JPH09288089A - 毛細管電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 毛細管電気泳動における試料の蛍光検出にお
いて励起光の散乱光および管壁での蛍光発生を減少する
こと。 【解決手段】 試料を泳動するための毛細管（45）中
に，光ファイバー（58）を挿入し，光ファイバー（58）
の出射口の対向部を開放した光学検出配置を提供し，励
起光の散乱面の数を減少し，また管壁中での蛍光発生を
なくす。 【効果】 高いS/Nでの蛍光検出が可能となり，検出下
限が向上した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は毛細管電気泳動装置
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】第一の公知例（特開平5-296978）には，
試料を光学的に検出する電気泳動装置の一つの様態が示
されている。この例では，電解質を満たした光学セル中
に２本の毛細管のそれぞれ一端を挿入し，両毛細管をほ
ぼ同軸にかつ一定のギャップを保持するように配置す
る。試料は一方の毛細管からギャップを通過して他方の
毛細管へと泳動される。ギャップ部に励起光を集光し，
試料から発生する蛍光を測定する。第二の公知例（J.A.
Taylor and E.S.Young，Anal. Chem.,64(1992)1741-174
4)には，試料を光学的に検出する電気泳動装置の別の様
態が示されている。この例では，試料励起用の光ファイ
バーを毛細管中に同軸に挿入し，試料から発生する蛍光
を測定する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般に毛細管電気泳動
装置における蛍光検出では，目的とする蛍光の他に，背
景光として，毛細管の内壁及び外壁での励起光の散乱光
および毛細管の管壁で発生する蛍光がある。そのためバ
ックグラウンドレベルおよびノイズレベルが高くなり，
検出下限の低下を招くことになる。また試料から発生す
る蛍光も毛細管の内壁および外壁において散乱されるた
め，信号レベルが低くなり，検出下限の低下を招くこと
になる。

【０００４】上記第一の公知例においては，検出部周囲
の毛細管管壁が取り除かれているが，光学セルでの散乱
と蛍光発生が存在する。蛍光検出のS/Nに対するこれら
の影響は，毛細管の軸に垂直方向の光学セルの内径を大
きくし，光学セルを形成する壁を検出部から遠ざけるほ
ど低減するが，内径が大きくなるほど光学セル内部に満
たされた電解質の対流が大きくなり，ギャップ中での試
料の泳動に悪影響を及ぼす。

【０００５】上記第二の公知例においては，毛細管管壁
での散乱と蛍光発生の影響が実質的に排除されている。
しかし，励起光は検出部以外の泳動路中にも照射される
ため，蛍光体の劣化が激しい。また泳動路中に光ファイ
バーを挿入することにより電気泳動の乱れが生じる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記課題は，毛細管であ
る溝の一部を光導波路で形成し，光導波路の出射面を溝
に面し，出射面の対向部を開放することによって解決さ
れる。

【０００７】

【発明の実施の形態】

（実施例１）本実施例は，蛍光標識した試料分子を分離
し，検出部に励起光を照射して試料から発生する蛍光を
検出する電気泳動装置である。ここでは標識用の蛍光体
としてfluorescein isothiocyanate（FITC）を使用し，
水溶液中のアミノ酸を分離分析する場合について説明す
る。

【０００８】図１に，本実施例の構成図を示す。基板１
（１）および基板２（２）がスペーサー（３）〜（６）
を介して130μｍの間隙を形成するように配置される。
基板１（１）と基板２（２）とはネジ（23）〜（26）に
より固定する。基板１（１）と基板２（２）の間隙を形
成する面は鏡面である。基板１（１）のほぼ中心部に外
径120μｍ，内径50μｍのシリカ製毛細管１（７）の一
端を貫通する。毛細管１（７）の先端部は基板１（１）
の間隙を形成する側の面と同一面にある。基板２（２）
のほぼ中心部に外径120μｍ，内径50μｍのシリカ製毛
細管２（８）の一端を貫通する。毛細管２（８）の先端
部は基板２（２）の間隙を形成する側の面と同一面にあ
る。貫通部において，毛細管１（１）と毛細管２（２）
とは同軸に配置される。毛細管１（７）の他端を電解質
溶液を満たした陽極側電極槽（９）に，毛細管２（８）
の他端を電解質溶液を満たした陰極側電極槽（10）にそ
れぞれ浸す。毛細管１（７），毛細管２（８）および基
板１（１）と基板２（２）の間隙に電解質溶液を満た
す。毛細管１（７）の陽極側電極槽（９）側の一端に試
料溶液を一定量注入する。高電圧電源（11）により，両
電極槽間に直流電圧を印加する。電圧印加によって，陽
極側電極槽（９）から陰極側電極槽（10）の方向に電気
浸透流が生じる。注入された試料溶液は電気浸透流によ
って毛細管１（７）から毛細管２（８）へ基板１（１）
と基板２（２）との間隙を通過して流れる。FITC標識し
た各種アミノ酸は，電荷および分子量の違いに応じて成
分分離され，成分ごとにゾーンを形成しながら毛細管中
を移動し，間隙部を通過する際に光学的に検出される。
外径125μｍ，コア径50μｍ，開口数0.2の励起用光ファ
イバー（12）の一端が間隙部に挿入され，その中心軸
が，毛細管１（７）と毛細管２（８）の中心軸と直交す
るように配置される。しかし光ファイバー（12）の先端
部は，試料の流れとは衝突しない。アルゴンレーザー
（13）からの励起光（波長488nm）をレンズ（14）を通
して励起用光ファイバー（12）の他端に入射する。外径
110μｍ，コア径100μｍの検出用光ファイバー（15）〜
（20）が，その中心軸が毛細管１（７）と毛細管２
（８）の中心軸と直交するようにそれぞれ配置される。
ただし，それぞれの光ファイバーの先端部は，試料の流
れおよび励起光とは衝突しない。光ファイバー(12）お
よび（15）〜（20）は，接着剤により基板２（２）上に
固定する。間隙部を通過するFITC標識アミノ酸は，励起
光の照射を受けて蛍光（波長約520nm）を発生する。蛍
光は検出用光ファイバー（15）〜（20）に入射し，それ
ぞれの他端から出射した蛍光を光電子増倍管（21）によ
り測定する。検出用光ファイバー（15）〜（20）の出射
口と光電子増倍管（21）との間にはS/Nを向上するため
に500nm〜540nmの波長領域の光を透過させるバンドパス
フィルタ（22）を配置する。図２に，基板１（１）に平
行な面での光学的検出部の断面図のひとつを示す。また
図３に，毛細管１（７）と毛細管２（８）および励起用
光ファイバー（12）のそれぞれの中心軸を含む平面での
光学的検出部の断面図を示す。励起用光ファイバー（1
2）の出射口は，出射光が毛細管１（７）および毛細管
２（８）の管壁に衝突しない限りにおいて，毛細管１
（７）と毛細管２（８）の交差部から遠ざける。先端部
の位置は，予め計算により求めておくか，あるいは実際
に励起光を照射し，散乱光を観察しながら毛細管の管壁
に励起光が衝突しないように目視または顕微鏡観察下に
て調節する。検出用光ファイバー（15）〜（20）の先端
部は励起光および泳動路を遮らない限りにおいて，毛細
管１（７）と毛細管２（８）の中心軸に近づける。

【０００９】図４に，本実施例に用いることができるス
ペーサーの構成図を示す。基板（29）表面に光ファイバ
ー（12）および（15）〜（20）を挿入するための溝（3
0）および（31）〜（36）と励起光が通過するための溝
（42）を加工する。励起光が通過する溝（42）の底面
は，銀蒸着などの方法によって鏡面とする。基板（29）
の中心部には毛細管２（８）を挿入するための丸穴（4
1）が貫通している。またネジ（23）〜（26）を通すた
めの丸穴（37）〜（40）が貫通している。基板（29）の
材料には，ガラスあるいはシリコンを用い，フォトリソ
グラフィーとエッチングによって溝を加工する。

【００１０】（実施例１の効果）間隙は毛細管の内径と
同程度であるため，毛細管中と同様に液体の対流がほと
んどない。従って対流による電気泳動の乱れが問題とな
らない。また円形基板面は鏡面であるため，光学散乱面
は実質的に光ファイバー出射口と電解質溶液との界面１
ヶ所のみである。また背景光としての蛍光は発生しな
い。本装置はキャピラリーゾーン電気泳動法に基づいた
毛細管電気泳動装置であるが，毛細管中にゲルを充填す
ることにより，毛細管ゲル電気泳動装置として用いるこ
とができる。また液体クロマトグラフィー装置へも容易
に応用できる。図４のスペーサーを用いれば，光ファイ
バーの方向を精度良く規定することができる。また光フ
ァイバー先端部の位置合わせ作業も容易となる。励起用
光ファイバーの出射口での散乱の影響を減少するため
に，励起用光ファイバーはコア径ができる限り小さく，
開口数ができるかぎり小さいものを用い，出射口を交差
部からできるだけ遠ざけることが好ましい。コア径数μ
ｍ，開口数0.1程度の光ファイバーは入手可能である。
また検出用光ファイバーは，入射する蛍光量を増すため
にコア径のできるだけ大きいものを用いるのが好まし
く，また散乱光の入射量を減らすために開口数のできる
だけ小さいものを用いるのが好ましい。励起用光ファイ
バーの出射面の形状をレンズ面とすることにより，出射
光を平行光にすれば，検出部近傍での散乱がさらに減少
する。また出射口を検出部から遠ざけることも可能とな
り，出射面での散乱の影響も減少することができる。

【００１１】（実施例２）本実施例は，実施例１と同様
の目的に用いる，実施例１とは構成の異なる電気泳動装
置である。

【００１２】図５に，本実施例の構成図を示す。ガラス
基板１（43）上に幅130μｍ，深さ150μｍの溝１（4
5），溝２（46），溝３（47）を加工する。溝１（45）
と溝２（46），溝１（45）と溝３（47）はそれぞれ十字
状に交差する。溝３（47）の両端はガラス基板１（43）
の側面まで達している。この加工面にガラス基板２（4
4）を接着することによって，毛細管を形成する。この
接着は，ガラス基板１（43）とガラス基板２（44）の接
着面をそれぞれ研磨して平滑化し張り合わせる方法（光
学接着法）によりおこなう。加工面を研磨する際に，同
時に加工面を20μｍ削り，溝１〜３（45〜47）の深さを
130μｍとする。コア径50μｍ，外径125μｍ，開口数0.
2の励起用光ファイバー（58）を溝３（47）に挿入し，
実施例１の場合と同様の方法で先端部の位置合わせと固
定をおこなう。溝３（47）の表面は銀蒸着などの方法に
より鏡面処理する。またガラス基板２（44）の接着面に
も，溝３（47）の内壁を構成する部分を同様の方法で鏡
面処理する。ただし，溝１（45）と溝３（47）との交差
部は鏡面処理しない。また，溝３（47）のうち，溝１
（45）との交差部から光ファイバー（58）が挿入されて
いる側には鏡面処理を施す必要はない。ガラス基板２
（44）には，溝１（45）および溝２（46）の端部に通じ
る貫通穴（48）〜（51）が開けてある。貫通穴（48）〜
（51）にはそれぞれ，筒（52）〜（55）を装着し，それ
ぞれ陽極側電極槽１（52），陰極側電極槽１（53），陽
極側電極槽２（54），陰極側電極槽２（55）とする。陽
極側電極槽２を試料溶液で満たし，他の３つの電極層お
よび溝１〜３（45〜47）を泳動液で満たす。高電圧電源
（56）により，陽極側電極槽２（54）と陰極側電極槽２
（55）の間に直流電圧を印加する。電圧印加によって電
気浸透流が生じ，陽極側電極槽２（54）中の試料溶液が
溝２（46）に導入される。陽極側電極槽２（54）と陰極
側電極槽２（55）との間の電圧を切断し，高電圧電源
（56）により陽極側電極槽１（52）と陰極側電極槽１
（53）との間に電圧を印加する。電圧の印加によって溝
１（45）の中を陽極側電極槽１（52）から陰極側電極槽
１（53）の方向に電気浸透流が生じる。これにより，溝
１（45）と溝２（46）との交差部の試料溶液が溝１（4
5）中で電気泳動分離され，溝１（45）と溝３（47）と
の交差部において励起光の照射を受けて蛍光を発生す
る。ガラス基板の外に配置した光電子増倍管（61）によ
り蛍光を測定する。光電子増倍管（61）と検出部との間
にスリット（62）およびレンズ（63）を配置して蛍光と
背景光とを空間的に分離し，また500nm〜540nmの波長領
域の光を透過させるバンドパスフィルタ（64）をレンズ
（63）と光電子増倍管（61）との間に配置して背景光を
さらに減少させ， S/Nを向上する。光電子増倍管（61）
への背景光の入射量を減らすために，ガラス基板２（4
4）を極力薄くし，スリットを検出部にできるだけ近づ
けることが好ましい。溝１〜３（45〜47）をガラス基板
２（44）側に形成し，ガラス基板１（43）薄くして，ガ
ラス基板１（43）側から蛍光測定をおこなってもよい。

【００１３】検出部と溝中に光ファイバーを挿入する代
わりに，基板上に光導波路を形成することによっても同
様の電気泳動装置を実現できる。

【００１４】（実施例２の効果）毛細管と検出部とを１
枚の基板上に加工するため，装置の製造が簡便である。
また機械的強度や機械的安定性，熱的安定性にも優れ
る。加工精度の高いフォトリソグラフィーとエッチング
により溝の加工や光導波路の形成をおこなえば，光ファ
イバーあるいは光導波路の位置調節を精度良く，しかも
簡便におこなうことができる。さらに大量生産により低
コスト化が可能である。

【００１５】（実施例３）本実施例は，実施例１と同様
の目的に用いる，実施例１および実施例２とは構成の異
なる電気泳動装置である。

【００１６】図６に，本実施例の光学的検出部の断面図
を示す。ガラス基板（87）中で溝１（88）および溝２
（89）が交差する。溝１（88）の一端は陽極側電極層に
通じている。また溝２（89）の一端は陰極側電極層に通
じている。溝１（88）および溝２（89）の他端からそれ
ぞれ光ファイバー１（90）および光ファイバー２（91）
を挿入する。陽極側電極層と陰極側電極層との間に電圧
を印加すると，試料は溝１（88）から交差部を通過して
溝２（89）へと流れる。光ファイバー２（91）から交差
部に試料励起光を照射し，試料から発生する蛍光は光フ
ァイバー１（90）に入射する。蛍光の測定は実施例１と
同様にしておこなう。溝２（89）のうち交差部から陰極
側電極層までの内壁には鏡面処理を施す。検出部と陰極
側電極層との距離を十分に大きくすることで，陰極側電
極層での励起光の散乱光の影響は無視できる。

【００１７】（実施例３の効果）検出部から蛍光検出器
への蛍光の伝達を光ファイバーを用いておこなうことに
より，実施例２よりもさらに光学検出配置の機械的安定
性および熱的安定性が増した。

【００１８】（実施例４）本実施例は，種々の蛍光体で
標識した他種類の成分試料を分離分析するための電気泳
動装置である。

【００１９】図７に，本実施例の光学的検出部の構成図
を示す。ガラス基板１（67）に１本の泳動路（68）と，
それと交差する複数の溝（69）〜（72）（この図では４
本）を加工する。これら交差部をそれぞれ光学的検出部
とする。それぞれの交差部に直結する穴（75）〜（78）
を貫通したガラス基板２（74）をガラス基板１（67）に
接着する。穴（75）〜（78）はそれぞれ異なる検出部に
直結する。溝（69）〜（72）に挿入した励起用光ファイ
バー（79）〜（82）から，それぞれ波長λ１〜λ４の光
を検出部に入射する。各検出部で発生する蛍光はそれぞ
れ穴（75）〜（78）に挿入した検出用光ファイバー（8
3）〜（86）に入射する。検出用光ファイバーの他端か
ら出射する蛍光をそれぞれ光検出器により測定する。励
起用光ファイバー（79）〜（82）および検出用光ファイ
バー（83）〜（86）は，実施例１あるいは実施例２と同
様にして配置する。穴（75）は，ガラス基板３（73）に
溝（75）を加工し，ガラス基板２（74）に接着すること
によって形成する。穴（76）〜（78）も同様の方法で形
成する。光ファイバーを用いて蛍光を検出器まで伝達す
ることにより，各検出部を互いに近接させて配列するこ
とが可能である。

【００２０】（実施例４の効果）異なる蛍光体で標識し
た異なる試料を１度の電気泳動で同時に測定できる。

【００２１】

【発明の効果】毛細管電気泳動における蛍光検出におい
て，試料励起光の散乱光が減少し，また毛細管材料中で
の蛍光発生がなくなった。これにより，S/Nの高い蛍光
検出が可能になり，検出下限の向上が実現した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例２の構成図。

【図２】本発明の実施例１の毛細管電気泳動装置の構成
図。

【図３】実施例１の光学的検出部の断面図１。

【図４】実施例１の光学的検出部の断面図２。

【図５】実施例１に用いるスペーサーの概観図。

【図６】本発明の実施例３の光学的検出部の断面図。

【図７】本発明の実施例３の光学的検出部の構成図。

【符号の説明】

１・・・基板１ ２・・・基板２ ３〜６・・・スペーサー ７・・・毛細管１ ８・・・毛細管２ ９・・・陽極側電極槽 10・・・陰極側電極槽 11・・・高電圧電源 12・・・励起用光ファイバー 13・・・アルゴンレーザー 14・・・レンズ 15〜20・・・検出用光ファイバー 21・・・光電子増倍管 22・・・バンドパスフィルター 23〜26・・・ネジ 27・・・増幅器 28・・・データ処理装置 29・・・ガラス基板 30〜36，42・・・溝 37〜41・・・貫通穴 43・・・ガラス基板１ 44・・・ガラス基板２ 45・・・溝１ 46・・・溝２ 47・・・溝３ 48〜51・・・貫通穴 52〜55・・・筒 56，57・・・高電圧電源 58・・・励起用光ファイバー 59・・・アルゴンレーザー 60・・・レンズ 61・・・光電子増倍管 62・・・スリット 63・・・レンズ 64・・・バンドパスフィルター 65・・・増幅器 67・・・ガラス基板１ 68・・・泳動路 69〜72・・・溝 73・・・ガラス基板３ 74・・・ガラス基板２ 75・・・溝および貫通穴 76〜78・・・貫通穴 79〜82・・・励起用光ファイバー 83〜86・・・検出用光ファイバー 87・・・ガラス基板 88・・・溝１ 89・・・溝２ 90・・・光ファイバー１ 91・・・光ファイバー２。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小泉 英明 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】溝の一部が光導波路で形成され，該光導波
   路の出射面が溝に面し，該出射面の対向部において該溝
   が開放された光学検出配置を有することを特徴とする毛
   細管電気泳動装置。
2. 【請求項２】前記光導波路の出射面がレンズ面であるこ
   とを特徴とする請求項１記載の毛細管電気泳動装置。
3. 【請求項３】前記開放部を構成する面が鏡面であること
   を特徴とする請求項１または請求項２に記載の電気泳動
   装置。
4. 【請求項４】前記光学検出配置を複数有することを特徴
   とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の電気泳動装
   置。