RO122612B1 - Procedeu de realizare a unui biocip cu funcţia de amplificare a unor fragmente specifice de adn prin reacţia polimerazică în lan - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de realizare a unui biocip pe substrat de siliciu, destinat a înlocui maşina clasică de amplificare a unor fragmente specifice de ADN prin reacţia polimerazică în lanţ, cât şi sistemul de electroforeză capilară de analiză a unui material genetic. Procedeul conform invenţiei constă, într-o primă etapă, în definirea unor microrezervoare, acest lucru făcându-se prin oxidarea unei plachete de siliciu la o temperatură de 1150°C, timp de 360 min, pentru obţinerea unui strat de SIO2, etalarea unui fotorezist pozitiv pe spatele plachetei de siliciu, aplicarea unui tratament termic la o temperatură de 90°C, expunerea şi developarea fotorezistului, şi deschiderea unor ferestre în stratul de SIO2, urmată de corodarea stratului de SIO2 într-o soluţie de KOH, la o temperatură de 85°C, în timpul corodării realizându-se şi dezoxidarea spatelui plachetei, într-o a doua etapă, în realizarea unei rezistenţe de încălzire şi a unui senzor de temperatură, prin etalarea unui fotorezist pozitiv pe faţa plachetei de siliciu, expunerea şi developarea fotorezistului, urmată de spălare în soluţie de HF de concentraţie 5%, timp de 1 min, şi clătire în apă deionizată, timp de 10 min, pe structura astfel pregătită depunându-se, prin procedeul pulverizării catodice în vid, două straturi succesive de Ti şi Pt; după depunerea straturilor, plachetele de siliciu sunt spălate printr-un proces de agitare prin ultrasonare, în acetonă, iar într-o a treia etapă, se definesc nişte paduri de contactare şi se acoperă structura astfel obţinută cu un capac transparent din sticlă.

Description

Invenția se referă la un procedeu de realizare a unui biocip pe substrat de siliciu, care poate înlocui mașina clasică de amplificare a unor fragmente specifice de ADN prin reacția polimerazică în lanț (PCR), cât și sistemul de electroforeză capilară de analiză a materialului genetic.

Structura integrată pe un singur cip de siliciu deschide posibilitatea dezvoltării unui domeniu nou: microsistem - laborator multicip mobil, pentru identificarea rapidă a materialului genetic (ADN), utilizând amplificarea unui fragment din ADN și analiza produsului de reacție.

Aplicațiile sistemului propus sunt multiple: pentru identificarea umană (criminalistică, medicină legală, teste de paternitate, stabilirea moștenitorilor, stabilirea biocompatibilității la transplantul de organe, identificarea de persoane dispărute etc.); diagnostic genetic (cancer, autism, ALZHEIMER, Addison, fibromastoze etc.); monitorizarea transplantului de măduvă osoasă; studii antropologice; istorice; migrarea speciilor animale; genetica plantelor și animalelor etc.

în scopul realizării unui microsistem PCR pe substrat de siliciu, se cunosc diferite procedee tehnologice (US 6503750, Benett, et al., January 7, 2003, PCR thermocycler, US 6893863, Benett, et al., May 17, 2005, PCR thermocycler, US 6810713, Hahn, et al., November 2, 2004, Method for handling and delivering fluid on a lab-on-a-chip).

Alte referințe: S. Poser*, R. Ehricht*. T. Schulz, S. Uebel, U. Dillner, J. M. Kohler, Rapid PCR in flow-through Si chip thermocyclers, M. U. Koop, A J. DeMello, A. Manz, „Science 280 (1998), 1946; Todd Strother, Wei Cai, Xinsheng Zhao, Robert J. Hamers, Lloyd M. Smith, Synthesis and Characterisation of DNA-Modified Silicon (111) Surfaces, J. Am. Chem. Soc. 2000,122,1205-1209; C. F, Chou et al, A Miniaturized Cyclic PCR DeviceModeling and Experiments, Microelectronic Engineering, 61-62 (2002), pp. 921-925; J. N. Crain, A Kirakosian, J.-L. Lin, Y. Gu, Rahul R. Shah, N. L. Abbot, F. J. Himpsel, Functionalisation of Silicon step Arrays II: Molecular orientation ofalkanesand DNA, Journal of Applied Physics, Voi. 90, No. 7,2001,3291; W. Cai, J. R. Peck, D. W. van der Weide, R. J. Hamers, Biosensors and Bioelectronics, 2003; L. A. Chrisey, Gil U. Lee, C. E. O'Ferrall, Covalentattachment ofsyntheticDNA toself-assembledmonolayer films, Nuci. Acids Res., 24(15):3031,1995; Todd Strother, Robert, J. Hamers, Lloyd M. Smith,Covalent attachment of oligodeoxyribonucleotides to amine-modified Si(001) surfaces, Nuci. Acids Res., 2000, Voi. 28, No. 18, 3535-3541; J. H. Kim, J-A. Hong, Myungok Yoon, Moon Young Yoon, H-S. Jeong, H. J. Hwang, Solid-phase genetic engineering with DNA imobilised on a gold surface, Journal of Biotechnology 96 (2002) 213-221; S. Tuukkanen, J. Virtanen, V.P. Hytonen, M.S.Kulomaa, P. Torma, Fabrication of DNA monolayers on gold substrates and guiding of DNA with electric field, Rev. Adv. Mater. Sci. 5 (2003) 226-231; J. Cheng, M. A. Shoffner, G. E. Hvichia, L. J. Kricka, P. Wilding, Chip PCR. II. Investigation ofdifferent PCR amplification systemsin microfabricatedsilicon-glasschips, Nucleic, Acids Research 1996, Voi. 24, No. 2.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția este aceea de a îmbunătăți procedeele de obținere a biocipurilor pentru amplificarea unor fragmente specifice de ADN, prin reacție polimerazică în lanț și înlocuirea sistemului cunoscut de electroforeză capabilă de analiză a materialului genetic.

în conformitate cu invenția, microcipul pentru PCR este realizat pe siliciu și prezintă un sistem de rezervoare, camere de reacție, în care are loc amplificarea, și un sistem de încălzire din două rezistențe. Una din rezistențe funcționează ca senzor de temperatură și, prin intermediul unui microcontroler extern, asigură ciclul rapid de încălzire și răcire, cerut de procesul biologic de amplificare a lanțului ADN. Suprafața reactoarelor este modificată fizico-chimic (funcționalizată) corespunzător, în vederea imobilizării pe microcip a lanțurilor amplificate.

Problemele careaparîn cazul miniaturizării mașinii PCR și a dimensionării corespunzătoare a rezistenței de încălzire și a microreactoarelor biocipului ADN-PCR au fost soluționate prin tehnici de modelare/simulare adecvate. Pentru a obține amplificarea catenelor

RO 122612 Β1 de ADN, este necesar un control foarte strict al temperaturii din reactor, acest control fiind 1 asigurat de rezistențele din platină. Rezistențele sunt comandate de un circuit electric extern, pentru realizarea ciclurilor termice. Procesele de aliniere, extensie și denaturare a 3 fragmentelor de ADN se repetă în decursul mai multor cicluri; sunt necesare trei zone de temperatură: 5 (i) 47... 55’C - hibridizarea selectivă a primerilor;

(ii) 7O...75’C - multiplicarea lanțului de molecule, prin reacția polimerazică;7 (iii) 95’C - topirea, separarea celor două lanțuri.

Printre avantajele invenției, se numără:9

- distribuția uniformă a temperaturii în volumul de ADN;

- tensiune mică de alimentare a rezistenței (4 V);11

- distribuție bună a fluxului de căldură în materialul de analiză;

- diferențe mici între temperatura maximă, medie și minimă;13

- timpul pentru ca proba să ajungă la temeratura critică este mai mic.

a) Proiectarea rezistenței de încălzire, ținând cont de datele de simulare/modelare 15 termică

Printr-un set de simulări, cu programul MEMCAD - modul de modelare termică, s-a 17 urmărit, în prima etapă, distribuția temperaturii în volumul membranei și a materialului de amplificare. Pentru proiectarea și simularea microstructurii s-a folosit programul software 19 COVENOTRWARE. S-a editat microstructura cu modulul Layout Editor și s-a elaborat procesul de construcție 3D, iar structura tridimensională s-a discretizat în elemente finite în 21 vederea efectuării simulării.

Geometria regulată a structurii a permis utilizarea elementelorfinite de tip Manhattan Bricks (paralelipipede dreptunghice), care permit obținerea unor soluții numerice foarte apropiate de soluția reală, datorită absenței elementelor distorsionate.

Pentru simulare s-au folosit modulele MemMech (simulare termică tranzitorie) și MemETHerm pentru simulare cuplată electrotermică.

Simularea termică tranzitorie a demonstrat un răspuns uniform și rapid al materialului biologic la 95’C (fig. 2). Pasul de timp pentru care s-a făcut simularea este de 0.0002 s, astfel se poate observa practic încălzirea uniformă pe întreaga suprafață, neobservându-se diferențe între centru și marginea suprafeței. Variația în timp a temperaturii în stratul de ADN este prezentată în fig. 3.

Pentru procesul de răcire prin convecție termică de la 90 la 60’C, s-a obținut un timp mai mare, astfel că dacă încălzirea se realiza în 10³ s, pentru răcire timpul este de 5 s, după cum se vede mai jos.

în fig. 4 este redat graficul distribuției temperatirii la răcirea structurii prin convecție termică.

Calculele au demonstrat o variație de maximum un grad, de-a lungul traseului rezistenței cu grosimea de 0.5 pm și conductivitatea electrică de 94.34 Qcm, la o tensiune de 4 V.

Ecuația de difuzie a căldurii în cazul unidimensional este:

dTd²T _Â = unde di d²x² x este grosimea stratului în care are loc difuzia și în care este înglobată și proba de 45 ADN; în cazul dispozitivului propus, această grosime este de 0.45 mm siliciu.

a este coeficientul de difuzie termică a siliciului, cu valoarea de 0.9 cm²/s. 47

RO 122612 Β1

Deci:

,_^«_ϊ2.₂₅.₁₀λ a 0.9

Timpul de difuzie obținut folosind modelul unidimensional este deci de 0.00225 s în bună concordanță cu simularea, pentru cazul tridimensional care folosește analiza cu elemente finite.

Din compararea rezultatelor simulărilor, s-a ajuns la concluzia că pentru structurile proiectate (microreactoare de capacitate 2...4 pl și grosimea membranei de siliciu între materialul genetic și elementul de încălzire de 150 pm), rezultă o valoare a rezistenței de încălzire de 220 Ω, la o lățime a traseului metalic de 100 pm. Rezistența cu rol de senzor de temperatură are între 50 și 70 Ω. Aceste valori ale rezistenței de încălzire asigură avantajele de mai sus.

b) Tehnologia de fabricație

Conform invenției, s-a folosit un set de 3 măști, astfel:

- masca M1 pentru definirea rezervoarelor și funcționalizare;

- masca M2 pentru definirea microîncălzitorului și a senzorului de temperatură;

- masca M3 pentru definirea pădurilor de contactare.

Se utilizează substrat de Si de tip n sau p, de orientare <100> și rezistivitate 0.001... 10 Gem.

Varianta tehnologică propusă de realizare a structurilor biocipului ADN-PCR include următoarele etape:

A. se crește un strat de oxid termic de 1,7 pm;

B. se maschează fața plachetelor de Si cu fotorezist;

C. proces fotolitografic (masca M1) pe spatele plachetei de siliciu, pentru definirea microrezervoarelor: etalare fotorezist; tratament fotorezist; expunere și developare fotorezist; corodare SiO₂;

D. corodare Si de pe spatele plachetei în soluție de corodare anizotropă, KOH, 85’C, 20%; adâncimea de corodare: 300 pm;

E. funcționalizarea suprafeței microrezervoarelor cu nanoparticule de Au, înglobate într-un strat subțire de siliciu poros;

F. proces fotolitografic pentru definirea microîncălzitoarelor prin masca M2: etalare fotorezist pozitiv pe fața plachetei; expunere și developare fotorezist;

G. corodare oxid pe fața plachetei, prin masca M2 de fotorezist, pentru pregătirea procesului de lift-off;

H. spălare după fotogravură, pentru curățarea ferestrelor în oxidul de siliciu: soluție HF 5%, 1 min și apă deionizată 10 min;

I. depunere sandvici Pt/Ti, prin procedeul pulverizării catodice: Ti 50 nm și Pt 200 nm;

J. proces de agitare prin ultrasonare în acetonă, pentru înlăturarea straturilor de metal din zonele nedorite;

K. proces fotolitografic (masca 3 inversă) pe fața plachetei de siliciu, pentru definirea pădurilor: etalare fotorezist; tratament fotorezist; expunere și developare fotorezist;

L. depunere metal, pentru realizarea pădurilor (evaporare în vid; proces chimic/electrochimic);

M. tăiere și separare structuri;

N. izolarea feței cu rezistențe a plachetei cu polipropilenă sau sticlă.

RO 122612 Β1 în prima etapă s-au oxidat plachetele de siliciu, pentru a realiza o grosime de oxid 1 care să asigure mascarea siliciului în vederea corodării. Dioxidul de siliciu a fost obținut prin oxidarea termică a Si la 1150’C timp de 360 de min. Stratul de SiO₂ obținut are grosimea de 3 1,7 pm.

în etapa următoare s-a efectuat fotogravură (masca M1) pe spatele plachetei de 5 siliciu, pentru definirea microrezervoarelor; a fost etalat fotorezist pozitiv pe suprafața plachetelor de siliciu, urmat de un tratament termic la 90’C; după expunerea și developarea 7 fotorezistului s-au deschis ferestre în SiO₂; dioxidul de siliciu a fost corodat prin masca de fotorezist; rezervoarele s-au realizat prin corodarea siliciului într-o soluție de KOH de con- 9 centrație 20%, la temperatura de 85’C; viteza de corodare a fost de 1.2 pm/min. S-a obținut o adâncime a rezervorului de 300 pm și a rezultat o membrană de siliciu de 150 pm. 11 în timpul corodării rezervoarelor se realizează și dezoxidarea spatelui plachetei, această operație fiind necesară pentru pregătirea suprafeței pentru realizarea rezistențelor, 13 direct pe siliciu.

Pentru realizarea elementelor de încălzire, masca pentru definirea rezistențelor, M2, 15 a fost aliniată cu masca de rezervoare, M1, utilizând mașina de aliniere dublu-față. Rezistența de încălzire și senzorul de temperatură s-au obținut prin tehnica de Iift-off. Tehnica de 17 lift-off constă în procesul de fotogravură prin masca inversă. S-a etalat fotorezist pe spatele plachetei, procesul fotolitografic având ca scop definirea traseelor pentru depunerea 19 rezistențelor metalice. După developarea fotorezistului, structurile de siliciu au fost spălate în soluție 5% de HF, 1 min, și clătite în apă deionizată timp de 10 min. Această procedură 21 de spălare este deosebit de importantă pentru aderența ulterioară a stratului metalic. Pe structurile astfel pregătite, s-au depus prin procedeul pulverizării catodice în vid două straturi 23 succesive TiPt (500 A Ti, 1000 A Pt). După depunerea straturilor metalice, plachetele de Si au fost spălate printr-un proces de agitare cu ultrasonare în acetonă; metalele depuse pe 25 zonele nedorite s-au îndepărtat prin dizolvarea stratului de fotorezist în acetonă.

Biocipul conform invenției are un capac din sticlă sau din elastomer de tip 27 polidimetilsiloxan. Acest capac împiedică evaporarea reactanților și a produselor de reacție în timpul ciclului termic și permite analizarea prin microscopie de fluorescență a materialului 29 biologic. Capacul structurilor se fixează cu sticlă solubilă.

Ciclurile de temperatură pentru PCR vor fi asigurate prin programare și interfațare la 31 un aparat Keithley PicoammeterA/oltage Source 6487. în cazul sistemelor mobile, controlul și comanda ciclurilor de temperaturi se poate face cu un circuit special (microcontroler 33 extern), automatizarea fiind o problemă de rutină pentru o firmă cu experiență în domeniul automatizărilor. 35

Conform invenției, pregătirea suprafeței rezervorului în vederea imobilizării oligonuleotidelor constă într-o operație suplimentară de funcționalizare fizico-chimică. 37

c) Metoda de funcționalizare a microrezervoarelor cu nanoparticule de Au, înglobate într-un strat subțire de siliciu poros 39

Pentru funcționalizare, există mai multe metode: silanizarea interiorului camerei prin tratarea cu mercaptopropil trimethoxisilane în atmosferă de azot; depunere de aur în 41 interiorul camerei de PCR și tratarea materialului biologic în vederea obținerii unor terminații SH. Filmele de Au <111 > au aplicații în biochimie, în SAM pentru atașarea moleculelor de 43 tioli.

Metoda propusă conform invenției se aplică în cazul plachetelor de Si de tip p(100) 45 sau n(100), de rezistivitate 0.01...0.001 Qcm, cu rețele de rezervoare configurate după

RO 122612 Β1 operația (D), înainte de realizarea rezistențelor de încălzire și a senzorului de temperatură, și constă din următoarele secvențe:

E1. Curățare chimică

Se aplică rețeta standard: solvenți, amestec oxidant (H₂ SO₄+H₂O₂, 1:3), 5 % HF, amestec oxidant sau fierbere în apă oxigenată deionizată și apă deionizată (15 Mohm cm) interoperații.

E2. Pentru realizarea contactului ohmic, pe spatele plachetelor se face implantarea de bor, la energie și doză maximă de implantare, pentru asigurarea unui strat p+. Pentru formarea speciilor active, plachetele implantate se tratează la temperatura de 900...1000’C în atmosferă de N₂, timp de 30...60 min.

E3. Porozificarea siliciului

Siliciul mezoporos/p+-Si se prepară în condiții similare 'bio-Ps' pentru aplicații în ingineria țesuturilor și se tratează termic în atmosferă de oxigen la temperaturi moderate, 300. ,.800’C; condițiile de porozificare au fost astfel selectate, încât să se obțină PS de porozitate medie (50 %), cu pori de dimensiuni mici 5...15 nm, uniform distribuiți.

Observație: în cazul utilizării siliciului dopat, nu este necesară doparea spatelui plachetelor. Condițiile de porozificare efectuate pe Si p+ (100) 0.005 Qcm sunt prezentate în tabel.

Porozificarea Si

Grupa	Densitatea de curent anodic (mA/cm2)	Concentrație HF (%)	Timp de porozificare (min)	Porozitatea stratului de PS (%)	Mărimea porilor
1	2	25	1	<50%(38%)	5...7 nm
2	20	25	1	>50%	15 nm

E4. Spălarea PS după porozificare

După porozificare, PS a fost spălat cu apă deionizată, timp de 10 min. Probele care au fost ulterior oxidate anodic sau în H₂O₂, au fost introduse imediat la procesare. La celelalte probe, urmele de HF din pori au fost îndepărtate prin spălare cu acetonă, la cald (operația s-a repetat de trei ori). Până la efectuarea operațiilor ulterioare, acestea au fost stocate în apă deionizată.

E5. Stabilizarea Si poros

PS de porozitate 50% poate fi stabilizat, utilizând una din următoarele metode:

- oxidarea anodică parțială. S-a realizat în soluție 0.3 M KNO₃, la o densitate de curent anodic de 2 mA/cm², timpul variind între 30 s și 5 min;

- oxidare parțială în plasmă la P = 750 W, timp de 30 min;

- oxidare parțială prin fierbere în H₂O₂, timp de 7 min;

- oxidare termică în atmosferă de oxigen, la temperatura T = 850°C, 40 s introducere lentă, 40 s tratamentul propriu-zis;

- atașare de grupări metil: PS de porozitate 50% poate fi stabilizat prin tratament cu HMDS care conține grupări metil. PS se introduce la presiune scăzută, P = 0.37 torr și temperatura 300’C, timp de 1 h, după care se tratează cu HMDS, 30 min, la T = 300°C și 20 h la temperatura camerei.

E6. Depunere strat metalic:

Au: 10...100 nm.

RO 122612 Β1

- Depunere electrochimică din sarea metalului respectiv:1

Au: 10'³ M AuCI₃,0.5 M H₂SO₄; 0.5 mA/cm²; 1 ...5 min.

- Depunere PVD:3

Au: 0.057 g Au; P-5x10'⁶ torr.

- Depunere în regim static.5

E7. Tratament termic

T=500; 900“C; în atmosferă reducătoare, N₂ cu 10% H₂.7

Tratamentul termic favorizează o aglomerare a filmului de aur depus pe anumite zone; filmul de aur tratat termic prezintă aglomerări de dimensiuni mai mari pe substratul de 9 PS de porozitate >50%, comparativ cu cel depus și tratat, realizat pe substrat de PS de porozitate <50 %. 11

Analizele XRD ale filmelor de aur tratate termic au scos în evidență o texturare a stratului de aur. Comparativ cu un film de aur netexturat, factorul de orientare apare după 13 tratamentul la 500°C (textură 111). Dimensiunile cristalitelor (cu excepția celor orientatate (220) și (311), care dispar din spectrul de difracție) cresc comparativ cu cele obținute în urma 15 tratamentului la 500°C cu -5...8 nm, ajungând la aproximativ aceeași valoare, 25...28 nm.

S-a observat că atașarea moleculelor de ADN pe suprafața microreactorului este cu 17 mult mai uniformă în cazul microreactoarelor funcționalizate cu Au/PS, tratate termic la temperaturi între 500 și 900°C, comparativ cu microreactoarele funcționalizate prin alte 19 metode (silanizare a cu hexametildisilazan sau cu polilisină). Atașarea ADN de suprafețele funcționalizate cu nanoparticule de aur are loc fără formarea legăturilor covalente Au-Si, ca 21 în cazul straturilor organice subțiri care se formează spontan pe o suprafață a unui solid (SAMs - seif assambled monolayers), ceea ce indică un mecanism diferit. 23

Claims (14)

1. Revendicări 25

   1. Procedeu de realizare a unui biocip cu funcția de amplificare a unor fragmente 27 specifice de ADN prin reacția polimerazică în lanț, folosind pentru încălzire și detectarea temperaturii un strat metalic cu rezistență electrică și un microcontroler extern pentru controlul 29 și comanda ciclurilor de temperatură, caracterizat prin aceea că se utilizează un substrat de Si de tip n sau p, de orientare <100> și rezistivitate 0,001 ...10 Qcm, și într-o primă etapă 31 (A) se oxidează termic placheta de Si la 1150°C timp de 360 min, obținându-se un strat de bioxid de Si de 1,7 pm, într-o a doua etapă (B, C) se realizează pe spatele plachetei un număr 33 variabil de microrezervoare, de geometrii și capacități diferite, între 1 și 10 pl, cu adâncimi de 300 pm, folosind fotogravarea folosind masca M1 a unui oxid termic crescut la 90’C, 35 bioxidul de Si fiind apoi corodat (D) prin masca de fotorezist într-o soluție de KOH de concentrație 20% la temperatura de 85’C, cu o viteză de corodare de 1,2 pm/min, rezultând 37 o membrană de Si de 150 pm, realizându-se concomitent dezoxidarea spatelui plachetei, pentru pregătirea suprafeței în vederea depunerii unor rezistențe de încălzire și a unor senzori 39 de temperatură, într-o a treia etapă (E) se asigură funcționalizarea suprafeței microrezervoarelor cu nanoparticule de Au, înglobate într-un strat subțire de Si poros, într-o a patra etapă 41 (F, G, H) se obțin rezistențele de încălzire și senzorii de temperatură prin tehnica lift-off, folosind masca M2, rezistențele depunându-se (F) prin pulverizare catodică, în două straturi 43 succesive: Ti 500 A și Pt 1000...2000 A, cu geometrii diferite, etapă urmată de spălarea (J) prin agitare ultrasonică în acetonă a plachetei, în vederea înlăturării metalelor depuse pe 45 zonele nedorite, într-o altă etapă (K, L, M) se configurează pădurile de conectare pentru

   RO 122612 Β1 rezistențe, iar în ultima etapă (N) se asigură acoperirea structurilor cu un capac transparent din sticlă, ce permite analiza materialului genetic pe același cip, pentru a evita impurificarea acestuia prin manipulare de la aparatul PCR la aparatul de măsură.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, în etapa a patra (H), în vederea realizării rezistențelor de încălzire a senzorilor de temperatură, după developarea fotorezistului, structurile de siliciu sunt spălate în soluție 5% de HF, 1 min, și clătite în apă deionizată timp de 10 min, procedură care asigură o bună aderență ulterioară a stratului metalic.
3. 3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, în etapa a treia (E) de funcționalizare a microrezervoarelor are loc, într-o primă fază (E1), o curățare chimică, urmată de o a doua fază (E2) de realizare a contactului ohmic pe spatele plachetei, se face o implantare de bor care asigură realizarea unui strat p⁺, urmată de un tratament termic la 900...1000’C în atmosferă de N₂, timp de 30...60 min, după care, într-o a treia fază (E3) are loc porozificarea siliciului, în condiții cunoscute, astfel încât să se obțină strat PS de porozitate 50% cu pori de dimensiuni mici, 5...15 nm, uniform distribuiți, urmată de spălarea (E4) stratului PS cu apă deionizată timp de 10 min, urmată de stabilizarea (E5) Si poros și apoi de o fază de depunere (E6) de strat metalic de Au, de 10... 100 nm, și orientare predominantă <111>, și de o fază (E7) de tratament termic la 500...900’0, în atmosferă reducătoare de N₂ cu 10% H₂, asigurând o atașare uniformă a ADN pe suprafața microreactorului, în scopul imobilizării și hibridizării materialului genetic, pentru analiza rapidă a acestuia.
4. 4. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, în prima fază (E1) de curățare chimică, se folosesc solvenți sau amestec oxidant H₂SO₄+H₂O₂1:3 sau 5% HF, sau fierbere în apă oxigenată deionizată și apă deionizată 15 Mohmcm.
5. 5. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că prepararea (E3) siliciului mezoporos pe substratul dopat p’ se face în condiții similare bio PS pentru aplicații în ingineria țesuturilor și se tratează termic în atmosferă de oxigen la temperaturi de 300...800’C.
6. 6. Procedeu conform revendicării 5, caracterizat prin aceea că porozificarea Si se realizează cu densități de curent anodic de 2 sau 20 mA/cm², cu soluție 25% HF, timp de 1 min, porozitatea obținută fiind de 30% sau respectiv >50%, iar mărimea porilorde 5...7 nm, respectiv de 15 nm.
7. 7. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că etapa de stabilizare (E5) a Si poros cu stratul de PS de porozitate 50% se face prin oxidare anodică parțială în soluție 0,3 MKNO₃, la o densitate de curent anodic de 2 mA/cm² timp de 30 s până la 5 min.
8. 8. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că etapa de stabilizare (E5) a Si poros cu stratul de PS de porozitate 50% se face prin oxidare parțială în plasmă la putere 750 W, timp de 30 min.
9. 9. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că stabilizarea (E5) Si poros cu stratul PS cu porozitate 50% se face prin oxidare parțială prin fierbere în H₂O₂ timp de 7 min.
10. 10. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că stabilizarea (E5) Si poros cu stratul PS cu porozitate 50% se face prin oxidare termică în atmosferă de oxigen, la temperatura de 850’C timp de 40 s, introducere lentă, 40 s, tratamentul propriu-zis.

    RO 122612 Β1
11. 11. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că stabilizarea (E5) 1

    Si poros cu stratul PS de porozitate 50% se face prin tratament HMDS, care conține grupări metil, timp de 30 min la temperatura camerei, după ce timp de 1 h a fost introdus la presiune 3 de 0,37 torr și temperatură de 300’C.
12. 12. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că depunerea stratului 5 de Au (E6) se face electrochimie, din sarea metalului, 10 ³MAuCL₃, 0,5 MH₂SO₄, cu intensitatea curentului 0,5 mA/cm², timp de 1 ...5 min. 7
13. 13. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că depunerea stratului de Au se face prin tehnica PVD, în regim static, cu 0,057 g Au, la presiunea 5x10’⁶ torr. 9
14. 14. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că rezistorul de încălzire a biocipului este realizat sub forma unui traseu metalic cu lățimea de 100 pm, cu o 11 valoare a rezistenței de 220 Ω, iar rezistorul-senzor de temperatură are valori ale rezistenței între 50 și 70 Ω. 13