KR100755746B1

KR100755746B1 - 중금속 흡착 단백질을 이용한 양자점의 제조방법 및 이를 위한 양자점 생성능을 가지는 재조합 미생물

Info

Publication number: KR100755746B1
Application number: KR1020060045455A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박태정
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2006-05-22
Publication date: 2007-09-06
Also published as: JP2009538127A; WO2007136174A1; CN105039418A; CN101454454A; US8476055B2; US20110124131A1; EP2021480A1; EP2021480A4

Abstract

본 발명은 중금속 흡착 단백질을 이용한 중금속 나노입자의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물을 중금속이 함유된 배지에서 배양하여 미생물내에 중금속 구조물을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 중금속 구조물을 회수하는 단계를 포함하는 중금속 구조물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조되는 중금속 구조물의 나노입자에 관한 것이다.

본 발명에 따른 나노입자인 생체내 양자점은 기존에 금속물질을 물리적으로 결합시켜서 제조하는 방법과는 달리 중금속 흡착 단백질을 세포내에 발현시켜 양자점을 생체내에서 효율적으로 생산할 수 있고, 상기 나노입자는 organic fluorophore의 단점인 광학적 안정성 문제를 해결할 수 있는 장점을 가지고 있어 유용하게 사용될 수 있다.

양자점 (quantum dot), 나노입자, 중금속 흡착 단백질, 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase), 메탈로티오닌 (metallothionein), 카드뮴 (Cd), 셀레늄 (Se), 아연 (Zn), 텔루리움 (Te)

Description

중금속 흡착 단백질을 이용한 양자점의 제조방법 및 이를 위한 양자점 생성능을 가지는 재조합 미생물{Method for Preparing Quantum dot Using Metal Binding Protein and Recombinant microorganisms therefor}

도 1은 일반적인 양자점 (quantum dot)의 구조를 나타낸 예시도이다.

도 2a는 본 발명에 따른 발현벡터 pTJ1-AtPCS의 유전자 지도이다.

도 2b는 본 발명에 따른 발현벡터 pTJ1-PpMT의 유전자 지도이다.

도 3은 본 발명에서 카드뮴, 세슘 등의 중금속을 포함한 배양배지에 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase)를 발현한 대장균의 형광 스캔 모식도이다.

도 4는 본 발명에서 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균의 세포내에 축적된 중금속 구조물의 공초점현미경 사진이다(a: 420 nm의 발광스펙트럼을 갖는 것과 일치하는 파랑색 형광의 대장균 세포, b: 700nm 발광스펙트럼을 갖는 황색 형광의 대장균 세포, c: real image(실상), 및 d: a 및 b의 merge, 스케일 막대는 각각 5㎛의 크기를 나타냄).

도 5는 본 발명에서 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균의 세포내에 축적된 중금속 구조물의 투과전자현미경 사진이다 (a: 파이토켈라틴 합성효소가 발현되지 않은 대조군, 및 b, c 및 d: 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균의 세포 내에 축적된 중금속 구조물의 다양한 배율에서의 전자현미경 사진).

도 6는 본 발명에서 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균을 카드뮴(Cd), 아연(Zn) 및 세슘(Cs)을 포함한 배지에서 배양했을 때의 세포내에 축적된 중금속 구조물의 X선 분광 분석 (EDS, Energy Dispersive X-Ray Spectrometry) 모식도 및 투과전자현미경 사진이다.

도 7은 본 발명에서 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균을 카드뮴(Cd), 아연(Zn) 및 셀레늄(Se)을 포함한 배지에서 배양했을 때의 세포내에 축적된 중금속 구조물의 X선 분광 분석 모식도 및 투과전자현미경 사진이다.

도 8은 본 발명에서 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균을 카드뮴(Cd), 아연(Zn), 셀레늄(Se) 및 텔루리움(Te)을 포함한 배지에서 배양했을 때의 세포내에 축적된 중금속 구조물의 X선 분광 분석 모식도 및 투과전자현미경 사진이다.

발명의 분야

본 발명은 중금속 흡착 단백질을 이용한 중금속 나노입자의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물을 중금속이 함유된 배지에서 배양하여 미생물내에 중금속 구조물을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 중금속 구조물을 회수하는 단계를 포함하는 중금속 구조 물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조되는 중금속 구조물의 나노입자에 관한 것이다.

발명의 배경

최근 나노바이오테크놀로지 (nanobiotechnology) 발전에 힘입어, 나노물질의 생물, 의학 분야에 대한 접근과 관심이 고조되고 있다. 나노기술은 기본적으로 나노스케일의 물질을 개발하는 것에 기초를 두고 있다. 이러한 나노스케일의 물질을 만드는 전통적인 방법으로 bulk법이 있으며, 유기용매 내에서 분자 전구체에서 고온 상황에서의 결정 성장을 통해 크기, 모양 및 구성성분 등을 조절할 수 있는 분자화학적 방법 등으로도 나눌 수 있다. 결정성장을 조절할 수 있는 분자화학적 방법으로 만든 나노물질을 바이오 분야에 응용한 예로는, 최초의 semiconductor nanocrystal을 이용한 생물학의 적용가능성을 나타낸 사례를 들 수 있다 (Bruchez et al ., Science, 281:2013, 1998).

양자점 (quantum dot)은 빛 등의 에너지로 자극하면 빛을 발하는 나노크기의 반도체 입자로서, 입자의 크기에 따라 방출하는 빛의 색상이 달라지는 물질이다. 즉, 물질의 크기가 작아져서, 물질의 차원이 낮아지면 전자상태밀도와 에너지가 다르기 때문에 물질의 특성도 차원에 따라 각기 다르게 나타난다. 예를 들면, 2차원계에서는 3차원 물질에서는 나타나지 않는 양자홀 효과가 관측된다. 여기서 차원을 줄인다는 것은 엄밀한 의미에서는 전자들을 드브로이파 길이보다 작은 영역에서 가둔다는 것을 의미한다. 0차원적인 양자점은 면적이 전혀 없는 점이 아니라 실제로 는 3차원적으로 크기가 드브로이파 길이보다 작은 시료를 말한다. 양자역학에서 운동량을 가진 모든 물질입자에 수반되는 파동, 즉 드브로이파 길이는 물질에 따라 다른데 반도체의 경우는 약 10nm 수준이다.

일반적으로, 양자점은 도 1에서 나타난 바와 같이 core 및 shell로 구성된 구형의 형태를 띠고 있으며, 함유되는 중금속은 도 1의 예시된 구조의 Zn, S, Cd 등으로 한정되는 것이 아니고, 기타 여러 종류의 중금속이 포함된다.

양자점은 크게 두 가지 방법으로 제작될 수 있다. 하나는 레이저 등의 광원을 이용하는 리소그라피 (lithography)에 의한 방법이고, 다른 하나는 화학합성에 의한 방법이다. 그 중 화학합성법에 의한 양자점의 합성은 리소그라피에 의한 방법보다 비교적 단순한 장치로 양자점을 생산해 낼 수 있는 장점이 있으나, 이 방법 또한 아직까지 대량의 양자점을 저렴하게 생산하기에는 기술적으로 해결해야할 점이 많다. 또한, 기존의 bulk 방법과 비교하여, 분자화학적 기법으로 만들어진 양자점 (quantum dot)은 광학적 안정성이 뛰어나고, 나노물질의 크기, 모양 및 성분에 따라 다양한 파장의 빛을 낼 수 있도록 광학적 속성을 조절할 수 있음을 증명하였다. 이로 인하여 양자점 (quantum dot) 계열의 나노물질을 중심으로 급속도로 생물학적 응용을 할 수 있게 되었다. 이것은 바이오센서 분야 뿐만 아니라 생체 내 광학영상의 조영제로도 사용할 수 있는 폭넓은 응용 가능성을 보여준 것이고, 최근에 다양한 연구를 통해서 그 가능성을 증명해가고 있는 실정이다 (Jovin, Nat . Biotechnol., 21:32, 2003; Wu et al ., Nat . Biotechnol ., 21:41, 2003; Alivisatos, Nat . Biotechnol ., 22:47, 2004; Gao et al ., Nat . Biotechnol ., 22:969, 2004; Lidke et al ., Nat . Biotechnol ., 22:198, 2004).

그 대표적인 예로, 생체 외에서 살아있는 세포의 신호전달을 추적할 수 있는 기법이 개발되었는데, HER2/neu pathway에 대한 접근이 그 한 예이다. 이는 기존의 organic fluorophore의 단점인 쉽게 광학적 안정성을 잃어서 지속적인 세포 변화를 확인할 수 없는 단점을 극복한 것이다 (Wu et al ., Nat . Biotechnol ., 21:41, 2003; Lidke et al ., Nat . Biotechnol ., 22:198, 2004). 또한, 살아있는 세포에 erbB/HER 수용체 중재된 신호전달 추적을 위해서 양자점에 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)를 중합하여, 상피세포성장인자 수용체(EGFR)에 결합 후 활성화한 다음, 세포 내로 함입되는 과정을 추적하였다 (Lidke et al ., Nat . Biotechnol., 22:198, 2004). 이러한 방법으로 살아있는 세포에서의 생물학적 과정을 실시간으로 관찰할 수 있게 되었다.

더 나아가, 생체 내 영상을 가능하게 할 수 있는 길이 열렸는데, 이는 생체 내 투과도의 부족의 단점을 극복하기 위해, near infrared의 범위의 파장을 이용할 수 있는 semiconductor nanocrystal을 개발한 것이다. 예를 들면, 전립선 특이 막 항원 (prostate-specific membrane antigen, PSMA)을 표적하는 단일클론 항체를 양자점에 중합하고, PSMA 양성의 인간 전립선암 세포주를 이용한 종양모델을 Balb/c 누드마우스에 만든 후 생체 내 영상을 시행하였다 (Gao et al ., Nat . Biotechnol ., 22:969, 2004). 상기 방법은 양자점을 효과적으로 수용성을 띠게 하면서 동시에 효과적으로 생체 내 전달하기 위해 triblock copolymer를 이용하여 양자점 (ZnS-capped CdSe)을 코팅하였고, 이 코팅된 폴리머의 반응기 부분에 단일클론 항체를 중합하는 방법을 선택하였다. 또한, 광학적 영상의 약점인 생체 투과도가 낮은 것을 극복하기 위해 파장을 near infrared에 맞출 수 있는 양자점을 개발하였다.

아울러, Near infrared의 파장을 지니는 양자점을 개발하여 최초로 생체 내에 적용한 것은 마우스의 겨드랑이에 있는 파수꾼 림프절 (sentinel lymph node)을 광학영상으로 영상화한 연구였다 (Kim et al ., Nat . Biotechnol ., 22:93, 2004). 이러한 나노물질의 특성은 양자점 등에서 보여진 대로 bulk 방법과는 대비되는 물성을 보임으로써 자기공명영상에 응용될 수 있는 잠재력을 지니고 있다.

한편, 환경으로부터 금속 이온을 처리하는 방법에는 일반적으로 화학적, 물리적 및 생물학적 처리방법 등이 있다. 생물학적 처리방법은 미생물 자체의 생체기작을 이용하는 것으로서, 미생물의 생체축적 (biosorption & bioaccumulation), 산화환원반응 (oxidation & reduction), 금속 유기물질 복합반응 (metal-organic complexation)과 비용해성 복합체형성 (insoluble complex formation) 등의 기작은 중금속으로 오염된 환경을 복원시키는 데에 중요한 기술기반을 제공한다 (Valls and de Lorenzo, FEMS . Microbiol . Rev., 26:327, 2002). 특히, 미생물은 대량으로 수확할 수 있으며, 중금속의 흡수와 탈착이 짧은 시간 안에 이루어지고 중금속의 선택적 분류와 균체의 폐기처리가 간단하므로, 기존의 화학적 처리방법인 산화환원 반응 혹은 침전, 여과를 이용하여 분리하거나 이온 교환수지를 이용하는 방법보다 더 효과적이다. 지하수와 같이 중금속 오염도가 1-100 mg/L 정도로 낮을 때는 기존의 처리 공정은 효과적이지 못하다 (Chamarthy et al ., J. Chem . Technol . Biotechnol., 76:593, 2001; Volesky, FEMS . Microbiol . Rev., 14:291, 1994). 더 욱이 분자생물학의 발전과 더불어 중금속 흡착능력을 향상시킨 균주의 최근 개발시도는 기존의 생물학적 처리방법을 개량 발전시킬 수 있는 가능성을 제시하고 있다. 미생물들은 생체축적 (bioaccumulation)을 통해 세포내외에서 중금속 결합단백질을 합성하는데, 이들은 중금속을 제거할 뿐만 아니라 세포 내 금속이온의 저장이나 농도 조절에도 관련한다.

최근, 납, 수은 그리고 카드뮴과 같은 유해 원소들과 자연적으로 결합해서 무독화시키는 ‘phytochelatin’으로 일컫는 펩티드를 중금속에 노출된 곰팡이와 식물이 생산하고 있음을 밝혀내었다. Phytochelatin은 (gamma-Glu-Cys)n-Gly (n=2-7)의 구조를 가지고 있으며 펩티드-금속 혼합체 형성을 통해 유해 금속이온을 축적한다 (Cobbett, Curr . Opin . Plant Biol ., 3:211, 2000). 또한, 다른 종류의 중금속결합 단백질로써 메탈로티오닌 (metallothionein)이라는 저분자 단백질도 많이 연구되어 있으며, 상기 단백질은 cysteine 함량이 많고, 카드뮴, 아연, 니켈, 구리 등과 결합한다 (Hamer, Annu . Rev . Biochem ., 55:913, 1986; Wu and Lin, Biosens . Bioelectron., 20:864, 2004).

한편, 양자점의 제조와 관련된 종래 기술로서, 금속분말의 종류, 양, 열처리 조건을 조절하여 양자점의 크기 및 밀도를 용이하게 조절하여 제조하는 방법에 관한 "금속분말을 이용한 양자점 형성방법 (대한민국등록특허 제10-0540801호)", 자성체막 또는 반도체막에 레이저를 조사함으로써 균일한 분포를 갖는 양자점을 형성하는 방법에 관한 "양자점 형성방법 (대한민국등록특허 제10-0526828호)" 등이 있고, 그 외에도 반도체 물질의 양자점 형성에 관한 "양자점 형성방법 (대한민국등록 특허 제10-0541516호)", "응력층을 이용한 양질의 양자점 형성방법 (대한민국공개특허 제10-2004-0094052호)", "실리콘 양자점 형성방법 (대한민국등록특허 제10-0249813호)", "나노미터 크기의 실리콘 양자점 형성방법 (대한민국등록특허 제10-0279739호)", "반도체 소자의 양자점 형성방법 (대한민국등록특허 제10-0268936호)" 등의 다수의 기술이 존재하나, 이는 금속물질을 물리적으로 결합시켜 제조하는 방법들이었다.

이에 본 발명자들은 양자점의 구성성분이 카드뮴(Cd), 셀레늄(Se), 아연(Zn), 텔루리움(Te)의 규칙적인 배열에 의해 합성된다는 점으로부터 착안하여, 중금속 흡착단백질을 효소공학적으로 발현시키면, 경제성이 높은 양자점을 생체내에서 합성하기 위한 시스템을 개발가능하다는 것을 확인하고, 상기 생물학적 시스템을 이용하여 광학적 안정성을 가진 양자점을 제조하고 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 목적은 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물을 중금속이 함유된 배지에서 배양하여 미생물내에 중금속 구조물을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 중금속 구조물을 회수하는 단계를 포함하는 중금속 구조물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조되고, 5∼120nm의 직경을 가지며 구형태인 중금속 구조물의 나노입자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 일부 를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 중금속 구조물 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자를 화학물질, 리간드, 금속, DNA, 및 단백질로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상과 결합하는 것을 특징으로 하는 나노입자의 개량방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자에 단백질을 결합하고, 상기 결합된 단백질에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질, 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 나노입자를 개량시키는 것을 특징으로 하는 나노입자의 개량방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 상기 나노입자의 표면에 바이오틴(biotin)을 코팅하는 단계; (b) 상기 바이오틴이 코팅된 표면에 스트렙타비딘(streptavidin)을 코팅하는 단계; (c) 상기 스트렙타비딘이 코팅된 표면에 아민(amine), 알데히드(aldehyde) 및 카르복실기(carboxyl group)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화학적 잔기를 변형하는 단계; 및 (d) 상기 표면에 금(gold) 또는 은(silver)을 코팅하여 개량된 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 상기 나노입자를 개량하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물을 중금속이 함유된 배지에서 배양하여 미생물내에 중금속 구조물 을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 중금속 구조물을 회수하는 단계를 포함하는 중금속 구조물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 중금속 구조물은 나노입자인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 나노입자는 양자점 (quantum dot)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 5∼120nm의 직경을 가지며, 구형태인 중금속 구조물의 나노입자를 제공한다.

본 발명은 또한, 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 일부를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 중금속 구조물 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 중금속은 카드뮴(Cd), 아연(Zn), 셀레늄(Se), 텔루리움(Te), 세슘(Cs), 구리(Cu), 납(Pb), 니켈(Ni), 망간(Mn), 수은(Hg), 코발트(Co) 및 크롬(Cr)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 중금속 흡착 단백질은 파이토켈라틴 합성 효소 또는 메탈로티오닌인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 파이토켈라틴 합성 효소를 코딩하는 유전자의 일부는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 중금속 흡착 단백질은 인간 (Homo sapiens), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 꽃담배 (Ornamental tobacco), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 및 대장균 (Escherichia coli ) 으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균 (Escherichia coli)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 중금속 흡착 단백질의 세포내 발현에 유리하도록 발현된 단백질을 분해하는데 관련된 세포 내외의 단백질 분해 효소를 생산하지 못하도록 변형된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 일부를 함유하는 발현벡터는 상기 중금속 흡착 단백질이 중금속 흡착에 유리하도록 단백질의 아미노산 서열 중 일부분이 제거되거나 위치특이적으로 돌연변이 된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 일부를 함유하는 발현벡터는 도 2a의 개열지도를 가지는 pTJ1-AtPCS인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 일부를 함유하는 발현벡터는 도 2b의 개열지도를 가지는 pTJ1-PpMT인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 나노입자를 화학물질, 리간드, 금속, DNA 및 단백질로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상과 결합하는 것을 특징으로 하는 나노입자의 개량방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 나노입자에 단백질을 결합하고, 상기 결합된 단백질에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질, 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 나노입자를 개량시키는 것을 특징으로 하는 나노입자의 개량방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 나노입자의 표면에 바이오틴 (biotin)을 코팅하는 단계; (b) 상기 바이오틴이 코팅된 표면에 스트렙타비딘 (streptavidin)을 코팅하는 단계; (c) 상기 스트렙타비딘이 코팅된 표면에 아민 (amine), 알데히드 (aldehyde) 및 카르복실기 (carboxyl group)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화학적 잔기를 변형하는 단계; 및 (d) 상기 표면에 금 (gold) 또는 은 (silver)을 코팅하여 개량된 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 상기 나노입자를 개량하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 중금속 흡착 단백질 유전자를 대장균에 도입, 발현시킨 후, 상기 흡착단백질을 발현하여 세포내에서 중금속을 흡착, 축적하는 정도에 따라 양자점을 합성하고자 연구하여, 중금속 흡착단백질 유전자인 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase) 혹은 메탈로티오닌 (metallothionein)을 코딩하는 유전자 가 단독 혹은 융합 발현되도록 플라스미드를 제작하고, 상기 플라스미드로 대장균을 형질전환하여 배양함으로써 중금속 흡착 단백질을 세포내에 생성하고, 이를 중금속의 각 성분이 포함된 배지를 이용하여 배양하고, 세포내에서 합성된 중금속 흡착구조체를 성분 분석 및 형광 분석을 통해 세포내 합성된 양자점인지를 확인하였다.

본 발명에서는 중금속 흡착 단백질로 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase)와 메탈로티오닌 (metallothionein)을 예시하였으나, 동일한 특성을 갖는 다른 단백질이나 펩티드도 또한 본 발명에 적용이 가능하다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

본 발명은 아라비돕시스 딸리아나 (Arabidopsis thaliana)의 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase)와 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)의 메탈로티오닌 (metallothionein)을 단독 혹은 융합된 형태로 발현시키는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 중금속 흡착 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.

중금속 흡착 단백질은 상기 단백질의 C-말단, 또는 N-말단에 융합되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 중금속의 구체적인 예로는 카드뮴(Cd), 아연(Zn), 셀레늄(Se), 텔루리움(Te), 세슘(Cs), 구리(Cu), 염소(Cl), 납(Pb), 니켈(Ni), 망간(Mn), 수은(Hg), 코발트(Co), 크롬(Cr) 등을 포함한다.

본 발명에서, 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase)가 발현되도록 형질전환된 대장균을 제조하기 위한 pTJ1-AtPCS는 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase)를 암호화하는 유전자 및 엠피실린 저항 유전 자(ampicilline resistance gene), 그리고 발현유도를 위한 프로모터인 trc 프로모터를 포함한다. 이때, 대장균에서 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase)를 발현하기 위해 아라비돕시스 딸리아나 (Arabidopsis thaliana) 염색체 DNA의 상보적 염기서열 (cDNA)로부터 2개의 프라이머 (primer)를 합성하여 PCR (polymer chain reaction)을 통해 제작하였으며, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)의 염색체 DNA로부터 GenBank에 등록된 염기서열을 이용하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)에 의해 메탈로티오닌 (metallothionein)의 중금속 흡착영역 유전자를 얻어 중첩 PCR을 통해 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase)와 메탈로티오닌 (metallothionein)이 융합된 형태의 유전자를 수득하였으며, 균주의 선별을 위하여 엠피실린 저항 유전자를 이용한다.

상기 균주로부터 수득한 파이토켈라틴 합성효소 (phytochelatin synthase)와 메탈로티오닌 (metallothionein)을 단독 혹은 융합 형태로 발현하여 중금속이온을 포함한 배지내에서 배양하여 성장단계별, 중금속 농도별로 관찰한 결과, 세포내에 중금속이 흡착, 축적되어 규칙적인 배열을 갖는 양자점을 형성하는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 생체내 양자점을 간단한 세포파쇄 공정을 거쳐 이들을 수백 나노미터 구멍크기 (pore size)을 갖는 막 (membrane)에 여과하여 쉽게 양자점을 수득할 수 있었다. 또한, 상기 중금속 흡착 단백질 뿐만 아니라, 하기 실시예에 국한되지 않고, 중금속이 흡착될 수 있는 단백질, DNA, 중간물질 및 대사물질 등 모든 세포내의 구성성분에 당업자로서 용이하게 본 발명에 적용할 수 있다. 다양한 중금속 흡착 단백질을 합성할 수 있는 생물로는 고등생물에서부터 미생물에 이르기까지 광 범위하게 나타나고 있으며 말의 신장세포에서 처음 발견된 바 있다 (Margoshe and Vallee, J. Am . Chem . Soc ., 79:4813, 1957). 현재 문헌상에 대표적으로 나타나있는 종으로는 인간 (Homo sapiens), 아라비돕시스 딸리아나 (Arabidopsis thaliana), (Ornamental tobacco), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 사카로아이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로아이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 대장균 (Escherichia coli ) 등의 다양한 종에서 나타나는 것으로 알려져 있다. 이로부터 다양한 중금속 흡착영역을 본 발명에 적용되는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 중금속을 흡착하는 단백질의 발현벡터 제조

(1) 파이토켈라틴 합성효소의 발현벡터 제조

파이토켈라틴 합성효소를 합성하는 AtPCS의 유전자 (NCBI accession No. AF461180)를 확보하기 위하여, 서열번호 5 (Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase)의 염기서열로 표시되는 아라비돕시스 딸리아나 (Arabidopsis thaliana)의 상보적 DNA (cDNA)를 표적 DNA (template DNA)로 사용하여 중합효소 연쇄반 응(PCR)을 수행하였다. 상기 중합효소 연쇄반응 (첫번째 변성 94℃ 7분, 두번째 변성 94℃ 1분, 교잡 55℃ 1분, 연장 72℃ 1분 30초, 30회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)은 하기 서열번호 1 및 서열번호 2의 개시절편 (primer)을 이용하여 수행하였다.

서열번호 1: 5'-GGAATTCATGGCTATGGCGAGTTTAT-3'

서열번호 2: 5'-CCCAAGCTTATTAATAGGCAGGAGCAGCGAG-3'

아가로즈 젤 전기영동법으로, 상기 중합효소 연쇄반응에 의해 수득한 약 1.5kb 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하였다. 이와 동시에 유도가능하고 강력한 tac 프로모터가 있는 플라스미드 pTac99A (Park and Lee, Biotechnol . Techn ., 12:815, 1998)를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단한 다음, 이를 상기 DNA 절편과 혼합하여, T4 DNA 리가아제 (ligase)로 연결시키고, 이를 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법을 이용하여 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주는 항생제 엠피실린 (ampicillin, 100μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하고, 이로부터 pTJ1-AtPCS 재조합 플라스미드를 수득하였다 (도 2a). 상기에서 제조한 pTJ1-AtPCS 재조합 플라스미드는 중금속 흡착 단백질로서 사용될 AtPCS 유전자가 강력하고 유도가능한 tac 프로모터에 의해 발현될 수 있다.

(2) 메탈로티오닌의 발현벡터 제조

메칼로티오닌을 합성하는 PpMT의 유전자 (NCBI accession No. NC_002947 REGION: 3696753..3696977)를 확보하기 위하여, 서열번호 6 (Pseudomonas putida KT2440 metallothionein)의 염기서열로 표시되는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) KT2440의 염색체 DNA (genomic DNA)를 표적 DNA (template DNA)로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 상기 중합효소 연쇄반응 (첫번째 변성 94℃ 7분, 두번째 변성 94℃ 1분, 교잡 55℃ 1분, 연장 72℃ 1분, 30회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)은 하기 서열번호 3 및 서열번호 4의 개시절편 (primer)을 이용하여 수행하였다.

서열번호 3: 5'-GGAATTCATGAACGATCAACGCTGCGC-3'

서열번호 4: 5'-AACTGCAGTTAGGGCGAGATCGGATCACT-3'

아가로즈 젤 전기영동법으로, 상기 중합효소 연쇄반응에 의해 수득한 약 230bp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 PstI로 절단하였다. 이와 동시에 유도가능하고 강력한 tac 프로모터가 있는 플라스미드 pTac99A(Park and Lee, Biotechnol . Techn ., 12:815, 1998)를 두 가지의 제한효소 EcoRI과 PstI로 절단한 다음, 이를 상기 DNA 절편과 혼합하여, T4 DNA 리가아제(ligase)로 연결시키고 이를 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법을 이용하여 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 형질전환 균주는 항생제 엠피실 린(ampicillin, 100μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하고, 이로부터 pTJ1-PpMT 재조합 플라스미드를 수득하였다 (도 2b). 상기에서 제조한 pTJ1-PpMT 재조합 플라스미드는 중금속 흡착 단백질로서 사용될 PpMT 유전자가 강력하고 유도가능한 tac 프로모터에 의해 발현될 수 있다.

재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.

실시예 2 : 재조합 플라스미드 pTJ1 - AtPCS 가 발현된 대장균의 형광 분석

강력하고 유도 가능한 tac 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pTJ1-AtPCS로 형질 전환된 대장균 DH5α (Woodcock et al ., Nucleic Acids Res., 17:3469-3478, 1989)에서 발현하였다. tac 프로모터는 IPTG (isopropyl-β- thiogalactoside)에 의해서 유전자 발현이 유도되며 pTJ1-AtPCS로 형질 전환된 대장균 DH5α의 경우 다음과 같이 파이토켈라틴 합성효소를 제조하였다. 형질 전환된 재조합 대장균을 중금속 이온이 각각 함유 (5 mM CdCl₂·2.5H₂O, ZnCl₂, SeO₂, TeCl₄, CsCl₂)된 LB 액체 배지 100 mL가 담긴 500 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. pTJ1-AtPCS 재조합 플라스미드는 tac 프로모터를 가지고 있어 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도(induction)하였는데, 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도가(OD, optical density)가 0.6일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 수행하였다. 유도 발현 후 4시간 후에 배양액 전체 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고, 10 mL PBS 버퍼 (pH 7.4)로 한번 씻은 다음, 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 PBS 버퍼 10 mL 용액에 현탁하였다. 현탁한 샘플을 96-well 흑색 plate에 100 μL씩 분주하여 형광 분광 광도계(Molecular Devices, 미국)를 이용하여 360∼700 nm에서의 발광 스펙트럼(emission spectrum)을 분석하였다 (도 3). 도 3에서 나타난 바와 같이, 320 nm의 자외선 영역 excitation에서 약 420 nm의 발광 스펙트럼(emission spectrum) 피크(peak)를 갖는 형광시그날이 강하게 나타남을 확인할 수 있었다. 이로써, 양자점이 나타내는 고유한 형광시그날을 갖는 물질이 대장균 내에 포함되어 있음을 알 수 있다.

또한, 이들 파이토켈라틴 합성효소가 발현된 재조합 대장균을 증류수로 세척하여 poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드 글라스에서 고정한 다음 커버 글라스를 씌 운 후 공초점현미경(Confocal laser scanning microscopy, LSM 510, Carl Zeiss, 독일)을 이용하여, 세포 내에 축적된 중금속의 형광이미지를 분석하였다 (도 4). 도 4에서, 도 3에서 나타난 약 420 nm의 발광스펙트럼을 갖는 것과 일치하는 파랑색 형광(a)과 약 700nm 발광스펙트럼을 갖는 황색 형광(b)의 대장균 세포를 관찰할 수 있었으며, 이는 양자점과 같은 나노입자들만이 가지고 있는 형광을 발광하는 특성이 본 발명에서의 세포내 중금속 구조물에서 확인할 수 있었다. (c)는 real image(실상)이며, (d)는 (a) 및 (b)의 merge이다. 또한, 도면에 표시된 스케일 막대는 각각 5㎛의 크기를 나타낸다.

실시예 3 : 재조합 플라스미드 pTJ1 - AtPCS 가 발현된 대장균으로부터 생체 내에 합성된 중금속의 특성 조사

유도 가능한 tac 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pTJ1-AtPCS로 형질 전환된 대장균 DH5α에서 IPTG에 의해 발현된 파이토켈라틴 합성효소가 재조합 대장균 내에서 중금속 구조물을 만들었는지를 확인하기 위해서, 상기 실시예 2의 재조합 대장균을 증류수로 세척하여 동결건조기에서 진공상태로 하루동안 건조시킨 후, 투과전자현미경(TEM, Technai G2, FEI, 네덜란드)을 이용해서 세포 내에 축적된 중금속을 분석한 결과, 중금속 구조물의 크기 및 형태가 균일하다는 것을 확인하였다 (도 5). 파이토켈라틴 합성효소가 발현되지 않은 대조군(a)에서는 발견되지 않는 중금속 구조물이 파이토켈라틴 합성효소가 발현된 재조합 대장균의 내부에 존재함을 확인할 수 있었다 (b, c 및 d). 본 발명에서 세포 내에 합성된 중금속 파티클의 크기는 도면의 스케일 막대에 비교하여 확인할 수 있듯이 약 5∼120 nm 였으나, 이 크기에 제한되지 않고, 다양한 크기의 중금속 파티클이 제조가능할 것이다. 또한, 본 발명에서 세포 내에 축적된 중금속 파티클의 고유한 구조 형태인 격자모양의 구조를 형성하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5의 c 및 d).

또한, 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균의 세포내에 흡착된 중금속 구조물의 X선 분광(EDS, Energy Dispersive X-Ray Spectrometry)을 투과전자현미경(FE-TEM/EDS, Technai G2, FEI, 네덜란드)을 이용하여 분석하였는데, 전자현미경 사진에 표시된 부분의 중금속 구조물을 분석한 결과, 배양액에 첨가한 성분중에서 카드뮴(Cd), 아연(Zn), 세슘(Cs) 등이 검출되었다 (도 6).

도 6은 본 발명에서 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균을 카드뮴(Cd), 아연(Zn) 및 세슘(Cs)을 각 5mM씩 포함한 배지에서 배양했을 때의 세포내에 축적된 중금속 구조물의 X선 분광 분석 (EDS, Energy Dispersive X-Ray Spectrometry) 모식도 및 투과전자현미경 사진이다. 유기물인 대장균에서 나타날 수 있는 탄소(C), 산소(O)가 있으며, 그 외에 세포내에 항상 존재하는 나트륨(Na) 및 염소(Cl)를 제외하면 아연(Zn), 카드뮴(Cd) 및 세슘(Cs)이 세포내 중금속 나노입자를 구성하는 성분임을 확인할 수 있었다.

도 7은 본 발명에서 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균을 카드뮴(Cd), 아연(Zn) 및 셀레늄(Se)을 각 5mM씩 포함한 배지에서 배양했을 때의 세포내에 축적된 중금속 구조물의 X선 분광 분석 모식도 및 투과전자현미경 사진이다. 특히, 전자현미경 사진에 표시된 부분의 중금속 구조물을 분석한 결과, 아연(Zn)과 셀레 늄(Se)의 구성성분을 함유하며, 셀레늄(Se)의 함량이 높은 중금속 구조물을 형성하고 있음을 확인하였다.

도 8은 본 발명에서 파이토켈라틴 합성효소를 발현한 대장균을 카드뮴(Cd), 아연(Zn), 셀레늄(Se) 및 텔루리움(Te)을 각 5mM씩 포함한 배지에서 배양했을 때의 세포내에 축적된 중금속 구조물의 X선 분광 분석 모식도 및 투과전자현미경 사진이다. 전자현미경 사진에 표시된 부분의 중금속 구조물을 분석한 결과, 아연(Zn), 셀레늄(Se) 및 카드뮴(Cd)을 소량 함유하며, 특히, 텔루리움(Te)의 함량이 높은 중금속 구조물을 형성하고 있음을 확인하였다.

도 6 내지 도 8의 X선 분광 분석에 이용된 세포내 중금속 나노입자의 크기는 대략 30∼50nm의 크기였으며, 뿐만 아니라, 상기 중금속 나노입자가 약 5nm에서 약 120nm까지 다양하게 세포내에 존재함을 투과전자현미경으로 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 중금속 흡착 단백질을 이용하여 중금속 구조물을 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 나노입자인 양자점 및 중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 일부를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 중금속 구조물 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에서 제공되는 나노입자인 생체내 양자점은 기존에 금속물질을 물리적으로 결합시켜서 제조하는 방법과는 달리 생체내에서 발현되는 효소의 활성에 의 해 합성되는 것으로서, 중금속 흡착 단백질을 세포내에 발현시켜 양자점을 생체내에서 효율적으로 생산가능하고 제조공정이 단순하여 높은 생산성과 경제성을 가지고, 상기 양자점은 organic fluorophore의 단점인 광학적 안정성 문제를 해결할 수 있는 장점이 있어 유용하게 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물을 중금속이 함유된 배지에서 배양하여 미생물 내에 양자점을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 양자점을 회수하는 단계;를 포함하는 양자점의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 중금속 흡착 단백질은 파이토켈라틴 합성 효소 또는 메탈로티오닌인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중금속 흡착 단백질은 인간 (Homo sapiens), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 꽃담배 (Ornamental tobacco), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 및 대장균 (Escherichia coli ) 으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 중금속 흡착 단백질의 세포내 발현에 유리하도록 발현된 단백질을 분해하는데 관련된 세포 내외의 단백질 분해 효소를 생산하지 못하도록 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중금속은 카드뮴(Cd), 아연(Zn), 셀레늄(Se), 텔루리움(Te), 세슘(Cs), 구리(Cu), 납(Pb), 니켈(Ni), 망간(Mn), 수은(Hg), 코발트(Co) 및 크롬(Cr)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 양자점의 회수 단계는 상기 미생물을 파쇄시키는 공정; 및 생성된 파쇄물을 수백 나노미터의 구멍 크기를 가지는 막에 여과시켜 상기 양자점을 수득하는 공정;을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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중금속 흡착 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 발현벡터로서 도 2a의 개열지도를 가지는 pTJ1-AtPCS 또는 도 2b의 개열지도를 가지는 pTJ1-PpMT를 사용하여 형질전환된 양자점 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제11항에 있어서, 상기 중금속은 카드뮴(Cd), 아연(Zn), 셀레늄(Se), 텔루리움(Te), 세슘(Cs), 구리(Cu), 납(Pb), 니켈(Ni), 망간(Mn), 수은(Hg), 코발트(Co) 및 크롬(Cr)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
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제11항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제11항에 있어서, 상기 미생물은 중금속 흡착 단백질의 세포내 발현에 유리하도록 발현된 단백질을 분해하는데 관련된 세포 내외의 단백질 분해 효소를 생산하지 못하도록 변형된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
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