JP2005528118A - 高処理一体化化学および生化学反応のための新規方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、高処理方式で基板を使って多数の分子反応プロセスをモニタリングする方法であって、前記基板が多数のマイクロチャンネルを有し、各マイクロチャンネルは前記基板の流入口端および流出口部短を各反対側に含み、前記マイクロチャンネルが少なくとも一の第一反応成分を含み、
(a)前記固体基板の前記マイクロチャンネルをサンプルと接触させ、該接触は、前記流入口端を経由し、前記サンプルが検体を含み、前記検体を前記マイクロチャンネル内に前記第一反応成分によって特異的に保持可能となる条件下で行なわれ;
(b)任意に、過剰のサンプルを前記流出口端から除去し;
(c)少なくとも一の第二反応成分を保持した検体と接触させ、該第二反応成分は工程(a)で規定した前記第一反応成分とは異なり、接触は分子反応が生起可能な条件下で行なわれ、該反応がシグナルを生じ;
(d)前記シグナルを検出し、反応結果を読み取り;
(e)第二反応成分を前記流出口端から除去し;
(f)工程(c)から(e)までを少なくとも1回繰り返し、その場合、(c)で規定した前記の少なくとも一の第二反応成分の組成は変更してもよく;かつ
最後に、反応結果を検出し読み取る、
の諸工程を含む方法に関する。
本発明は、その使用、並びに、本発明の前記方法を実施するためのマイクロアレイおよびキットにも関する。
(a)前記固体基板の前記マイクロチャンネルをサンプルと接触させ、該接触は、前記流入口端を経由し、前記サンプルが検体を含み、前記検体を前記マイクロチャンネル内に前記第一反応成分によって特異的に保持可能となる条件下で行なわれ;
(b)任意に、過剰のサンプルを前記流出口端から除去し;
(c)少なくとも一の第二反応成分を保持した検体と接触させ、該第二反応成分は工程(a)で規定した前記第一反応成分とは異なり、接触は分子反応が生起可能な条件下で行なわれ、該反応がシグナルを生じ;
(d)前記シグナルを検出し、反応結果を読み取り;
(e)第二反応成分を前記流出口端から除去し;
(f)工程(c)から(e)までを少なくとも1回繰り返し、その場合、(c)で規定した前記の少なくとも一の第二反応成分の組成は変更してもよく;かつ
最後に、反応結果を検出し読み取る、
の諸工程を含む方法に関する。
本発明は、その使用、並びに、本発明の前記方法を実施するためのマイクロアレイおよびキットにも関する。
Description
本発明は、高処理並行小規模反応の実施法に関する。特に、本開示は、化学および生化学分子の多重同時微量反応に関する。
試験管内の2個以上の分子間の化学および生化学反応などの反応プロセスは、チャンバーや容器内で実施されることが多い。前記チャンバー、あるは、反応釜は、一般に、ガラスやプラスチック製で、例えば試験管、微量遠沈管、毛細管およびマイクロタイタープレートを含む。
これらのプロセスは、一般に、いくつかの手法を挙げると、例えばピペット操作、混合、遠心分離、培養、洗浄および沈殿による容器間の液体の移行のようなサンプルの頻繁な手操作が関与する。従って、実験作業は、非常に時間がかかり、大きな労力を要する。
さらに、例えば分子生物学における方法の一般的な特徴は、一部の試薬が少量しか利用できずあるいは非常に高価であり、そのためほとんどの場合にごく少量の通常はμlの範囲の試薬や反応混合物が前記の方法の各工程で操作されるにすぎないことである。しかし、現在使用されている反応チャンバーは、例えば反応溶液の蒸発による損失が起こるために、1マイクロリットル未満の体積に使用するには向かない。
それらの反応の少量化による解決法が提供されている。例えば、WO 01/61054(特許文献1)は、微量液体反応の並行処理用の装置と方法を開示している。
PamGene BVを出願人とするWO01/12846(特許文献2)は、生体分子を負荷した金属酸化物支持体の調製に関する。
AKZO NBEL NVを出願人とするWO 99/02266(特許文献3)は、アッセイを実施するための装置、前記装置の製造法および前記装置製造での膜の使用に関する。
Perkin ElmerCorporationを出願人とするWO00/31304(特許文献4)は、フロースルーハイブリッド形成用の方法と装置に関する。
Houston Advanced Research Centerを出願人とするWO 95/11755(特許文献5)は、結合反応の断続的検出用の微量処理フロースルー多孔装置に関する。
Van Beuningenら(2001 Clinical Chemistry 47:1931-1933)(非特許文献1)は、多孔性金属酸化物上フロースルーマイクロアレイを使った迅速および特異的ハイブリッド形成に関する。
しかし、上記の先行技術の書類は、逐次反応の実施およびモニタリングに関するものではない。
WO 01/61054
WO01/12846
WO 99/02266
WO 00/31304
WO 95/11755
Van Beuningenら,Clinical Chemistry47:1931-1933,2001年
先行技術から認識されるように、微量反応に適した方法および装置の改良が常に求められている。そのため、本発明は、少量化分子反応プロセスのための一体化高処理法を提供することを目的とする。
本明細書で開示するのは、アレイ方式での複数同時微量化学および生化学反応の実施法である。前記方式は、多孔性基板による微小孔から成る反応チャンバーアレイを含む。
従って、本発明は、高処理方式で、基板を使って多数の分子反応プロセスをモニタリングする方法であって、前記基板が多数のマイクロチャンネルを有し、各マイクロチャンネルが、流入口端および流出口端を前記基板の各反対側に含み、前記マイクロチャンネルが少なくとも一の第一反応成分を含み、
(a)前記固体基板の前記マイクロチャンネルをサンプルと接触させ、この接触は前記流入口端を経由し、前記サンプルが検体を含み、前記検体が前記マイクロチャンネル内で前記第一反応成分によって特異的に保持可能である条件下で行なわれ;
(b)任意に、過剰のサンプルを前記流出口端から除去し;
(c)少なくとも一の第二反応成分を保持した検体と接触させ、前記第二反応成分は工程(a)で規定した前記第一反応成分とは異なり、分子反応を生起可能な条件下で行い、該反応がシグナルを生じ;
(d)前記シグナルを検出し、反応結果を読み取り;
(e)第二反応成分を前記流出口端から除去し;
(f)工程(c)から(e)までを少なくとも1回繰り返し、その場合、(c)で規定した前記の少なくとも一の第二反応成分の組成は変更してもよく;
(g)最後に、反応結果を検出し、読み取る、
の諸工程を含む方法を提供する。
(a)前記固体基板の前記マイクロチャンネルをサンプルと接触させ、この接触は前記流入口端を経由し、前記サンプルが検体を含み、前記検体が前記マイクロチャンネル内で前記第一反応成分によって特異的に保持可能である条件下で行なわれ;
(b)任意に、過剰のサンプルを前記流出口端から除去し;
(c)少なくとも一の第二反応成分を保持した検体と接触させ、前記第二反応成分は工程(a)で規定した前記第一反応成分とは異なり、分子反応を生起可能な条件下で行い、該反応がシグナルを生じ;
(d)前記シグナルを検出し、反応結果を読み取り;
(e)第二反応成分を前記流出口端から除去し;
(f)工程(c)から(e)までを少なくとも1回繰り返し、その場合、(c)で規定した前記の少なくとも一の第二反応成分の組成は変更してもよく;
(g)最後に、反応結果を検出し、読み取る、
の諸工程を含む方法を提供する。
アレイ反応チャンバーの寸法を小型化することにより、試薬量は著しく削減され、反応時間は短く、迅速な分析が可能になる。流入口端および流出口端を備えることによって、例えば酵素分解工程を用いずに済むので、さらに、反応の費用対効果が改善される。
本発明のさらなる特徴と長所を以下の詳細な説明で述べ、一部は、該説明から明らかになり、あるいは、本発明の実施によって理解できる。本発明の目的と他の長所は、特に本明細書と添付した請求の範囲で指摘する方法によって、実現、達成される。
本発明は、特に、一体化小型分子反応に関する。
本明細書および添付した請求の範囲で、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上、他に明確に指定しない限り、複数のものを含む。本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するものと同一の意味を持つ。
本発明で基板としての使用に適した多数の材料は、従来技術に記載されている。本発明で基板としての使用に特に適した材料には、従来技術で周知のいずれかのタイプの多孔性基板がある。本発明で基板としての使用にさらに特に適した材料には、従来技術で周知のいずれかのタイプの固体多孔性基板がある。
従って、本発明のある実施態様では、基板が多孔性である方法が提供される。
基板は、ビーズ、粒子、シート、フィルムまたは膜の形態であることができ、透過性であるのがよい。例えば、基板は、ビーズまたは粒子(従来の固相合成支持体など)、繊維(ガラスウールまたは他のガラスまたはプラスチック繊維)、ガラスまたはプラスチック毛細管、あるいは、金属酸化物膜から成ることができる。多孔性基板は、平面であることができ、単純または複雑な形をとることができる。分子が付着する表面は、多孔性基板の外面でもまたは内面でもよい。特に、表面が多孔性である場合には内面に付着することができる。固体表面が多孔性である場合、系の性質に応じて、各種ポア(孔)サイズを採用してよい。
本発明で使用する用語「マイクロチャンネル」は、多孔性基板の単一の孔を指す。本発明で有用なポアサイズ直径の適切と思われる例は、約10〜500nm、50〜400nmまたは100〜300nmの範囲であり、あるいは、例えば、10nm、50nm、70nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、225nm、250nm、300nm、350nmまたは400nmである。本発明に記載の方法で有用な基板は、例えば、ポア約105〜109、106〜108または107個/mm2であるのがよい。これらの寸法は、本発明を限定するとみなすべきでない。
多孔性基板材料は、例えば、金属、セラミック金属酸化物または有機ポリマーであることができる。強度と剛性の観点から、金属またはセラミック金属酸化物を使用するのがよい。とりわけ、耐熱性および耐薬品性の観点から、金属酸化物を使用するのがよい。さらに、金属酸化物では、チャンネルの高密度と高多孔度が得られるので、最初の結合物質を含有するアレイのサンプル適用単位表面積当たりの密度が高くなる。さらに、金属酸化物は可視光に対する高度の透過性がある。金属酸化物は、比較的安価な基板であり、典型的な微細加工技術のいずれの使用も必要とせず、例えば電気化学的に製造した金属酸化物膜のように支持体表面への液体分布の調節が容易になる。貫通指向チャンネルを有する金属酸化物膜は、金属シートの電気化学的エッチングによって製造できる。
従って、本発明のある実施態様では、本明細書で説明する前記多孔性基板が金属酸化物基板である方法が提供される。
金属酸化物の種類は、特に限定しない。金属として、例えば、ステンレススチール(焼結金属)の多孔性基板使用できる。耐熱性を必要としない利用には、剛性でアレイば、有機ポリマーの多孔性基板も使用できる。
考慮対象の金属酸化物は、とりわけ、ジルコニウム、シリシウム、ムライト、コーディエライト、チタン、ゼオライトまたはゼオライト類似物質、タンタル、およびアルミニウム、並びに、2種類以上の金属酸化物およびドープ処理金属酸化物の合金および金属酸化物含有合金である。
ある実施態様では、本明細書で説明するとおりに、前記多孔性基板が酸化アルミニウム基板である方法が提供される。
金属酸化物膜は、例えば、特に吸湿している場合透過性であり、これによって各種光学技術を使ったアッセイが可能になる。上記の膜は、適切に調節した直径と有用な化学的表面特性を持つ指向性貫通チャンネルを有する。WO99/02266は、この点で典型的な多孔性基板としてAnopore(登録商標)の使用を開示しており、これを特別に本発明に組み入れる。
基板が多孔性であるので、液体、例えばサンプル溶液は加圧を受けて基板構造を容易に抜けて移動する。二次元の基板とは対照的に、本明細書で説明する方法で使用する三次元基板またはマイクロアレイはフロースルー性であるので、有意にハイブリッド形成時間は短縮しシグナルおよびシグナル対ノイズ比は減少する。さらに、サンプル溶液を基板孔から勢いよく送り込み、または、送り出すために、アレイに陽圧または陰圧をかけることができる。
「分子反応プロセス」および「反応」という用語は、本明細書全体で互換的に使用し、少なくとも2分子が関与する反応プロセスを指す。本明細書で使用する場合の分子反応プロセスは、例えば化学反応、生物学的反応、生化学反応および分子生物学的反応など、溶液中で実施する反応を含む。
従って、ある実施態様では、前記分子反応を、化学反応および生化学反応を含む群から選択する方法が提供される。
本明細書に記載の方法を使って実施する反応の適切な例には、これに限定されないが、RNA、染色体DNAまたはプラスミドまたは他のベクターからのDNAの単離、核酸の制限酵素消化、核酸の配列決定、酵素による核酸の伸長および重合、オリゴヌクレオチド合成、生体活性クローン用細菌株のスクリーニングなどがある。
従って、別のある実施態様では、既述のとおりに、前記分子反応を、連結反応、プライマー伸長反応、ヌクレオチド配列決定反応、制限エンドヌクレアーゼ消化、生体相互作用、オリゴヌクレオチド合成反応、ポリヌクレオチドハイブリッド形成反応、ペプチド合成およびタンパク結合反応を含む群から選択する方法が提供される。
本発明に従って実施でき、本詳細な説明で例示する反応の特に適切な例には、合成配列決定が含まれる。合成配列決定反応は、従来技術で周知であり、例えばパイロシーケンシングがある。
従って、ある実施態様では、前記分子反応がヌクレオチド配列決定反応である方法が提供される。
別の実施態様では、前記配列決定反応が合成配列決定反応である方法が提供される。
本発明の長所は、反応が起こる基板にフロースルー特性があるため、現行のプロトコルをスピードアップできる点である。反応組成物および/またはプロトコルは、酵素的分解工程を用いないことによって簡略化できる。本発明方法によれば、例えば、アピラーゼによるヌクレオチド分解を必要とせずにパイロシーケンシング反応が可能である。
反応溶液を基板孔から動的に送りこみ、または、送り出すために、陽圧または陰圧をかけることができる。別法として、基板を重力または遠心力に供することができる。適用する該重力または遠心力の持続時間、種類、強度が、基板内の反応成分の置換レベルを決定する。本発明の長所は、簡単な流出によって反応成分を移動させる、または補給することができる。
本発明のある実施態様では、検体および/または反応成分の除去は、重力、遠心力、圧力および真空を含む吸引を含む群から選択する手段による。
本発明のある実施態様では、第一反応成分を基板上に整列させ、マイクロアレイを作る。
「スポット」および「所定の領域」という用語は、本発明全体で互換的に使用し、個々に、アレイを形成する基板上の空間的に処理可能な位置に関する。
特定の基板サイズに関して、基板上のスポット数の上限は、アレイ中のスポット作製および検出能によって決定される。アレイ上の好ましいスポット数は、一般に、アレイを配置すべき特定の使用によって異なる。例えば、ハイブリッド形成による配列決定は、一般に、大型アレイを必要とするが、突然変異の検出には、小型アレイを必要とするだけでよい。一般に、アレイは、2〜106個以上のスポット、または約100〜105個のスポット、または約400〜約104個のスポット、または約500〜約2000個のスポット、または外側限界を含めた100〜500個のスポットを含む。
本発明のさらなる実施態様では、前記マイクロアレイは、25個/mm2までのスポットを含む。
本発明で使用する場合の「第一反応成分」という表現は、基板上の所定の領域内に存在する反応成分の1つを指す。所定領域内に存在する第一反応成分は、別の所定領域内に存在する第一反応成分とは混ざり合わないことは、明らかである。第一反応成分は、前記基板に、例えば共有結合、非共有結合または吸収によって付着でき、あるいは、所定領域内で、該基板に付着せずに、例えば溶液状態を保つことができる。
本発明に従ったある実施態様では、前記第一反応成分は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、PCR生成物および化合物を含む群から選択する。
本発明に従った特定の実施態様では、前記第一反応成分は、オリゴヌクレオチドである。
本発明に従ったさらなる実施態様では、前記第一反応成分を、共有結合、非共有結合および吸収を含む群から選択するメカニズムによって、前記マイクロチャンネルに結合させる。
本発明の簡便な実施態様では、前記第一反応成分は、前記マイクロチャンネルに共有結合する。
「共有」および「非共有」結合という用語を、以下の実施例でさらに詳細に説明する。cDNAアレイについては、cDNAクローンをPCRによって増幅し、予めポリ-L-リジンでコートしていた顕微鏡スライド上に整列させる。これにより、オリゴヌクレオチドとスライド表面の間に安定だが、本質的に非共有結合が形成される。別法として、PCR中の5'-アミノ修飾プライマーを使ってPCR生成物の5'-末端の1つをアミノ修飾することができる。該5'-アミノ-修飾PCR生成物を、アルデヒド官能基でコートしておいた顕微鏡スライド上に整列できる。cDNA上のアミノ基とスライドガラス上のアルデヒド基の間に共有結合が形成され、該ガラスへのDNAサンプルの永続的付着が生じる。
共有結合を奏効させるために、一般に、最初に基板を活性化する、即ち、処理して、第一反応成分、例えば捕獲ポリヌクレオチドと反応できる基板上または基板内に反応基を生じさせ、共有結合を形成する。どんな反応基が望ましいかは、第一反応成分、例えば捕獲ポリヌクレオチド、を多孔性基板および多孔性基板組成物に付着させるのに使用する化学作用よって異なり、これは当業者でアレイば認識する。多孔性基板への捕獲ポリヌクレオチドの共有結合を奏功させるのに有用な典型的反応基は、ヒドロキシル基(-OH)、スルフォニル基(-SH)、アミノ基(-NH2)、エポキシ基O=(-CH2-CH2-)およびカルボキシル基(-COOH)である。しかし、当業者に周知の他の反応基も使用でき、本発明の範囲に含まれる。ミリアドタイプの基板材料上に反応基を適切な密度または表面濃度で生成させる様々な技術は、従来技術で周知であり、例えば化学活性化、コロナ放電活性化、火焔処理活性化、気体プラズマ活性化およびプラズマエン助長化学気相蒸着法(PECUD)がある。これらの技術は十分な反応基密度または表面濃度を達成するものでアレイばいずれも本発明の多孔性基板の活性化に使用できる。いずれかの活性化方式により達成した反応基濃度は、生成した特定基のための標準法を使って測定することができる。例えば、活性化多孔性基板をレポーター構成部分と反応させることにより、定量可能なシグナルが得られる。限定されない例には、放射能標識体を保持した構成部分、蛍光標識体を保持した構成部分、基板から分裂した場合、例えば蛍光および/または吸光度分光分析法などの簡便な分光分析技術を使って簡便に定量できる構成部分がある。
特に適した共有結合の例は、従来技術で周知のシラン処理を含む。この点に関して、例えばWO 01/12846に記述されている方法が参照される。
本発明の別の簡便な実施態様では、前記第一反応成分を吸収によって前記マイクロチャンネルに結合させる。
「検体」および「検体分子」という用語は、本発明全体で互換的に使用する。「サンプル中検体」という用語は、サンプル中の分子、即ち、前記反応が起こる基板内および/または該基板に提供する試薬との反応によって分析する分子を指す。前記サンプルは、従来技術で周知のどんなタイプのサンプルでもよい。
本明細書で使用する検体は、マイクロアレイによる分子反応を実施する目的で多孔性基板に固定した標的分子が特異的に保持することができるいずれかの分子を指す。
従って、本発明のある実施態様では、検体を第一反応成分との特異的ハイブリッド形成によって保持する
本明細書で使用する検体という用語は、別個の分子でも、例えばタンパク質エピトープなどの分子の一部でもよい。本発明で使用できる検体の限定されない例は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、精製抗体、合成抗体、特異的抗原決定因子(ウイルス、細胞または他の材料など)との反応性を示す抗血清、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素結合部位、細胞膜レセプター、脂質、プロテオリピド、薬物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖類、ポリサッカライド、細胞、細胞膜および小器官、核酸、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)やリボ核酸(RNA)およびペプチド核酸(PNA)またはそれらの混合物;補因子、レクチン、代謝物、酵素基質、金属イオンおよび金属キレートがあるが、それらに限定されない。
本発明の特定の実施態様では、前記検体は核酸である。
基板内で検体を特異的に保持した後、反応試薬を添加して分子反応プロセスを開始すればよい。想定したプロセスによれば、単一の第二反応成分を添加するのがよいが、別の反応成分を含めることもできる。該第二反応成分は、酵素または基質あるいはそれらの混合物を含む混合試薬であるのがよい。本発明方法によれば少なくとも一の第二反応成分を逐次的に添加することが可能である。逐次的な添加毎に、前記の少なくとも一の第二反応成分の組成は変更してもよく、例えば、フィルイン、エクステンションおよび合成配列決定反応に変更でき、その場合、様々なヌクレオチド種を逐次的に該反応に添加する。
従って、ある実施態様では、第二反応成分を酵素および酵素基質を含む群から選択する方法が提供される。
さらなる実施態様では、前記の第二反応成分は酵素である。
なおもさらなる実施態様では、前記の酵素は、DNA/RNA修飾酵素またはタンパク質ツールである。
有用なDNA/RNA修飾酵素には、例示であって限定するものではないが、制限エンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、メチラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ、RNアーゼ、DNA修復タンパク質、リコンビナーゼおよびトランスポーゼースがある。有用なタンパク質ツールには、例示であって、限定するものではないが、プロテアーゼ、エンドグリコシダーゼ、エキソグリコシダーゼ、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼおよび阻害剤類がある。
本発明の特定の実施態様では、前記の修飾酵素は、ポリメラーゼ、リガーゼおよびヌクレアーゼを含む群から選択する。
本発明の別の実施態様では、前記の第二反応成分は、酵素基質である。
基板内での反応プロセスのモニタリングは、前記反応によって発生したシグナルによって行う。前記シグナルは、一過性であるのがよく、即ち、特に急速に通過し、消失するのがよい。本発明で使用する場合の「一過性シグナル」という用語は、例えばパルスを指す。本発明では、少なくとも1種類の第二反応成分の各逐次添加を、シグナルパルスの発生についてモニターする。前記パルスのレベルと強度は、前記の少なくとも1種類の反応成分の添加時の反応結果と直接関連するのがよい。
従って、ある実施態様では、前記シグナルが一過性である方法が提供される。
シグナルの検出は、定量的または定性的な観察またはその両方であるのがよい。
本発明のある実施態様では、前記シグナルが光学的輻射線による、本明細書に記述する方法が提供される。
本明細書で使用する、「光学的輻射線」という用語は、電磁線スペクトルの可視部、紫外部、赤外部および/または他の領域の輻射線など、シグナルを伝達する際に使用できる輻射線を含むことができる。
本明細書で述べる実施態様は、化学発光を指すが、本発明に従って実施する反応は、例えば生物発光、放射性輻射線および蛍光でモニターできることが明らかになる。
本発明の簡便な実施態様では、前記の光学的輻射線が化学発光である方法が提供される。
発生したシグナルの検出法は、従来技術で周知である。シグナルは、様々な方法によって検出または可視化するのがよく、特定の検出法は、利用するレポーター系に基づいて選択する。代表的検出法は、シンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、光学検出法、例えば蛍光測定、比色定量、光散乱などである。
ある実施態様では、本発明の一方法を説明しているが、その場合、前記検出法は、光学的検出法である。
ある実施態様では、本発明の一方法を説明しているが、その場合、前記検出法は、化学発光検出法である。
「化学発光」という用語は、化学反応からのエネルギーの放出による、電磁線の光としての発生を指す。原則として、光は、紫外領域、可視領域、赤外領域で放出されるが、放出されるもののうち、可視光が最も一般的である。該可視光は、最も興味深く、有用でもある。
化学発光反応は、3つのタイプに分類できる:
1.合成化合物を使用し、高度酸化種、例えば過酸化物、が関与する化学反応は一般に称される化学発光反応である。
2.生物、例えば蛍やくらげから起こる発光反応は、一般に称される生物発光反応である。
3.電流の使用によって起こる発光反応は、電気化学発光反応に指定されている。
1.合成化合物を使用し、高度酸化種、例えば過酸化物、が関与する化学反応は一般に称される化学発光反応である。
2.生物、例えば蛍やくらげから起こる発光反応は、一般に称される生物発光反応である。
3.電流の使用によって起こる発光反応は、電気化学発光反応に指定されている。
化学発光および生物発光反応は、通常、有機過酸化物のO-O結合の開裂または切断が関与する。過酸化物、特に環状過酸化物は、光放射反応の主流である。理由は、過酸化物の結合が比較的弱く、開裂し易く、結果として起こる分子の再構成によって、大量のエネルギーが放出されるからである。
本発明のある実施態様では、反応プロセスによって生じるシグナルのモニタリングが光学的手段による方法が提供される。
さらなる実施態様では、前記の光学的手段は、CCD画像描出システムによる。
本発明のなおもさらなる実施態様では、本発明に従った反応プロセスのモニタリングは、リアルタイムとする。
さらなる実施態様では、1種類以上の基板を同時に使用する方法が提供される。
さらなる実施態様では、前記の1種類以上の基板が固定手段によって一平面上にある方法が提供される。
さらなる実施態様では、前記固定手段がマイクロタイタープレートで、前記マイクロタイタープレートが多数の個別ウェルを有し、各ウェルが流入口、底部流出部、および前記基板を保持する付属品を備えている方法が提供される。
さらなる実施態様では、分子反応プロセスの高処理実施およびモニタリング法の使用が提供される。
さらなる実施態様では、リアルタイム分子反応プロセスのモニタリング法の使用が提供される。
さらなる実施態様では、ヌクレオチド配列決定反応法の使用が提供される。
さらなる実施態様では、合成配列決定反応法の使用が提供される。
さらなる実施態様では、マイクロチャンネルを有する基板を含む方法を実施するためのマイクロアレイであって、前記マイクロチャンネルが流入口端および流出口端を前記基板の各反対側に含み、その場合、各マイクロチャンネルが、核酸、酵素および酵素基質を含む群から選択した少なくとも1種類の反応成分を含むマイクロアレイが提供される。
さらなる実施態様では、本発明に記載の方法を実施するための分子反応キットの製造に向けたマイクロアレイの使用が提供される。
さらなる実施態様では、(a)マイクロチャンネル内に第一反応成分を含む、本発明に記載のマイクロアレイと、(b)第二反応成分であって、該第二反応成分が工程(a)で規定した前記第一反応成分と異なるもの、から成る分子反応キットが提供される。
ウイルスRNAサンプルのパイロシーケンシング
序論
-70℃で保存したHIV-1感染者の血漿サンプルからのHIV-1 RNAを、NucliSensRNAキット(BioMerieux)を使って製造会社の説明書に従い抽出する。該サンプルは、NucliSensHIV-QT(BioMerieux)によって製造会社の説明書に従い定量する。cDNA合成キット(AmershamPharmaciaBiotech、Uppsala、Sweden)を使って、ウイルスRNAからcDNAを合成する。
序論
-70℃で保存したHIV-1感染者の血漿サンプルからのHIV-1 RNAを、NucliSensRNAキット(BioMerieux)を使って製造会社の説明書に従い抽出する。該サンプルは、NucliSensHIV-QT(BioMerieux)によって製造会社の説明書に従い定量する。cDNA合成キット(AmershamPharmaciaBiotech、Uppsala、Sweden)を使って、ウイルスRNAからcDNAを合成する。
配列分析を、Sanger配列決定反応(Amersham Pharmacia Biotech)と比較する。
配列決定反応は、可変配列領域(http://hiv-web.lan.gov)に隣接する一群の変性プライマー10個について実施する。該プライマーをスポットし、従来技術で周知のとおりに、基板に共有結合する。cDNAをプライマーアレイに捕捉する。
リアルタイム配列決定は、基板インキュベーター中、総量10μl、28℃で実施する。最初のdNTP-トリフォスフェート/酵素混合液を添加した後、該溶液を真空下で基板を通し、CCD画像描出システム(Olympus)で化学発光を記録する。その後、洗浄液5μlを添加し、基板に通す。次の、それに続くdNTP-トリフォスフェート/酵素混合液を添加し、基板に通し、化学発光を記録する。後者の2工程を繰り返す。
標準的パイロシーケンシング法(Pyrosequencing SQAキット、Pyrosequencing AB、Uppsala、Sweden)に勝る長所は、反応時間がはるかに短い点である。これは、反応どうしの間で酵素やヌクレオチドの分解工程が行われない;即ち、取り込まれなかったヌクレオチドをフロースルー洗浄工程により簡単かつ速やかに移動させるからである。
結果
オリゴヌクレオチドプローブを酸化アルミニウムAnopore基板(「Anodisc25」Whatman)の小さな計量済みディスクに結合した。
オリゴヌクレオチドプローブを酸化アルミニウムAnopore基板(「Anodisc25」Whatman)の小さな計量済みディスクに結合した。
陽性対照オリゴとして、JD-APC-gen #01-0432(TAATTTTTAGGGTTCAACT-SEQIDNo.1)を使用した;陰性対照オリゴとして、逆相補Thr3オリゴ#01-316(GCGCCATGTCTATTGGACTAGATGGTTCACCGATTTGCCTGGCGTCTAAA-SEQIDNo.2)を使用した(Fakhrai-Rad,H et al., Human Mutation,Vol. 19(5), 2002)。
さらに、「裸の」Anopore膜(ディスクフォーマット中、または、Anopre粉末として)を真の陰性対照として使用した。
その後、製造会社の添付文書に従い、PSQ96システム上のJD-APC-genに相補プローブ配列を添加して、パイロシーケンシング反応で調製サンプルを検討した。陽性対照のサンプルF、G、HにJD-APC-genプローブを添加した。
断片Cの野生型(wt)と突然変異型(mut)をスポットしたアレイを1nMの野生型断片D(Dwt)とハイブリッド形成し、その後、室温にて、20μlの6xSSPE(塩化ナトリウムリン酸ナトリウム-EDTA)/5xDenhardt中で、野生型断片E(Ewt)または突然変異型断片E(Emut)とそれぞれ1時間ハイブリッド形成した。その後、該アレイを室温で2xSSPEで洗浄した。次に、リガーゼ緩衝液中リガーゼ混合液20μl(T4リガーゼ10単位、Promega)を添加し、反応混合液を基板孔の中で上下させながら、室温で2時間連結反応を行った。その後、膜を75℃で5分間水洗し、画像を撮影した。各分析を2回繰り返しで行った(図3および図4に示す1および2)。
第一実験(A、図3)では、突然変異型断片Cmutが基板に結合する。鋳型の野生型断片DwtはCmut並びに野生型断片Ewtとハイブリッド形成する。断片Cは変異型であるので、該断片は鋳型として働くDwtによってEwtに連結させることができない。従って、連結および洗浄を実施した後、連結反応の分析時にはシグナルが検出されない。
第二実験(B、図3)では、野生型断片Cwtを基板に結合する。鋳型の野生型断片DwtをCmut並びに野生型断片Ewtとハイブリッド形成する。断片CおよびEは野生型であるので、これらの断片は鋳型として働くDwtによって連結した。従って、連結および洗浄を実施した後、連結反応の分析時にはシグナルが検出された。
第三実験(A、図3)では、突然変異型断片Cmtを基板に結合する。鋳型の野生型断片Dwtを、Cmut並びに突然変異型断片Emtとハイブリッド形成する。断片CおよびEは、共に、変異型であるので、これらの断片は、鋳型として働くDwtによって連結させることができない。従って、連結および洗浄を実施した後、連結反応の分析時にはシグナルが検出されなかった。
第四実験(B、図4)では、野生型断片Cwtを基板に結合する。鋳型の野生型断片DwtをCmut並びに突然変異型断片Emtにハイブリッド形成する。断片Eは突然変異型であるので、該断片は、鋳型として働くDwtによってCwtに連結させることができない。従って、連結および洗浄を実施した後、連結反応の分析時にはシグナルが検出されなかった。
KlenowおよびTaq反応
金属酸化物基板を、標準条件下で、変性プラスミドpGEM-ルシフェラーゼとハイブリッド形成した。アレイの配置は図5に示すとおりである。この膜と対照膜を洗浄し、室温でKlenow酵素(図6)と30分間、または、95℃でTaq-ポリメラーゼ(図7)と1分間および72℃で30分間、10%フルオレセイン-UTPを含有する標準ニックトランスレーション緩衝液中でインキュベーションした。その後、該両膜を95℃の水で5分間洗浄した。各実験は、2回繰り返して実施した(図6および7に1および2で表したとおり)。
金属酸化物基板を、標準条件下で、変性プラスミドpGEM-ルシフェラーゼとハイブリッド形成した。アレイの配置は図5に示すとおりである。この膜と対照膜を洗浄し、室温でKlenow酵素(図6)と30分間、または、95℃でTaq-ポリメラーゼ(図7)と1分間および72℃で30分間、10%フルオレセイン-UTPを含有する標準ニックトランスレーション緩衝液中でインキュベーションした。その後、該両膜を95℃の水で5分間洗浄した。各実験は、2回繰り返して実施した(図6および7に1および2で表したとおり)。
Claims (41)
- 高処理方式で基板を使って多数の分子反応プロセスをモニタリングする方法であって、前記基板が多数のマイクロチャンネルを有し、各マイクロチャンネルは流入口端および流出口端を前記基板の各反対側に有し、前記マイクロチャンネルが少なくとも一の第一反応成分を含み、
(a)前記固体基板の前記マイクロチャンネルをサンプルと接触させ、該接触は、前記流入口端を経由し、前記サンプルに検体が含まれ、該検体が前記マイクロチャンネル内で前記第一反応成分によって特異的に保持可能となる条件下で行なわれ;
(b)任意に、過剰のサンプルを前記流出口端から除去し;
(c)保持した検体を少なくとも一の第二反応成分と接触させ、該第二反応成分は工程(a)で規定した前記第一反応成分とは異なり、接触は分子反応が生起可能な条件下で行なわれ、該反応がシグナルを生じ;
(d)前記シグナルを検出し、反応結果を読み取り;
(e)第二反応成分を前記流出口端から除去し;
(f)工程(c)から(e)までを少なくとも1回繰り返し、その場合、(c)で規定した前記の少なくとも一の第二反応成分の組成は変更してもよく;かつ
(g)最後に、反応結果を検出し読み取る、
の諸工程を含む方法。 - 前記基板が多孔性基板である請求項1に記載の方法。
- 前記基板が金属酸化物基板である請求項1または2に記載の方法。
- 前記金属酸化物基板が酸化アルミニウム基板である請求項3に記載の方法。
- 前記第一反応成分を基板上に整列させ、マイクロアレイを形成する請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マイクロアレイが25個/mm2までのスポットを含む請求項5に記載の方法。
- 前記の第一反応成分をタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、PCR生成物および化合物を含む群から選択する請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第一反応成分がオリゴヌクレオチドである請求項7に記載の方法。
- 前記第一反応成分を、共有結合、非共有結合および吸収を含む群から選択するメカニズムによって、前記マイクロチャンネルに結合させる請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記の第一反応成分を前記マイクロチャンネルに共有結合させる請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第一反応成分を前記マイクロチャンネルに吸収によって結合させる請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検体が核酸である請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的を前記の第一反応成分との特異的ハイブリッド形成によって保持する請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第二反応成分を、酵素および酵素基質を含む群から選択する請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の第二反応成分が酵素である請求項14に記載の方法。
- 前記修飾酵素がDNA/RNA修飾酵素またはタンパク質ツールである請求項15に記載の方法。
- 前記酵素を、ポリメラーゼ、リガーゼおよびヌクレアーゼを含む群から選択する請求項16に記載の方法。
- 前記の第二反応成分が酵素基質である請求項14に記載の方法。
- 前記の、検体および/または反応成分の除去が、重力、遠心力、圧力および吸引、例えば真空を含む群から選択する手段による請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の分子反応を化学反応および生化学反応を含む群から選択する請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分子反応を、連結反応、プライマー伸長反応、ヌクレオチド配列決定反応、制限エンドヌクレアーゼ消化、生体相互作用、オリゴヌクレオチド合成反応、ポリヌクレオチドハイブリッド形成反応、ペプチド合成およびタンパク結合反応を含む群から選択する請求項20に記載の方法。
- 前記分子反応がヌクレオチド配列決定反応である請求項20または21に記載の方法。
- 前記配列決定反応が合成配列決定反応である請求項22に記載の方法。
- 前記シグナルが一過性である請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルが光学的輻射線による請求項24に記載の方法。
- 前記光学的輻射線が化学発光である請求項25に記載の方法。
- 前記検出法が光学的検出法である請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出法が化学発光検出法である請求項27に記載の方法。
- 前記モニタリングが光学的手段による請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記光学的手段がCCD画像描出システムである請求項29に記載の方法。
- 前記モニタリングがリアルタイムである請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 1種類以上の基板を同時に使用する請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1種類以上の基板を固定手段によって一平面に保持する請求項32に記載の方法。
- 前記固定手段がマイクロタイタープレートで、前記マイクロタイタープレートが多数の個別ウェルを有し、各ウェルが流入口と底部流出部、および前記基板を保持する付属品を有する請求項33に記載の方法。
- 分子反応プロセスの高処理実施およびモニタリングのための請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法の使用。
- リアルタイム分子反応プロセスのモニタリングのための請求項35に記載の方法の使用。
- ヌクレオチド配列決定反応のための請求項35または36に記載の方法の使用。
- 合成配列決定反応のための請求項37に記載の方法の使用。
- 基板が多数のマイクロチャンネルを有し、前記マイクロチャンネルは、流入口端および流出口端を前記基板の各反対側に含み、前記マイクロチャンネルが、核酸、酵素および酵素基質を含む群から選択した少なくとも一の第一反応成分を含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法を実施するためのマイクロアレイ。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法を実施する分子反応キットの製造のための請求項39に記載のマイクロアレイの使用。
- 分子反応キットであって、(a)マイクロチャンネル内に第一反応成分を含む請求項39に記載のマイクロアレイと、(b)第二反応成分であって、該第二反応成分は工程(a)で規定した前記第一反応成分と異なるもの、を含むキット。
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