일으킨다. 분석 소모가 일어나는 경우에, 샘플에서 분석물질의 농도는 시간에 걸쳐 불리하게 감소된다. 유동 채널에 고정되는 중공 유동 엘리먼트는 엘리먼트가 노출되는 액체 샘플의 체적에 과도한 포획제를 제공할 수 있고, 분석물질의 효과적인 농도를 감소시킨다는 것을 깨달았다. 농도는 측정된 최초, 개시점 농도에 상대적으로 과도한 속도로 감소된다. 이를 위해 칼리브레이트 하려는 노력은 도움이 되지만, 이러한 소모는, 시그널이 낮아짐에 따라, 노이즈 레벨에 도달되고, 낮은 시그널 투 노이즈 비율, 즉 분석의 유효성의 내재적인 감소를 일으키기 때문에 분석의 감도를 매우 낮춘다.(이미, 노이즈, 즉 백그라운드, 포획 항체의 비특이적 결합, 형광 노이즈, 전자 노이즈 등에 대해 많은 기여자가 있음). 따라서, 특히 낮은 농도를 검출하기 위해서, 분석 측정에 긍정적으로 기여하지 않는 방법으로 분석물질의 최초 체적을 소모하지 않는 것이 바람직하다. 노출된 면의 양을 어떻게든 제한함에 따라 그렇게 하는 효율적인 방법은 명백하지 않다. 이는, 면역분석 또는 샌드위치 분석 또는 분자 진단 형태의 분석에서 사용되고, 침지 등에 의해 코팅되는 다양한 설명의 저소모 엘리먼트를 사용함에 따른 내재적인 문제로서 보여질 수 있다. 일반적으로, 엘리먼트의 전체 표면을 균일하게 코팅하기 위해, 센싱 또는 검출되는 분석물질용 포획 분자인 일부 형태의 부위 또는 항체와 같은 포획제에서 엘리먼트를 침지하는 것이 소망된다. 본 발명의 하나의 목적은, 내표면 및 외표면, 또는 종종 두 말단면에 의해 특성화되는 중공 유동 엘리먼트에 대한 이러한 문제를 극복하는 것이다. 포획 분자의 밀도가 코팅되는 모든 표면적의 증가는, 대략 100,000 스퀘어 미크론에 걸친 표면적까지 증가될 수 있다. 이는 작은-보어 필라멘트로 형성된 중공 유동 엘리먼트의 바람직한 형태의 경우이고, 이 엘리먼트는 대략 700 미크론 미만의 길이, 바람직하게는 약 500 미크론 이하, 현재 바람직한 실시형태는 200 미크론이다. 마찬가지로, 내부 보어는 침지 및 교반에 의해 균일한 코팅을 수행하기 위해 50 미크론 +/- 25 미크론의 범위내를 갖는 것이 바람직한 것이 발견되었다. 하나의 바람직한 경우에, 엘리먼트는 125 미크론의 외부 직경 또는 폭, 70 미크론의 내부 직경 또는 폭을 갖는다. 여기서 언급하는 특정 문제는, 침지-코팅된 유동 분석 엘리먼트, 일반적으로, 특히 중공 유동 엘리먼트, 특히 언급된 치수의 엘리먼트의 활성 표면적을 정확히 감소시키는 것에 대한 실질적인 접근을 발견하는 것이다.
여기서 언급하는 다른 문제는, 샘플의 유동을 노출하기 위해 채널에서 고정된 위치가 되도록 하는 것에 관한 것이다. 엘리먼트 표면에 포획제 또는 항체를 적용한 후, 채널에서, 예컨대 멀티플렉스 미세유체 "칩"(또는 "카셋")의 채널에서 그 고정된 위치에 기계적으로 각각의 엘리먼트를 이동시키는 고정화 공정에 자유로운 상태에서 배치에 엘리먼트를 노출하는 것이 바람직하다. 빠르고 정확한 플레이싱 공정, 예컨대 정밀 X, Y 스테이지에서 마운팅되는 픽 앤 플레이스 장치를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 표면으로부터 그것을 픽킹하고 개방 채널에서 그것을 플레이싱하기 위해 작은 엘리먼트를 물리적으로 접촉한 후, 미세유체 경로를 형성하기 위해 폐쇄되는 것이 바람직하다. 장치의 외부면과 접촉하는 트위져 기기와 같은 그리퍼(gripper)를 적용하는 것이 바람직하다. 픽 앤 플레이스 조작은, 자유로운 엘리먼트가 자동 픽 앤 플레이스 기기에 공급되는 표면 및 중공 유동 엘리먼트를 수신(receive)하기 위해 개방 채널을 미리 얼라이닝함으로써 가능해진다. 이는, 그리퍼가 이들이 공급 포켓으로부터 고정될 바람직한 유동 채널 위치로 중공 유동 엘리먼트를 정확히 픽 앤 플레이스하는 것을 가능하게 한다. 진공 픽업을 이용하여, 공급 홈에 말단 대 말단 유사 관계에 중공 엘리먼트를 제공하고, 진공 픽업으로 외측 원통형 표면을 연결하는 것이 가능하다. 문제는 엘리먼트의 외표면 상의 고정화되는 항체와 같은 활성 포획제를 갖는 것에서 발생한다는 것을 알았다. 이러한 코팅은, 기계적 조작 공정의 결과로 기계적 손상에 민감하다. 미세 유동 엘리먼트의 외부면은 (a) 공급면, 예컨대 얼라인된 포켓 또는 홈, (b) 이동하는 그리퍼 또는 진공 픽업 장치, 및 (c) 그것이 증착되는 채널의 표면과 접촉하게 된다. 이들 접촉 기회 모두는, 일반적으로 유동 엘리먼트의 표면에 흡수되는 항체 등의 초박층인, 약한 코팅된 포획제에 손상을 발생시킬 수 있다. 이러한 코팅은 종종 단지 약 나노미터 또는 수십 나노미터의 두께의 몇 분자 두께이고, 매우 약하다. 위치된 중공 유동 엘리먼트의 포획 표면의 손상의 최종 결과는 분석에서 리딩 동안 보여진다. 포획된 분석물질의 불규칙적인 농도 또는 제시를 일으킬 수 있는 임의의 방법으로 표면이 스크래치되거나 동요되는 경우에, 시그널은 불규칙해질 수 있고, 분석을 재생할 수 없거나 수행이 불량해지게 한다.
따라서, 손상에 민감하고, 소모에 기여하는 포획제 또는 항체의 총 표면적의 증가에 기여하는 중공 검출 엘리먼트, 특히 미세-보어 필라멘트로 형성된 미세한 보어 엘리먼트의 외표면 상에 고정화된 활성 포획제를 갖지 않는 것이 바람직하다는 것을 알았다.
청구항 및 이하에 설명되는 특징은, 이러한 그리고 다른 중요한 문제를 다룬다.
개별의 중공 유동 엘리먼트는 항체 또는 항원과 같은 포획제를 함유하는 액체에 침지되고, 액체에 의해 코팅된 후 유동-통과 분석용 채널로 픽 앤 플레이싱된다. 중공 유동 엘리먼트는 약 700 ㎛ 미만의 길이, 70 +/- 50 미크론, 바람직하게는 50 +/- 25 미크론의 보어 직경의 개별 엘리먼트의 바람직한 형태이다. 유동 엘리먼트는 포획 항체와 같은 활성 포획제로 표면 처리되고, 외측은 아니거나 외측 면적에 한정된다. 이러한 효과를 위해, 중공 유동 엘리먼트는 활성제의 베스에 배치되고, 격렬하게 교반되어, 보호된 내부면의 코팅을 야기하지만, 극심한 전단력에 기인하여 예컨대 라운드된 단면 개별의 엘리먼트의 전체 외측 원통면과 같은 외표면 상의 클린한 면적을 야기한다. 이러한 전단 절차 대신에 또는 이에 추가하여, 특별한 필라멘트-제조 공정이 도출되어, 소정의 포획제를 갖는 유동 엘리먼트의 외부면을 코팅하는 것을 억제하는 것을 야기한다. 선택된 코팅 면적 상의 포획제는, 다수의 엘리먼트의 동시 처리를 위한 마스크에 의해 제조되어, 중공 유동 엘리먼트의 내부면 상에 정의된 면적의 잔여 활성제를 남길 수 있는 것(leaving)과 같이 정확하게 위치된 레이저 빔으로 제거 또는 비활성화된다. 엘리먼트의 내부에 잔여 포획제는 필요한 분석에 관련된 리딩 가능한 코드로 정의된다. 유동 채널 형태는 (a) 제1엘리먼트가 막히는 경우에 채널에 엘리먼트를 도달 및 플러싱 하기 위해 중공 유동 엘리먼트의 노출된 외측을 따라 바이패스 채널 유동, (b) 포획제 및 다른 분석 액체에 표면을 노출하기 위해 중공 유동 엘리먼트를 통해 샘플 및 분석 액체 유동을 함께 시키는 채널 내에 고정된 유동 엘리먼트에 비례하여 치수가 달라진다. 외측을 밀봉하려는 시도의 필요성의 부족으로, 엘리먼트는 엘리먼트에 대해 가압된 엘라스토머 시트에 의함으로써 단순히 그리핑될 수 있다. 유동 엘리먼트와 채널 벽 사이의 정전기적 인력은, 엘리먼트의 전달 후 드로잉되기 때문에 플레이싱 기기의 임의의 기파력을 극복하는 위치에 엘리먼트를 고정하도록 적용된다. 분석 후, 에피-형광 검출을 이용하는 경우에, 형광은 중공 유동 엘리먼트 기하학으로 국한되는 특별한 스캐닝에 의해 여기 및 리딩된다. 로케이터(Locator)는 리코딩되는 데이터에 시딩되고, 예컨대 엘리먼트로부터 검출된 형광 데이터에서 관심 있는 영역을 위치시키기 위해 사용된다. 중공 엘리먼트 내부에 포획제 물질로 읽히는 코드는 엘리먼트의 투명벽을 통해 리딩된다. 많은 특징은, 예컨대 더 긴 엘리먼트인 다른 중공 엘리먼트에 유용한 것이 발견되거나 발견될 것이다.
스캐닝에 대해서, 본 발명의 목적은 미세유체 칩에 함유된 다중 고정화된 엘리먼트의 형광 측정을 수행하기 위한 방법을 전달하는 것이다. 이러한 방법은, 스캐닝, 적절한 포커스 및 카메라 노출 동안 이어질 경로를 결정하기 위해 제공한다. 이러한 방법은 공지된 일반적인 칩 레이아웃에 근거한다. 제공된 방법은 스캐너로 측정할 칩을 플레이싱한 후 요구되는 임의의 추가적인 메뉴얼 세팅 없이 스캔을 시작하기 위한 능력을 야기한다. 이러한 방법은 나머지를 하고, 결과적으로 소망되는 형광 측정을 제공한다.
본 발명의 소정의 실시형태는 진동되지 않는 내부면 또는 소망되는 면적 또는 패턴 상에 활성 포획제를 남기지만(leaving), 중공 유동 엘리먼트의 외부면, 예컨대 연장된 원통형 외표면 및/또는 말단면 상에 활성 포획제의 발생을 제거 또는 억제하는 것을 포함한다. 이러한 실시형태에서 다루는 특징은, 바람직한 결과를 얻기 위해 외부면 및 내부면과 함께 조작하는 단계 및 내부면 상의 포획제를 선택적으로 제한하기 위한 기술을 포함한다.
전체 포획 면적을 감소시키는 특정 이점을 위해, 본 발명의 2가지 실시형태는 기술되고, 이들의 조합의 효과가 기술된다. 첫번째 기술은 중공 유동 엘리먼트의 외표면에 고정화하는 것으로부터 항체와 같은 포획제를 제거 또는 억제하기 위해 적용된다. 이는 배치 코팅 공정 동안 행해지고, 엘리먼트의 외부면에 파괴 전단력을 부여하기 위해 관심 있는 포획제를 갖는 에펜도르프 튜브 또는 다른 시험관에, 개별의 중공 엘리먼트를 현탁하고, 과감하게 교반하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 이는, 예컨대 오비터의 회전의 중심을 가로질러 측정되는 약 0.5 cm의 지지 테이블의 총 측방 운동을 하는 오비탈 경로, 오비터의 약 2000 rpm에서 용기의 궤도를 돌게 하는 기기를 적용하여, 고속으로 유체를 볼텍싱(Vortexing)함으로써 수행된다.
중공 유동 엘리먼트는 항체와 같은 포획제의 밀리리터와 같은 체적으로 플레이싱된다. 적절한 볼텍싱 속도는 예컨대 선택되는 액체의 점도와 같은 현탁액의 특성에 따라 달라지고, 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 포획제가 외측, 중공 유동 엘리먼트의 긴 면, 예컨대 바디가 원형 단면이 되는 경우 원통형 외표면에 효율적으로 실재하지 않는지를 관찰함으로써 정해진다.
관련된 물리적 원리는 흡수 공정을 통해 표면에 포획제의 결합을 억제하도록 작용하는 엘리먼트의 외표면 상의 전단력에 관련된다. 격렬한 교반이 그 표면에 결합되는 항체와 같은 임의의 포획제를 전단하기에 충분한지 관측할 수 있다. 그때, 내부면은 관모양인, 미세-보어 튜브인 기하학 덕분에 이러한 전단으로부터 환경적으로 보호된다. 이는 볼텍싱이 엘리먼트 내에서 일어나도록 임의의 격동을 야기하는 것을 억제한다. 단지 라미네이트 유동 조건이 존재한다. 마이크로 보어 엘리먼트를 사용하여, 레이놀드 수(Reynolds number)는 항상 층상(laminar) 유동 조건이 내부면 상에 존재하게 하도록 충분히 적다. 이러한 조건 하에서, 내부 벽 계면에서 중공 엘리먼트 내에 횡단하는 유체의 속도는 당연히 0이다. 따라서, 여기에 관련된 전단력은 없지만, 외측은 매우 격렬하고, 높은 전단력 환경이다. 엘리먼트의 길이의 짧음은 내부면의 균일한 코팅을 가능하게 하지만, 침지에 의해 코팅된 긴 엘리먼트는 불리한 비균일한 코팅에 민감하다.
강한 교반 교반, 예컨대 볼텍싱의 관측 결과는, 샌드위치 분석을 수행함으로써 얻어지는 형광은 원통형 외표면 또는 중공 엘리먼트의 다른 형태에 완전히 없지만, 내부면 상에 식별 가능한 방법으로 존재한다는 것이다. 스퀘어 말단 중공 유동 엘리먼트의 경우에, 형광은 엘리먼트의 말단면에 존재한다.
볼텍싱은 현재 전단력을 생성하기 위한 바람직한 기술이다. 여기에 나타낸 경우는 분당 약 2천번 회전 속도, 약 25 mm의 편위(excursion)로 작은 원으로 앞뒤로 매우 빠른 방법으로 코팅된 엘리먼트를 궤도를 돌도록 회전하는 것을 적용한다.
그러나, 높은 정도의 격동을 만드는 임의의 형태의 빠른 진동이 적용될 수 있어, 앞뒤로 움직이는 모션, 원형 회전, 매우 빠르게 유체를 혼합하고 고 전단력을 생성할 수 있는 어느 것이면 충분할 것이다.
요약에서, 강한 교반 교반이 존재하는 중공 유동 엘리먼트는 엘리먼트의 외표면으로부터 항체와 같은 포획제를 제거시키고, 포획제로의 코팅을 억제하지만, 샘플의 분석물질과 이후 상호작용을 위해 포획 항체와 같은 포획제를 고정화하는 조건으로 엘리먼트의 내부면에 남는다.
고전단 기술의 대안으로서, 작은 보어 튜브의 원래의 드로잉(drawing) 동안, 보통의 제거 가능한 보호적 폴리머 코팅이 필라멘트에 적용되고, 비점착 코팅, 예컨대 스퍼터링된 금, 은 또는 그래파이트가 스퍼터링 챔버를 통해 통과시킴으로써 필라멘트에 적용되는 드로잉 경로(draw path)를 따르는 시점 전에, 다른 공정을 도출한다. 실란 또는 유사 코팅은 예컨대 항체와 같은 포획제가 부착되기 전에 수신면에 적용되어야 한다. 그러나, 스퍼터 코팅 등의 특성에 기인하여, 표면은 실란 또는 등가물, 마찬가지로 활성 포획제를 수신하지 못할 수 있다.
본 발명의 다른 특징은 내부면의 다른 부분 또는 경계 부분 및 유동 엘리먼트의 선택된 말단 표면으로부터 코팅된 포획제를 제거하는 기술 및 바람직한 상황을 실현화하는 것에 관한 것이다. 바람직하게는, 강한 교반 교반 공정 후에, 엘리먼트는, 포획제가 고전단 공정에 의해 제거되지 않는 표면으로부터 항체와 같은 포획제를 제거 또는 비활성화시키는 레이저 제거 공정을 이용하여 더 가공된다. 이러한 면은, 샘플로부터 분석물질의 소모를 감소하기에 충분히 작지만, 분석을 가공하는데 충분히 사이즈 조정된 내부면 상에 고리 모양의 스트라이프만 남기고 내부면의 선택된 부분 및 횡단 말단면을 포함한다.
바람직한 형태에서, 제거 레이저는, 충분히 평행 방사 및 그 말단면이 정의되는 투명 물질에 의해 방사의 내부 반사 산란의 조사의 결과로, 에너지가 그 말단면에 평행하게 도달하는 효과가 그 말단면 상에 있는 포획제에 무효화 또는 제거 효과를 갖는 중공 엘리먼트의 연장축에 횡단하여 배열된다.
신규 조합이 사용되는 경우에, 기재되는 2개의 신규 공정의 전체 효과는, 중공 엘리먼트의 내표면 상에 고정화되는 포획제의 작아질 수 있는 선택된 치수의 밴드만이 남게 되는 것이다. 이는 포획제 없이 공간에 의해 분리되는 하나 이상의 밴드를 남게 하는 방법으로 행해질 수 있다. 따라서, 중앙의 단일 밴드 또는 엘리먼트의 길이 방향으로 분산되는 하나의 말단 또는 다중 밴드에 가까이에 단일 밴드가 생성될 수 있다. 이러한 밴드는, 다른 폭을 가질 수 있고, 다른 공간을 가질 수 있고, 특정 유동 엘리먼트에 유용한 바코드와 같은 코드의 형태일 수 있다.
중요한 신규 특성을 갖는 제조 기술이 더 설명된다.
짧은, 중공 엘리먼트는, 우선 이전에 공급된 연속된 작은 보어 필라멘트로부터 짧고, 개별의 엘리먼트로 형성, 즉 촙드된다. 그 후, 이들은 배치 방법으로 처리된다.
그 후, 중공 엘리먼트의 벌크는 버퍼를 세정하기 위해 에펜도르프 튜브에 노출된다. 세정 공정이 수행된 후, 버퍼는 제거되고, 실란으로 대체된다. 이러한 단순한 저비용 침지 단계를 이용함으로써, 실란은 엘리먼트의 표면 전체에 결합된다. 일정 기간 후 과도한 실란은 버퍼 중 물로 세정된다. 그 후, 용액 중 항체와 같은 포획제는 중공 엘리먼트의 벌크와 에펜도르프 튜브에 첨가되고 밤새 배양된다. 배양은 분당 2000번의 회전으로 약 16시간 동안 오비탈 보텍서 상에서 수행된다. 오비탈 모션에 의해 약 0.5 센티미터 직경의 변위(The order of 0.5-centimeter diametric displacement by the orbital motion). 많은 에펜도르프 튜브를 함유하는 오비탈 플레이트는 약 6인치의 직경이지만, 오비탈 모션은 원형 패턴의 시계 반대 방향으로 회전된 후, 예를 들어 좌우로 약 0.5 센티미터의 직경의 변위를 일으키는 궤도를 도는 시계 방향으로 회전된다.
볼텍싱 공정이 완료된 후, 전체 결과는 포획제는 중공 엘리먼트의 내부면 및 말단면에 고정되지만, 중공 엘리먼트의 원통형 외표면 상에 존재하지 않는 것이다. 포획제 용액은 에펜도르프 튜브로부터 제거되고, 세정 버퍼, 세정 버퍼 용액으로 대체되고, 그 후 세정 버퍼 용액은 블로킹 버퍼라고 불리는 안정화 버퍼로 대체된다. 바람직한 실시형태에서, StabilCoat® 용액이라고 불리는 시판 물질이 사용된다.
StabilCoat® 블로킹 용액은 중공 유동 엘리먼트와 함께 에펜도르프 튜브에 도입된 후 엘리먼트의 부분이 StabilCoat®의 일부와 함께 피펫에 흡입되고 얼라인먼트 플레이트 상에 디스펜싱된다. 트위져 픽 업에서, 얼라인먼트 플레이트는, 작은 공간, 바람직하게는 미크론 사이즈로 허용 오차가 있는 엘리먼트와 포켓의 벽 사이에 10 내지 50 미크론의 공간 내에 단일 엘리먼트의 위치를 각각 맞추도록 배치된 일련의 직사각 형태의 포켓을 함유한다. 엘리먼트가 플레이트 상에 돌아다니도록 한 후, 이들은 버퍼 용액의 존재 하에 이러한 포켓으로 떨어진다. 과도한 버퍼 용액은, 엘리먼트를 갖는 얼라인먼트 플레이트를 원심분리기 또는 원심분리기 홀더로 플레이싱하고, 30초 동안 약 2천 rpm에서 원심분리하여 엘리먼트 및 플레이트로부터 과도한 모든 StabilCoat® 용액을 제거함으로써, 엘리먼트를 함유하는 얼라인먼트 플레이트로부터 제거된다. 이러한 공정은, 배수 채널이 포켓으로부터 방사상으로 연장되는 플레이트의 신규 디자인에 의해 이용 가능해진다.
(진공 픽업 연속 홈이 처리된 엘리먼트를 수용하기 위해 적용되는 경우에, 픽업은 트위져가 이용되는 경우에 말단면이 아니고, 원통형 표면과 연결함으로써 엘리먼트는 한줄로 함께 근접될 수 있기 때문에 포켓에 의해 가능한 것보다 큰 밀도이다.)
플레이트 내에 있는 동안에 중공 엘리먼트는 레이저, 바람직하게는 엑시머 레이저, 간격이 있는 2개의 빔을 갖는 플루오라이드 또는 크립톤 플루오라이드 레이저일 수 있는 자외선 레이저로 더 가공될 수 있어, 엘리먼트의 말단 및 엘리먼트의 내표면으로부터 항체와 같은 포획제를 제거 또는 변성하는 방법으로 레이저 빔에 의해 엘리먼트 축과 직각으로 노출된다. 이는, 포획 항체 표면의 남아 있는 밴드의 바람직한 폭을 정의하는 고정된 거리에 의해 2개의 레이저 빔이 분리되는 레이저 형태의 특징이다. 얼라인먼트 플레이트의 포켓 내에 중공 엘리먼트는 자유도를 가지고 앞뒤로 움직여질 수 있지만, 레이저는 엘리먼트의 말단을 충분히 가공하고, 엘리먼트의 중앙 부근에 합리적인 약간의 허용 오차 윈도우를 플러스 또는 마이너스하여 고정된 폭 패턴을 남긴다.
대신, 갭을 가지고 3개 이상의 일련의 레이저 빔을 정의하는 것이 가능하여, 레이저 빔들 사이에 다양한 갭으로 레이저 빔의 다양한 폭에 의해 생성되는 패턴은 보이는 중공 엘리먼트에서의 노출 패턴을 정의하고, 바코드로 유용하다.
또한, 엘리먼트를 통해, 중공 엘리먼트의 채널 외측에 상당한 바이패스 유동을 갖는 것이 유용하다는 것을 깨달았다. 하나의 이점은, 엘리먼트를 채널 벽에 부착하기 위해 다루기 힘든 접착제를 사용할 필요가 없고 밀봉하지 않고 엘리먼트가 고정될 수 있기 때문에 제조가 간단해진다는 것이다. 다른 이점은, 액체 유동 경로에 연속적으로 배열되는 경우에, 우연한 입자가 미세 유동 엘리먼트 중 하나의 내부 유동을 중단하기 때문에 분석을 전체적으로 망치는 것을 회피한다는 것이다. 외측 상에 상당한 바이패스 유동을 갖는 것, 적어도 50% 만큼 많이, 다수의 경우에 75% 이상, 소정의 바람직한 예에 100% 이상이 매우 유용하다. 최소 일부 정도로서, 이는 엘리먼트를 "짧게 우회하는(short circuiting)"것을 가능하게 하여, 하나의 엘리먼트가 막히거나 중단하게 되고 유동이 멈추더라도, 다른 엘리먼트가 유동을 받을 것이고, 분석은 중단 입자에 의해 부분적으로만 영향을 받게 될 것이라는 것을 보증한다. 여기에 제시된 개념을 이용하여, 중공 엘리먼트의 원통형 외측 또는 그 말단면 상에 활성 포획제를 갖는 것을 피할 수 있는 것은, 소모 문제를 일으키지 않는다는 것도 깨달았다. 따라서, 중공 엘리먼트의 외측 원통형 표면에 활성 포획제가 점착되는 것을 피하고, 말단을 레이저 처리하는 앞서 기재한 기술은, 기재된 바이패스 유동을 적용하는 실현 가능성에 기여한다.
중공 유동 엘리먼트의 사이징
항체와 같은 포획제의 표면적이 작아질수록, 이론적 관점으로부터 분석은 더욱 민감해진다는 4 지식이 받아들여져 왔다. 따라서, 표면적을 최소화하기 위해 가능한 작게 유동 엘리먼트의 내측 직경을 유지하는 것이 요구되어 왔다. 그러나, 한계 내에서, 분석의 수행이 직경의 크기가 증가됨으로써 개선되는 경험으로 결정되게 되었다. 이는 적용되도록 소망되는 배치 공정에 의해 비균일한 코팅의 직접적인 결과이고, 튜브 엘리먼트 직경이 엘리먼트와 비교하여 작은, 즉 75 미크론인 경우에 중공 엘리먼트를 통해 실제적으로 유동하는 체적의 양, 총 체적의 동요가 있는 것이 가능하다는 점에서 분석 동안 일어나는 아마도 일부 효과인 것이 믿어진다. 내부 직경이 약 75 +/- 50이고, 바람직하게는 50 + 25이어야 한다는 것을 발견했다.
외측 직경은 내부 직경 또는 폭의 1.2 및 4배의 범위 내에서 직경 또는 폭을 갖는 것이 바람직하다.
중공 유동 엘리먼트의 길이에 있어서, 최적의 결과는 약 700 미크론 미만의 길이, 많은 경우에 500 미크론 미만의 길이에서 얻어진다. 현재 바람직한 형태는 길이가 250 um이다.
일부 실시형태에서, 내측 직경은 내부 직경의 20:1까지 길이를 갖는 직경 또는 폭을 갖는 것이 바람직하다.
여기에 기재된 배치 공정에 의해 코팅되는 경우에, 더 짧은 중공 엘리먼트는 포획제의 코팅을 더욱 균일하게 한다는 것을 발견했고, 또한, 더 짧은 중공 엘리먼트는 픽 앤 플레이스 모션 동안 축방향으로 트위징력을 견디기 위해 더욱 잘 처리될 수 있다는 것이 발견되었다.
상술한 바와 같이, 허용되게 유연한 것을 통해, 치수적으로 안정한 각각의 고체 기판 또는 캐리어 상에 각각 제조되는 2개의 서브어셈블리를 제공하는 것은 현저한 이점이 있다. 매우 작은 중공 유동 엘리먼트(또는 카셋 내에 위치가 고정될 다른 검출 엘리먼트)는 얼라이닝 전에 서브어셈블리 중 하나의 매칭 면 상에 개방 위치로 플레이싱된다. 서브어셈블리가 얼라이닝되면, 2개의 서브어셈블리는 하나의 완전한 어셈블리를 형성하기 위해 결합 조건 하에서 함께 제공되고, 엘리먼트의 임베딩된 위치에 고정된다. 그 후, 2개의 어셈블리는 유체 채널을 완성하기 위해 함께 제공된다. 이들을 함께 세정하는 것은 검출 엘리먼트를 임베딩하고, 밸브 및 피스톤 장치를 완성한다. 이러한 특징은 비영구적으로 결합되는 실행이 발생한다.
넓은 어셈블링 개념의 다른 실행은 영구적인 결합 특징을 적용하여 이제 기재될 것이다. 이제, 도 30으로 시작하는 도면들을 참조할 것이다. 이하는 도 30 그 이하에 언급되는 성분의 리스트이다.
20. 완성된 카트리지(Completed Cartridge)
22. 샘플 주입 웰(Sample Inlet wells)
24. 버퍼 주입 웰(Buffer Inlet Wells)
26. 폐기 웰 저장소(Waste Well Reservoir)
28. 저장 웰(Reservoir Well) - 항체 시약 검출(Detect Antibody Reagent)
- 바람직한 실시형태(Preferred Embodiment) - 건조(Dried)
30. 미세유체 채널(Micro fluidic Channels)
32. 초소형 중공 유동 엘리먼트(Extremely Small Hollow Flow Elements) ("엘리먼트(Elements)")
34. 미세유체 밸브 시트(Microfluidic Valve Seats)
35. 미세유체 밸브 공압 챔버(Microfluidic Valve Pneumatic Chamber)
36. 피스톤 유체 챔버(Piston Fluidic Chamber)
37. 피스톤 공압 챔버(Piston Pneumatic Chamber)
38. 엘라스토머 멤브레인(Elastomer Membrane)
39. 플라즈마 결합된 계면(Plasma Bonded Interface)
40. 유동을 나타낸 애로우(Arrows Depicting Flow)
41. 바이패스 유동 경로(Bypass Flow Path)
42. 유리 기판(Glass Substrate)
43. 벌크 물질(Bulk Material)
44. 미세유체 채널 벽(Microfluidic Channel Walls)
46. 제어 저장층(Control Reservoir Layer)
48. 유체층 서브 어셈블리(Fluidic Layer Sub Assembly) - 엘리먼트 없음(No Elements)
50. 유체층 서브 어셈블리(Fluidic Layer Sub Assembly) - 엘리먼트 있음(With Elements)
52. 단일 샘플 4개의 분석물질 미세유체 네트워크(Single Sample Four Analyte Microfluidic Network)
54. 미세유체 밸브(Microfluidic Valve) - 전체 어셈블리(Full Assembly)
55. 피스톤(Piston) - 전체 분석(Full Assembly)
56. 저장소/제어 플라스틱 멤버(Reservoir/Control Plastic Member)
58. 공압 계면 포트(Pneumatic Interface Ports)
60. 피스톤 제어 라인(Piston Control Lines)
62. 밸브 제어 라인(Valve Control Lines)
64. 암 툴링의 말단(End of arm tooling) (트위져 또는 진공 프로브(tweezer or vacuum probe))
66. 픽 앤 플레이스 암(Pick and Place Arm) (위아래로 움직임(moves up and down))
68. 소스(Source) / 타겟 X, Y 테이블(Target X, Y table) (X 및 Y 좌표에서 움직임(moves in X and Y coordinates))
70. 중공 유동 엘리먼트의 소스(Source of Hollow Flow Elements) (홈 또는 웰 플레이트(groove or well plate))
72. 타겟 미세유체 장치(Target Microfluidic device)
74. 암 툴링의 말단(End of arm tooling) - 진공(vacuum)
76. 암 툴링의 말단(End of arm tooling) - 트위져(tweezer)
78. 활성화된 표면(Activated Surface)
상부측으로부터 시작하는 도 30에서, 어셈블리(46), 즉 제어/저장층(46)은 2개의 엘리먼트, 상부 인젝션 몰딩된 또는 기계로 조작된 플라스틱 성분(56)과 그 저면과 결합된 PDMS 멤브레인 시트(38)로 이루어진다.
저부 유체층 또는 어셈블리(50)은 검출 엘리먼트, 예컨대 중공의 짧은 원통형 유동 엘리먼트(32)를 갖는다. 유체 어셈블리는 PDMS 개스킷을 갖는 박형 유리 시트(42) 또는 그 상부면에 마주보도록(face-wise) 영구적으로 결합된 시트(38)로 이루어지고, 상기 시트(38)는 채널 벽(44)들 사이에 유체 채널을 정의하는 컷-아웃을 갖고, 채널은 도 31C의 유리 시트(42) 상에 바닥이 된다(the sheet 38 having cut-outs defining fluidic channels between channel walls 44, the channel bottomed on the glass sheet 42, Fig. 31C). 2개의 서브어셈블리가 함께 제공되기 전에, 검출 엘리먼트는 유체층(48)의 채널에서 고정된 위치로 픽 앤 플레이스 조작에 의해 나타낸 실시형태에서 디스펜싱된다. 2개의 서브어셈블리(46 및 50)는, 멤브레인(38)의 부분에 의해 밸브 및 피스톤의 액츄에이션을 가능하게 하고, 액밀한, 누수 없는 조작을 제공하는 방법으로 결합되고, 함께 제공된다. 이러한 구조의 하나의 신규 특성은, PDMS 개스킷을 이용하여 상술한 바와 같이 2개의 서브 어셈블리가 검출 엘리먼트, 여기서 매우 짧은 중공 유동 엘리먼트(미세길이 튜브 TM 엘리먼트)가 채널로 포획 또는 임베딩되는 것을 가능하게 한다. 단일 어셈블리로 2개의 서브어셈블리를 조합하는 것은, 밸브 및 피스톤을 기능화하는 것과 중공 유동 엘리먼트를 함유하는 미세유체 채널을 갖는 기능을 제공한다. 유동적으로 강화된 및 누수 없는 미세유체 구조에서, 기재된 많은 기능을 수행하기 위해 공지된 플라즈마-결합 공정을 이용하여, 제자리에 검출 엘리먼트를 장착하고, PDMS 멤브레인에 의해 접촉된 노출된 밸브 시트에서 플라즈마 결합을 무산시키는 기재할 공정과 함께 채널을 완전히 밀봉하는 방법으로 밸브 및 펌프 격막을 형성한다.
유체 서브어셈블리는 유리에 PDMS를 공유 결합 후 상부 어셈블리에 의해 어셈블링되고, 저장 어셈블리는 플라스틱에 PDMS 공유 결합을 함으로써 형성된다. 우세한 이점은 어셈블링 전에 개방 채널로 개별, 작은 검출 엘리먼트, 중공 유동 엘리먼트를 플레이싱 하는 것이다.
또한, 기술의 중요성은 효율적인 배치 공정에서 고체 기판 상에 항체와 같은 포획제의 고정화를 가능하게 하여, 수천의 이들 엘리먼트가 비용 효율적이고 매우 재생 가능한 매우 단순한 배치 공정으로 제조되는 것을 가능하게 하는 것에 관한 것이다. 공정 자체는, 생물학적 함량에 손상을 일으킬 수 있고, 실온 공정일 수 있는 공정 파라미터가 없다.
따라서, 개념의 특징은 고정된 위치에 엘리먼트를 포획하도록 서브어셈블리를 함께 제공하는 것을 포함하고, 포획(또는 검출) 엘리먼트는, 서브어셈블리를 조합하기 위해 결합 공정, 특히 영구적인 플라즈마 결합 공정을 적용하고, 이제 기재할 밸브 표면과 접촉을 반복적으로 국부적으로 변형 및 제공함으로써 밸브 시트에서 선택적인 방법으로 이를 수행하는, 최종 어셈블리를 갖는 배치 공정에서 미리-제조된 것이다.
밸브 브레이크-인 공정(Valve Break-In Process)
·외측으로 제어된 공압 라인에 공압 제어 인풋 포트를 연결
·공압 밸브 챔버로 멤브레인을 드로잉하기 위해 진공(5-14 psi)을 이용하여 모든 밸브를 엑츄에이트.
·유체층과 정각 접촉으로 표면 활성화된(예컨대 플라즈마 활성화된) 저장소/제어층을 제공.
·유체층의 PDMS 표면과 밀접한 접촉으로 PDMS 멤브레인에 힘을 가하기 위해 압력(1-10 psi)을 밸브 제어 라인에 잠깐 공급. 제어 라인에서 진공 압력까지 다시 바꾸기 전에 약 1-3초 동안 접촉시킴.
·1-2분의 시간에 걸쳐 약 20 사이클의 압력과 진공 사이에서 엑츄에이션의 시퀀스를 빠르게 수행함으로써 밸브의 최초 브레이크-인을 수행함.
·PDMS 표면의 열적 히스토리 및 표면 활성화에 따라 달라지는 5-20분의 기간에 걸쳐 진공 및 압력으로 밸브의 사이클을 계속함. 최초 브레이크-인 사이클이 수행되면, 더 느리고 더욱 오래 끈 엑츄에이션 시퀀스는 결합의 모든 경향이 억제될 때까지, 바람직하게는 PDMS 표면의 느린 멈출 수 없는 결합을 억제하기 위해 사용되고, 이는 1분까지 동안 압력으로 밸브를 엑츄에이팅한 후 임의의 새롭게 형성된 결합을 부수기 위해서 진공으로 간헐적 엑츄에이션을 함으로써 수행될 수 있다. 20분까지 동알 이러한 공정을 계속하는 것은 밸브 멤브레인과 밸브 시트 사이에 영구적인 결합을 더 완전히 억제하기 위해 보여진다.
·비슷한 표면이 함께 제공되는 경우에 분자의 결합 능력을 갖는 다른 물질 또한 적용될 수 있고, 분자의 결합은 동일한 방법으로 밸브 시트에 파괴된다.
밸브 브레이크-인 공정의 설명
주로 -0-Si(CH3)2-의 반복 기로 이루어진 본래의 PDMS는 사실상 소수성이고, 특별한 처리 없이는 PDMS, 유리 및 실리콘과 같이 다른 비슷한 표면에 영구적인 결합은 아니지만, 접착되는 경향이 있다. 그러나, 산소 플라즈마 등의 처리 시에, 메틸기(CH3)는 실라놀기(SiOH)로 대체되어, 높은 표면 에너지를 형성하고, 친수성 표면은 실라놀기의 높은 밀도를 함유하는 다른 비슷한 면으로 비가역적으로 결합할 수 있다. 이러한 비가역적인 결합 공정은, 물(H20)에 수반되는 자유도로 공유 Si-O-Si 결합을 야기하는 각 표면 상의 OH 기들 사이에서 축합 반응을 통해 일어난다.
산소 플라즈마 및 유사한 기술은 압력, 전력 및 표면 OH 기들의 농도를 결정하는 시간 모두와 같은 파라미터를 제어한다. 더 높은 농도의 OH 기는 2개의 면 사이에 더욱 공요 결합을 이끌어, 더 높은 기계적 결합을 야기한다. 산소 플라즈마 또는 유사한 처리 후 대기에 노출된 왼쪽, 친수성 표면은, 표면에 벌크로부터 짧고 이동 가능한 폴리머 쇄의 이동을 통해 본래의 소수성 상태로 되돌아하는 "회복(recovery)"을 겪는다. 전체 "회복"은 실온에서 1시간에 걸쳐 일어나고, 증가된 온도에서 가속되고, 진공 및/또는 저온에서 저장에 의해 느려질 수 있다. 이는 결합 전에 친수성 표면 처리를 록 인(lock-in)하기 위해 며칠동안 진공 백에서 -50C에서 활성화된 기판을 저장함으로써 제공된다.
결합 메카니즘이, 이용 가능한 OH 부위를 완전히 소모하기 전에 몇 분에서 몇 시간까지의 기간에 걸쳐 물의 자유도를 포함하는 꽤 느린 축합 반응이 이어지기 때문에, 완성 전에 이러한 공정을 중단시키는 것이 가능하다. 한번 완성되면, 계면들 사이의 결합 강도는 2가지 물질의 비가역적인 부착을 이끄는 벌크 절단 강도와 상응할 만하다. 이 단계에서 층들을 분리하려는 시도는 하나 또는 둘의 레이저의 벌크 손상을 야기할 것이다. 그러나, 결합 사이클의 초기 단계 동안 표면을 기계적으로 분리하는 것에 의한 결합 공정의 중단은 2개의 표면 사이에서 형성된 결합의 적은 수만을 비가역적으로 손상시키는 것이 발견되었다. 벌크의 절단 강도는 계면 결합보다 상당히 높고, 따라서 분리는 벌크에 회복할 수 없는 손상을 만든다. 또한, 결합 공정이 충분히 일찍 중단되는 경우에(일반적으로 처음 몇 초에), 층들을 분리하는데 요구되는 힘은 미처리된 층들을 분리하는데 요구되는 접착력보다 더 작다. 짧은 기간(일반적으로 몇 초) 동안 층을 접촉으로 돌아가게 하는 것이 착수될 것이고, 다시 결합을 중단할 것이다. 매번 이 사이클은 반복되고, 잠재적인 결합은, 모든 이러한 결합 부위가 소모되고, 물질이 미처리된 물질의 특성을 갖도록 되돌아가기 전까지 증가하면서 제거된다.
바람직한 신규 기술에서, 미세밸브는 플라즈마 활성과 같은 표면 활성에 의해 PDMS의 층들 사이에 형성되고, PDMS 또는 유사한 표면은, 유연한 멤브레인과 밸브 시트 사이에서 결합을 영구적으로 중단하지만, 장치를 함께 유지하기 위해 넓은 표면에 걸쳐 완전하고 강력한 결합을 일으키는 방법으로 이들을 접촉 후 개폐하기 위해 밸브를 활성화한다.
장치 제조
도 30을 참조하여, 기재된 개념을 적용하는 제품은 인간 플라즈마 샘플의 항체 농도를 정량화하는 목적을 위한 소모품의 미세유체 카트리지이다. 도 30에 도시된 바와 같은 카트리지는 샘플 주입구용 넓은 저장(board provisions), 다른 말로, 혈액 플라즈마 또는 혈청 샘플을 분석할 샘플을 수용할 저장소(reservoir)를 함유한다.
완성된 카트리지(20)는 환자 플라즈마 또는 혈청 샘플 또는 뇌 척수액을 포함하는 체액의 다른 형태를 수용하기 위한 샘플 주입 웰(22)을 함유한다. 또한, 카트리지는 분석의 가공 동안 사용되는 시약인 버퍼의 버퍼 주입 웰(24), 미세유체 카트리지 상에 자체 함유된 모든 더 이상 필요하지 않은 미세유체 채널을 통해 유동하는 시약 및 샘플의 모두를 함유하기 위해 고안된 폐기 저장소 웰(26)을 함유하고, 또한 형광 레벨을 갖는 검출 항체에 함유되는 저장 웰(28)을 함유할 수 있다. 바람직한 실시형태, 검출 항체는 채널 또는 저장소에서 건조되고, 버퍼 웰(24)에 함유된 버퍼를 이용하여 조작하는 동안에 다시 수화될 것이다.
도 31, 32 및 33을 참조하여, 도 31은 이후 엘리먼트라고 하는 초소형 중공 유체 유동 엘리먼트를 함유하는 4개의 독립적인 미세유체 채널군을 함유하는 미세유체 채널을 도시한다. 도 31은 6개의 채널(30)을 각각 함유하는 4개의 채널군을 도시한다. 초소형 중공 유동 엘리먼트(32), 미세유체 밸브 시트(34) 및 피스톤(36)이 있다. 초소형 중공 유동 엘리먼트는 엘리먼트의 내표면 상에 제공되는 포획 항체를 갖는 배치 공정에서 형성되고, 이들 엘리먼트는 채널(32)로 플레이싱된다.
중공 엘리먼트의 치수의 예: 바람직한 실시형태의 길이는 약 250 미크론, 내부 직경은 약 75 미크론, 외부 직경은 약 125 미크론이다. 도 32는 예시적인 채널에 평행한 2개의 예시적인 채널로 도시되는 중공 엘리먼트의 확대도이다.
현재 바람직한 실시에서, 채널은 엘리먼트보다 넓고, 엘리먼트는, 다른 측 상에 바이패스 유동 경로를 정의하는 하나의 채널 벽에 부착되는 정전기력에 의해 접착된다.
도 34는 엘리먼트의 외측 상에 중공 엘리먼트를 둘러싸는 공간을 갖는 채널(30)의 중공 유동 엘리먼트의 단면도를 도시한다. 도 34는, 도시한 유동 애로우(40)을 갖는 미세유체 채널(30) 내에 중공 엘리먼트(32)를 나타내고, 여기서 중공 엘리먼트는 유리 기판 엘리먼트(42)에 의한 저부면 상에 및 상부면 엘라스토머 멤브레인(38)에 의해 포획된 것이다.
유리 기판층(42)의 일반적인 치수는 보로 실리케이트 유리의 200 미크론 두께이고, 엘라스토머 멤브레인층 엘리먼트(38)는 일반적으로 100-200 미크론 두께이다. 또한, 제공하는 채널은 엘라스토머이고, PDMS 물질은 일반적으로 100-150 미크론의 크기여서 미세유체 채널을 형성한다. 또한, 도 34에 도시된, 엘라스토머 멤브레인층은 왼쪽으로 오른쪽으로 계속되고, 또한 유리 기판은 중공 유리 엘리먼트를 함유하는 하나 이상의 평행한 미세유체 채널을 함유하는 왼쪽으로 및 오른쪽으로 및 양쪽으로 계속되고, 유리층 엘리먼트(42)는, PDMS 표면의 플라즈마 활성 및 이후 접촉 및 유리층에 결합을 포함하는 공유 결합 기술을 이용하여 서브어셈블리 공정으로 이전에 형성된 엘라스토머 벽, 미세유체 채널 벽(44)에 결합되고, 중공 엘리먼트는 그 채널에 삽입된다.
추가적인 채널(30)이 평행하게 존재한다. 평행한 채널의 목적은, 교차-반응성을 억제하기 위해 서로로부터 다른 항체를 분리하기 위해서이다.
채널 경로는 채널 벽 중 하나에 대해 픽 앤 플레이싱되는 중공 엘리먼트의 직경이 더 작아, 엘리먼트와 채널 벽 사이의 정전기력은 엘리먼트로부터 플레이싱 장치, 예컨대 트위져 또는 진공 픽업을 해방한다. 이 공정에서, 말단에서 측면으로 "L" 형태 모션으로 이동함으로써, 정전기적 인력을 증가시키고, 트위져가 제거할 트위져 및 엘리먼트를 갖는 연결(engagement)로부터 해방되도록 한다. 채널(30)은 제어/저장소(46)의 탄력 있는 멤브레인(38)의 양 말단과 접촉에 의해 부착된다. 엘리먼트는 엘라스토머(38)와 유리(42) 사이에 채널(30)에 유지된다.
도 32는 일련의 4개의 이격된 엘리먼트(32) 및 바이패스 유동 공간(41)을 함유하는 2개의 예시적인 채널을 도식으로 나타낸다.
도 35는 채널(30)에서 엘리먼트(32)를 갖는 유체층 서브어셈블리(48)의 상면도이다.
도 35에서, 미세유체 단일 샘플의 4개의 시트, 즉 4개의 분석물질 네트워크(52)가 도시되고, 각각의 네트워크는 각각의 샘플로 분석을 실행하기 위해 고안된다.
도 33은 도 31의 시트(34)를 갖는 밸브(54), 미세유체 피스톤 챔버(36), 4개의 엘리먼트(32)를 함유하는 단일 채널(30)의 확대도이다.
도 33은 엘리먼트를 통해, 또한 중공 엘리먼트(32) 주변에 바이패스 유동 경로(41)를 통해 유동을 화살촉에 의해 나타낸다.
도 30 및 35를 참조하여, 채널(30)은 110-미크론 두께의 PDMS의 시트(32)를 나이프 커팅함으로써 형성된 미세유체 채널 벽 및 유리 기판(42)으로 형성된다.
도 30은 공지 기술을 이용하여 특이 커팅 패터닝된 PDMS 시트(42) 및 유리 시트(42)를 함께 제공함으로써 유체 면적(48)를 형성하는 것을 보여준다.
저장소/제어 플라스틱 멤버(56)(샘플에 대한 유체 저장소(22), 분석 버퍼(24) 및 시약 폐기물(26)을 함유하는)는 제어/저장소층(46)을 형성하기 위해 PDMS 멤브레인(38)에 결합된다.
도 24는 채널(30)에 엘리먼트(32)를 갖는 유체층 서브어셈블리(48)의 상면도이다.
도 24에서, 4개의 미세유체 단일 샘플, 즉 4개의 분석물질 네트워크(52)가 도시되고, 각각의 네트워크는 각각의 샘플로 분석을 실행하기 위해 고안된다.
도 24를 참조하여, 채널(30)은 110-미크론 두께의 PDMS의 시트(32)를 나이프 커팅함으로써 형성되는 미세유체 채널 벽 및 유리 기판(42)에 의해 형성된다.
도 36을 참조하여, 층(46) 및 멤브레인(38)은 플라즈마 활성된 분자 결합에 의해 어셈블링될 준비가 되었다. 도 37은 최종 어셈블리(46)를 나타내는 상면도이다. 공압 계면 포트(58)는, 밸브(54)에 압력 및 진공 엑츄에이션을 제공하는 컴퓨터-제어된 공압 제어 라인(멤브레인(38) 및 미세유체 밸브 시트(34)로 형성된) 및 피스톤(55)(피스톤은 피스톤 공압 챔버 및 피스톤 유체 챔버(36)에 놓이는 엘라스토머 멤브레인(38)으로 형성됨) 피스톤 제어 라인(60) 및 밸브 제어 라인(62)를 맞추도록 적용된다. (37)과 (36) 사이에 샌드위칭된 멤브레인(38)에 의해 형성된 피스톤 펌프는 다른 것과 하나의 방향 및 압력으로 진공에 의해 활성화된다.
공압 제어된 미세유체 시스템에서, 연장된 면적에 걸쳐 높은 정확도로 미세하고 근접한 공간의 공압 채널 네트워크를 형성할 필요가 있다. 이러한 네트워크의 중요한 용도는, 미세유체 펌프를 구성하는 밸브 및 미세유체 피스톤의 시스템 또는 미세유체 밸브의 분산을 엑츄에이팅하기 위해서이다. 미세유체 영역에서 잘 알려진 바와 같이, 이러한 경제적이고 확실하게 하는 것과 관련된 상당한 문제가 있다. 문제는, 미세유체 네트워크의 대규모, 복잡성 및 더 큰 소형화가 증가하기 때문에 더욱 첨예해진다. 많은 문제들은 물질, 물질 처리 및 제조 기술과 관련된다.
다른 기능을 수행할 수 있는 바디와 3개 측의 미세 공압 채널을 형성하기 위해 높은 정확도를 이용하는 경우, 정확한 몰드를 생성하고, 몰드의 수명에 요구되는 몰드 변화를 만드를 것과 관련되는 비유연성 및 비싼 비용이 있다. 많은 몰딩된 부분에서, 공기의 양압 및 부압 하에서 기밀성을 얻고, 개방 채널을 폐쇄하기 위해 다른 물질로 충분히 밀접한 결합을 수행하는데 어려움이 있을 수 있다.
다른 물질의 상부 및 하부 폐쇄 및 하나의 물질의 벽으로 컴포지트 채널을 형성하는 경우, 필요 조건을 모두 충족하는 제조기술 및 올바른 물질을 발견하는 것을 어렵다. 공기의 양압 및 부압 하에서 밀접하고, 기밀하고, 오래 지속되는 결합을 수행하는데의 어려움 및 형태 불안정이 문제들 사이에 있다. 이러한 장치의 제조 동안, 공압 시스템의 미세한 특징을 완성하기 위해 함께할 필요가 있는 부분이 형성되는 경우에, 조합되는 부분으로 적당히 짝지워지고 등록을 수행하기 위해 처리 시에 치수 안정성을 갖는 미세하게 형성된 부분이 특히 요구된다. 정확한 등록 없이, 바람직한 공압 압력 레벨은 적당한 시퀀스로 이들을 조작하기 위해 미세유체 밸브 또는 피스톤을 도달할 수 없을 수 있다.
이들 고려사항은, 하나의 장치에서 체액의 다중 분석이 수행되는 멀티플렉스 분석, 예컨대 ELISA를 수행하는 미세유체 분석 장치에 특히 적용한다. 많은 경우에, 예컨대 약물 개발에서, 다중 분리된 샘플은 다중 분석을 동시에 수행하는 것이 바람직하다.
미세유체 분야에서 잘 알려진 다른 것들, 여기에 기재된 미세 공압 구조의 많은 요구 사항의 모두를 충족시키는 제조 기술과 물질의 조합을 발견할 특정한 필요성이 있다.
특정 실시예로서, 단일 휴대용 미세유체 카트리지 상에 다중 샘플, 예컨대 약 16 내지 64개의 샘플을 수용할 수 있는 매우 정량적인 면역 분석 장치를 제공하고, 각각의 샘플에 대해서, 많은 분석물질을 동시에 정량 결정할 수 있고, 예컨대 4 내지 8개의 다른 분석을 수행할 수 있고, 상기 분석 카트리지는 환자의 샘플(예컨대, 혈액 혈청, 오줌), 버퍼 및 2차 항체 및 폐기물과 같은 시약을 함유하는 마크로 사이즈 특성을 갖는 것인 미세유체 네트워크를 제공하는 것이 바람직하다.
특히, 예컨대 5인치 × 3인치의 전체 ("풋프린트(footprint)") 치수의 휴대용 미세유체 분석 장치와 같은 제조에 효율적인 접근을 발견하는 것이 바람직하다. 이러한 장치에서, 예컨대 채널 사이즈 약 100 미크론 이하, 예컨대 채널 폭 약 100-150 미크론, 깊이 100-150 미크론, 허용 오차 10-20 미크론의 특징의 정확성을 갖는 공압 미세 채널의 폭의 약 4배 내지 8배의 거리의 다른 채널 및 특징으로 밀접하게 패킹된 미세유체 채널을 갖는 것이 중요하다. 많은 경우에, 샘플 웰 및 시약 저장소와 같은 마크로 사이즈 특징은, 일반적으로 치수가 몇 밀리미터인, 즉 십자형으로 몇 밀리미터 및 깊이가 몇 밀리미터인 휴대용 장치에 포함되는 것이 바람직하다.
실제 이용을 위해서, 다양한 특징의 물질의 최고의 질은 다르지만 전체 어셈블리를 확실히, 저렴하게 제공하기 위한 방법을 발견하고, 및 전체 기능성을 유지하면서 신뢰할만한 방법으로 이들을 조합할 필요가 있다.
본 발명은 공압 채널 성분, 유체 채널 성분 및 둘과 조합하는 유연한 멤브레인을 갖는 미세유체 분석 장치에 특히 유용한다. 구조의 이러한 형태에서, 더욱 일반적으로, 특히 이하의 시스템의 공압 성분에 대해 상기 문제들이 해결된다.
공압 채널을 형성하기 위한 우수한 출발 물질은, 접착제를 보호하는 박리 가능한 라이너 층 및 각각의 측에 경성 물질, 비형광 접착제로 형성된 비형광 중앙층(non-fluorescent central layer)을 갖는 이중 측 압력 민감 접착제 시트(double sided pressure sensitive adhesive sheet)를 포함한다는 것을 발견했고, CO2 레이저를 이용함으로써 이러한 시트를 가공한 후 매우 단순한 결합 공정에 의해 공압 채널 및 특징을 형성하는 공정을 발견했다. 레이저는, 바람직한 채널 및 다른 특징의 측벽을 형성하기 위해 코어, 접착층 및 라이너를 통해 전체적으로 커팅함으로써 공압 미세채널 및 다른 구조를 제거하는데 사용된다. 따라서, 공압 채널은 코어층의 양쪽에서 접착제에 의해 부분적으로, 접착 시트의 내부 코어층의 부분적으로 형성된 측벽을 갖는다. 이러한 기술은, 허용 오차 10-20 미크론의 특징의 정확도로, 약 100-150 미크론의 채널 폭, 100-150 미크론의 깊이를 갖는 약 100 미크론 이하의 사이즈를 갖는 미세 정확한 특징을 형성하는 것이 발견된다.
정당히 낮은 형광을 갖는 2중 측 압력 민감 접착 시트는, 예컨대 27 인치까지의 사이즈로 상업적으로 이용 가능하다. 분석의 포획 부위에서 형광-태그의 분석물질을 에피 형광 리딩의 수행으로 형광을 여기하기 위해 사용되는 녹색 레이저 또는 적색 레이저와 같은 여기 레이저에 노출되는 경우에, 물질이 형광에 매우 낮은 경향을 갖는 것이 중요하다. 접착제가 적용되는 구조적 성분으로 압력 민감 접착 시트의 제조에 사용되는 물질, Mylar TM (폴리에스테르)은, 카트리지에서 측정을 취하는 공정을 간섭하고, 다른 자극 형광 방출 공정 또는 에피 형광에 의해 준비가 되도록 요구되는 분석 카트리지를 사용하는 것이 부적당한 높은 정도의 자동 형광을 갖는다.
폴리프로필렌의 코어 층은 이러한 목적에 우수하다는 것을 발견했다. 1.8 밀리 또는 45 미크론 두께의 각 측 상에 접착제를 갖는 약 2 밀리(50 미크론) 두께의 폴리플로필렌층은 실리콘 접착 측으로 매우 잘 수행하는 것이 발견되었다. 적합한 제품은, SR26 실리콘 접착제로 알려진 실리콘기반의 접착제의 층을 갖는 제품명 AR 90880로 Adhesive Research에 의해 판매된다.
기재된 기술에 의해 형성되는 제품의 예는, 몇개의 층으로 구성되는 휴대용 소모성 면역분석 카트리지(카셋)이고, 관통-레이저 커팅(through-laser cutting)에 의해 형성되는 채널을 갖는 압력 민감 접착제(pressure sensitive adhesive)는 카트리지로 통합되는 층 중 하나이다. 필 스트립이 제거된 그 층은, 상술한 마크로 특징, 즉 샘플 웰 및 버퍼 및 시약 저장소를 정의하는 경성 저장층의 저부의 평평한 면에 부착된다. 필 스트립을 제거하면서, 2차 압력 민감 접착 시트에 의해 공압 채널층의 저면에 라미네이팅되는 것은, 저장층 및 접착 시트층에 바이어스로 얼라인드된 100 미크론 두께의 PDMS 멤브레인 함유 바이어스 상에 형성되는 멤브레인 층이다. 이러한 어셈블리는, 다른 곳에 기재된 샘플 웰 및 저장소에 바이어스를 통해 카트리지의 미세유체 채널을 접촉하고, 미세유체 채널에 도입되는 개별의 검출 엘리먼트를 포획하는데 효과적으로 결합하는 다른 곳에 기재된 유체층에 결합된다.
경성 저장소 카트리지층은 약 6 내지 14 밀리미터 두께의 기계로 가공된 플라스틱체 또는 그 상부면에 위치된 저장소 마크로-특징을 갖는 약 6 내지 14 밀리미터 두께의 주입 몰딩된 플라스틱체이고, 상기 특징은 치수가 약 3 내지 6 밀리미터이고, 압력 민감 접착층에 바이어스 레이저 커팅으로 얼라인된 저장층의 바닥을 통해 통과하는 저장소로부터 유체 바이어스를 갖는다. 레이저-관통-커팅 공압 채널, 바이어스 및 다른 특징을 갖는 접착 시트는 저장층에서 바이어스로 얼라인먼트된 경성 저장층의 저면에 라미네이팅되어, 유체 바이어스는, 저장층의 바이어스를 통해, 압력 민감 공압층의 바이어스 및 이하 멤브레인 층의 바이어스를 통해, 저장층에서 유체층으로 샘플 및 시약을 이동시키도록 배열된다. 공압층에 함유되는 유체층으로 들어가는 것은, 유체 바이어스 이외에 밸브 및 피스톤과 관련된 특징이다(To then enter into the fluidic layerAlso contained in the pneumatic layer are features associated with valves and pistons in addition to the fluidic vias). 이러한 특징은 밸브의 경우에 약 800 um 길이, 500 um 폭, 기판의 전체 표면을 따라 이들 특징을 연결하고, 일련의 공압 바이어스에서의 장치의 말단에 위치되는 공압 엑츄에이트 포트에서 종결되는 긴 채널을 갖는 피스톤의 경우에 3000 um 길이, 800 폭일 수 있다.
매우 기능적인 일회용 면역분석 카트리지의 시도 중 하나는, 많은 수의 특징을 가져, 높은 정도의 기능을 제공하는 것을 구성한 것이다. 예컨대, 이는, 다중 샘플, 바람직하게는 16 내지 48의 다양한 샘플을 주행할 수 있는 것, 그리고 각각의 샘플에 대해서 하나의 카트리지 상에 몇 개의 분석물질, 4-8개를 정확히 정량화하기 위한 능력이다. 이러한 필요조건은 종종 밸브, 바이어스 및 피스톤 펌프를 포함하는 유체 특징의 밀도가 높기 위한 필요성 및 복잡성을 구동한다.
각각의 샘플에 대해서, 카트리지 상에 8개까지의 특이한 분석물질의 측정을 수행하기 위한 능력을 갖는 독립적인 유체 서킷이 있다. 독립적인 유체 서킷은 카트리지 상에서 모든 다른 유체 서킷으로부터 유동적으로 분리되고, 다른 샘플 상에 평행하게 동일한 측정을 수행하기 위해 사용된다. 현재 디자인은, 특징과 연결되는 공압 채널 및 약 200 스퀘어 밀리미터(10 x 20 mm)의 면적으로 밸브, 피스톤 펌프 및 바이어스와 같은 20-30개 만큼 많이 다양한 유체 특징을 짜낸다(squeezes).
16개의 개별의 샘플을 측정하는 카트리지는 독립적인 16개의 유체 서킷을 갖는다. 그러나, 각각의 서킷의 기능은, 모든 서킷이 구조적으로 동일하다는 것을 의미하는 것과 동일하다. 카트리지를 횡단하여, 각각의 검출 시약, 폐기물 배출구 및 피스톤과 연관된 16개의 밸브 뱅크 및 16개의 버퍼 주입 밸브(각각의 서킷에 하나)가 있다. 서킷은 동일한 카피이기 때문에, 모든 서킷을 횡단하여 공압 제어 라인을 공유하고, 독립적으로 제어된 공압 채널의 소형 세트를 사용하여, 카트리지를 주행하는 기기의 복잡성을 한정하는 것이 가능하다. 예컨대, 8개까지의 다양한 분석물질을 주행하는 16개의 샘플을 갖는 카트리지는, 예컨대 7개 만큼 적은 공압 채널을 가질 수 있고, 이들 공압 채널 각각은 독립적인 유체 서킷 각각에 위치된 기능적 특징의 동일한 세트를 연결한다. 기능적 세트는 특정 시간에 검출 시약을 유동시키는 밸브의 뱅크, 또는 유체 서킷의 매니폴드 영역에서 서로로부터 유체 채널의 세트를 폐쇄 및 분리하도록 고안된 밸브의 뱅크, 또는 아웃풋에 위치된 밸브의 뱅크, 또는 피스톤의 뱅크를 포함할 것이다. 기능적 세트는, 연결된 특징의 스트링에 공압 계면에서의 하나의 말단과 마지막 특징에서의 다른 말단에서 종결되는 단일 연속 공압 채널을 통해 서로 연결된다. 모든 서킷에서 활성 특징의 세트와 교차하기 위한 공압 채널은, 카트리지의 표면에 위치되는 모든 특징을 커버하기 위해, 서로 오버랩되지 않고, 미세유체 카트리지를 횡단하여 구불구불하게 왔다 갔다 하는 것이 요구된다. 길이가 10 내지 20 인치만큼 긴, 긴 연속적 채널. 또한 장치 상에 위치되는 고밀도 공압 채널의 결과로, 이러한 분석을 주행하기 위해 요구되는 높은 정도의 기능을 적용하기 위해 가능한 타이트하게 패킹되는 채널, 공압 채널을 유지할 필요가 있다. 이러한 긴 채널이 타이트하게 패킹 및 카트리지 상에 위치되고, 구불구불한 경로 특성을 갖는 결과, 이러한 공압 채널을 형성하는 목적을 위해 PSA계 막을 레이저 커팅하는 것은 구조적으로 부적절해지는 해로운 효과를 갖는다는 것을 발견했다. 제조 공정 또는 직후 레이저 커팅 공정 동안, 이렇게 형성된 채널을 갖는 기판은 자체를 구조적으로 지지하는 것이 불가능하고, 요구되는 필요한 치수 허용 오차를 유지한다는 것을 발견했다.
결과적으로, 밸브 및 펌프 피스톤의 정확한 엑츄에이션을 형성하기 위한 목적을 위해 매우 타이트한 물리적인 허용 오차를 갖는 것이 의도된 특징은, 기판을 횡단하여 앞뒤로 채널을 길게 구불구불하게 형성하는 것에 기인하여 물리적인 불안정성을 갖는 결과로 상실된다.
긴 연속적인 중단되지 않는 채널을 형성하는 것보다는, 채널 형성을 중단하는 것이 포함된 문제에 대한 해답은, 채널은 약 20 내지 30 밀리미터의 세그먼트으로 쪼개지는 것이고, 코너, 예컨대 또는 채널을 터닝하는 것이 서로에 밀접하게 패킹된 후, 세그먼트 길이를 10 밀리미터 내지 30 밀리미터로 변경할 수 있는 경우에, 채널 경로의 특성에 따라 달라진다. 이러한 채널의 중단은 짧고, 커팅되지 않은 갭의 약 150 미크론의 길이의 채널 경로를 제조하고, 약 150 미크론의 채널 세그먼트들 사이의 브릿지를 형성함으로써 형성된다. 결과는, 의도된 타이트한 치수적 허용 오차 또는 등록의 손실의 문제 없이 처리될 수 있는 전체 자가-지지된(self-supporting) 구조이다. 브릿지의 결과로서, 공압 주입구로부터 채널의 말단에서의 최종 말단 구조까지 공기 유동의 연속성을 갖지 않고, 이들의 중단을 갖는 채널은, 도 53i 및 53j에 도시된 바와 같이 저장층 내에 브릿지 상에 직접적으로 또는 멤브레인층에 브릿지 아래에 직접적으로 분류기를 배치함으로써 기능적으로 제조된다.
분류기가 도 53i에 도시된 멤브레인층에 형성된 경우에, 홀 또는 비아는 유체 바이어스에 사용되는 것과 유사한 멤브레인으로 커팅된다. 분류기가 도 53j에 도시된 저장층에 형성된 경우에, 작은 포켓은 저장층의 저면으로 기계 가공되거나, 저장층의 형성을 포함하는 플라스틱의 피스를 주입 몰딩하는 공정으로 형성될 수 있다.
한번 조합되면, 공압 채널의 채널 네트워크와 브릿지와의 분류기 얼라인먼트 오버랩은 카트리지의 면적에 위치되는 피스톤 및 밸브와 같은 특징의 모두를 엑츄에이팅할 수 있는 연속 공압 채널을 형성한다. 이러한 채널은 약 150 미크론 × 150 미크론의 단면 치수를 갖는다.
접근의 이점은 제조 비용이 더 낮고, 특징 위치의 정확성이 더 높은 것을 포함한다. 압력 민감 접착제용 원료 물질이 카트리지당 상대적으로 저렴하기 때문에(<$1/ 카트리지), 이들 채널을 제조하는 상대적으로 높은 속도 때문에, 상대적으로 낮은 비용이지만, 공압적으로 엑츄에이트된 미세유체 장치에서의 엑츄에이트된 피스톤 및 밸브를 정확히 실행하기 위해 필요한 정밀성이 높은 구조를 야기한다.
이러한 공압 채널과 유사하게 형성하기 위해 사용되는 인젝션 몰딩 또는 기계 가공 또는 다른 방법과 비교하여 전체 비용 효과는 현저하다.
피스와 같은 인젝션 몰드를 할 수 있지만, 디자인 컨셉을 변경하도록 적용하는 인젝션 몰딩 공정의 비유연성 때문에 인젝션 몰딩 공정을 개발하는 것과 관련된 개발 시간이 길고, 비용이 높다. 카트리지의 많은 변형 또는 형태가 공급되고, 공압 서킷의 형성 시에, 일부 유연성을 필요로 하고, 각각의 성분을 인젝션 몰딩하는 것은 특정 몰드를 요구한다는 것이 예상된다. 본 발명을 이용하는 것에 대해, 동일한 기기, 레이저 셋 업은 제조되는 도면을 실행하기 위해 다양한 프로그램으로 사용될 수 있다.
다른 중요한 이점 중 하나는, 많은 기능의 원인이 되기 때문에 유체 카트리지의 통합 부분인, 멤브레인층의 실행이다. 이는, 채널을 폐쇄하고(closing off the channels), 이들을 폐쇄된 유체 채널로 제조하고(making them closed fluidic channels), 미세밸브 및 피스톤을 형성하는 것과 관련된 유연성을 위해 이러한 채널로 위치되는 엘리먼트를 함유하는 것의 원인이 된다. PDMS 멤브레인은 미세유체 카트리지의 통합 부분으로 필요하고, 공압 채널 표면이 형성되는 것이 무엇이든 공압 채널 표면에 영구적으로 부착될 필요가 있다. 인젝션 몰딩된 플라스틱의 경우에, PDMS 멤브레인과 PDMS 사이의 결합 공정은, 일반적으로 다중 단계를 포함하고, 폴리스티렌, 폴리셀폰, COC 및 COP와 같은 플라스틱의 작은 서브셋에 한정되기 때문에 어렵고 비싸다. 이들 플라스틱의 일부는 한쪽이 마크로 특징, 다른 쪽이 미세 특징을 갖는 6-12 밀리미터와 같은 두께로 형성되는 저장층의 형성에 부적합하다. COC 및 COP의 경우에, 이러한 플라스틱의 비용은 엄청나게 비싼 장치의 형성을 만든다. 그 후, 이는 폴리스티렌과 같은 이용 가능한 매우 적은 수의 플라스틱으로 격하시킨다(Which then relegates one to Avery few number of available plastics such as polystyrene).
폴리스티렌과 같은 일부 플라스틱은 이러한 공정에 우수한 후보자를 만들지만, 폴리카보네이트 및 PMMA와 같은 대부분의 다른 것들은 우수한 후보자가 아니다. 더욱 유연한 기계 가공으로 카트리지를 개발한 후 이를 주입 몰딩으로 이동시키는 것은, 물질 선택은 양 공정에 맞춰지기 때문에 어려울 수 있다.
일반적으로, 디자인을 라이팅하기 위한 기계 가공을 시작한 후, 디자인이 필수적으로 고정 및 록킹되면 주입 몰딩에 이동시킨다. 이는 주입 몰딩과 관련된 높은 재현되지 않는 비용의 직접적인 결과이다(Which is really a direct consequence of the high nonrecurring expenses associated with injection molding).
그러나, 예컨대 양측에 압력 접착제를 갖는 물질은 임의의 것에 쉽게 결합될 수 있는 쪽으로 수행하게 된다(But you're bringing working towards the fact that the material for instance with pressure adhesive on both sides can be easily bonded to any).
정확히, 이것이 일종의 포인트이고, 이는 임의의 세정된 평활면에 거의 자연적으로 들러붙거나 자연적으로 부착되고, 플라스틱의 이용 가능 범위 및 가공 처리가 널리 개방되기 때문에 압력 민감 접착제이다. 플라스틱의 면에 PDMS 멤브레인의 결합성에 관계없이 폴리카보네이트 또는 폴리스티렌 또는 많은 플라스틱을 적용할 수 있다.
또한, 한쪽에서처럼, 인젝션 몰딩 부분 또는 기계 가공된 부분으로 공압층을 제조하는 경우에 그것을 PDMS 멤브레인에 결합하능하도록 하기 위해 무엇을 해야하는가?(And just as an aside, if you were to make the pneumatic layer as a part of injection molded or machined part, what is done to make it bondable to a PDMS membrane?)
그 플라스틱 표면의 표면을 플라즈마 활성화한 후, 플라스틱 표면과 PDMS 멤브레인 표면에 쉽게 접착되는 실란 또는 유기 실란과 같은 중간체 결합 가능한층에 이를 노출시키는 것을 포함하는 공정이 있다.
도 51Ai-iv의 예는 PDMS에 결합하는 PDMS를 설명한다. 결합 가능한 표면의 결합이 요구되지 않는 영역 R1에서, 도 5A iv는 탄력적인 변형에 의해 반대 방향으로 2개의 PDMS 층의 소모를 보여주고, 점선은 안정화되고, 미소모된 영역 R1에서의 층을 나타낸다. 층의 인접 영역 R2는 최초 표면 대 표면(surface-to-surface) 결합에 의해 단독으로, 또는 화살표 P로 나타내는 외측 가둠(confinement) 또는 압축의 추가된 이익과 접촉하여 유지된다. 따라서, 도는 이전에 기재된 메이크 앤 브레이크 프로토콜의 실행 동안 주기적으로 활성화되고, 연속 영역에서 결합을 가능하게 하지만, 잠재적으로 결합 가능한 표면의 선택된 영역에서 결합을 억제하는 2개의 조건을 설명한다.
예컨대, 영역 R1에서 메이크 앤 브레이크 조건을 생성하기 위해 물리적 연결 및 기계적 이동을 적용하는 것 대신에 툴링 및 제품 디자인을 용이하게 하기 위해, 메이크 앤 브레이크 접촉이 각각의 층의 영역 R1를 균등하게 횡단하여 유체 압력 차이의 적용에 의해 야기되는 것이 바람직하다("유체"는 모든 "액체", 즉 액체 또는 가스를 커버하기 위해 그 포괄적인 의미로 여기에 적용된다). 유체 압력의 이용은, 순환적인 메이크 앤 브레이크 프로토콜 동안 층의 뒤틀림을 방해하는 것을 억제 및 로딩하는 것을 보장한다. 왜곡된 조건을 수행하기 위해, 영역 R1의 후측에 편향 구멍은 편향에 공간을 제공한다. 층의 인접한 영역 R2는 표면 대 표면 결합에 의해 단독으로 또는 가둠 또는 압축의 추가된 이익과 접촉하여 유지된다.
많은 경우에 편리성 및 경제적 이유로, 편향을 생성하기 위해 다른 가스 압력을 적용하는 것이 바람직하다는 것을 발견했다. 예컨대, 액체 압력을 이용하는 것과 관련된 건조의 필요성 또는 특별한 기계적 이동 장치의 디자인의 필요성이 피해질 수 있다. 가스 압력 차이는, 결합이 빠르게 형성되거나 높은 강도의 이용을 위해 또는 조작을 가속화하도록 높은 값의 압력을 이용할 수 있는 이익을 갖는, 특정 채널에 의함으로써 간극 공간에 가스 양압의 적용에 의해 수행될 수 있다.
그러나, 많은 경우에, 가스 압력 차이는 그 편향을 생성하기 위해 층의 외측에 진공을 적용함으로써 생성되는 것이 바람직하다는 것을 발견했다. 하나의 이점은, 제조자가 그 일반적인 이용 동안 장치의 공압 조작과 연관된 것과 같은 장치 자체의 구멍 및 채널을 적용할 수 있는 것이다. 이것에 의해 제조자는 특별하고, 비싼 툴링 및 여분의 제조 단계의 필요성이 감소될 수 있다. 예는, 여기에 기재된 미세유체 카트리지 장치의 제조이다.
도 51Av를 참조하여, 가스 압력 차이를 생성하기 위해 PDMS 층의 후측(외측 표면) 상에 진공을 적용하는 경우, 구멍은 PDMS 층의 후측에 연결된 폐쇄된 진공 챔버이다. 도 51Av는 한 쌍의 접촉 멤브레인 표면들의 각 측 상에 편향 챔버를 나타낸다. 영역 R1의 진공-엑츄에이트된 편향된 상태는 직선으로 도시되지만, 점선은 진공 챔버에 진공이 적용되지 않는 경우에 본래의 릴렉스되고, 비편향된 상태를 설명한다. 바람직하게는, 양압은 순간적인 접촉을 향상시키는 효과를 갖는 두 챔버에 적용되고, 따라서 주기적인 다른 메이크 앤 브레이크 상이 수행되기 전에 필요한 시간을 감소시켜, 영역 R1 내에 층의 중화를 가속화시킨다.
도 51Avi는 단일 멤브레인을 편향하는 어셈블리의 일측 상에만 편향 챔버를 설명한다. 반대측 멤브레인은 R1 풀이 주행되는 경우에 스테이션이 남아 있는 것을 보증하기 위해, 이전에 부착될 수 있는 평면에 대해 완고히 지지되는 것이 도시된다.
도 51Avii는 도 51Avi의 것과 달리 유사한 구조에서 평면 상의 반대측 밸브 시트 및 단일 편향 챔버를 나타낸다.
도 51Aiv-vii 모두의 경우에, 편향 챔버는 목적을 위해 구성된 후 제거되는 툴링을 제조함으로써 형성될 수 있다. 본 출원에서 도시된 미세유체 분석 카트리지의 실시예로 도시된 바와 같은 다른 경우에, 편향 챔버는, 제조 단계의 툴링 비용 및 경제에 대해 많은 명백한 이점을 갖는 최종 미세유체 제품의 부분이다.
도 51Aviii은 복합 미세유체(액체) 채널 네트워크, 메이크 앤 브레이크 프로토콜에 의해 형성된 많은 수의 미세유체 밸브, 및 밸브와 동시에 엑츄에이트되는 다른 공압 제어된 피처를 갖는 미세유체 카트리지를 설명한다.
많은 밸브 상에, 또는 이하에 설명되는 것과 같은 많은 다른 피처 상에, 또는 많은 밸브와 많은 다른 피처의 조합 상에 동시에 이러한 메이크 앤 브레이크 조작을 수행하는 많은 명백한 기술적 이점 및 유용한 효과가 있다. 예컨대, 제조의 관점으로부터, 복잡한 구조가 한번에 모든 피처를 엑츄에이팅 및 진공 또는 압력의 형태로 단일 공압력 만을 적용함으로써 제조될 수 있는 것이 용이할 수 있다. 이러한 과정은 제조 공정의 낮은 비용 및 낮은 복잡성의 이익을 포함한다.
나타낸 바와 같이, 유연한 시트의 비결합 측 또는 외측 상에 적용되는 양압 및 공압 진공의 사이클을 이용하는데 수많은 이점이 있다. 휴대용 미세유체 분석 카트리지의 제조 시에 메이크 앤 브레이크 프로토콜의 이러한 진공 편향은 매우 이점을 갖지만, 더욱 넓게 보면, 본 발명의 유체를 활성화하는 실시형태의 본질은, 어떤 매체가 적용되거나 또는 어떤 측 상에 더 큰 압력이 적용되는지에 상관없이 층을 횡단하여 차이가 있는 유체 압력을 적용함으로써 멤브레인 층의 영역의 편향을 가지고 해야 한다(has to do with deflection of a region of a membrane layer). 특히, 이점이 시트 형태의 층들 사이에 적용되는 공압력에 의해 층을 횡단하여 차이가 있는 가스 압력을 생성하고, 즉 붕괴와 접촉을 야기하기 위해 시트 형태의 층들 사이에서 음압 및 하나 또는 두개의 층들의 편향을 야기하기 위해 양압을 적용하는 것으로 얻어지는 중요한 환경이 있다.
양압을 적용하는 이점 중 하나는, 멤브레인을 편향하기 위해 진공을 적용하여, 적용될 수 있는 최대 압력이 1 대기압, 약 -14 psi인 것에 관한 것이고, 이는 멤브레인에 적용되는 편향력을 제한하지만, 시트들 사이에 적용되는 양압은 시트들 사이에 생성하기 위한 분리를 일으키기 위해 크기에 거의 제한이 없다.
바깥쪽으로 멤브레인의 편향을 생성하기 위해 양압을 적용하는 것에 대해서, 편향 구멍에 대한 2가지 대안, 하나는 층의 외측 표면을 연결하지만, 층의 편향 거리에 대해 제한하지 않고 개방된 벽에 의해 정의된 편향 슬롯에 대한 것, 다른 하나는 벽을 갖지만, 천장으로 폐쇄된 챔버에 대한 것이 있다. 가압된 편향용 개방 또는 폐쇄 구멍의 벽은 편향 면적의 물리적인 주위를 정의하여, 영역 R1 및 R2 및 메이크 또는 브레이크 공정이 일어나는 면적을 정의한다. 단일 개방 슬롯을 이용하는 경우에, 편향의 제한은 적용될 압력 및 멤브레인의 탄력적인 특성의 기능이고, 보통의 양압을 이용하는데 가장 유용할 수 있고, 또는 멤브레인의 강도에 관한 오차에 대해 충분한 경계가 있다. 천장을 갖는 챔버를 사용하는 것은, 바깥쪽 편향에 대해 추가적인 물리적 제한을 생성하고, 이는 멤브레인의 파단 또는 폭발의 유해한 효과로부터 멤브레인을 잠재적으로 보호할 수 있고, 예컨대, 특히 박형 멤브레인 또는 특히 놓은 외향력이 적용되는데 유용할 수 있다.
지금까지 설명에서, 유연한 편향 가능한 시트는 모놀리식이고, 도 51Ai 내지 viii의 실시예에서는, PDMS였다. 컴포지트 시트는 대신 다층으로 이루어지고, 기본 요건이 탄력적인 편향이 가능하도록 유연하고, 내부면이 결합 가능한 것이 사용될 수 있다. 본 발명의 넓은 실시형태에 따라 필요하지 않지만, 컴포지트의 결합 가능한 면은, 모놀리식 또는 컴포지트일 수 있는 캐리어 시트 상에 코팅으로 또는 분리된 시트로 미리 형성된 표면 활성화된 PDMS인 것이 유리하다. 도 51Aix의 실시예에서, 컴포지트는 물질의 서로의 층에 조합되는 결합 가능한 미리 형성된 층을 포함한다. 예컨대, 결합 가능한 층은 표면-활성화된 PDMS 및 PDMS을 제외한 물질의 미리 형성된 층의 지지층, 예컨대 호환 가능한 물질의 제2차 미리 형성된 유연한 시트에 라미네이트된 시트, 또는 불꽃 또는 플라즈마 처리와 같은 처리를 이용함으로써 또는 서로 결합될 수 있는 사이에 있는 층을 이용함으로써 호환 가능할 수 있다. 예컨대, 제2층은 환경(the resi and the circumstances)에 적합한 블로잉되거나 캐스팅된 필름 시트로 제조된 폴리우레탄 또는 폴리카보네이트, Mylar TM (PET)의 미리 형성된 시트일 수 있다. 도 51Ax는 결합 공정용 제조 시에 활성화된 표면을 갖고, 일반적으로 약 1 내지 3 미크론의 두께의 PDMS 물질의 박형 코팅으로 코팅되는 유연한 미리 제조된 지지 시트를 설명한다. 예컨대 지지층은 두께가 약 5 내지 15 미크론인 Mylar TM (PET)일 수 있다.
도시되지 않지만, 또 다른 실시형태에서, PDMS의 필수적으로 모놀리식인 층은, 컴포지트의 가스-베리어 특성을 개선시키는 것과 같은 목적을 위해 다른 물질의 외측 코팅을 수반할 수 있다.
도 51Axi는 유연성을 증가시키는 피처를 갖지만 도 51Ax의 것고 유사한 라미네이트 구조를 설명한다. 이는 유연한 외측 시트가 PDMS 시트에 결합되는 조건에 유용하고(또는 이는 PDMS 표면 코팅을 갖는 유연한 시트일 수 있음), 유연한 시트는 PDMS보다 덜 유연하고, 예컨대 편향 능력을 증가하기 위해 컴포지트는 증가된 유연성을 보이고, 따라서, 밸브 또는 펌프의 유동 능력은 편향 가능한 멤브레인에 의해 형성되는 것이 바람직하다. 설명되는 원리는 지지층의 두께의 감소 또는 중단을 이용하는 것이다. 중단은, 도시되는 정의된 면적 Rls의 주위를 연장하는 지지층에 단일 모트, 진공 배치된 또는 압력 배치된 활성 프로토콜의 활성 동안 PDMS의 유연성이 대부분의 스트레칭을 수행시킨 결과로서 더 큰 변위를 발생시키는 일련의 동축 모트일 수 있다.
유연한 멤브레인의 물질 선택에 관한 피처의 유리한 효과 및 소정의 기술적 이점을 요약을 통해:
PDMS는 쉽게 결합되고, 유연하고, 쉽게 기계 가공되는 저비용 물질이고 또는 기재된 편향 가능한 멤브레인 피처와 협력하기 위해 채널 표면으로 쉽게 형성되는 이점이 있다. 라미네이트 구조의 특정 경우에, 도 51Axi의 것을 포함하는 것은 공기 경로를 차단하거나 구조의 전체 가스 투과 계수를 감소시키기 위해 PDMS를 제외한 물질의 능력이다. PDMS는 높은 정도의 가스 투과성을 갖는 것이 알려져 있지만, 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및 폴리에틸렌과 같은 다른 플라스틱 물질은 PDMS에 상대적으로 매우 낮은 투과성을 보인다. 이는, 양압이 밸브를 엑츄에이팅하고, 맴브레인을 통해 유체 채널로 가스가 투과하는 것을 억제하여, 해로운 효과를 가질 수 있는 버블을 형성하는데 사용되는 미세유체 형태 장치에서 매우 이점을 가질 수 있다. 예컨대, 많은 분석 유동 조건 하에서, 시약 스트림에 들어가는 공기 버블은 포획제에 접착하고 결합을 억제할 수 있다: 공기 버블은 표면의 완전한 웨팅(wetting)을 억제하여, 포획제가 관심 있는 항원을 포획하는 것을 억제할 수 있다; 또한, 공기 버블은 미세유체 채널의 유체를 대체하여, 미세유체 시스템이 유체의 관점으로부터 덜 뻣뻣해질 수 있고, 유동 속도의 가변성이 증가하고, 정량 분석을 손상시킬 수 있는 유동 속도의 불확실성을 야기할 수 있다.
마지막 도, 도 51Axi의 유리한 효과 및 기술적 이점에 대해서. 이는, 유연한 시트/PDMS 라미네이트의 더욱 뻣뻣하지만 다소 유연한 공기 불침투성의 지지 시트 부분으로 커팅되는 일련의 좁게 정의되는 모트 또는 채널을 적용한다. 모트는, 더 딱딱한 성분, 예컨대 Mylar TM (폴리에스테르) 또는 폴리에틸렌이 팽창성의 스프링으로 작용하여 더 큰 편향을 얻기 위해 언더라잉 유연한 PDMS를 이용하여 편향시키도록 한다. 따라서, 미세유체 밸브 내에 공기 투과성을 감소시키기 위해, 상대적으로 뻣뻣한 지지층의 감소된 투과성이 얻어지면서, 멤브레인이 개방 위치로 편향되는 경우에 조합하는 밸브 시트를 횡단하여 유동을 개선 또는 적합하게 하는 밸브 시트로부터 강화된 멤브레인 편향을 수행한다. 이는, 장치의 물질을 결합하기 위해 다양한 접근이 적용되는 경우에 이러한 이점이 얻어질 수 있는 것과 같은 그 권리에서의 신규 특성이다.
도 51Avi를 참조하면, 단일 편향 가능한 멤브레인 실행, 유연한 멤브레인 PDMS 결합면 반대에 고정된 결합 가능한 표면은 동일한 물질로 한정되지 않고, 이점이 다양한 결합 가능한 표면에 의해 얻어지는 환경이 있다. 도 51Axiv를 참조하여, 편향 가능한 멤브레인은 PDMS 결합 가능한 표면을 가지지만, 반대 결합 가능한 표면은 결정 또는 비정질 실리콘, 비정질 실리카, 실리케이트 및 세라믹을 포함하는 경성의 실리콘계 물질에 의해 제공된다. 실리콘의 경우에 또는 세라믹의 절연 특성 및 특정 강도 특성 또는 광학 투명도가 낮은 자동형광 광학 평활성의 형태로 실리카의 유리한 특성을 가짐으로써, 다양한 열전도성, 전기 전도성 또는 전기 접촉을 가하기 위한 능력의 이들은 유리할 수 있다.
도 51Axv은 중간 2기능성 층을 적용하는 합성 수지 또는 금속 기반 장치에 표면 활성화된 PDMS 결합 가능한 표면을 갖는 유연한 멤브레인의 적용을 설명한다. 예컨대, COC (cyclical olefin polymer), COP (cyclical olefin copolymer), 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리스티렌을 포함하는 공지의 플라스틱의 표면은 표면 활성화될 수 있거나 또는 산화물 층을 쉽게 형성할 수 있는 알루미늄 또는 철과 같은 금속이 적용될 수 있다. 이러한 표면은 산화물층을 형성하기 위해 오가널(organol)과 같은 중간 2기능 층으로 변형될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 휴대용 미세유체 카트리지(2)는 사용자에 의해 조작 및 스캐닝 기기에 플레이싱된다. 스캐닝 동안 분석을 수행하는데 카트리지가 유지되는 용기(receptacle) 또는 수용 면적(reception area)(6)에 카트리지가 들어간다.
적당한 용기는 도 54 및 54a에 도시되고, 분석/위치 리딩 시, 용기 및 카셋의 관계는 도 55에, 그 상세는 도 55a에 도시된다. 전체 시스템의 실행은 도 56에 확대도로 도시된다. 도 56은 정상 대물 렌즈에 대해 그 캐리어 상에 카트리지를 이동하는 x, y 정확히 이동 가능한 스테이지(13)를 포함한다.
도 54 및 54a를 참조하여, 카트리지(2) 및 카트리지 용기(6)는 클램핑 기기(12) 및 공압 계면(8)과 함께 도시된다. 카셋과 함께 스테이지 상에서 이동하는 일련의 컴퓨터-조작된 솔레노이드 밸브(9)는 위치된 카셋과 접촉하는 포트에 공기 양압 및 음압을 인가한다.
도 57은 유체 네트워크에서 온-보드 멤브레인 미세밸브 및 미세피스톤을 엑츄에이트하기 위해 일련의 유체 네트워크 및 공압 채널 네트워크를 설명하는 카트리지 내에 미세유체의 형태를 설명한다. 도 57a에서의 유체 네트워크는 오버라잉 탄력적 멤브레인, 예컨대 PDMS의 연속층에 의해 폐쇄되는 8개의 개별의 미세유체 서킷을 포함한다. 각각의 이들 서킷은 많은 미세유체 채널, 밸브 위치 및 피스톤 위치를 갖는다. 이러한 멤브레인의 부분은 밸브 및 펌프 구멍을 정의하는 채널에서의 형성물(formations)에 위치된다. 멤브레인의 대응하는 부분은 밸브 및 피스톤의 이동 가능한 엘리먼트를 정의한다.
도 57b의 공압 채널 네트워크는 도 57c에 오버레이로 도시된다. 엑츄에이트될 필요가 있는 다양한 피처에 대해 유체 네트워크가 매치된다.
도 58은 샘플, 버퍼(세정), 분석 리딩 염료, 2차 항체 및 폐기물을 포함하는 다양한 시약 또는 저장소 입구 및 밸브, 피스톤을 포함하는 많은 미세 피처를 설명하는 도 57의 서킷 중 하나의 확대도이다. 각각의(분리 가능한) 4개의 채널에서 흑색으로 나타내는 4개의 엘리먼트 GNR은 그 채널에 임베딩된 유리 나노-리엑터(GNRs)를 나타낸다. 이는 카트리지가 수용하도록 고안된 샘플의 수에 따라 달라지는, 카트리지의 몇번이고 복제된 베이직 미세유체 유닛을 설명한다. 도 58의 왼쪽에 도시된 분석 프로토콜 유동 시퀀스는 최초 유동 단계로 시작하고, 샘플 단계, 세정 단계, 2차 항체 단계, 다른 세정 단계, 포획 부위에 리딩 염료를 부착하도록 반응하기 위한 염료 단계, 및 최종 다른 세정 단계가 이어진다. 이는 이러한 미세유체 구조에서 수행될 수 있는 예시적인 분석 시퀀스를 설명한다. 유체 중 하나의 각각: 샘플, 2차(예컨대 2차 항체), 세정 및 반응 염료는 각각의 피스톤에 의해 형성되는 펌프 및 업스트림 및 다운스트림 밸브의 활성화에 의해 각각의 주입 웰로부터 유동하는 것이 야기되고, 각각의 염료로 라벨링된 검출 엘리먼트에서 포획된 부위의 최종 결과는 분석의 결과를 정량화하도록 리딩할 준비가 되었다. 이러한 장치에 적용되는 체적의 예는 20 마이크로리터의 샘플, 150 마이크로리터의 버퍼(표에 도시된 바와 같음)를 포함한다-미세유체 서킷의 총 체적은 약 1.8 마이크로리터이다.
도 98에서, 휴대용 미세유체 카트리지 상의 4개의 미세채널이 설명되고, 각각은 2개의 모니터 위치를 갖는다. 다른 논의는 각각의 채널에 모니터 위치 1, 2, 3, 4의 첫번째 세트에 관한 것이다. 도 98a에서, 개별의 상을 갖는 설명적 분석의 3개의 다른 조작은 시간 tl, t2, 및 t3로 나타낸다. 샘플 4개 채널에 카트리지 상에 4개의 다른 위치에서, 시간 t1에, 상 1에서, 추적 시그널은 허용 속도 내에서 예상되는 명목상의 값으로 측정된다. 따라서, 성공적인 상 1 배치가 고려된다. 시간 t2에서 상 2에서, 명목상 수준은 거의 0이고, 이는 의도적으로 추적자가 없는 버퍼 또는 일부 유체가 특정 상에서 채널에 적절히 유동되는 것을 나타낼 수 있다. 시간 t3에서, 상 3에서, 채널에서의 제3 시약 또는 유체는, 상과는 다르지만, 허용 가능하고 예상되는 범위 내에서 명목상의 값으로 발생하도록 검출되는 추적자 레벨을 갖는다. 그래서, 상 1, 2, 및 3에 관한 전체 조작은 성공적인 것으로 간주될 수 있다. 이는 고장 없이 적절한 조작을 나타낸다.
도 98b는 동일한 분석의 다른 주행을 설명한다. 상 1에서, 시간 t1에서, 고장은, 검출되는 추적자 시그널이 허용 가능한 범위 외측(그, 이하)에서 일어나는 것이 발생한다. 채널 1에서, 추적자 시그널은 존재하는 것으로 도시되지만, 허용 범위보다 낮고, 채널 4에서, 검출된 추적자 값은 존재하지 않는 것으로 도시된다. 도 98c에서, 분석 주행의 시간 t1에서, 4개의 채널 모두는 허용 가능한 범위 이하에 검출 가능한 추적자 시그널을 갖는 것으로 도시된다. 그러나, 4개의 시그널 모두는 동일하고 균일하다는 것을 주목한다. 이는, 그 카트리지 내에 독립적인 고장 모드는 없는 것을 나타내지만, 아마도 사용되는 시약을 생성하기 위해 부적당한 희석액이 사용되는 것을 나타낸다.
밸브가 완전히 개방되지 않거나 완전히 폐쇄되지 않거나 피스톤이 가득 연장 또는 리프트로 조작하지 않는 것을 야기할 수 있어, 이들 유체 체적은 예상되는 것이 아닐 수 있는 공압 시트의 부적당한 계면과 같은 다른 고장 모드가 있다. 시그널 모드의 체계는, 예컨대 시그널 대 노 시그널, 단순한 디지털 리스펀스의 가장 간단한 경우, 및 시그널의 정량 값이 기대를 충족하지 못하는 다른 경우에 구성될 수 있다.
디지털 리스펀스에서, 정량화는 없다. 시그널은 존재하거나 없거나 이다. 복잡성의 더한 레벨은 레벨을 정량화하고, 단지 온 오프가 아닌 허용 가능한 레벨의 범위인(허용 범위) 수용 가능 레벨과 그 양을 비교하는 것을 포함한다. 이 정량화 기술은, 적당한 희석액 또는 적당한 농도 또는 적당한 시약이 적당한 위치에 사용되는지 결정하기 위해 사용될 수 있다. 정교함의 다른 유리한 레벨은, 예상된 일시적 리스펀스에 대한 시그널의 일시적인 리스펀스를 얻기 위해, 시간에 걸쳐 시그널 구조를 모니터링 및 분석하는 것이다. 이는 더욱 상세한 설명을 필요로 한다.
도 99를 참조하여, 검출된 추적자 시그널의 변화는, 예컨대 약 20-50 미크론 길이의 길이 부분에서 약 100 미크론의 폭 × 약 100 미크론의 깊이의 미세유체 채널의 고정된 위치를 시간에 걸쳐 모니터링하면서 도시된다. 따라서, 채널 내에 매우 특별히 분리된 위치는 3개의 다른 상에서 모니터링된다. 도시된 첫번째 상은, 채널 내에 유동이 일어나지 않지만, 채널은 임의의 형태의 검출 시그널, 예컨대 검출된 형광을 제공하는 소정의 농도의 추적자와 섞인 시약에 제공되는 조건을 나타낸다. 도 99의 상 2는 시그널의 변화가 이어지고, 이는, 추적자를 갖는 시약이 추적자가 들어 있지 않은 세정 액체 또는 버퍼 시약과 같은 추적자 없는 시약으로 대체되기 때문에 시간에 걸쳐 감소되는 것을 보여준다.
새로운 시약이 추적자를 갖는 오래된 시약으로 대치되기 때문에, 시그널 변화는 상 2에서 매우 빠르게 쇠퇴되고, 시그널은 내려간다. 그 후, 도 99의 상 3에서, 대체 공정은 중단되고, 시그널는 상 3 동안 전체 유동 없이 모니터링된다. 이는 채널의 성공적인 세정을 나타낸다.
따라서, 하나의 위치에서 바라보는 이점은, 위치에서 일어나는 실시간 변화를 응시하는 것이고, 또한 광 표백되는 형광 염료를 이용하는 경우에, 이 추적에서 나타내지 않지만, 미세유체 장치에서 일어나는 상세한 것을 정확히 반영하는 이후 추적에 나타내는 미세 구조를 응시하는 것이다.
특정 위치에서 보는 다른 이점은 최적화된 프로토콜의 진행 시에 정보를 얻는 것이다. ELISA 또는 다중 시퀀스의 시약을 포함하고 이후 새로운 시약을 흘러내리게 하는 것을 포함하는 임의의 다른 분석의 진행 상에서, 분석 공정의 이후 상이 단호히 확립되는 것을 보증하기 위해, 이전 시약이 완성되었는지, 실시예에 대해 얼마나 많은 사이클 또는 얼마나 긴 또는 어떤 형태의 유동 속도가 요구되는지를 아는 것이 중요하다. "개방 프로토콜(open protocol)"이란 모니터링된 분석을 말한다. 이러한 분석에서, 사전에 미세유체 시스템을 특성화하는 것이 필수적으로 중요하다. 기재되는 기술은 시스템을 특성화하고 프로토콜을 최적화하기 위해, 분석의 시험 주행 동안 사용될 툴로서 사용될 수 있다. 예컨대, 불충분한 흘러내림 또는 세정 단계가 적용되는 경우에, 잔여 시약은 분석을 시행하는데 해로울 수 있는 상에 존재할 것이다. 이러한 잘못된 시약의 존재는 그 각각의 추적자의 존재에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 이는 실행을 평가하고, 분석 프로토콜을 최적화하기 위해 유리한 기술이다.
일 실시형태는, x, y 이동 가능한 표 상에서 진행되는 카셋을 제공하는 것이다. 표는 검출 시스템, 예컨대 광학 시스템에 대해 임의의 선택된 위치에 인덱스되고, 분석은 그 위치로부터 시그널을 검출하면서 주행될 수 있다. 분석을 주행 및 리딩하도록 구성된 시판 기기는, 최적화된 프로토콜을 진행하는 곳으로 돌아가는 진행 데이터(development data)를 생성하기 위해 요구되는 실질적으로 모든 기능을 갖는다.
도 100은 예컨대 도 99의 위치 2로 돌아가는 것을 참조하는 미세유체 장치에서의 단일 위치에서 바라볼 때, 추적자 시그널의 시간 리스펀스를 설명한다. 채널의 액체 내에 존재하는 추적 염료는 시간에 걸쳐 계속해서 광 표백되도록 선택된다. 예로, 적색 레이저 다이오드는 적색-여기 가능한 형광 추적 물질로 적용된다. 유체가 정상(stationary)인 경우, 광 표백 공정이 관측되고, 검출된 시그널은 시간과의 함수로 소모된다. 소모 속도는 레이저 전력 및 염료의 형태 및 농도에 따라 달라진다.
유동은 진동하는 방법으로 채널에 도입될 수 있다. 분석의 일반적인 조작으로 유동의 진동의 목적은 고정화된 포획 항체를 갖는 샘플 내에 항원과 같은 포획 부위를 갖는 미지의 농도 샘플에 존재하는 분석물질의 상호 작용을 강화하는 것이다. 액체의 일반적인 정의된 체적("슬러그(slug)")은 검출점에 노출된 체적보다 더욱 큰 고정된 체적이 사용된다. 액체의 진동하는 슬러그의 부분이 이동하는 경우, 포획 부위 및 앞뒤를 노출하도록 돌아오기 전에, 이 부분에서 일어나는 확산 시간이 물질을 평행이 되게 한다(allows time for diffusion to take place in those portions to bring the material into equilibrium before it comes back for exposure to the capture site, and back and forth). 돌아오는 언제라도, 일부 퍼센트의 항원과 같은 포획 부위 가장 근처에 분석물질은, 그 서브 체적을 소모하는 샘플의 서브 체적 중 포획 및 드로잉된다. 그 후, 이는 흘러가버리기 때문에, 확산은 서브 체적이 다시 평형을 맞추고, 제시간에 실질적으로 평형 농도에 도달하게 하고, 포획제 주변에 서브 체적을 다시 보충한다. 또한, 포획 부위를 갖는 최적화 조건에 의해 반응을 실질적으로 최적화하고, 포획 부위와 상호 작용하도록 모든 서브 체적에 대해 최적의 기회를 제공하기 위해, 유동은 앞뒤로 진동된다.
도 100를 다시 참조하면, 검출된 추적자 시그널의 시간 리스펀스는 진동 유동을 갖는 시나리오에서 제공된 모니터링 위치로부터 도시된다. 형광 염료는 형광 표백이 행해지도록 사용된다. 유체 앞뒤의 진동수에 기인하여 제공된 시간 시퀀스 및 주기에서 피크 앤 벨리(peaks and valleys)로 위 아래 시그널 구조 또는 피크와 같은 특성을 관측한다. 그래서, 위치로부터 유체의 전체 유동이 없지만, 진동으로, 신선한 시약을 갖는 시약의 광 표백 부분을 보충할 기회가 있다. 빠르게 여기 빔에 의해 통과하는 유동 속도가 최대인 경우에, 광 표백 소멸 속도는 새로운 시약의 보충에 의해 상쇄된다. 이는 피크 표지된 "최대 유동 속도(max flow rate)"로 나타낸다. 진동 유동의 유동 속도가 0으로 가는 회송점(turnaround point)에서, 광 표백 소모는, 이 그래프 상에 "최소 유동 속도(min flow rate)"라 표지된 밸리로 나타내는 최대이다. 이 특정 그래프에 도시된 상세로부터, 주파수 및 피크와 같은 특성 이외에, 2개 형태의 피크, 더 큰 피크와 더 작은 피크가 있는 것을 볼 수 있다. 더 큰 피크는, 피스톤은 진공 엑츄에이션 아래인 경우, 특정 유체 장치에서 가장 빠르게 피스톤을 움직임으로써 구동되는 유동과 관련된다. 더 작은 피크는 양압으로 엑츄에이트되는, 피스톤이 더 느리게 이동하는 경우, 피스톤 이동에 의해 생성된다. 엑츄에이팅 음압 값은 양압 값보다 더 크고, 따라서 피스톤의 이동의 더 큰 속도를 유도한다. 예컨대, 펌프의 멤브레인 격막을 엑츄에이팅 하는 음압은 약 -8 또는 -10 psi이고, 피스톤의 양압 엑츄에이션은 약 4 psi 이하이다.
도 100에 도시된 시그니처는 보통의 조작을 나타낸다. 공압 계면이 적절히 밀봉 또는 시팅된 후, 이들 피크의 높이가 보통의 허용 범위 외측의 다른 수준으로 일어나는 경우에, 이는 검출될 수 있는 고장 모드의 형태이다. 여기에 관련된 다른 요소는 피스톤의 이동 체적 및 미세유체 채널에서의 유체의 임피던스에 따라 달라지는 유동 속도이다. 임피던스가 오염원 또는 일부 다른 문제로부터 폐색의 추가에 의해 증가되는 경우에, 이러한 검출 엘리먼트는 채널에서 자리를 잘못 잡게 된 후, 시그니처 구조의 특성은 이 그래프에 예상 및 도시되는 것과는 달라질 수 있다.
도 100에 도시된 흔적 및 도 98a-99의 검출된 값은, 도 26에 개략적으로 도시된 이미징 시스템에 의해 분석의 단계 동안 형광 강도를 포획함으로써 얻어진다. 이는 대물 렌즈 및 일련의 광학 엘리먼트를 갖는다. 레이저로부터의 여기 빔은 도 102의 미세유체 채널에 모니터링 위치에 도입된다. 광학은, 광 검출기(바람직한 실시형태에서, CCD 카메라)로 도시되는 이미지 평면에 도 102를 참조하여 자극된 형광의 대상을 변형한다. 카메라 상에 포획되는 관심 영역(ROI) 내에 픽셀의 강도는, 제시간에 그 순간 동안 그 프레임에 단일 강도점을 생성하기 위해 합쳐진다(통합된다).
도 102에서, 레이저 빔은 타원형의 단면으로 나타내지만, 직사각 박스는, 타원형이, 단일 산물의 단일점을 생성하기 위해 픽셀의 강도가 통합되는 관심 영역(ROI)을 나타내는 것을 제한한다. 그 때 이 점에서의 값은 도 100의 그래프 상에 점으로 플로팅된다.
스캐닝 시스템은 분석 포획제가 고정화된 검출 엘리먼트의 정보를 얻기 위해 분석 결과를 리딩하는 동안 적용되고, 이후에 기재되는 스캐닝 도를 참조한다. 그러나, 광학과 미세유체 시스템 사이의 상대적인 이동에 의한 도 102에 나타낸 바와 같은 모니터링 모드에서, 시스템은 검출 엘리먼트가 존재하지 않는 점에서 유체-이동 채널 상에 선택된 모니터링 점에 초점을 맞춘다.
도 101 및 102의 광학 배열은 도 100의 시그널 흔적 또는 도 98a-98c의 모니터링점에서 "스냅 샷", 또는 도 99의 시간에 걸친 측정을 생성하기 위해 사용된다.
신규 추적자 검출 기술의 다른 중요한 이용은, 미세유체 카셋의 작은 피처에 적절한 스케일로 위치가 일부 변이되는 카트리지 위치에 대해 휴대용 카트리지(카셋) 내에 높은 신뢰성을 갖는 미세유체 채널의 위치를 확인한다. 이는 스캐닝/분석 수행 기기의 바람직한 실행을 설명한 후 더 기재된다.
바람직한 실시형태에서, 휴대용 미세유체 카트리지(2)는 사용자에 의해 작동 및 스캐닝 기기로 플레이싱된다. 이는, 스캐닝 동안 분석을 수행하기 위해 카트리지가 유지되는 수용 면적(6) 또는 용기에 들어간다.
적당한 용기는 도 54 및 54a에 도시되고, 분석/리딩 위치일 때 용기 및 카셋의 관계는 도 55 및 도 29a의 상세에 도시된다. 전체 시스템의 실시형태는 도 56의 확대도에 도시된다. 도 56은 정지상 대물 렌즈에 대해 캐리어 상에 카트리지를 움직이는 x, y 정확히 이동 가능한 스테이지(13)를 포함한다.
도 54 및 54a를 참조하여, 카트리지(2) 및 카트리지 용기(6)는 클램핑 기기(12) 및 공압 계면(8)과 함께 도시된다. 카셋과 함께 스테이지 상에서 이동하는 일련의 컴퓨터-조작된 솔레노이드 밸브(9)는 위치된 카셋과 접촉하는 포트에 공기 양압 및 음압을 인가한다.
적합한 즉각적인 이미지 사이즈의 도 102를 다시 참조하면, 약 12 미크론의 폭 × 250 미크론 길이의 스팟 사이즈로 대물 렌즈를 통해 이미징된 여기 빔을 사용하는 것이 적당하다. 그 스팟을 포함하는 카메라의 관심 영역(ROI)은 약 35 미크론의 폭 × 250 미크론의 길이의 면적을 갖는다. 모니터링할 카셋의 미세유체 채널은 약 180 미크론 폭의 채널을 갖는다.
이러한 빔으로 추적 염료를 모니터링하기 위한 3가지 시나리오는: (1) 연속 스캐닝 모달리티(Continuous Scanning Modality). 미세유체 채널은 예컨대 카트리지와 같은 미세유체 시스템의 모든 채널을 횡단하여 실질적으로 일정한 속도를 가지고 스캐팅된다. 이 경우에, 빔은 채널을 횡단하고, 채널이 횡단하는 시간과의 함수로 또는 위치와의 함수로 형광 강도를 측정한다. (2) 빠르게 시프트-모멘터리 드웰 모달리티(A Rapidly Shift-Momentary Dwell Modality). 이 경우에, 검출 축은 미세유체 시스템에, 선택된 위치에, 모멘터리 드웰, 예컨대 몇초에 상대적으로 빠르게 움직이고, 스캐닝 시스템 중단 시, 광학 검출 시스템은 고정된 위치에서 시간과의 함수로 추적자 정보 또는 추적자 시그널을 응시하고 수집한다. 그 후, 세이지(sage)는 응시를 반복하기 위해 다른 위치까지 이동하고, 이는 짧은 기간에 미세유체 시스템에서 많은 위치에서 행해진다. (3) 긴 응시 모달리티(Long Stare Modality). 이 경우에, 단일 위치는 시스템이 연장된 기간, 예컨대 수초 또는 수분 동안 중단 및 시작하는 때에 선택된다. 이는 특정 펌핑 또는 유체 조작 단계를 특성화할 수 있다. 이는 특히, 사전의 2개의 스캐닝 모달리티 중 하나의 결과로 측정되는, 특정 위치에서 의심이 되는 경우에 유용하다.
시스템 및 방법은, 매번의 분석의 및 디자인의 진단 툴로 유용한 다른 것의 조작 동안 모니터링하기 위해 유용한 실시형태를 갖는다.
매번의 분석을 모니터링에 대해서, 스캐팅 모달리티는 특히 유용하다. 이는, 예컨대 분석의 실행의 각각의 상 동안 이를 반복하는 카트리지 상에 미세유체 시스템의 모든 채널을 횡단하여 스캐팅하는데 사용된다. 또한, 그 위치에서 흔적을 수집하기 위해 짧은 기간 동안 다양한 위치에서 중단하고, 보통의 분석 기능을 모니터링하는 경우에 시간에 걸쳐 유동을 특성화하도록 응시를 위한 긴 간격을 중단할 수 있다.
미세유체 카셋의 현재의 바람직한 실시형태 및 어떻게 스캐닝이 수행될 수 있는지에 대해서는 도 57a, b, c 유체/공압 구조물 및 도 58 유체 구조물 및 프로토콜을 참조한다.
도 57은, 유체 네트워크에서 온 모드 멤브레인 미세밸브 및 미세피스톤을 엑츄에이트하기 위해 일련의 유체 네트워크와 공압 채널 네트워크를 설명하는 카트리지 내에서 미세유체 형태를 설명한다. 도 57a에서 유체 네트워크는, 오버라잉 탄력적 멤브레인, 예컨대 PDMS의 연속층에 의해 폐쇄되는 개별의 미세유체 서킷을 포함한다. 각각의 이들 서킷은 많은 미세유체 채널, 밸브 위치 및 피스톤 위치를 갖는다. 이러한 멤브레인의 부분은 밸브 및 펌프 구멍을 정의하는 채널에서의 형성물(formations)에 위치된다. 멤브레인의 대응하는 부분은 밸브 및 피스톤의 이동 가능한 엘리먼트를 정의한다.
도 57b의 공압 채널 네트워크는 도 57c에 오버레이로 도시된다. 엑츄에이트될 필요가 있는 다양한 피처에 대해 유체 네트워크가 매치된다.
도 58은 샘플, 버퍼(세정), 분석 리딩 염료, 2차 항체 및 폐기물을 포함하는 다양한 시약 또는 저장소 입구 및 밸브, 피스톤을 포함하는 많은 미세 피처를 설명하는 도 58의 서킷 중 하나의 확대도이다. 각각의(분리 가능한) 4개의 채널에서 흑색으로 나타내는 4개의 엘리먼트 GNR은 그 채널에 임베딩된 유리 나노-리엑터(GNRs)를 나타낸다. 이는 카트리지가 수용하도록 고안된 샘플의 수에 따라 달라지는, 카트리지의 몇번이고 복제된 베이직 미세유체 유닛을 설명한다. 도 58의 왼쪽에 도시된 분석 프로토콜 유동 시퀀스는 최초 유동 단계로 시작하고, 샘플 단계, 세정 단계, 2차 항체 단계, 다른 세정 단계, 포획 부위에 리딩 염료를 부착하도록 반응하기 위한 염료 단계, 및 최종 다른 세정 단계가 이어진다. 이는 이러한 미세유체 구조에서 수행될 수 있는 예시적인 분석 시퀀스를 설명한다. 유체 중 하나의 각각: 샘플, 2차(예컨대 2차 항체), 세정 및 반응 염료는 각각의 피스톤에 의해 형성되는 펌프 및 업스트림 및 다운스트림 밸브의 활성화에 의해 각각의 주입 웰로부터 유동하는 것이 야기되고, 각각의 염료로 라벨링된 검출 엘리먼트에서 포획된 부위의 최종 결과는 분석의 결과를 정량화하도록 리딩할 준비가 되었다. 이러한 장치에 적용되는 체적의 예는 20 마이크로리터의 샘플, 150 마이크로리터의 버퍼(표에 도시된 바와 같음)를 포함한다-미세유체 서킷의 총 체적은 약 1.8 마이크로리터이다.
도 61은, 각각의 피스톤 및 밸브가 이 채널에 만들어진 펌프를 정의하는 각각에 4개의 독립적인 유동적으로 분리된 미세유체 채널을 나타내는 개략적인 방법으로 동일한 미세유체 유닛을 설명한다. 도는 값을 나타내는 x's를 함유하는 많은 서클로 종결하는, 오버레이되는 제어된 공압 제어선을 나타낸다. "채널 스캔 1 발견(Find channel scan 1)" 및 "채널 스캔 2 발견(Find channel scan 2)"으로 표지되는 화살표를 갖는 수평선은, 형광의 강도를 확인하고, 따라서 각각의 유체 채널의 위치를 확인하기 위해 미세유체 시스템을 수반하는 스테이지 또는 스캐너가 이동하는 경로를 설명한다. 각각의 스캔 모션이 경로를 따라 이동함으로써, 도식에 근접한 도시된 흔적을 생성할 것이다. 중앙에 도시된 상부 및 하부의 흑색 및 백색 흔적은 흔적 상에 도시되는 피크에 근거하여 채널 1, 2, 3, 및 4에서 높은 형광 강도를 설명한다. 이는, 각각의 채널에서 액체 중의 양성의 추적자(benign tracer) 때문에, 그 경로를 횡단하는 스캐닝이 높은 형광성을 접할 때의 스캐너를 설명한다. 그 후, 채널의 위치는 그 흔적 상에 겹쳐진 인코더 정보를 입수함으로써 매우 정확히 결정된다. 따라서, 이 채널의 정확한 위치는 스캐닝 시스템의 절대 좌표 프레임에 대해 결정된다. 스캔의 정확한 위치는 x, y 스테이지에 대해 결정되기 때문에 높은 해상도 및 높게 얼라인드된 스캔을 생성하는 것이 가능하다. 따라서, 지지 시스템은 조작하는 스캐닝 위치 내에서 카셋의 위치를 고정하지만, 흔적-결정된 높은 정확성 검출 때문에, 미크론 수준의 정확성으로 그 정확한 위치를 정밀하게 할 필요가 없다. 이러한 조작을 수행하는 시스템의 예는 스캐닝 도와 관련하여 이하에 기재된다.
채널의 위치를 정확하게 확인하는 기재된 접근법의 주된 이점은, 카트리지가 사용자에 의해 스테이지 상에 정확하게 얼라인드될 필요를 완화시킨다는 것이다.
이는 스테이지에 대해, 코스 허용 범위 내에서 고정되어야 한다. 이 기술의 이점은, 사용자에 의해 정확히 완전히(및 비싸게) 위치시키는 것이 요구되지 않는 것이다. 이는 기재될 현재의 바람직한 클램핑 실시형태가 허용된다.
분석을 실시하고, 동시에 양성의 추적자의 존재를 스캐닝하기 위한 장치가 도 54-56을 참조하여 기재될 것이다. 도 54에서, 분석 카트리지(카셋)(2)는 용기 면적(6)으로 플레이싱되는 제조 시에 캐리어 플레이트(4) 상에 도시된다. 플레이싱되는 경우에, 카트리지는 공압 계면(8)과 밀접히 접촉할 수 있어, 공압 제어(솔레노이드 밸브(9))는, 넓은 카셋 상에 미세밸브 및 피스톤을 엑츄에이트하여 분석을 수행하기 위해 계면(8)을 통해 공기압 및 진공을 적용하기 위해 적당히 엑츄에이트할 수 있다. 카트리지는 클램프(12)를 유지함으로써 용기 계면(6)에 유지된다. 도 55에서, 클램프(12)는 용기 면적(6) 내에 제자리에 카트리지를 갖는 것이 도시된다. 도 54a에서, 유지하는 클램프는 폐쇄되는 공정으로 도시된다. 도 55, 55a 및 도 56의 확대도는, 확대도에서 기기의 기계적 어셈블리의 나머지 및 그것에서의 캐리어 플레이트(4)와 카트리지(2) 사이의 관계를 설명한다. 정밀 x, y 스테이지(12), 섀시(16), 히트 플레이트(14) 및 광학 어셈블리(18)가 도시된다. 카트리지 또는 다른 미세유체 분석 시스템으로부터, 광학 시스템으로부터 주변광을 배재하여, 분석 결과를 리딩하는 동안, 분석을 수행하는 동안 주변광이 형광 여기 및 검출로 간섭하지 않는 시스템용 인클로져(enclosure)는 도시되지 않았다.
특히 도 55a, 확대도를 참조하여, 공압 계면 및 클램핑 공압 계면(8)은 공압 계면(8)과 친밀히 접촉하는 카트리지(2)로 도시되지만, 클램핑 앤빌(clamping anvil)(26)은 탄력 있게 압축되어 공압 계면에 대해 카트리지를 압출하는 힘을 제공한다. 클램프는 래치(latch)에 의해 아래 위치에 고정된다.
이전 가출원에서 이미 기재된 채널 알고리즘의 발견(이하, 도 79, 80 및 81을 스캐닝함으로써)에 관해, 도 62, 63 및 64를 갖는다. 다시, 도 62는 각각의 채널의 정확한 위치를 확인하기 위해 수행되는 스캐닝 스위프의 경로 및 4개의 분리 채널을 설명한다. 도 63은 레이저 기반 에피 형광 공정에 의해 양성 추적자를 갖는 형광을 이용하는 것에 반대로 백색광 조명을 이용하여 스캔함으로써 얻어지는 흔적을 도시한다. 도 63에 도시된 시그널은, 이것이 채널에 영향을 주기 때문에 백색광 조명의 결과로 채널 또는 섀도우의 에지가 형성되는 것을 설명하는, 높은 수준의 시그널 이후 매우 작은 드롭아웃 또는 스파이크를 설명한다. 시그널 변화가 전체 백그라운드 시그널의 매우 적은 퍼센트이고, 시그널이 약 3500 카운트에서 단지 2300 카운트로 떨어지는 흔적을 볼 수 있다. 이러한 낮은 시그널은, 다른 방법에 의해 야기되는 시그널의 작은 착오 또는 동요가 채널의 진실된 확인을 간섭할 수 있는 것을 잠재적으로 도전하는 시그널 가공을 만든다. 도 64는, 스캐너가 채널을 횡단하여 진행하기 때문에 채널의 왼쪽 및 오른쪽 에지를 설명하는 2개의 이들 스파이크의 확대도를 도시한다. 양성 추적자 형광 염료를 이용하는 설명 또는 본 발명은, 이러한 특정 흔적에 대한 노이즈 레벨에 매우 큰 시그널을 제공하고, 따라서 시스템에서 치환될 수 있는 현저한 개선이다. 형광 염료가 존재하지 않는 채널의 외측의 시그널 레벨은 단지 카트리지의 구조에서의 물질 이용이다. 이들 물질의 형광은 매우 낮지만, 형광 염료를 갖는 액체를 함유하는 채널을 건너갈 때 발견되는 형광은 매우 높고, 노이즈 레벨까지 매우 높은 시그널을 제공하고, 따라서 정확성 및 건장함을 제공한다.
요약에서, 본 발명의 큰 값의 많은 점은 리뷰될 것이다. 분석은 예컨대 균일하게 히팅된 엄격히 통제된 분석 조건 하에서 수행되고, 대조군(예컨대 공압 밸브 및 피스톤)은 정확히 제어된다. 이는, 어셈블리 일부 또는 전부가 검출기(예컨대 카메라)의 광축에 대해 검출, 예컨대 x, y 좌표로 번역되는 동안 행해져, 카셋이 동시에 검출되고, 추적자 조건은 분석이 주행되는 동안 다양한 채널 내에서 결정된다. 유리한 실시형태에 있어서, 매우 동일한 검출 기기는 포획제로부터 분석 결과를 검출하기 위해 나중에 사용된다.
상당한 값을 갖는 실행을 위한 단순한 기술은, 분석 프로토콜을 수행하는 다양한 상에서 추적 염료의 존재 또는 미존재를 단순히 검출하기 위한 분석 프로토콜 동안 스캐너를 사용한다. 스캐닝 공정은 카트리지 상에 분석의 정상적인 수행과 관련된 소정의 예상된 레벨과 비교되는 시그널 패턴을 생성한다.
이는 컴퓨터 계산에 의해 쉽게 수행될 수 있고, 또는 경험적으로, 보통의 레벨을 결정하기 위해 실험 주행수로부터 정의되는 허용 레벨 및 이 레벨의 일부 허용 가능한 범위에 근거될 수 있다.
이러한 흔적 기반의 공정은 분석이 주행되는 동안 분석 또는 카트리지가 어떤 것을 하려고 했는지를 결정하는 우수한 값을 제공한다.
본 발명은 이미 기재된 고장 모드 및 다른 것들을 언급하기 위해 조정된 방법으로 적용될 수 있는 모니터링 방법의 전체 시스템을 제공한다. 예컨대, 이전에 언급되지 않은 다른 고장 모드는 벤치 탑 조작 및 스캐닝 기기에 근거하여 스스로 제어된다. 예컨대 공압 압력 제어 솔레노이드 밸브의 제어가 고장나는 경우, 또한 이러한 고장이 검출된다. 따라서, 본 발명은, 미세유체 분석 시스템이 주행되는 동안 잠재적인 고장 모드의 호스트를 검출하고, 특히 그 채널 내에 적당한 시약인 경우에, 시약이 그 채널에 존재하는지 아닌지를 결정하는 포괄적인 방법을 제공한다.
마찬가지로, 본 발명은 미세유체 채널을 정확히 위치시키기 위해, 스캔 파라미터를 셋업하기 위해, 예컨대, 최적 포커스 위치, 상당한 값의 다른 중요한 피쳐를 확인하기 위해, 양성 형광 염료를 갖는 채널을 횡단하여 단순히 스캐닝하는 것이 가능하다. 이는 스캐닝 도와 관련하여 더 기재되는 분석 프로토콜의 실행 동안 셋업 공정 내에 있다. 카트리지가 분석 프로토콜, 예컨대 공압 프로토콜 하에서 주행되는 동안, 스캐너 시스템은, 분석이 완료되는 검출 상에 유용한 많은 측정을 수행하기 위해 동시에 사용될 수 있다. 이러한 측정은 추적 염료를 갖는 액체를 함유하는 채널의 형광 특성에 근거하여 채널을 위치시키는 것을 포함한다. 또한, 최적 포커스 위치를 결정하기 위해-포커스의 최적 위치를 결정하도록 z-축 또는 포커스 축의 스캐닝은 형광 강도 프로파일에 근거된다(for determining the optimal focus location - scanning of the z-axis or the focus axis to determine the optimal location of the focus based on the fluorescence intensity profile as well). 이는 분석의 유체상을 정량화한 후 수행되는 최후 스캐닝에 사용된다.
상기 개념의 이점은 면역 분석 측정을 위해 강력한 조작적 시스템을 제조하는 것과 관련된다. 데이터 질의 향상된 타당성 및 재현 가능성은 이러한 시도를 위한 값을 제공한다.
공정 제어는 측정 기술, 예컨대 ELISA 플레이트에서 일상적으로 사용되고, 제어는 ELISA 플레이트 상의 각각의 웰로 사용된다. 임의 형태의 기기를 주행하는 경우에 연구자는 그들이 하는 측정이 믿을만한 것이고, 실행되도록 기대되는 방법으로 수행되는 것을 알거나 긍정적인 확인을 하기를 원한다. 본 발명은 시스템이 생성하는 데이터 및 미세유체 시스템에서의 신뢰성을 생성하기 위한 방법이다.
여기에 개념을 이용하여, 미세유체 시스템의 특정 형태와 상관 없이 신뢰성있는 스캐너 또는 모니터링 스캐너를 제공할 수 있다. 이러한 스캐너는, 이것이 어떻게 수행되는지를 모니터하기 위해 미세유체 분석을 주행하는 누구에 의해서도 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명은, 각각이 적절히 수행되는 것을 긍정적으로 확인하기 위해, 일련의 시약이 다양한 체적 및 다양한 타이밍에 유동되는 미세유체 카트리지에 특히 유용하다.
본질적으로 양성 추적자로 사용되는 형광 염료는 분석의 성분과 상호작용하지 않아야 한다. 그러나, 화학적 상호작용이 발견되는 경우에, 시스템에서 간섭과 관련하여 이것이 더욱 불활성 또는 더욱 양성이 되도록 하기 위해 염료를 화학적으로 변형하는 것이 일상적일 수 있다. 이러한 목적을 위해 염료 마크 상에 수행될 수 있는 공지의 콘쥬게이션이 있다.
본 발명은 정량화가 측정의 최초 결과인 분석, 시약의 시퀀스를 주행하는 복잡한 미세유체 기반의 시스템에 대한 특별한 이용을 갖는다.
많은 바람직한 실시형태의 레버리지는 정량적으로 분석적인 측정을 하기 위한 시스템, 예컨대 존재하는 시스템에서 이미 이용 가능한 것이고, 분석적인 측정은 많은 위치에서 만들어지고, 따라서 그 위치에 카트리지를 놓거나 또는 미세유체 시스템, 예컨대 카트리지 상에 그 위치로 검출기를 이동시킬 필요가 있다. 이하 본 발명의 기술은, 이러한 시스템으로 빠르게 새로 장착될 수 있다. 본 발명은 특히 유체 성분 및 광학 성분이 동시에 수행할 수 있고, 분석 환경 요건이 충족될 수 있는 상황에서 적용 가능하다. 온도는 분석 프로토콜 동안 제어될 중요한 파라미터이다. 온도는 일반적으로 적어도 플러스 또는 마이너스 1 degree, 바람직하게는 플러스 또는 마이너스 1/2 degree C까지 면역 분석 시스템에서 제어된다. 추가적으로, 주변광 또는 미광의 부재가 유리하고, 따라서 분석은, 인클로져에 제공된 바와 같이, 어두운 환경에서 수행된다. 본 발명의 기술은 이러한 필요 조건과 양립 가능하다.
기재된 기술의 일부는 보통의 혈액 실험이 수행할 수 있는 것 이상의 정확성을 갖는다. 예컨대, GNR's는 매우 정확한 측정을 위해서 고정상, 비휴대용 미세유체 시스템에 유용할 수 있다. 기재된 모니터링 기술은 예컨대 높은 스루풋 혈액 시험에서 이용 가능성을 갖는다.
이러한 발명자는 환경의 진단 형태에서 높은 정확성을 갖는 크고, 덜 휴대용인 높은 스루풋 기계가 적용되는 본 발명을 상상한다. 요점은, 진단 측정은 그 정확성 내에 소정의 확실성을 가져야 하고, 여기에 제공되는 결과에서의 확실성을 향상시키는 새로운 방법이 널리 이용되어야 한다는 것이다.
특정 분석 시스템이 이제 기재될 것이고, 이는 미세유체 일회용 카트리지에 시약의 정확한 체적을 전달하기 위한 피스톤 및 공압적으로 엑츄에이트되는 밸브를 포함한다.
분석 전에 카트리지 상에 플레이싱 되고, 이후에 결과를 리딩하는 유체의 유동을 야기하는 카트리지 상의 공압 밸브의 시기 적절한 조작을 통해 분석을 수행하도록 분석 카트리지를 조작할 수 있는 벤치 탑 조작 및 리딩 기기를 갖는 것이 바람직하다.
상기 기기는 기기의 유용한 수명의 관점에서 상당한 강력함을 가져야할 필요가 있다.
결과를 리딩하고, 분석의 모니터 진행 및 그 안에 카트리지 및 유체 채널의 위치를 결정하는 광학 시스템의 고정축에 대해서 X, Y 스캐닝 모션으로 카트리지를 이동시킬 수 있는 이동 가능한 스테이지 상에서 카트리지 기기 계면을 제공하는 것이 바람직하다.
주요 요건은, 카트리지기 믿을만한 방법으로 공압 제어 성분과 접촉하여, 어떠한 공압 누수고 카트리지와 공압 엑츄에이션 시스템 사이에서 일어나지 않아야 한다는 것이다. 카트리지 상의 밸브 및 피스톤은 기기에 의해 제공되는 압력 및 진공으로 제어되고, 카트리지와 리더 사이의 계면에 누수가 발생하게 되는 경우, 이러한 밸브는 정확하고 빠르게 엑츄에이팅하지 않을 것이다. 결과는 분석에 대한 불확실한 결과 및 카트리지 상의 시약의 흐름의 부정확한 제어일 수 있다. 이는 분석이, 정확하게 시기를 맞춘 엑츄에이션 및 시약의 계량, 포획제에 미지의 시료의 정확한 체적 및 정확한 시간의 노출, 혼합 전에 샘플의 후속 플러싱 및 세정, 및 2차 포획제로의 노출 후 그 성분의 후속 세정 후 형광 염료에의 노출, 또는 마지막 2 단계에 대해서, 선택적으로 형광 표지된 2차 제제에의 노출에 따라 달라지기 때문이다.
이러한 공압 계면을 쉽게 제고하는 개념은, 카트리지의 일부로 컴플라이언스 성분을 포함한다. 그 바람직한 형태로, 이는 기기 내에 함유되는 강력하고, 경성의 포트 성분과 맞춰지는 카트리지의 일부로서 실리콘 고무층의 형태이다. 경성의 성분은 가압된 공기 또는 진공의 형태로 공압 엑츄에이션이 제공되는 것을 통해 많은 바이어스를 함유한다.
중요한 특징 중 하나는, 컴플라이언트 성분(compliant component) 및 경성의 성분이 제공되는 것에 의한 새로운 배열이고, 이는 기밀 밀봉을 형성하기 위해 압력 하에 함께 제공된다. 유리한 관계는, 컴플라이언트 성분이 리더의 비일회용 측이 아니라, 일회용 엘리먼트 상에 위치되는 것이다. 이점은, 경성의 성분이 시간에 걸친 변형을 겪지 않지만, 실리콘 고무 및 다른 형태의 고무 또는 플라스틱과 같은 컴플라이언트 성분은 비탄력적 변형을 겪어 결국 공압 누수의 형성으로 고장 모드를 일으키기 때문에, 경성의 성분이 컴플라이언트 성분보다 수명이 훨씬 길다는 것이다.
바람직한 실시형태에서, 조작 지지 상에 위치된 경성의 성분은 알루미늄 또는 철인 금속이고, 컴플라이언트 성분은 분석 카트리지에 의해 수반되는 PDMS 또는 실리콘이다.
고무는 카트리지 내에 층들 중 하나의 연장으로 제공된다. 이는 카트리지의 저면 상에 제공되지만, 카트리지의 저장소 및 웰은 상면 상에 제공된다. 실리콘 고무의 두께는 약 100 미크론이다. 바람직한 실시형태에서, 카트리지의 전체 표면적은 120 밀리미터 × 85 밀리미터에 걸쳐 이어지고, 그 경도계(durometer)는 약 30 쇼어 A이다. 클램핑 시스템은 많은 공압 바이어스에서 유지되는 밀봉을 형성하기 위해, 압력을 2개에 함께 제공하도록 플레이싱하기 위해 제공된다. 실시예에서, 밀접한 부근에 위치된 7개의 바이어스가 있다. 예컨대, 바이어스 사이의 공간은 약 2 밀리미터이고, 비아 직경은 약 1 밀리미터이다.
공압 매니폴드 계면의 중요한 특징 중 하나는, 기기 상의 경성의 성분이 접촉의 작은 단면적을 갖도록 구성되는 것이다. 이 방법에서, 컴플라이언트 물질 상에 상당한 물리적 압력을 형성하기 위해 단지 작은 힘이 요구된다. 압력은 국부적으로 컴플라이언트 물질을 압축하여, 누설 밀봉(leak-tight seal)의 보증을 제공한다. 길이와 폭이 매우 작은 치수를 갖는 공압 매니폴드 계면을 제공함으로써 작은 면적이 완성된다. 실시예에서, 계면 시트의 전체 폭은 약 3 또는 4 밀리미터의 폭 × 10 밀리미터의 길이이고, 이는 7개의 모든 바이어스를 포함한다. 카트리지가 조작/리딩 기기 상에 조작 위치에 있는 경우, 공압 계면 바이어스를 갖는 그 말단은 기기의 경성 공압 계면 부분 상에 받쳐지고(rest), 카트리지의 다른 말단은 위치에서 카트리지를 고정하는 고정 시트에 의해 지지된다. X, Y 방향 제약은 스탠드를 유지하는 4개 세트의 코너에 의해 제공되고, 이들은 이렇게 형성된 용기 포켓으로 카트리지의 용이한 삽입이 가능할 수 있도록 테이퍼된다.
압력은 Z좌표에서의 안정성을 얻기 위해 단지 하나의 방향으로 카트리지에 가해진다. 힘은, 일 실시형태에서 리프 스프링과 접속된 롤러에 의해 카트리지를 통해 아래로 가해지고, 롤러는 카트리지 상면과 접촉하도록 배열되고, 공압 매니폴드에 대해 카트리지 상에 컴플라이언트 물질을 압축하는 아래 방향의 힘을 제공한다. 여기서 도시되는 다른 실시형태에서, 단순한 해소 가능한 클램프는 압력을 적용한다.
스프링-로딩된 메카니즘, 롤러 메카니즘 및 동력화된 렉(rack) 및 피니언(pinion)을 포함하는 당업자에 의해 이해될 수 있는 클램핑력을 얻기 위한 다른 기술이 있다. 공압 솔레노이드 또는 전기 솔레노이드는 연결 압력을 유지하기 위해 유사하게 힘을 적용할 수 있다.
비용 효율성 및 단순성은 일반적으로 클램핑 메카니즘을 고안하는 경우에 목적이다. 동력화된 롤러는 사용자 관점에서 편리하지만, 도시된 스윙바는 단순하고, 효율적이고, 잠재적인 고장 모드를 피한다.
이동 가능한 스테이지 상의 다른 상당한 피처는 공압 계면 매니폴드이다. 이 실시형태에서 공압 제어선, 7개의 다른 공압 제어선은, X, Y 스테이지 상에서 이동되고, 진공 펌프 및 압력 펌프와의 공압 연결된 공압 매니폴드에 유연한 호스를 통해 연결된다.
스테이지 상에 공압 밸브를 놓는 중요한 이점은, 2개의 유연한 공압 라인 및 유연한 전기 제어 케이블은 스테이지의 모션 공정 동안 이동하도록 요구되어, 카트리지와 솔레노이드 밸브를 연결하는 공압 채널이 공압 계면의 일부로 채널을 강하게 고정되는 것이다. 이점 중 하나는 시간에 걸쳐 고장의 경향이 있는 유연한 튜브 커넥터와 비교하여 강한 금속 또는 플라스틱 성분에 고정된 기계 가공된 채널을 이용하는 것의 신뢰성이다. 스테이지 상에 마운팅되는 고정된 기계 가공된 성분으로 공압 계면을 갖는 다른 유리한 특징은, 분석의 바람직한 속도에 대한 그 기여이다. 이는 공압 경로의 사적(dead volume)을 최소화하기 위한 능력에 관한 것이다. 이는, 진공 상태에서 가압된 상태로 바뀌는 결과로 밸브 및 피스톤의 상태가 변화하기 때문에 카트리지의 조작에서 중요하다. 이것이 일어나는 속도는 그 채널의 사적에 직접적으로 비례한다. 예컨대, 압력에서 진공으로의 변화는 체적이 솔레노이드 밸브의 다운스트림이 함유될지라도 완전히 드로잉되기 위해 진공이 요구된다. 기재된 특징을 이용하여, 솔레노이드 밸브로부터의 다운스트림 채널 모드는 매우 작고, 솔레노이드 밸브와 칩 사이의 거리는 매우 짧은 거리로 유지된다. 낮은 사적을 갖는 스테이지 상에 마운팅되는 고정된 기계 가공된 성분으로 공압 계면을 갖는 또 다른 이점은, 유동 속도가 낮은, 따라서 저렴한 체적 및 압력 펌프를 이용하기 위한 능력이다. 솔레노이드 밸브의 공압 라인 다운스트림의 체적 및 상태 변화의 속도가 평균 유동 속도를 결정하기 때문에, 더 작고, 낮은 유동 속도 펌프를 이용하기 위해 낮은 사적을 유기하는 것이 바람직하다.
속도는, 많은 엑츄에이션이 분석 프로토콜에서 일어나야하기 때문에 중요하다. 수만 엑츄에이션이 될 수 있고, 수십 밀리세컨(tens of millisecond) 또는 수백 밀리세컨(hundreds of milliseconds)의 디퍼런스는 시간의 상당한 손실까지 추가할 수 있다.
카트리지, 밸브 및 피스톤 상에 2개의 다른 활성 성분이 있다. 밸브의 목적은, 어떤 시약이 유동하고, 이들이 유동하는 채널이 어떤 것인지 결정하는 것이다. 피스톤은 유체를 모티베이팅하기 위한 주된 성분이다. 이들은 카트리지에 위치되는 시약에 양적 및 음적 변위를 제공하고, 따라서 모티베이팅된 유체의 주된 엘리먼트이다.
스테이지 상에 함유되는 피처는 솔레노이드 밸브 및 카트리지 및 클램핑 장치를 갖는 공압 계면이다. 이는 이동하는 스테이지 상의 모든 것이다. 이동 가능한 스테이지 상의 카트리지는 카트리지의 표면 아래 단지 4 또는 5 밀리미터로 지지된 아래 고정된 히터 플레이트에 노출되고, 방사열 트랜스퍼(radiant heat transfer)에 마주보도록 노출된다. 활성 포획 엘리먼트가 미세유체 채널에 함유되는 카트리지의 저면은 항온 35 내지 37 degrees C에서 유지되어야 한다. 히터 플레이트는, 그 이동 범위를 커버하기 위해 카트리지의 표면적보다 약간 더 큰 치수로 연장된다. 따라서, 균일한 온도 프로파일은 카트리지의 표면에 걸쳐 유지된다. 이의 가장 큰 이점은, 카트리지의 온도는 전체 리더 인클로져의 온도를 제어하지 않고 쉽게 유지된다는 것이다. 따라서, 인클로져 내에서 전자품 및 다른 민감한 성분을 가열하는 것에 대한 문제는 없다. 온도 제어 및 안정성은 임계면에서만 제공된다.
또한, 전달 공정을 이용하는 것보다 방사열을 이용하는 이러한 방법으로 보다 정확하게 온도를 제어하는 것이 더 용이하다. 또한, 전달 공정에 의하는 것보다 더욱 빠르게 온도 안정성을 얻는 것이 가능하다. 이는 항체 키네틱에서 중요하다. 항체 결합은 온도 의존적이어서, 온도를 정확하게 제어하는 것은 키네틱의 속도를 제어하는 개선된 방법이다.
이는, 주행하려는 많은 분석이 "단일점 분석(single point assays)"이기 때문에 특히 중요하다. 분석은 고정된 시간량 동안 주행되고, 얻어진 형광 시크널은 샘플 중 분석물질의 농도에 비례한다. 형광에 영향을 미치는 임의의 다른 파라미터는 정확하게 제어될 필요가 있고, 변수는 분석물질의 농도이다. 온도는 항원과 포획 항체 사이의 결합 키네틱에 영향을 주는 상당한 파라미터이다. 또한, 제어의 필요를 위해 변수의 잠재적인 소스를 위해 방정식이 도출된다(so that needs to be controlled so that potential source of variation it is taken out of the equation). 또한, 1분 또는 2분 내에 기기를 단지 터닝할 수 있는 사용자에게 편리한 피처는, 이의 카트리지를 제공하고, 분석 주행을 실행한다(a convenient feature for a user to be able to just turn the instrument on and within a minute or two provide their cartridge and execute an assay run).
기기의 피처 중 하나는 레이저를 이용하여 형광 시그널을 여기한 후, 스테이지가 트렌스레이트(translated)되는 동안 대물 렌즈로 형광을 포획하는 것이다. 공지의 에피형광 형태는, 레이저 또는 레이저 다이오드에 의해 제공되는 여기 시그널이 대물 렌즈를 통해 보내진 후, 돌아가는 형광이 동일한 대물 렌즈에 의헤 포획되고, 이미징 CCD 카메라로 보내지는 것이 적용된다. 카트리지 아래에 직접적으로 고정되는 히터 플레이트는, 여기 및 발산 시그널이 고정된 광학 시스템을 통해 전파되도록 하는 홀이 제공된다.
모든 대물 렌즈는 소위 "작동 거리(working distance)"를 갖는다. 대물 렌즈의 주요 특징은, 매우 효율적인 방법으로 형광 강도 및 CCD 카메라에 돌아오는 이미지를 포획하기 위해 대상의 능력을 결정할 수 있는 많은 조리개 및 배율을 포함한다. 일반적인 lOx 대물렌즈의 작동 거리는 약 5 내지 12 밀리미터이다. 대물렌즈와 카트리지의 저면 사이를 약 5 내지 12 밀리미터의 거리로 유지하는 것은 중요하다.
이러한 중요한 거리는 히터 플레이트의 매개하는 존재에도 불구하고 얻어진다. 이는 히터플레이트가, 알루미늄 히터 플레이트에 완전히 부착되는 초박형 히트 스트라이프, 예컨대 1/32" 두께를 갖는 약 1/8 인치의 박형 알루미늄 플레이트임으로써 얻어진다.
대물 렌즈와 카트리지 저면 사이의 총 거리는 약 12 밀리미터이고, 플레이트의 두께는 그의 작은 부분이고, 4-6이고, 플레이트는 광을 투과시키는 구멍을 갖는다. 구멍은, 대물 렌즈가 홀로 제공되고, 플레이트로 부분적으로 피팅되도록 사이징된다.
조작의 시퀀스
시퀀스는, 카트리지 용기 포켓 상에 카트리지를 플레이싱 한 후, 클램핑 메카니즘을 이용하여 카트리지를 밀봉한 후, 웜 업(warm-up) 후, 배양이 일어나게 하도록 특정 기간 동안 특정 시퀀스에서 유동하도록 버퍼 및 샘플 및 검출 항체를 포함하는 시약에 힘을 가하는 공압 밸브를 엑츄에이팅하는 것으로 시작한다. 배양은 카트리지에 함유되는 포획 부위와 샘플 중 미지의 항원을 결합시킨다. 다양한 시약은 중간 세정 단계 후 최종적으로 형광 스캐닝 공정으로 제공된 시퀀스로 유동한다.
일부 경우에, 스테이지는 전체 배양 공정에서 고정상을 유지한다. 여기서 기재되는 다른 경우에, 스테이지는 유체에 추적자를 이용함으로써 시각 모니터링이 가능하도록 배양 동안 움직인다. 최종 시약 공정은, 고정화된 2차 항체에 결합하는 채널을 통해 유동 검출 염료 또는 형광 염료를 유동하는 것이다. 이 공정 동안, 추적 염료를 이용하여 이전에 하지 않은 경우에, 이 공정 동안에 채널에서 발견되는 형광 염료는 채널의 위치를 확인하기 위해 식별 비콘(beacon)으로 사용되기 때문에 스테이지를 이동할 필요가 있다. 광학 시스템은, 채널에서 레이저로 형광을 여기함으로써 채널의 위치를 확인하기 위해 모션 제어 시스템으로 조정하여 사용되고, 이 채널의 위치는 채널을 통과하는 증가된 시그널의 결과로 확인된다.
여기에 기재된 벤치 탑 유닛 실시형태는 카트리지와 벤치 탑 유닛 사이에 액체 또는 액체 유동을 함유하지 않는다.
이하에서, 바람직한 벤치 탑 유닛의 다른 새로운 상세를 설명한다.
도를 참조하여, 벤치 탑 유닛은 주요한 몇개의 서브시스템을 갖는다. 서브시스템은 카트리지를 지지한다. 카트리지는 작은 용기 면적에 플레이싱되고, 용기 면적이, 카트리지와 접촉을 위해 한정된 말단 표면적("립 면적(lip area)")을 갖는 공압 계면 보스(pneumatic interface boss)이도록 위치된다. 이는 표면 밖으로 튀어나오고, 이는 가장 높은 면이다. 카트리지의 하나의 말단은 보스 상에 시팅된다. 카트리지의 다른 말단은 이 용기 면적의 다른 측 상의 작은 레일 상에 시팅된다. 이들은 카트리지를 플레이싱하기 쉽게 하는 코너 가이드이다. 작은 암(arm)은 그 위에 스프링 로딩된 봉쇄 클램프를 함유한다. 스프링 로딩된 클램프 바는 내려지고, 카트리지의 상면 상에 지지되고(rest), 공압 보스 상에 카트리지를 푸시한다.
반대쪽 상의 말단은 그 클램핑 위치에서 장치를 지지하는 록 앤 캐치(lock and catch)이다. 사용자는, 그것을 클릭하고 캐치로 록킹할 때까지 암의 부분으로 내려 놓는다. 레버리지 때문에, 사용자는 큰 힘을 적용할 필요가 없다. 4 또는 5 파운드의 힘은 사운드한 공압 계면 밀봉을 보증하기에 충분한 공압 보스에 대해서 카트리지를 푸시하는데 효과적이다.
또한, 어셈블리 상에서, 그 위에 위치된 밸브를 갖는 매니폴드로 돌아가게 하고, 스테이지에 X, Y에 의해 이동되는 많은 공압 채널이 있다. 이들은 진공 및 압력을 위한 포트이다. 각각의 엑츄에이션 포트는 밸브 뱅크의 솔레노이드 밸브에 의해 제어된다. 이는 진공 또는 압력에 이들 포트 중 하나를 스위칭할 수 있다.
에피-형광 광학 시스템은 레이저 다이오드, 적색 레이저 다이오드, 콜리메이터 렌즈(collimator lens), 원통형 렌즈 및 3개의 필터이다. 여기 필터는, 임의의 여기 광이 소정의 파장 밴드 내에 있는 것을 보증한다. 680-690 나노미터 주변에 형광의 결과로 돌아가는 더 깊은 적색에 대해 매우 낮은 반사성을 갖지만, 여기 640 나노미터의 적색에 대해 높은 반사성을 갖는 다이크로익 빔 스플리터(dichroic beam splitter)가 있다. 640을 반사하지만 680은 투과한다. 680은 다른 필터, 발산 필터를 히팅한다. 이는 단지 작은 밴드만을 가능하게 한다-이는 모든 적색을 차단하고, 작은 밴드를 가능하게 한다. 이어서 이는 튜브 렌즈라고도 하는 카메라 상의 포커싱 렌즈이다.
콜리메이터와 인젝터 사이의 무한한 공간의 원통형 렌즈는 타겟에서 무수차 빔을 제공한다. 이는 매우 긴 타원형 프로파일의 타겟에서 레이저 빔을 제공한다. 빔은 약 500 미크론의 길이 × 약 8 미크론의 두께이다. 이는 선과 유사하다. 긱기는 채널의 전체 폭을 조명하기 위해 채널로 내려온 그 선을 스캔한다.
고정된 미세유동 엘리먼트 어레이의 스캐닝
상기 기재된 엘리먼트의 신규 어레이는 유체 분석이 수행된 후 효과적으로 리딩하는 경우에만 유용하다. 미세유체 칩을 자동으로 스캐닝하기 위한 이하 스캐닝 장치, 절차 및 방법은 미세유체 엘리먼트, 특히 미세길이 튜브 엘리먼트의 어레이에 관한 문제를 해결한다.
2 스캐너 설명(Scanner Description)
2.1 스캐너(The Scanner)
2.2 스캔(The Scan)
2.3 칩 레이아웃(Chip Layout)
2.4 파인드 채널(Find Channels)
2.5 파인드 엘리먼트(Find Elements)
2.6 자동-포커스(Auto - Focus)
2.7 자동-노출(Auto - Exposure)
2.8 형광 스캔(Fluorescence Scan)
2.9 스캔 데이터 가공(Scan Data Processing)
2.9.1 로드 데이터(Load Data)
2.9.2 데이터를 세그먼트으로 브레이크(Break data into segments)
2.9.3 쓰레스홀딩(Thresholding)
2.9.4 시간 히스토리에서 엘리먼트 및 백그라운드 로케이트(Locate Elements and Background in time history)
2.9.5 결과에 엘리먼트 평균 RFU's를 합침(Aggregate element mean RFU's into results)
도입-스캐너
본 발명의 일반적인 스캐닝 개념은 블럭 도식 및 플로우 차트로 제공된다. 이들은 특정 설명, 신규 실시형태가 이어진다. 기재할 특정 방법에 대한 전조로서, 스캐너의 일반적인 이용가능성, 스캔 및 일반적인 미세유체 칩 레이아웃이 우선 설명될 것이다. 이러한 3가지 섹션은, 미세유체 칩을 자동으로 스캐닝하기 위한 전체 방법에 기여하는 시퀀스로 각각의 서브-절차가 이어진다.
스캐너
본 발명에서 이용되는 스캐너는, 리딩할 칩의 모션을 위해 3개의 축(x, y, 및 z) 스테이지로 설비된 고정, 인버트된 에피형광 현미경, 밝은 시야 이미징 및 형광 검출을 위한 CCD 카메라, 여기를 위한 다이오드-펌핑된 고체 상태 레이저 및 밝은 시야 조명을 위한 백색 LED이다. 원통형 렌즈는 빔 사이즈를 연장하기 위해 임의의 필터 앞에 레이저 광학 경로에 사용된다. 이는, 칩 제조 동안 유동 채널에서 엘리먼트를 플레이싱하는 경우에, 일부 유동성을 부여하고, 단일 경로에서 더 큰 표면적을 여기시킨다. 스캐너의 모든 성분은 이하와 같이 컴퓨터를 통해 제어 가능하다: 지시된 x, y, z 모션, 이미지 획득/이미지 세팅, 레이저 온/오프, 및 LED 온/오프. 여기에 기재된 방법은 자동 스캔을 조직하기 위해 스캐너 제어/획득의 다양한 시퀀스 및 조합을 이용한다.
스캔
스캔은 시작/ 종결 (x, y) 위치, z (포커스) 위치, 속도 및 세그먼트 수로 설정된 단계의 시퀀스로 이루어진다. 시퀀스의 단계의 말단 위치가 다음 단계의 시작 위치가 아닌 경우에, 스테이지는 시퀀스의 다음 단계의 시작의 x, y, z 위치로 이동하기 위해 전체 스피드를 만들 것이고, 어떠한 데이터도 이러한 빠른 이동 동안 수집되지 않는다. 단계(고정된 z에서 x, y에서 시작부터 종결까지 이동) 중 하나가 실행되는 동안, 데이터는 시간에 대해 수집된다. 수집되는 데이터는 시간, 단계 세그먼트 수(스캔 단계를 설정하는 동안 어사인된), 현재 x 및 y 위치, 카메라 세팅(게인, 노출 등), 카메라로부터 비디오 스트림의 이미지로부터 추출된 정보를 포함한다. 카메라 비디오로부터 추출된 정보는 관심 영역(ROI)에 근거된다. ROI는 이미지에 직사각형으로 정의된다. ROI 내의 픽셀은 이미지로부터 정보를 추출하기 위해 가공된다. 예컨대, 제공된 이미지로부터 ROI 내에 평균, 지름, 표준편차, 최대, 최소 등의 픽셀은 산출되고, 단계 이동 동안 수집된 데이터에 포함된다. 스캔의 결론에서, 스캔을 포함하는 단계의 시퀀스에서 수집된 데이터는 바람직한 정보를 추출하기 위해 가공될 수 있는 파일(샘플 참조)에 기록된다.
이후 스캔 데이터 파일("파일로 시딩되는(seeded into the file)")로 기록되는 특정 세그먼트 수를 갖는 스캔에서의 다양한 단계를 표시(flag)하는 능력은 스캔 데이터 파일의 가능을 매우 가능하게 하고, 다양한 시그널 가공 알고리즘의 강도를 현저히 개선한다. 이러한 능력은 자동 스캔 방법에서 많은 시간의 이용으로 이루어진다.
이하 섹션에 기재되는 서브-절차 모두는 자동-포커스 서브-절차인 것을 제외하고 상기 기재된 스캔에 근거한다.
칩 레이아웃
칩 피처/레이아웃의 선행 지식은 자동 스캐닝을 가능하게 하기 위해 필요하다. 칩 레이아웃은 스캐닝에 도시된다. 이러한 도에서, 칩은 25 x 75 mm 스탠다드 현미경 유리 슬라이드이다. 칩 내에서, 관심 있는 엘리먼트를 함유하는 스캔 영역이다(Within the chip is the scan zone that contains the elements of interest). '스캔 영역-줌(scan zone - zoom)'은 더한 디테일을 제공한다. 특히, 스캐닝은, 많은 유체 채널이 있고(도에서 1 thru n 왼쪽에서 오른쪽으로), 유동 채널 당 많은 엘리먼트가 있다(도에서 1 thru n 위에서 아래로)는 것을 보여준다. 상세하게 스캐닝될 형광인 것이 엘리먼트이다. 유동 채널의 중간에서 수직선은 채널을 위치시키는 목적을 위해 실행되는 스캔 이동을 나타내고, 엘리먼트 위아래의 수평선은 엘리먼트를 위치시키는 목적을 위해 실행되고, 이후에 형광 측정을 수행하는 스캔 이동을 나타낸다.
파인드 유동 채널
자동 스캔의 제1 단계는, 채널이 스테이지 x, y 위치에 대해 위치되는 것을 결정하고, 채널이 수직축과 정확히 평행하지 않은 경우에 칩의 왜곡을 결정하는 것이다. 스캐너 스테이지의 이전 완전한 호밍(homing)에 근거한 미리 정의된 x, y 위치는, 실행되는 스캔이 사실 채널 에지 모두를 통과하여, 칩이 스테이지에 기계적으로 참조될 것을 보증하는데 충분하다. 그 후, 이러한 이슈는, 채널 에지가 x, y 스테이지 위치에 상대적이도록 정확하게 측정된다. 이러한 종결을 위해, '파인드 채널(find channels)' 스캔은 스캐닝에 도시되는 채널의 중앙에서 수평선을 따라 실행된다. 더욱 구체적으로, 파인드 채널 스캔은, 이후 데이터 가공을 가능하게 하기 위해 특정 세그먼트 수로 태그되는 스캔 영역의 '상부(top)' 및 '저부(bottom)'에서 각각의 개별적인 채널을 횡단하여 단계가 있도록 분명한 단계로 분리된다. 또한, 스캔은 밝은 시야(즉, 레이저 오프, LED 온)에서 행해지고, 사용되는 ROI는 폭이 매우 좁고, 이미지의 전체 높이가 연장되고(스캐닝에 도시된 바와 같이), z 위치는 스테이지를 호밍함으로써 확립되는 바와 같이, 0의 명시적인 포커스된 z 위치로부터 의도적으로 '디포커싱(defocused)'된다.
또는, '파인드 채널' 루틴은 칩 분석의 '검출' 유동상 동안 행해질 수 있다. 이러한 모드에서, 채널은 형광 염료로 충전된다. 채널을 찾기 위한 스캔은 그 후 상기 기재된 바와 같이 행해지지만, 스캐너는 형광 모드(즉 레이저 온, LED 오프)이다.
'파인드 채널' 스캔 동안 수집되는 데이터의 예는 스캐닝에서 제공되고, 단일 채널 스캔으로 줌 인은 스캐닝에 제공된다. 이러한 예에서, '파인드 채널' 스캔은 8개의 단계를 가지고, 각각의 채널에 대한 이것은 엘리먼트의 위아래를 크로싱한다.
파인드 채널 스캔으로부터의 스캔 데이터 파일은 퍼 스캔 세그먼트 베이시스 상에 가공된다(is processed on a per scan segment basis). 결과적으로, 데이터 가공은 설명된 바와 같이 데이터의 세트 상에서 조작된다. 데이터 가공은 스캐닝에 도시된 바와 같이 진행된다. 도에서, 데이터 가공은 유체 미세길이 튜브 엘리먼트 절차에 사용될 수 있는 스캔 형태를 제조할 것이고, 또는 자동 스캔 절차를 중단할 에러를 없앨 것이다. 이러한 절차 동안 수집된 정보는 이하에 유용하다:
· 파인드 엘리먼트 스캔을 정의(Defining the Find Elements Scan).
· 형광 스캔을 정의(Defining the Fluorescence Scan).
· 이하에 대한 칩 품질 제어 데이터 수집(Collecting Chip Quality Control data about):
o 채널 폭의 변형(Variations in channel width)
o 칩 리퍼런스 에지로 채널에서의 변형(Variations in channel to chip reference edge)
파인드 미세길이 튜브 엘리먼트(Find Micro-length tube Elements)
파인드 엘리먼트의 주된 목적은 각각의 유동 채널에서 제1 미세길이 튜브 엘리먼트를 위치시키는 것이다. 그 후, 이러한 정보는 자동-포커스 및 자동-노출 절차를 수행하기 위해 사용된다. 유체 채널 절차는, 파인드 엘리먼트에 의해 사용되는 스캔이 채널 위치의 지식을 통해 만들어지는 이러한 절차에 전조가 되어야 한다. 파인드 엘리먼트 스캔은 채널 당 세그먼트로 분리되고, 스캐닝에서 설명된 바와 같이 수평선을 따른다. 이러한 스캔은 밝은 시야(즉, 레이저 오프, LED 온)에서 행해지고, 사용되는 ROI는 폭이 좁고, 미세길이 튜브 엘리먼트의 길이보다 더 커진다. 이러한 ROI는 스캐닝에 도시된다. 또한, 스캔 z 위치는 스테이지를 호밍함으로써 확립되는 바와 같이, 0의 명시적인 포커스된 z 위치로부터 의도적으로 '디포커싱(defocused)'된다.
'파인드 엘리먼트' 스캔 동안 수집되는 데이터의 예는 스캐닝에 제공되고, '파인드 엘리먼트' 스캔 데이터의 가공 시퀀스는 스캐닝의 플로우 차트로 제공된다. 이러한 스캔 데이터의 가공 결과는 각 채널의 각각의 엘리먼트의 x, y 위치이다. 이러한 절차 동안 수집되는 정보는 이하에 유용하다: 자동-포커스를 실행하기 위한 x, y 위치.
·자동-노출을 위한 x, y 위치(The x, y positions to execute Auto-Exposure).
·형광 스캔을 가공하기 위한 x, y 위치(The x, y positions for processing a Fluorescence Scan).
·칩 상에 사실상 존재하는 엘리먼트의 소정의 수를 입증(Validating that the predetermined number of elements are in fact present on the chip).
·엘리먼트 배치에 대한 칩 품질 제어 데이터의 수집(Collecting Chip Quality Control data about element placement).
자동- 포커스
이 절차는 '파인드 엘리먼트' 절차에 의해 결정되는 각각의 채널에서의 제1 미세길이 튜브 엘리먼트의 x, y 위치를 인풋함으로써 일어난다. 이러한 위치 각각에 대해서, 절차는 제공된 x, y 위치로 이동하고, 네거티브 위치로부터 0을 거쳐 포지티브한 위치로 z를 스위핑한다. z의 스위프가 카메라 비디오로부터 전체 이미지를 발생시키는 동안, 스트림은 소벨 에지 검출 필터(Sobel edge detect filter)를 통해 주행한 후 얻어진 이미지 표준 편차가 계산된다. 최종 결과는 스캐닝에 도시된 바와 같은 데이터의 세트이다. 각각의 세그먼트에 대해(즉, 엘리먼트의 x, y 위치에서), 표준편차 플롯에 대해 얻어진 z 위치는 표준편차의 최대값에서 z 위치를 발견하도록 사용된다(스캐닝의 설명 참조). 각각의 세그먼트로부터 최대 표준편차에서 z 위치는, 칩 상에서 각각의 채널에 대한 '인 포커스(in focus)' z 위치이다. 이러한 절차 동안 수집된 정보는 이하에 유용하다: 형광 스캔의 포커스 세팅,
·칩/및 또는 스테이지가 광학 시스템에 대해 평평하지 않은 정도를 검량(Gauging the degree to which the chip / and or stage is not flat with respect to the optical system).
자동-노출
이 절차의 목적은 미세길이 튜브 엘리먼트의 형광 레벨이 제공된 카메라의 범위를 효율적으로 이용하기 위해 적절한 카메라 노출 세팅을 선택하는 것이다. 노출이 너무 짧으면, 이미지가 어두워지고, 노이즈로 시그널이 불량하고, 카메라 범위를 충분히 이용할 수 없다. 노출이 너무 길면, 형광 측정을 수집하기 위해 사용될 수 없는 포화된 이미지가 될 것이다. 미세길이 튜브 엘리먼트의 형광의 정도는 조사 하에 샘플에서 항체와 같은 타겟이 되는 포획제의 농도에 의존하므로, 미리 알 필요가 없다. 결과적으로, 최적의 노출 세팅은 칩에서 각각의 유체 채널에 대한 인시투로 측정되어야 한다.
이러한 절차는 인풋으로 일어난다:
·'파인드 엘리먼트' 절차에 의해 결정되는 각각의 채널에서 제1 미세길이 튜브 엘리먼트의 x, y 위치(The x, y positions of the first micro-length tube element in each channel as determined by the 'find elements' procedure)
·최대 픽셀 값 범위(Maximum pixel value range)
·노출 범위 및 시작 값(Exposure range and start value)
·스캔 하프 길이(Scan Half Length)
·데이터 추출 하프 길이(Data Extract Half Length)
이러한 인풋으로부터, 스캐닝에서 설명한 스캔이 구성된다. 자동-노출이 생성되고, 스캐닝에서 제공된 시퀀스가 이어진다. 이러한 절차에서 사용되는 ROI는 다음 섹션에서 언급되는 형광 스캔에 사용되는 것과 동일하다. 이러한 절차는 LED 오프 및 레이저 온으로 행해진다. 현저한 광-표백 효과를 피하기 위해서, 이러한 스캔의 속도는, 엘리먼트에 의해 일어나는 레이저 노출을 최소화하도록 선택된다. 이러한 공정의 최종 결과는 다음에 언급되는 형광 스캔에서 사용될 채널 당 최적의 노출 세팅이다.
형광 스캔
(x, y) 위치, z(포커스) 및 '채널 파인드'. '엘리먼트 파인드', '자동'포커스', 및 '자동-노출'의 결과로부터 발견되는 카메라 노출 세팅을 이용하여, 형광 스캔이 구성된다. 스캐너로부터 모든 측정을 이용함으로써, ROI는 픽셀 강도 값을 수집하기 위해 사용된다. 형광 스캔을 위한 ROI는, 레이저 단면적(스캐닝 & 28)의 상부의 이미지에 위치되고, 유동 채널에 긴측으로 직각으로 배향되는 직사각이다. ROI의 사이즈는 레이저 스팟의 사이즈, 미세길이 튜브 엘리먼트 상의 형광 영역의 폭, 엘리먼트를 함유하는 채널의 폭, 측정을 위해 필요한 픽셀의 수 및 스캔 속도에 의해 결정된다. 이러한 파라미터는 미리결정되고 경험적으로 최적화될 수 있고, 따라서 각각의 FS를 변경하지 않는다. FS는 스캐닝할 채널에 제1 미세길이 튜브 엘리먼트의 업스트림의 위치에서 시작한다. 스캐너는 형광 모드(LED: 오프, 레이저: 온)로 풋팅되고, 카메라 노출 시간 및 z 위치(포커스)가 세팅된다. 스캔이 수행된다(섹션 0 참조). 스캐닝은 FS 동안 엘리먼트의 스냅샷을 나타낸다.
스캔 데이터 가공
이 섹션의 설명은 스캐닝에 도시된 플로우 차트로 이용 가능하다.
로드 데이터
FS로부터 수집된 데이터는 메모리로 로딩되고, 평균 ROI 값는 시간에 대해 플로팅된다(스캐닝). 이 도는 시간에 대해 스캐닝되는 모든 채널의 평균 ROI 값을 나타낸다.
세그먼트로 데이터 브레이크
이 데이터를 가공하기 위해, 세그먼트로 분리되고, 각각의 세그먼트는 하나의 유동 채널의 가치 있는 데이터()로 이루어진다. 피크 검출 알고리즘은 백그라운드 시그널에 대해 채널에서 엘리먼트의 위치를 결정하기 위해 사용된다. '엘리먼트 파인드' 동안 발견되는 미세길이 튜브 엘리먼트 위치는 세그먼트 내에 엘리먼트를 위치시키기 위해 사용될 수 있다.
쓰레스홀딩
하나의 채널에서 모든 미세길이 튜브 엘리먼트에 대한 상대적인 시그널 강도는 대략 동일하기 때문에, k-평균 클러스터링(k-means clustering)은 미세길이 튜브 엘리먼트와 관련된 픽셀로부터 백그라운드와 관련된 픽셀을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 클러스터링 알고리즘의 아웃풋은 평균 백그라운드 값 및 평균 엘리먼트 값을 나타내는 센트로이드(centroid)이다. 2개의 센트로이드 사이의 중간점은 쓰레홀드로 사용된다. 쓰레홀딩은 유체 채널 당 백그라운드 및 노출 세팅을 분화하는 것에 기인하여 채널 바이 채널(channel-by-channel) 베이시스 상에 행해져야 한다.
시간 히스토리에서 엘리먼트 및 백그라운드 로케이트
적합한 쓰레홀드가 발견되면, 평균 시간 히스토리는 Savitzky-Golay (SG) 필터를 이용하여 필터링되고, 피크 검출 알고리즘은 소정의 폭보다 큰 모든 쓰레홀드 크로싱을 확인하여, 데이터에서 높은 주파수 노이즈의 대부분을 리젝팅한다. 파운드 쓰레홀드 크로싱을 이용하여, 시간 히스토리는 엘리먼트 시그널 성분 및 백그라운드 시그널 성분으로 더 분리된다. 엘리먼트 단일 성분은 그것 내에 형광 미세길이 튜브 엘리먼트를 갖는 채널의 부분으로부터 발생된다. 백그라운드 성분은, 형광 엘리먼트 ()의 다운스트림이지만, 근접한 채널의 '빈(empty)' 섹션으로부터 발생한다. 이는, 각각의 미세길이 튜브 엘리먼트가 그 백그라운드-오프셋 보정을 갖게 한다. 각각의 성분의 중앙이 발견되고, 엘리먼트 폭의 데이터 점 +/- 25%은 각각의 성분에 평균 값을 생성하도록 추출된다(스캐닝에서 강조된 점을 참조). 엘리먼트 및 백그라운드의 중앙 부근의 점들 만이 엘리먼트 에지 효과를 제거하기 위해 사용된다. 시그널이 백그라운드 오프셋 상에 통과하지만, 백그라운드 점의 평균은 엘리먼트 점의 평균으로부터 빠지고, 결과는 카메라 노출로 정상화되고, 엘리먼트의 평균 RFU (Relative Fluorescence Unit)로서 최종적으로 저장된다. 이는 칩 상의 각각의 채널에서 각각의 미세길이 튜브 엘리먼트에 수행된다.
결과에 엘리먼트 평균 RFU's 를 합침
각각의 채널에 대한 모든 미세길이 튜브 엘리먼트의 평균 RFUs에 통계가 행해지고, 엘리먼트 평균의 모든 조합 사이에서 가장 낮은 % CV를 찾는 것에 의해 이상점(outlier)이 제거된다. 미세길이 튜브 엘리먼트의 최소수는 통계적 목적을 위해 유지되어야 한다. 이러한 결과 값은 포획제, 예컨대 항체, 농도를 결정하기 위해 표준 선량 곡선(standard dose curve)에 적용될 것이다.
본 발명의 많은 실시형태가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다.

Claims (81)

  1. 미세유체 분석 장치로서, 상기 장치는,
    유동축을 갖는 적어도 하나의 미세유체 유동 채널(micro-fluidic flow channel)로서, 개별적으로 분산되고, 축방향으로 이격된, 복수의 투명한 중공 마이크로-길이의 튜브형 유동 엘리먼트(hollow micro-length tubularflow element)가 상기 미세유체 유동 채널 내에 고정된 위치에 장착되고, 각각의 유동 엘리먼트는 그 내부를 통해 적어도 하나의 축방향으로 연장하는 유동 통로(flow passage)를 갖고, 분석 포획제는 상기 유동 엘리먼트의 내부를 통해 흐르는 액체 내의 분석물질의 포획을 위하여 상기 엘리먼트의 내표면에 고정되는 것인, 미세유체 유동 채널을 포함하고,
    상기 장치는 포획된 분석물질로부터 형광을 리딩하기 위해 빛이 상기 엘리먼트의 밖으로 투과되도록 구성되고;
    상기 유동 엘리먼트의 외측의 축방향으로 연장되는 표면은 분석 포획제를 포함하지 않지만, 상기 내표면의 적어도 일부는 상기 엘리먼트를 통해 흐르도록 노출된 분석 포획제의 침적물을 운반하고,
    상기 장치는, 각각의 유동 엘리먼트의 축방향으로 연장되는 외측을 따라 연장하는 바이패스 유동 경로(bypass flow path)를 포함하고,
    상기 유동 엘리먼트는, 상기 분석 장치 내에 놓이기 전에, 내표면 상에는 분석 포획제가 제공되나 수직 방향의 외표면에는 분석 포획제가 제공되지 않으며, 이는,
    상기 유동 엘리먼트를 분석 포획제의 용액 중에서 강하게 교반시켜, 상기 엘리먼트의 외표면 상에 파괴 전단력(disrupting shear force)을 부가하고, 이에 의해 상기 유동 엘리먼트의 축방향으로 연장하는 외부 표면에서 분석 포획제가 없어지도록 하고, 동시에 유동 엘리먼트의 내표면의 적어도 일부가 분석 포획제의 침적물을 운반하도록 하는 단계를 포함하는 과정에 의한 것인, 미세유체 분석 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이패스 유동 경로는 적어도 상기 엘리먼트의 내부를 통하는 총 내부 유동 단면(A1)만큼 큰 총 바이패스(by-pass) 유동 단면적(A2)을 갖는 것인, 미세유체 분석 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 중공 유동 엘리먼트는 채널 축 방향으로 평행하게 연장되는 내표면 및 외표면, 및 상기 축에 가로로 연장되는 말단면을 갖고, 상기 엘리먼트의 표면은 상기 채널 내 액체에 노출되고, 상기 장치는 포획된 분석물질로부터 형광을 여기 및 리딩하기 위해 유동 축에 가로로 상기 엘리먼트 안팎으로 빛을 투과시키도록 구성되는 것인, 미세유체 분석 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 엘리먼트의 말단면은 분석 포획제를 포함하지 않는 것인, 미세유체 분석 장치.
  5. 제3항에 있어서, 상기 바이패스 유동의 단면 A2는 상기 유동 엘리먼트를 통한 총 내부 유동 단면 A1보다 적어도 1.5배만큼 큰 것인, 미세유체 분석 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유동 엘리먼트는 700 ㎛ 미만의 길이 L을 갖는 것인, 미세유체 분석 장치.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 엘리먼트 각각의 길이 L은 250 ㎛인 것인, 미세유체 분석 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    유동 엘리먼트 각각은 유리 또는 유리와 유사한 물질로 이루어지고, 1 나노리터의 크기(order)의 내부 체적(internal volume)으로 정의되고, 상기 엘리먼트는 분석 반응을 위한 유리 나노 리엑터를 구성하는 것인, 미세유체 분석 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    각각의 유동 엘리먼트는 75 ± 50 ㎛ 사이의 내부 유동 단면 폭을 갖는 것인, 미세유체 분석 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    각각의 유동 엘리먼트는 동축의 원통형 내표면 및 외표면을 갖고, 상기 내표면은 75 ± 50 ㎛ 사이의 직경을 갖는 것인, 미세유체 분석 장치.
  11. 제1항에 있어서,
    각각의 유동 엘리먼트는 용융된 실리카로 이루어지고, 내측 직경이 75 um, 외측 직경이 125 um, 축 길이가 250 um인 곧은 원통 형태이고, 말단면은 상기 엘리먼트의 수직방향 축에 대해 소정의 각도로 놓여 있는 것인, 미세유체 분석 장치.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 중공 엘리먼트는 연신된 튜브(drawn tubing)의 세그먼트인 것인, 미세유체 분석 장치.
  13. 제1항에 있어서,
    연신된 튜브를 커팅함으로써 상기 엘리먼트 축에 소정의 각도로 놓이는 말단면을 갖는, 미세유체 분석 장치.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 유동 채널은 이격된, 대향하는 측벽들에 의해 한정되고, 상기 채널은 그 안에 고정된 유동 엘리먼트의 폭 또는 외부 직경보다 큰 폭을 갖고, 상기 엘리먼트는 측벽 중 하나와 접촉하여, 엘리먼트가 접촉하는 벽과 대향하는 엘리먼트의 측 상의 바이패스 유동 단면적이 엘리먼트가 접촉하는 측보다 큰 것인, 미세유체 분석 장치.
  15. 제14항에 있어서,
    적어도 상기 유동 엘리먼트와 접촉하는 유동 채널의 측은 상기 엘리먼트의 외표면에 대해 정전기적 인력의 특성을 갖는 물질에 의해 정의되는 것인, 미세유체 분석 장치.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 유동 채널은, 단단한 베이스면 또는 저형광 유리에 의해 바닥이 정의되고, 엘라스토머 시트의 대향하는 절단면에 의해 측면이 정의되는 것인, 미세유체 분석 장치.
  17. 제14항에 있어서,
    유동 채널의 측벽은 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어지는 것인, 미세유체 분석 장치.
  18. 제1항에 있어서,
    유동 채널은 상기 유동 엘리먼트의 대응하는 치수보다 약간 얕은 깊이의 개방 채널(open channel)에 의해 정의되고, 상기 유동 엘리먼트는 이러한 개방 채널에 위치하고, 투명한 가요성 시트(flexible sheet)는 상기 개방 채널의 개방측 상에 배치되어 상기 개방 채널의 개방측을 폐쇄하고, 상기 유동 채널을 형성하고 동시에 상기 유동 채널 내에 고정된 위치에 상기 엘리먼트를 고정하도록 상기 가요성 시트는 개방 채널의 외측에 놓이는 엘리먼트의 일부에 대해 탄력적으로 지지하는(the flexible sheet elastically bearing against the portion of the element lying outside the open channel) 것인, 미세유체 분석 장치.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 가요성 시트는, 상기 유동 엘리먼트로부터 떨어진 유동 채널의 선택된 영역에, 유동 밸브의 가요성 격막을 형성하는 것인, 미세유체 분석 장치.
  20. 제19항에 있어서,
    유동 채널의 또다른 선택된 영역에, 가요성 시트의 다른 부분들이 공기압에 의해 엑츄에이트되는 피스톤이 분석물의 유동을 움직이도록 가요성 격막을 형성하는 것인, 미세유체 분석 장치.
  21. 삭제
  22. 제20항에 있어서,
    상기 가요성 시트는 폴리디메틸실록산(PDMS)을 포함하는 것인, 미세유체 분석 장치.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 분석 포획제는 항체와 항원 중 하나를 포함하는 것인, 미세유체 분석 장치.
  24. 삭제
  25. 하나 이상의 미세유체 유동 채널을 갖는, 유체 분석을 수행하기 위한 미세유체 분석 장치로서,
    상기 하나 이상의 미세유체 유동 채널에는, 채널 내에 고정된 위치에 장착된 하나 이상의 투명 중공 마이크로-길이의 튜브형 유동 엘리먼트가 삽입되고,
    각각의 유동 엘리먼트는 그 내부를 통해 적어도 하나의 축방향으로 연장하는 유동 통로(flow passage)를 갖고, 분석 포획제가 상기 유동 엘리먼트의 내부를 통해 흐르는 액체 내의 분석물질의 포획을 위하여 상기 엘리먼트의 내표면에 고정되고,
    상기 장치는 포획된 분석물질로부터 형광을 리딩하기 위해 빛이 상기 엘리먼트의 밖으로 투과되도록 구성되고;
    상기 유동 엘리먼트 외측의 축방향으로 연장되는 표면은 분석 포획제를 포함하지 않지만, 상기 내표면의 적어도 일부는 상기 엘리먼트를 통해 흐르도록 노출된 분석 포획제의 침적물을 운반하고,
    상기 장치는, 각각의 유동 엘리먼트의 축방향으로 연장되는 외측을 따라 연장하는 바이패스 유동 경로(bypass flow path)를 포함하고,
    상기 유동 엘리먼트는, 상기 분석 장치내에 놓이기 전에, 내표면 상에는 분석 포획제가 제공되나 수직 방향의 외표면에는 분석 포획제가 제공되지 않으며, 이는,
    상기 유동 엘리먼트를 분석 포획제의 용액 중에서 강하게 교반시켜, 상기 엘리먼트의 외표면 상에 파괴 전단력을 부가하고, 이에 의해 상기 유동 엘리먼트의 축방향으로 연장하는 외부 표면에서 분석 포획제가 없어지도록 하고, 동시에 유동 엘리먼트의 내표면의 적어도 일부가 분석 포획제의 침적물을 운반하도록 하는 단계를 포함하는 과정에 의한 것인, 미세유체 분석 장치.
  26. 유체 분석에 사용하기 위한, 복수의, 투명한, 마이크로-길이의 튜브형 유동 엘리먼트를 제조하는 방법으로서,
    각각의 상기 유동 엘리먼트는 내표면 및 외표면을 갖고, 그 내부를 통해 적어도 하나의 축방향으로 연장하는 유동 통로(flow passage)를 갖고,
    상기 방법은,
    유동 엘리먼트를, 분석 중에 사용되어 분석물질을 포획할 분석 포획제의 용액에 현탁시키는 단계, 및
    상기 유동 엘리먼트를 분석 포획제의 용액 중에서 강하게 교반시켜, 상기 엘리먼트의 외표면 상에 파괴 전단력을 부가하고, 이에 의해 상기 유동 엘리먼트의 축방향으로 연장하는 외부 표면에서 분석 포획제가 없어지도록 하고, 동시에 유동 엘리먼트의 내표면의 적어도 일부가 분석 포획제의 침적물을 운반하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    강하게 교반하는 것(aggressively agitating)은 볼텍싱(vortexing)에 의해 수행되는 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 볼텍싱이 2,000rpm의 속도에서, 16 내지 24시간 동안 수행되는 것인, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 볼텍싱은, 사실상 원형 패턴을 갖고 0.5 cm, 1.0 cm, 2.0 cm 및 2.5 cm 중 적어도 하나의 변위 직경을 갖는 오비탈 운동을 사용하는 오비탈 볼텍싱 장치(vortexer)에 의해 수행되는 것인, 방법.
  30. 제26항에 있어서,
    강하게 교반하는 것은 앞뒤로 움직이는 운동 및 원형 운동 중 적어도 하나를 포함하고, 파괴 전단력을 생성하기에 충분한 빠른 진동 운동을 포함하는 것인, 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 현탁은 적어도 수천 개의 엘리먼트로 된 배치에 의해 수행되는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 엘리먼트의 현탁은 적어도 하나의 에펜도르프 튜브에서 수행되고, 각각의 튜브가 적어도 수천 개의 엘리먼트의 배치를 포함하는 것인, 방법.
  33. 제26항에 있어서,
    볼텍싱 후에, 포획제가 엘리먼트의 내표면의 길이에 걸쳐 사실상 균일하게 분포하는 것인, 방법.
  34. 제26항에 있어서,
    상기 엘리먼트의 길이 L은, 볼텍싱 후에 포획제가 엘리먼트의 내표면의 길이에 걸쳐 사실상 균일하게 분포하도록 선택되는 것인, 방법.
  35. 제26항에 있어서,
    볼텍싱 후에는, 유동 엘리먼트가 안정화 화합물을 포함하는 용액 중에 위치되는 것인, 방법.
  36. 제26항에 있어서,
    상기 축방향으로 연장하는 유동 통로는, 격렬한 볼텍싱 동안에 축방향으로 연장하는 유동 통로의 내표면 상에 층상 유동 조건이 존재하도록 하는 레이놀드 수를 갖는 것인, 방법.
  37. 제26항에 있어서,
    상기 축방향으로 연장하는 유동 통로는, 격렬한 볼텍싱 동안에 축방향으로 연장하는 유동 통로의 내표면 상에 파괴 전단력이 존재하지 않도록 하는 치수를 갖는 것인, 방법.
  38. 제26항에 있어서,
    상기 유동 엘리먼트는 용융된 실리카로 이루어지고, 내측 직경이 25 um, 외측 직경이 125 um, 축 길이가 250 um인 곧은 원통 형태이고, 말단면은 상기 엘리먼트의 수직방향 축에 대해 소정의 각도로 놓여 있는 것인, 방법.
  39. 제26항에 있어서,
    상기 유동 엘리먼트는 700 um 미만의 길이 L을 갖는 것인, 방법.
  40. 제26항에 있어서,
    상기 유동 엘리먼트는 250 um 미만의 길이 L을 갖는 것인, 방법.
  41. 제26항에 있어서,
    상기 유동 엘리먼트 각각은 유리 또는 유리와 유사한 물질로 이루어지고, 1 나노리터 크기의 내부 체적(internal volume)으로 정의되고, 상기 엘리먼트는 분석 반응을 위한 유리 나노 리엑터를 구성하는 것인, 방법.
  42. 제26항에 있어서,
    각각의 유동 엘리먼트는 동축의 원통형 내표면 및 외표면을 갖고, 상기 내표면은 75 ± 50 ㎛ 사이의 직경을 갖는 것인, 방법.
  43. 제26항에 있어서,
    상기 유동 엘리먼트는 연신된 튜브(drawn tubing)의 세그먼트인 것인, 방법.
  44. 제26항에 있어서,
    상기 유동 엘리먼트는, 연신된 튜브를 커팅함으로써 상기 엘리먼트의 수직방향 축에 소정의 각도로 놓이는 말단면을 갖는 것인, 방법.
  45. 제26항에 있어서, 상기 방법은, 현탁 단계 전에, 상기 엘리먼트의 실란화 단계를 추가로 포함하며,
    상기 엘리먼트의 실란화 단계는, 상기 엘리먼트를 실란 용액에 현탁시키고 용액 중 엘리먼트를 격렬히 볼텍싱시켜 엘리먼트의 내표면을 따라 실란이 사실상 균일하게 분포하도록 하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  46. 제26항에 있어서,
    상기 엘리먼트를 용액에서 혼합한 후에, 엘리먼트를 건조시키고, 이후에 적어도 하나의 엘리먼트를, 분석을 수행하는 분석 카트리지의 미세유동 채널 속으로 픽-앤-플레이스(pick-and-place)하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제26항에 있어서,
    상기 분석 포획제가 항체와 항원 중 하나를 포함하는 것인, 방법.
  48. 제26항에 있어서, 상기 분석이 면역분석(immunoassay)을 포함하는 것인, 방법.
  49. 제26항에 있어서, 상기 분석이 ELISA를 포함하는 것인, 방법.
  50. 유체 분석에 사용하기 위한, 복수의, 투명한, 마이크로-길이의 튜브형 유동 엘리먼트를 제조하는 방법으로서,
    각각의 상기 유동 엘리먼트는 내표면 및 외표면을 갖고, 그 내부를 통해 적어도 하나의 축방향으로 연장하는 유동 통로(flow passage)을 갖고,
    상기 방법은,
    유동 엘리먼트의 배치를, 분석 중에 사용되어 분석물질을 포획할 분석 포획제의 용액에 현탁시키는 단계, 및
    상기 유동 엘리먼트를 분석 포획제의 용액 중에서 강하게 교반시켜, 상기 엘리먼트의 외표면 상에 파괴 전단력을 부가하고, 이에 의해 상기 유동 엘리먼트의 축방향으로 연장하는 외부 표면에서 분석 포획제가 없어지도록 하고, 동시에 유동 엘리먼트의 내표면의 적어도 일부가 분석 포획제의 침적물을 운반하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 축방향으로 연장하는 유동 통로는, 격렬한 볼텍싱 동안에 축방향으로 연장하는 유동 통로의 내표면 상에 층상 유동 조건이 존재하도록 하는 레이놀드 수를 갖는 것인, 방법.
  52. 제50항에 있어서,
    상기 축방향으로 연장하는 유동 통로는, 격렬한 볼텍싱 동안에 축방향으로 연장하는 유동 통로의 내표면 상에 파괴 전단력이 존재하지 않도록 하는 치수를 갖는 것인, 방법.
  53. 유체 분석에 사용하기 위한, 복수의 마이크로-길이의 튜브형 유동 엘리먼트를 제조하는 방법으로서,
    각각의 상기 유동 엘리먼트는 내표면 및 외표면을 갖고, 그 내부를 통해 적어도 하나의 축방향으로 연장하는 유동 통로(flow passage)를 갖고,
    상기 방법은,
    상기 유동 엘리먼트를 분석 포획제의 용액 중에서 강하게 교반시켜, 상기 엘리먼트의 외표면 상에 파괴 전단력을 부가하고, 상기 파괴 전단력은 상기 유동 엘리먼트의 축방향으로 연장하는 외부 표면에서 분석 포획제가 없어지도록 하며, 동시에 유동 엘리먼트의 내표면의 적어도 일부는 그러한 파괴 전단력을 겪지 않고 분석 포획제의 침적물을 운반하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 축방향으로 연장하는 유동 통로는, 격렬한 볼텍싱 동안에 축방향으로 연장하는 유동 통로의 내표면 상에 층상 유동 조건이 존재하도록 하는 레이놀드 수를 갖는 것인, 방법.
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
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