CN104198708B - 基于水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点/聚离子液体敏感膜的光电免疫传感器 - Google Patents
基于水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点/聚离子液体敏感膜的光电免疫传感器 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于肿瘤标志物检测、光电化学、免疫传感技术领域，具体公开了一种新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点及其制备方法、基于该新型量子点与3-癸基-1-（3-吡咯丙基）咪唑四氟硼酸盐离子液体聚合物膜修饰ITO电极，负载神经元特异性烯醇化酶抗体以构建光电免疫传感器，基于免疫反应，并以白光为激发光源实现神经元特异性烯醇化酶抗原的特异性检测。本发明将水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点、聚离子液体及白光激发光源引入NSE光电免疫传感体系，所制备的光-电免疫传感器具备方便、简易、经济、适用性强、操作简单快速、选择性好、灵敏度高、检出限低等优点。
Description
技术领域
本发明同时涉及肿瘤标志物检测、光电化学、免疫传感技术领域，具体涉及一种新型水溶性四元量子点的合成、表征及量子点和聚离子液体在NSE光-电免疫传感器中的应用。该光-电免疫传感器对神经元特异性烯醇化酶抗原测定灵敏度高、选择性好、准确度高，可用于小细胞肺癌筛查。
背景技术
光电化学过程是指分子、离子或半导体材料等因吸收光子而使电子受激发产生的电荷传递，从而实现光能向电能的转化过程。电化学生物传感器作为一种独立的集成检测装置，已经对生化、医疗领域产生了日益重要的影响。随着纳米技术和材料化学的快速发展，在光电化学过程与电化学生物传感器结合的基础上发展出了新一代光电化学传感器。光电化学传感器将传统的电化学传感器和光电化学结合起来，同时具有电化学和光化学传感器的优点。一方面，该检测方法与目前已经建立起来的电化学发光(ECL)方法在过程上正好相反，ECL采用电作为激发信号，检测的是光信号；而光电化学分析使用光作为激发信号，检测的是电信号，通过采用不同形式的能量作为激发信号和检测信号，使激发和检测信号互不干扰，因而背景信号较低，可获得较高的灵敏度；另一方面，由于采用电化学检测，因而具有设备简单、价廉，易于微型化的优点。基于以上优点，光-电传感器在分析检测和识别生物分子方面展现了独特的优越性和广阔的应用前景。但光-电传感还处于起步阶段，发掘光-电新材料、构建检测新方法、新体系显得尤为重要。
量子点作为典型的光电活性材料，在光电化学传感器的构建中应用广泛，但量子点与电极表面有一定的距离，需要在电极表面固定另一种光电活性材料，或者可进行电子传递的物质作为量子点与电极之间的桥梁，使得电子能够从量子点传递到电极表面。由于复合材料比单一材料具有更高的光电转换效率，近年，复合材料的研究获得广泛关注。量子点的复合物通常是将量子点与宽禁带的半导体氧化物进行复合，以此来改善半导体氧化物在近红外区无吸收的劣势。
离子液体(IonicLiquid)具有熔点低、稳定性高、溶解能力强、导电性高、蒸汽压低、电势窗口宽等普通有机溶剂和水均不具备的独特性质，已被广泛应用于电化学领域。此外，离子液体还具有良好的生物相容性，是一些生物分子电催化过程中的理想介质。
将新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点与聚离子液体复合，有望进一步改善和提高光-电传感器的性能，用于高灵敏测定神经元特异性烯醇化酶抗原，该传感器在小细胞肺癌筛查中具有潜在的应用价值，是一个值得深入探讨的课题。
以下工作受国家自然科学基金资助；项目编号：21275166；项目名称：基于分子印迹聚离子液体水凝胶阵列的肿瘤标志蛋白电化学传感研究。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于：
第一，提供一种发射波长可调的新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点；
第二，提供一种离子液体，进而提供一种聚离子液体负载上述四元Zn-Cd-Hg-Se量子点的纳米复合膜；
第三，提供一种基于上述纳米复合膜修饰ITO电极的光-电免疫传感器；
第四，提供上述光-电免疫传感器在测定神经元特异性烯醇化酶抗原中的应用。
为了实现上述诸发明目的，本发明采取了如下技术措施：
首先，一种波长可调的新型水溶性四元量子点Zn-Cd-Hg-Se的制备方法，其步骤如下：
氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中依次加入5-15mL0.005mol·L-1ZnCl2溶液、1–5mL0.005mol·L-1CdCl2溶液、5mL0.005mol·L-1HgCl2溶液和10mL0.01875-0.02742mol·L-1N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，加二次水使溶液总体积为50mL，混匀得混合液；用1mol·L-1NaOH溶液调节混合液的pH值为11-12。然后，加入150–230μL新制备的0.2398mol·L-1NaHSe溶液，氮气保护下，80℃反应5h，得到发射波长可调的Zn-Cd-Hg-Se量子点溶液。将上述溶液冷却至室温，用10kD的超滤管冷冻离心(以对量子点溶液进行浓缩和纯化)，得到新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点，4℃保存备用。
其次，制备一种3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体，其方法如下：
(1)将咪唑(0.6808g，0.01mol)溶于20mL无水乙腈，0℃冰浴搅拌下，加入氢化钠(0.3600g，0.015mol)反应1h，再加入溴代正癸烷(1.106g，0.005mol)的30mL乙腈溶液，78℃加热回流12小时后，即得到N-癸基咪唑黄色液体；
(2)称取N-癸基咪唑(0.2094g，1mmol)与1-(3-溴丙基)吡咯(0.1749g,1.03mmol)溶于20mL甲苯，氮气保护下，78℃反应24h，即得淡黄色油状溴化3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑离子液体；
(3)向溴化3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑(1g,2.888mmol)中加入30ml室温下的饱和四氟硼酸钠溶液，40℃搅拌反应4h，乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂，即得到3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体DPPIT。
上述3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体的反应路线如下：
再次，制备一种基于聚离子液体负载量子点的纳米复合膜修饰ITO电极的NSE光-电免疫传感器，其方法包括以下步骤：
ITO导电玻璃是在钠钙基或硅硼基基片玻璃的基础上，利用磁控溅射的方法镀上一层氧化铟锡(俗称ITO)膜加工制作成的。
(1)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃切成约3cm×1cm(长×宽)，依次用丙酮、NaOH(1mol·L-1)和二次蒸馏水分别超声淸洗3min，室温晾干。
(2)将ITO电极置于含0.4mmol·L-13-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体的0.01mol·L-1四氟硼酸钠溶液中，以0.5V为初始电位，1.3V为终止电位，多电位阶跃聚合，10圈后，洗净，置于经超滤管浓缩纯化的Zn-Cd-Hg-Se量子点溶液中浸泡10min，洗净，晾干；
重复上述步骤(2)的操作3次，得量子点/聚离子液体修饰ITO电极，简称为Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极；
(3)构建神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器：
将步骤(2)制备的Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极在含10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和20mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液中浸泡约1h，然后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH7.4)洗净；
将25μL的5μg·mL-1NSE抗体溶液滴涂至修饰电极表面，4℃下放置12小时，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH7.4)洗去未固定的NSE抗体，得到anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极。将anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极在1％牛血清白蛋白溶液中浸泡1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH7.4)洗净，晾干，即得神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器；
以白光为光源，在0.2mol·L-1抗坏血酸的0.1mol·L-1磷酸缓冲液(pH7)中对上述神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器进行光-电性能测试，并将其用于神经元特异性烯醇化酶抗原测定，具有较好的灵敏度、准确度、精密度以及选择性。
35℃下，在上述神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器表面分别滴加25μL不同浓度的NSE抗原溶液，其浓度分别为：1pg·mL-1、5pg·mL-1、10pg·mL-1、100pg·mL-1、1ng·mL-1、10ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1，孵育30min，然后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH7.4)洗净，得结合了NSE抗原的神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器，4℃储存，备用于光-电性能测试。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
(1)本发明以一种新型水溶性四元量子点-聚离子液体复合纳米材料作为光电免疫传感器的敏感材料，该材料在白光激发下，具有较强的光电流强度，能够实现对神经元特异性烯醇化酶的高灵敏检测，其检出限为0.2pg·mL-1(S/N＝3)。
(2)本发明将水溶性四元量子点引入光电化学传感体系，该量子点生物相容性好、波长可调，具有较强的荧光强度和稳定性。
(3)本发明将3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体聚合物膜用于修饰ITO电极，并负载水溶性四元量子点作为光-电敏感元件，经固载NSE抗体后制备出NSE光-电免疫传感器，离子液体导电性好、生物相容性好、电位窗口宽，有助于保持抗体生物活性，并提高检测灵敏度。
(4)本发明的光电免疫传感器测定神经元特异性烯醇化酶的操作过程简便，不需要特殊实验条件，仪器要求简单。
附图说明
图1为实施例1制备的一种Zn-Cd-Hg-Se量子点的荧光光谱图。
图2为实施例1制备的一种Zn-Cd-Hg-Se量子点的透射电镜图。
图3为N-乙酰-L-半胱氨酸(a)和实施例1制备的一种Zn-Cd-Hg-Se量子点(b)的红外光谱图。
图4为实施例2制备的3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体的核磁共振波谱表征。
图5为实施例2制备的3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体的高效液相色谱-质谱联用表征。
图6为本发明的NSE光电免疫传感器制备过程示意图。
图7为本发明制备的裸ITO电极(曲线a)、Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO(曲线b)、anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO(曲线c)、BSA/anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO(曲线d)、NSE/BSA/anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO(曲线e)的交流阻抗图。
图8为本发明制备的Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO(曲线a)、anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO(曲线b)、BSA/anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO(曲线c)、NSE/BSA/anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO(曲线d)光电流-时间响应曲线。
图9本发明的免疫传感器检测NSE的线性关系曲线。
图10本发明的免疫传感器在有(b)、无干扰物(a)存在时的光电流响应图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明请求保护的范围。此外，还应理解，在阅读了本发明所讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例中所用白光灯为5W高亮外置白光光源，购自“光概念车灯饰品店”淘宝店，网址为：
http://item.taobao.com/item.htm？spm＝a1z09.2.9.101.lFDGY0&id＝39175152864&_u＝fp3euhgb0aa&qq-pf-to＝pcqq.c2c，生产厂家为惠州市云峰照明科技有限公司；电极材料ITO购买于珠海凯为电子元器件有限公司，尺寸：2"*2"(约50.8mm*50.8mm)，厚度：1.1mm，表面电阻：7-10Ω/□，导电层厚度：185nm，透光率：>85％，包装：50片/盒；NSE抗体为RabbitAnti-NSEantibody(bs-1027R)、NSE抗原为NSE(bs-1027P)，均购自北京博奥森生物技术有限公司；实施例中用水均为二次蒸馏水。
以下实施例中所用原料1-(3-溴丙基)吡咯按照如下方法合成：将吡咯(0.6709g，0.01mol)溶于30mLDMF中，0℃冰浴搅拌下，逐滴滴加至含1,3-二溴丙烷(6.057g，0.03mol)和氢化钠(0.3600g，0.015mol)的20mLDMF溶液中，滴加完毕，80℃搅拌反应24h，关闭反应，旋干溶剂。加入少量二次水，用无水乙醚进行萃取，蒸干溶剂，即得到1-(3-溴丙基)吡咯。
实施例1
一种新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点，其合成步骤如下：
NaHSe的制备：玻璃瓶中加入0.0273gNaBH4，1.5mL超纯水，冰浴，加入0.0284g硒粉，密闭反应2h(方程式：2Se+4NaBH4+7H2O→2NaHSe+Na2B4O7+14H2↑)，得无色透明NaHSe溶液(浓度为0.2398mol·L-1)，备用。
方案一：在氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中依次加入5mL0.005mol·L-1ZnCl2、5mL0.005mol·L-1CdCl2溶液、5mL0.005mol·L-1HgCl2溶液和10mL0.01875mol·L-1N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，加二次水使溶液的总体积为50mL，混匀得混合液；用1mol·L-1NaOH溶液调节混合液的pH值为11-12，然后加入157μL上述新制备的NaHSe溶液，氮气保护，80℃反应5h，得到荧光发射波长为590nm、如图1曲线a所示的Zn-Cd-Hg-Se量子点溶液。冷却至室温，用10kD的超滤管10000rpm冷冻离心10min，得到100μL新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点，4℃保存备用。
方案二：在氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中依次加入10mL0.005mol·L-1ZnCl2、3mL0.005mol·L-1CdCl2溶液、5mL0.005mol·L-1HgCl2溶液和10mL0.02244mol·L-1N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，加二次水使溶液的总体积为50mL，混匀得混合液；用1mol·L-1NaOH溶液调节混合液pH值为11-12。然后，加入188μL上述新制备的NaHSe溶液，氮气保护，80℃反应5h，得到荧光发射波长为635nm、如图1曲线b所示的Zn-Cd-Hg-Se量子点溶液。冷却至室温，用10kD的超滤管10000rpm冷冻离心10min，得到100μL新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点，4℃保存备用。
方案三：在氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中依次加入10mL0.005mol·L-1ZnCl2、2mL0.005mol·L-1CdCl2溶液、5mL0.005mol·L-1HgCl2溶液和10mL0.02119mol·L-1N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，加二次水使溶液的总体积为50mL，混匀得混合液；用1mol·L-1NaOH溶液调节混合液pH值为11-12。然后，加入178μL上述新制备的NaHSe溶液，氮气保护，80℃反应5h，得到荧光发射波长为663nm、如图1曲线c所示的Zn-Cd-Hg-Se量子点溶液。冷却至室温，用10kD的超滤管10000rpm冷冻离心10min，得到100μL新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点，4℃保存备用。
方案四：在氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中依次加入15mL0.005mol·L-1ZnCl2、2mL0.005mol·L-1CdCl2溶液、5mL0.005mol·L-1HgCl2溶液和10mL0.02742mol·L-1N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，加二次水使溶液的总体积为50mL，混匀得混合液；用1mol·L-1NaOH溶液调节混合液pH值为11-12。然后，加入230μL上述新制备的NaHSe溶液，氮气保护，80℃反应5h，得到荧光发射波长为675nm、如图1曲线d所示的Zn-Cd-Hg-Se量子点溶液。冷却至室温，用10kD的超滤管10000rpm冷冻离心10min，得到100μL新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点，4℃保存备用。
方案五：在氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中依次加入15mL0.005mol·L-1ZnCl2、1mL0.005mol·L-1CdCl2溶液、5mL0.005mol·L-1HgCl2溶液和10mL0.02705mol·L-1N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，加二次水使溶液的总体积为50mL，混匀得混合液；用1mol·L-1NaOH溶液调节混合液pH值为11-12。然后，加入220μL上述新制备的NaHSe溶液，氮气保护，80℃反应5h，得到荧光发射波长为690nm、如图1曲线e所示的Zn-Cd-Hg-Se量子点溶液。冷却至室温，用10kD的超滤管1000rpm冷冻离心10min，得到100μL新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点，4℃保存备用。并将此波长量子点用于后续光电免疫传感过程。其形貌以透射电子显微镜表征，TEM图如图2所示。从图中可以观察到，该量子点呈球形，分散性良好，尺寸在2-3nm左右。
图3为N-乙酰-L-半胱氨酸(曲线a)以及图1e所示Zn-Cd-Hg-Se量子点的红外光谱图(曲线b)。由曲线a可知，2547.48cm-1为巯基的特征吸收；1717.16cm-1为碳氧双键的特征吸收，1586.61cm-1为酰胺中-NH的面内弯曲振动的特征吸收峰，2900.71cm-1和2808.78cm-1的两个特征吸收峰表明含有亚甲基。从曲线b中可明显看出，巯基的特征谱带2547.48cm-1在修饰后量子点的谱图上消失，另外，亚甲基特征吸收依然存在，由此可知，巯基与量子点可能已形成Cd-S键结合，表明N-乙酰-L-半胱氨酸已成功修饰到Zn-Cd-Hg-Se量子点表面。
实施例2
一种离子液体3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐，其制备方法如下：
(1)将咪唑(0.6808g,0.01mol)溶于20mL无水乙腈，0℃冰浴搅拌下，加入氢化(0.3600g,0.015mol)反应1h，再加入溴代正癸烷(1.106g,0.005mol)的30mL乙腈溶液，78℃加热回流12小时后，得到N-癸基咪唑黄色液体；
(2)称取N-癸基咪唑(0.2094g,1mmol)与1-(3-溴丙基)吡咯(0.1749g,1.03mmol)溶于20mL甲苯，氮气保护下，78℃反应24h，得淡黄色油状溴化3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑离子液体；
(3)向溴化3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑(1g,2.888mmol)中加入30mL室温下饱和四氟硼酸钠溶液，40℃搅拌反应4h，乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂，即得到3-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体(简称DPPIT)。
1HNMR(400MHz，D2O)δ：8.396(1H，d)，7.37(2H，d)，6.69(2H，d)，6.08(2H，d)，4.08(2H，t)，4.03(2H，t)，3.98(2H，t)，3.03(2H，t)，2.32(2H，t)，2.00(2H，t)，1.135(12H，t)，1.17(3H，t)。如图4所示，通过图谱化学位移值以及峰面积的积分，可以确定分子中氢原子的种类和含量，从而证实产物的结构正确；此外，通过HPLC-MS图谱如图5所示，测得的M+分子量316.27798，与离子液体的理论分子量一致，进一步证实产物的结构正确。
实施例3
如图6所示，一种基于聚离子液体负载量子点的纳米复合膜修饰ITO电极的NSE光电免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃切成约3cm×1cm(长×宽)小片之后，依次用丙酮、NaOH(1mol·L-1)和二次蒸馏水分别超声淸洗3min，室温晾干；
(2)以洁净ITO电极为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，置于含0.4mmol·L-13-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体的0.01mol·L-1四氟硼酸钠溶液中，以0.5V为初始电位，1.3V为终止电位，多电位阶跃扫描，10圈后，二次水洗净，晾干，浸入2mLZn-Cd-Hg-Se量子点溶液(实施例1方案五最后所得的新型水溶性四元Zn-Cd-Hg-Se量子点)10min，取出洗净，晾干，重复上述步骤(上述步骤即：置于含0.4mmol·L-13-癸基-1-(3-吡咯丙基)咪唑四氟硼酸盐离子液体的0.01mol·L-1四氟硼酸钠溶液中，以0.5V为初始电位，1.3V为终止电位，多电位阶跃扫描，10圈后，二次水洗净，晾干，浸入2mLZn-Cd-Hg-Se量子点溶液10min，取出洗净，晾干)3次，得Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极；
(3)构建NSE光电免疫传感器：
将步骤(2)制得的Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极在2.0mL含10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和20mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液中浸泡1h，然后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH7.4)洗净；将25μL5μgmL-1NSE抗体溶液滴涂至修饰电极表面，4℃放置12小时，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH7.4)洗去未固定的NSE抗体，得到Anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极。将Anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极在1％牛血清白蛋白溶液中浸泡1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，再用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH7.4)洗净，晾干备用，得BSA/Anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极；
在BSA/Anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极表面分别加25μL不同浓度的NSE抗原溶液，其浓度分别为:1pg·ml-1、5pg·ml-1、10pg·ml-1、100pg·ml-1、1ng·ml-1、10ng·ml-1、50ng·ml-1、100ng·ml-1。35℃下，孵育30min，0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH7.4)洗净，得到NSE/BSA/Anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极，4℃保存备用。
(4)自组装光电化学测试系统：以5W白光灯为激发光源，经光线引导至电极表面，采用三电极系统测试光电流：以0.25cm2的ITO电极作为工作电极，Ag/AgCl电极(饱和KCl)作为参比电极，铂丝电极作为对电极，光电流由CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器公司)测定。光电流在恒定电位(0VvsAg/AgCl)、0.2mol·L-1抗坏血酸的0.1mol·L-1磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)中进行，检测前通高纯氮15min除氧，测定时保持氮气气氛。
关于步骤(2)中，量子点在ITO电极上的最佳修饰层数，可通过考察不同层数量子点修饰电极在0.2mol·L-1抗坏血酸的0.1mol·L-1磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)中的光电流-时间响应曲线来确定。随着修饰层数的增加，光电流强度逐渐增强，当修饰层数增加到4层时，光电流达到最大，继续增加修饰层数，光电流强度减小。这可能是由于膜厚度的增加，电子的交换传导受到抑制。因此，本发明选择4层作为最佳修饰层数。
关于步骤(3)中，NSE抗原的最佳孵育时间可通过考察传感器的光电流响应与孵育时间的关系曲线来确定：在10～40min范围内，随着孵育时间延长，免疫传感器识别NSE前后的电流响应差值快速增加，30min后趋于稳定，表明抗原-抗体免疫结合趋于饱和，因此，本发明选择30min为最佳孵育时间。
关于步骤(3)中，NSE抗原的最佳孵育温度可通过考察传感器的光电流响应与孵育时间的关系曲线来确定：在20～35℃范围内，随孵育温度升高，免疫传感器识别NSE前后的电流响应差值快速增加，35℃时达到最大值；当温度高于35℃后，会影响蛋白质活性，降低其识别能力，电流响应差值降低。因此，本发明选择35℃为最佳孵育温度。
关于本步骤(4)中，抗坏血酸的浓度是通过同一传感器在不同浓度抗坏血酸的0.1mol·L-1磷酸缓冲溶液(pH7.0)中的光电流-时间响应曲线来确定。从0mol·L-1～0.2mol·L-1，随着抗坏血酸浓度逐渐增加，光电流也逐渐増大。随抗坏血酸浓度进一步增大，光电流减小。这是由于浓度太大，抗坏血酸在溶液中的吸光度增加，从而导致照射到电极表面的光强度下降而致使量子点的激发效率降低。因此，考虑到电极响应对抗坏血酸浓度的敏感性，本发明选择0.2mol·L-1作为抗坏血酸的最佳浓度。
以下光电化学性能测试也均选用上述确定下来的最佳参数条件。
实施例4
如图7所示，对实施例3各步骤所制得的修饰电极进行电化学交流阻抗谱(EIS)表征，EIS是探索化学修饰电极界面性质的有效工具之一。其谱图一般分为高频部分和低频部分，其中高频部分为动力学控制区域，低频部分为扩散控制区域。在5.0mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)+0.1mol·L-1PBS(pH＝7.0)+0.1mol·L-1KCl溶液中进行交流阻抗表征，并用Randlescircuit拟合电路计算电极界面的电荷传递电阻，在Randlescircuit拟合电路中，界面电荷传递电阻(Rct)、扩散电阻(ZW)与界面电容(Cdl)并联，半圆的直径对应于界面电荷传递电(Rct)。Nyquist曲线如图7所示，可以看出裸电极(曲线a)的交流阻抗图谱在高频部分的半圆很小，经模拟计算其Rct为90.9Ω；当量子点-聚离子液体修饰至电极表面后，其高频部分的半圆直径增加(曲线b)，阻抗较大，界面电荷传递电阻增至396.0Ω；曲线c是Anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT修饰电极界面的交流阻抗谱图，由于抗体是不利于电子传递的生物大分子，会阻碍界面的电子传递，界面电荷传递电阻增加为696.0Ω；当用BSA封闭电极表面可能存在的非特异性活性位点后，交流阻抗谱的半圆直径大大增加(曲线d)，模拟计算其电荷传递电阻为1926.0Ω；当免疫传感器与NSE抗原专一性结合后，抗原-抗体复合物覆盖电极表面，其界面电荷传递电阻进一步增加，达到3208.0Ω(曲线e)。以上结果表明，本发明经逐步修饰后，成功制备出NSE光电免疫传感器。
如图8所示，当修饰电极表面结合anti-NSE抗体(b)及BSA(c)封闭非活性位点后，光电流均降低，这可能是由于蛋白对电子传递的阻碍作用，使溶液中电子给体抗坏血酸难以扩散至电极表面，从而导致光电流强度的降低。当免疫传感器与NSE抗原特异性结合后(d)，观察到光电流强度进一步降低。表明修饰步骤及免疫测定的成功进行。
如图9所示，用光电流-时间法考察了实施例3中的光电免疫传感器对于不同浓度NSE抗原的光电流响应情况，当NSE的浓度在1pg·mL-1-100ng·mL-1之间时，键合NSE抗原前后的光电流差与键合抗原前的光电流比值与NSE抗原浓度的对数成良好的线性关系，线性方程为：I＝0.1081logcNSE(ng·mL-1)+0.4065(R＝0.9937)，检出限为0.2pg·mL-1(S/N＝3)。这表明基于水溶性Zn-Cd-Hg-Se量子点-聚DPPIT离子液体复合膜构建的光电免疫传感器可用于NSE抗原的高灵敏检测。
实施例5
测定实施例3所制得的NSE光电免疫传感器(即BSA/Anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极)的选择性，抗干扰性能是衡量电化学传感器的实用性的重要指标之一。配制两份NSE抗原溶液：(a)含0.5ng·mL-1NSE抗原；(b)含0.5ng·mL-1NSE抗原及浓度均为50ng·mL-1的前列腺抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、免疫球蛋白(IgG)、牛血清蛋白(BSA)、抗坏血酸(AA)、L-半胱氨酸(L-Cysteine)的混合溶液。在最佳条件下，将NSE光电免疫传感器分别在两份溶液中孵育30min后进行测定，结果如图10。由图可知，两份溶液的电流响应差值的偏差为4.17％，说明以上物质不干扰NSE抗原的测定，即该免疫传感器具有良好的选择性。
Claims (2)
1.一种神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器的制备方法，其步骤如下：
（1）ITO电极预处理：将ITO导电玻璃切成3cm×1cm，依次用丙酮、NaOH和二次蒸馏水分别超声清洗3min，室温晾干；
（2）将ITO电极置于含0.4mmol·L-13-癸基-1-（3-吡咯丙基）咪唑四氟硼酸盐离子液体的0.01mol·L-1四氟硼酸钠溶液中，以0.5V为初始电位，1.3V为终止电位，多电位阶跃聚合，10圈后，洗净，置于水溶性四元量子点Zn-Cd-Hg-Se中浸泡10min，洗净，晾干；
重复上述步骤（2）的操作3次，得量子点/聚离子液体修饰ITO电极，简称为Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极；
所述水溶性四元量子点Zn-Cd-Hg-Se的制备方法，其步骤如下：
氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中依次加入5-15mL0.005mol·L-1ZnCl2溶液、1–5mL0.005mol·L-1CdCl2溶液、5mL0.005mol·L-1HgCl2溶液和10mL0.01875-0.02742mol·L-1N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，加二次水使溶液总体积为50mL，混匀得混合液；用1mol·L-1NaOH溶液调节混合液的pH值为11–12；然后，加入150–230μL新制备的0.2398mol·L-1NaHSe溶液，氮气保护下，80°C反应5h，得到Zn-Cd-Hg-Se量子点溶液，冷却至室温后，用10kD的超滤管冷冻离心，得到水溶性四元量子点Zn-Cd-Hg-Se，4°C保存备用；
所述3-癸基-1-（3-吡咯丙基）咪唑四氟硼酸盐离子液体，其制备方法如下：
一、将0.01mol咪唑溶于20mL无水乙腈，0℃冰浴搅拌下，加入0.015mol氢化钠反应1h，再加入0.005mol溴代正癸烷的30mL乙腈溶液，78℃加热回流12小时后，得到N-癸基咪唑黄色液体；
二、称取1mmolN-癸基咪唑与1.03mmol1-（3-溴丙基）吡咯溶于20mL甲苯，氮气保护下，78°C反应24h，得淡黄色油状溴化3-癸基-1-（3-吡咯丙基）咪唑离子液体；
三、向2.888mmol溴化3-癸基-1-（3-吡咯丙基）咪唑中加入30mL室温下的饱和四氟硼酸钠溶液，40°C搅拌反应4h，乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂，得到3-癸基-1-（3-吡咯丙基）咪唑四氟硼酸盐离子液体；（3）构建神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器：
将步骤（2）制备的Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极在含10mg/mL1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和20mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液中浸泡1h，然后用0.01mol·L-1PBS缓冲液洗净；
将25μL的5μg·mL-1NSE抗体溶液滴涂至修饰电极表面，4°C下放置12小时，用0.01mol·L-1PBS缓冲液洗去未固定的NSE抗体，得到anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极；将anti-NSE/Zn-Cd-Hg-Se/Poly-DPPIT/ITO修饰电极在1%牛血清白蛋白溶液中浸泡1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L-1PBS缓冲液洗净，晾干，得神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器。
2.根据权利要求1所述方法制备的神经元特异性烯醇化酶光-电免疫传感器在定性和/或定量检测神经元特异性烯醇化酶抗原中的应用。
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