ES2322061T3

ES2322061T3 - Superficie de material de base que se inhibe en adsorcion no especifica.

Info

Publication number: ES2322061T3
Application number: ES04771169T
Authority: ES
Inventors: Yukio Nagasaki; Tadahito Takahashi; Kazunori Kataoka; Fumiko Aboshi; Miki Kato; Tomoko Jomura; Hiroshi Kobayashi; Yoshinori Katsuyama; Masami Nakamae
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2003-07-28
Filing date: 2004-07-28
Publication date: 2009-06-16
Anticipated expiration: 2024-07-28
Also published as: WO2005010529A1; US20060240438A1; US8841138B2; US9862992B2; DE602004020231D1; EP1650565B1; EP1650565A1; JPWO2005010529A1; ATE426809T1; US20140378346A1; EP1650565A4; JP4665762B2

Abstract

Una superficie de sustrato sobre la cual se inmoviliza una sustancia para detectar un analito o el analito per se, superficie que se forma mediante el tratamiento de la superficie de sustrato con un líquido que contiene un polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol, y tratamiento que se lleva a cabo simultáneamente con la inmovilización de dicha sustancia o analito o una vez que dicha sustancia o analito ha sido inmovilizado sobre dicha superficie, en que el polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol tiene una fórmula (I) como la siguiente: R1- L1 - (CH2CH2O)n- L2 - X (I) en la que R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, formilo que puede estar protegido, amino que puede estar protegido, carboxilo que puede estar protegido, hidroxilo que puede estar protegido o vinilsulfonilo; L1 y L2 representan independientemente un enlace de valencia o un conector; X representa una parte funcional para formar un enlace covalente o un enlace por medio de interacción física mediante el cual se inmoviliza dicha molécula de polímero sobre la superficie de partículas porosas finas; y n representa un número entero de 2 a 20.000, en que X es seleccionado del grupo que consiste en una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo amino sustituido con mono- o di-alquilo inferior; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo mercapto; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo silanol; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo carboxilo; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo sulfo; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo hidroxilo; una porción de cadena principal de un oligoimino o poliimino que tiene una pluralidad de grupos imino (-NH-) en la cadena principal; y una porción de cadena principal de una oligolactida o polilactida.

Description

Superficie de material de base que se inhibe en adsorción no específica.

Campo técnico

Este invento se refiere a la superficie de un sustrato, en particular de un chip biosensor, etc., específicamente a la superficie de un sustrato que ha sido tratada con un polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol, y también a un biosensor que tiene dicha superficie.

Fundamento técnico

El inmunodiagnóstico, los biosensores y similares para detectar una cierta sustancia de entre biomoléculas tales como proteínas y lípidos han sido muy utilizados como medios para la detección o el diagnóstico precoces de enfermedades. Sin embargo, la adsorción inespecífica de biomoléculas coexistentes en la superficie del biosensor, la cual se produce simultáneamente con una reacción específica, interfiere como ruido de fondo para evitar la consecución de una sensibilidad elevada. Además, en el caso de partículas diagnósticas, no sólo el problema del fondo causado por una adsorción inespecífica ha sido un asunto importante, sino también la estabilización de la dispersión en un fluido biológico o un líquido diluido del mismo. Los inventores de este invento hallaron previamente que un sustrato que tiene en su superficie una estructura de tipo cepillo, de un polímero soluble en agua tal como polietilenglicol, no sólo restringe la adsorción inespecífica en la superficie del sensor sino que también mejora la estabilización de nanopartículas en dispersión, y, por lo tanto, han proporcionado materiales como una nueva herramienta para el biodiagnóstico. Como ejemplos concretos de dichos inventos, se pueden mencionar una superficie con una estructura de poli(óxido de etileno) de tipo cepillo que tiene una densidad aumentada (por ejemplo, documento WO 03/076933 A1), una superficie de biosensor que lleva un derivado de polímero que contiene un segmento de polietilenglicol (por ejemplo, la Publicación KOKAI de Patente Japonesa nº 2003-149245), y partículas finas semiconductoras y partículas finas metálicas funcionales estabilizadas en dispersión (por ejemplo, la Publicación KOKAI de Patente Japonesa nº 2002-080903).

En los inventos anteriormente mencionados, se enlazan biomoléculas tales como anticuerpos a la punta de una estructura de tipo cepillo para que sirvan como un sistema para detectar, con una sensibilidad elevada, una reacción específica tal como el reconocimiento de un antígeno. Sin embargo, la superficie del cepillo es muy propensa a evitar la adsorción de una proteína o similar, y, también por algunas otras razones, a veces es difícil aumentar la cantidad de proteína, tal como un anticuerpo, soportada por la punta del cepillo, lo que ha sido un obstáculo para la consecución de una sensibilidad elevada. En otro método, una vez que se ha enlazado un anticuerpo o un antígeno a la superficie de una fase sólida, se adhiere un polímero originado a partir de (met)acrilato de glicosiletilo a sitios superfluos, ligantes de proteínas, presentes en la superficie de la fase sólida con objeto de evitar la adsorción inespecífica de impurezas proteínicas o similares que puedan estar contenidas en la muestra para ensayo (Publicación KOKAI de Patente Japonesa nº Hei 10-123135). También se ha propuesto otro método en el que la superficie de una fase sólida que se utiliza para una reacción inmune es protegida con un polímero originado a partir de (met)acrilato, que tiene una cadena de polietilenglicol en lugar del glicosiletilo anteriormente mencionado (Publicación KOKAI de Patente Japonesa nº Hei 11-287802).

Sin embargo, a veces estos polímeros pueden ser insuficientes en cuanto a su capacidad de enlace o inmovilización sobre la superficie de la fase sólida en la que es necesario restringir la adsorción inespecífica de proteínas o similares. En cualquier caso, cuando se potencia la capacidad de inmovilización, la capacidad de enlace específica del anticuerpo al antígeno en la reacción inmune puede resultar negativamente afectada. En otro método propuesto, se utiliza la afinidad de una pareja de enlace bioespecífica, tal como, por ejemplo, la afinidad entre estreptavidina y biotina. De forma detallada, se enlaza un anticuerpo biotinado a una fase sólida a la que se ha fijado previamente estreptavidina, y dicha fase sólida se reviste de este modo con polietilenglicol biotinado (Publicación KOKAI de Patente Japonesa nº Hei 11-211727). Sin embargo, cuando se va a emplear este método, uno de los miembros ligantes de la pareja de enlace bioespecífica ha de ser previamente inmovilizado en la superficie de la fase sólida.

Lu et al. [Langmuir, Volumen 16, páginas 1711-1718 (2000)] han descrito la fijación de películas de polietilenglicol funcionalizado a superficies de oro y, en particular, la fijación de moléculas de polietilenglicol (PEG) lineales (peso molecular = 2000-5000) a superficies de oro por medio de grupos terminales de disulfuro de ortopiridilo (OPSS), y el estudio de las mismas con espectroscopía fotoelectrónica de rayos X y otras técnicas. Las moléculas examinadas incluían una molécula de PEG terminada con un grupo metoxilo y derivatizada con un grupo OPSS en el otro extremo (M-PEG-OPSS), una molécula de PEG derivatizada con OPSS en ambos extremos [PEG-(OPSS)_{2}], y un PEG derivatizado con un grupo N-hidroxisuccinimida en un extremo y un grupo OPSS en el otro extremo (NHS-PEG-OPSS). De acuerdo con los autores, para aplicaciones con biosensores, se pueden usar los grupos OPSS o NHS libres de las películas de NHS-PEG-OPSS para inmovilizar biomoléculas con cisteínas o lisinas accesibles por medio de la formación de enlaces disulfuro o enlaces amida, respectivamente. Además, las películas de PEG formadas por M-PEG-OPSS y PEG-(OPSS)_{2} resisten la adsorción de albúmina. Sin embargo, de acuerdo con este documento, las biomoléculas se enlazan a una capa de PEG una vez que se ha formado esta capa de PEG sobre una superficie de oro. De esta manera, es necesario formar primero la capa de PEG, lo que es un inconveniente. Además, en ciertos casos es difícil incrementar la cantidad de proteína porque la superficie de PEG inhibe eficazmente su adsorción.

Peracchia et al. [Pharmaceutical Research, Volumen 15, páginas 550-556 (1998)] describen nanopartículas PEGiladas (tratadas con PEG) a partir de un nuevo copolímero anfipático de cianoacrilato de metoxipolietilenglicol-cianoacrilato de hexadecilo. Estas partículas se forman por nanoprecipitación o por emulsión/evaporación del disolvente. De este modo, este documento se refiere a polímeros injertados que tienen cadenas laterales de PEG. El polímero se enlaza al sustrato mediante enlace hidrófobo. Este polímero es a veces insuficiente en cuanto a su capacidad de enlace o inmovilización sobre superficies de fases sólidas en las que es necesario restringir la adsorción inespecífica de proteínas o similares. En otros casos, cuando se potencia la capacidad de inmovilización, la capacidad de enlace específica del anticuerpo al antígeno puede resultar negativamente afectada.

En la Patente de EE.UU. nº 5.919.712 se describen métodos y un aparato para fluoroinmunoensayos por luz evanescente. Un biosensor preferido descrito en este documento tiene piezas de moléculas de captura, cada una de las cuales es específica para un analito diferente, dispuestas adyacentemente dentro de un único depósito. Las moléculas de captura son inmovilizadas en las piezas mediante la copulación, específica del sitio, de grupos tiol de las moléculas de captura con agentes reticulantes por fotoafinidad. En este documento se describe una modificación superficial con el uso de PEG terminado con un grupo amino. Biomoléculas tales como anticuerpos se enlazan a la punta de un "cepillo" construido a partir de ellas. El sistema resultante se utiliza para detectar, con una sensibilidad elevada, reacciones específicas tales como el reconocimiento de un antígeno. Por lo tanto, es necesario construir la superficie de antemano, lo que es un inconveniente. Además, en ciertos casos, es difícil incrementar la cantidad de proteína, tal como un anticuerpo, soportada por la punta del "cepillo" porque la superficie de la misma inhibe la adsorción de proteínas y similares, lo que puede evitar la consecución de una sensibilidad elevada.

Descripción del invento

Los inventores de este invento realizaron investigaciones con el fin de obtener una superficie más estable que las de los métodos convencionales anteriormente mencionados, que fuera capaz de inhibir la adsorción inespecífica y que se preparara fácilmente. Como resultado, hallaron inesperadamente que, sobre la superficie de la fase sólida [por ejemplo, la superficie originada en oro, poliestireno o poli(fluoruro de vinilideno)] utilizada en la práctica para un inmunoensayo en que se inmoviliza un anticuerpo, un antígeno o similar, se puede inmovilizar un cepillo de cadena de PEG sin medios enlazantes especiales y sin efectos secundarios producidos sobre la capacidad de unión específica del antígeno o el anticuerpo. Además, a la vista del hecho de que la capacidad de reconocimiento del anticuerpo o similar depende de la longitud de la cadena de PEG, los inventores tomaron en consideración el diseño para la optimización de dicha longitud de cadena y, de esta manera, han hallado un método para llevar a cabo un reconocimiento molecular específico con elevada sensibilidad.

De este modo, este invento proporciona una superficie de sustrato sobre la cual se inmoviliza una sustancia para detectar un analito o el analito per se, superficie que se forma mediante el tratamiento de la superficie de sustrato con un líquido que contiene un polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol, y tratamiento que se lleva a cabo simultáneamente con la inmovilización de dicha sustancia o analito o una vez que dicha sustancia o analito ha sido inmovilizado sobre dicha superficie,

en donde el anteriormente mencionado polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol se representa mediante la fórmula (I) que viene a continuación:

(I)R^{1}-L_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-L_{2}-X

en la que R^{1} representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, formilo que puede estar protegido, amino que puede estar protegido, carboxilo que puede estar protegido, hidroxilo que puede estar protegido o vinilsulfonilo;

L_{1} y L_{2} representan independientemente un enlace de valencia o un conector;

X representa un grupo funcional o una parte funcional para formar un enlace covalente o un enlace por medio de interacción física mediante el cual se inmoviliza dicha molécula de polímero sobre la superficie de partículas porosas finas; y

n representa un número entero de 2 a 20.000,

en donde X es seleccionado del grupo que consiste en una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo amino sustituido con mono- o di-alquilo inferior; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo mercapto; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo silanol; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo carboxilo; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo sulfo; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo hidroxilo; una porción de cadena principal de un oligoimino o poliimino que tiene una pluralidad de grupos imino (-NH-) en la cadena principal; y una porción de cadena principal de una oligolactida o polilactida.

\newpage

Como otra realización, este invento proporciona un método para producir una superficie de sustrato, que comprende (A) preparar una superficie de sustrato y (B) poner, ya sea simultánea o sucesivamente, tanto una disolución acuosa de una sustancia para detectar analitos que ha sido modificada para que sea inmovilizable sobre dicha superficie de sustrato, como un líquido que contiene el polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol como el anteriormente definido, en contacto con dicha superficie de sustrato bajo unas condiciones bajo las cuales tanto dicha sustancia como dicho polímero no reticulado resultan completamente inmovilizables sobre dicha superficie de sustrato de (A).

Como otra realización, este invento proporciona un biosensor que está provisto de la superficie de sustrato anteriormente mencionada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que muestra tanto la capacidad bloqueante de una superficie sobre la cual se había inmovilizado IgG humana, como los resultados de la detección del anticuerpo anti-IgG humana.

La Figura 2 muestra el cambio de absorbancia antes y después de la adición de BSA biotinada a un coloide de oro (GC; del inglés, gold colloid) PEGilado con estreptavidina inmovilizada.

La Figura 3 es un gráfico que muestra el cambio en los gramos de sensor cuando disoluciones coloidales de oro PEGilado que soporta estreptavidina y que soporta BSA se pusieron en contacto con un sensor de resonancia de plasmón superficial (SPR; del inglés, surface plasmon resonance) que tenía una superficie de cepillo de biotina-PEG.

La Figura 4 es un gráfico que muestra el cambio en los gramos de sensor cuando una disolución coloidal de oro PEGilado que soporta un anticuerpo anti-biotina se puso en contacto con un sensor de SPR que tenía una superficie de cepillo de biotina-PEG.

La Figura 5 es un gráfico que muestra la relación entre el estado del tratamiento superficial de un látex magnético con acetal-PEG/PAMA, y el potencial zeta.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la dependencia, con respecto a los tiempos de lavado, de la cantidad de albúmina sérica bovina (BSA; del inglés, bovine serum albumin) adsorbida por látex magnético cuya superficie había sido tratada o no había sido tratada con acetal-PEG/PAMA.

La Figura 7 muestra una comparación de la capacidad de detección de anti-IgG de cabra cuando Dynabeads que soportan anticuerpo IgG de cabra fueron revestidos con un polímero de bloques. Cinco datos del lado izquierdo muestran la capacidad de detección de partículas, y cinco datos del lado derecho muestran la adsorción inespecífica por partículas que no soportan anticuerpo en su superficie.

La Figura 8 es un gráfico que muestra la relación señal/ruido (S/N; del inglés, signal/noise) obtenida de la Figura 6. PEHA-Ph-PEG-OH presenta la mejor capacidad bloqueante.

La Figura 9 es un gráfico que muestra el resultado del tratamiento superficial de partículas magnéticas JSR que soportan anticuerpo, con PEHA-Ph-PEG-OH. Se ve que la adsorción inespecífica resulta acusadamente inhibida.

La Figura 10 es un gráfico que muestra el resultado del tratamiento superficial de partículas magnéticas JSR que soportan anticuerpo, con PEHA-Ph-PEG-OH. Se ve que la capacidad de detección de antígenos era bastante elevada.

La Figura 11 es un gráfico que muestra el resultado del tratamiento superficial de partículas magnéticas Dynabeads que soportan anticuerpo, con PEHA-Ph-PEG-OH. Se ve que la capacidad de detección de antígenos era bastante elevada.

La Figura 12 es un gráfico que muestra el resultado del tratamiento superficial de partículas magnéticas Dynabeads que soportan anticuerpo, con PEHA-Ph-PEG-OH. Se ve que la adsorción inespecífica resulta inhibida por el tratamiento superficial.

La Figura 13 muestra el resultado del tratamiento superficial de partículas magnéticas Dynabeads que soportan anticuerpo, con PEHA-Ph-PEG-OH, y la relación S/N.

La Figura 14 son fotografías, en lugar de dibujos, que muestran si una proteína fluorescentemente marcada era inespecíficamente adsorbida por una membrana de PVDF para transferencia Western o no lo era.

La Figura 15 es un gráfico que muestra la comparación del potencial superficial de una superficie de vidrio tratada con acetal-PEG-b-PAMA.

La Figura 16 es una fotografía, en lugar de un dibujo, que muestra el resultado de una transferencia Western llevada a cabo de acuerdo con el Ejemplo 16.

La Figura 17 muestra una comparación del potencial superficial entre una superficie de silicona que había sido tratada con copolímero injertado de poli(metacrilato de trimetoxisililpropilo)-PEG (PTSPM-g-PEG-_{1100}) y una superficie de silicona no tratada.

La Figura 18 muestra el resultado de una comparación entre el potencial superficial de una silicona que había sido formada a partir de un molde de vidrio cuya superficie limpiada había sido revestida con copolímero injertado de poli(metacrilato de trimetoxisililpropilo)-PEG (PTSPM-g-PEG-_{1100}) y que por ello había sido simultáneamente tratada, el potencial superficial de una superficie de silicona no tratada y el potencial superficial de una superficie tratada con un homopolímero de polietilenglicol.

La Figura 19 es un gráfico que muestra el resultado de una comparación de las adsorbencias de una superficie de silicona superficialmente tratada y de una superficie no tratada, en cuanto a IgG humana fluorescentemente marcada.

La Figura 20 es un gráfico que muestra el resultado de una comparación de las adsorbencias de una superficie de silicona superficialmente tratada y de una superficie no tratada, en cuanto a albúmina sérica bovina fluorescentemente marcada.

Mejor modo de llevar el invento a cabo

Los ejemplos de una sustancia para detectar un analito o del analito per se, como se hace referencia en este invento, incluyen parejas de enlace bioespecíficas tales como un antígeno o hapteno y un anticuerpo; un oligonucleótido y un ácido nucleico que se hibrida con él bajo condiciones rigurosas; una enzima, su azúcar sustrato y una lectina; una hormona y su receptor proteico; y avidina (incluyendo estreptavidina) y biotina (incluyendo destiobiotina, iminobiotina y aminobiotina). Por lo tanto, un miembro ligante de una pareja de enlace específica significa uno de los elementos para formar las parejas de enlace anteriormente mencionadas.

La superficie de sustrato sobre la cual se ha inmovilizado una sustancia (que puede incluir un analito) tal como la anteriormente mencionada es una superficie, en una fase sólida, de un chip o biosensor de bioensayos con que detectar dicha sustancia. Para dicha superficie es utilizable cualquier material con tal de que sirva para alcanzar los objetivos de este invento. Los ejemplos preferibles de superficie de sustrato incluyen la superficie de un sensor electroquímico (hecha, por ejemplo, de un metal precioso, un óxido metálico, etc.), la superficie de un sensor de resonancia de plasmón superficial (SPR) (hecha, por ejemplo, de un metal precioso), la superficie de un sensor de cuarzo, la superficie de una microplaca (hecha, por ejemplo, de poliestireno, polipropileno o politetrafluorotileno) para un inmunoensayo con enzimas ligadas en fase sólida (ELISA), una superficie de plástico [hecha, por ejemplo, de derivados de celulosa tales como nitrocelulosa, poli(fluoruro de vinilideno) o nailon], para transferencia de proteínas o transferencia de ácido nucleico, una superficie de microrred (hecha, por ejemplo, de vidrio o plástico) para la hibridación de ácido nucleico, una superficie hecha de vidrio y una hecha de silicona (por ejemplo, tratada con polidimetil-siloxano), que se emplean habitualmente en este campo. Los ejemplos preferibles del caso en que el sustrato y la superficie del sustrato llegan a ser uno incluyen la superficie de una partícula de oro, la superficie de una partícula semiconductora, la superficie de una partícula magnética, la superficie de una partícula de sílice, la superficie de una partícula porosa fina y la superficie de una partícula de látex que contiene una de las partículas anteriormente mencionadas.

Un miembro ligante o el otro de una pareja de enlace específica que ha sido "así modificado para que resulte inmovilizable sobre dicha superficie de sustrato" significa, cuando la superficie de sustrato es una membrana depositada sobre oro, un miembro en cuyo extremo se ha introducido un grupo mercapto de una manera bien conocida en este campo técnico.

La superficie de sustrato de este invento se produce al tratar una superficie de sustrato con un líquido que contiene un polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol, ya sea simultáneamente con la inmovilización sobre la superficie, o ya sea después de la inmovilización sobre la superficie, de una sustancia para detectar un analito o el analito per se (por ejemplo, un miembro ligante de una pareja de enlace específica) que se ha modificado para que resulte inmovilizable sobre dicha superficie de sustrato. Preferiblemente, la superficie de sustrato sobre la que se ha inmovilizado previamente una sustancia para detectar un analito o el analito per se es tratada con un líquido que contiene un polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol. En este invento, dicha superficie de sustrato sobre la que se ha inmovilizado previamente una sustancia para detectar un analito o el analito per se incluye todas las superficies que han sido utilizadas o sugeridas para uso en este campo técnico, tales como las que se citaron anteriormente.

El polímero que se utiliza eficazmente para el tratamiento superficial anteriormente explicado se representa mediante la fórmula (I).

En una realización, X representa una porción de cadena principal de un oligoimino o poliimino que tiene una pluralidad de grupos imino (-NH-) en la cadena principal, que tiene una fórmula como la siguiente:

-(CH_{2}CH_{2}NH)_{m}-R^{2}

\newpage

en la que R^{2} representa un átomo de hidrógeno o un alquilo inferior (por ejemplo, un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene de uno a seis átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-hexilo, etc., que se aplica a lo siguiente), y m representa un número entero de 1 a 2000.

En otra realización, X representa una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo amino sustituido con mono- o di-alquilo inferior, con una fórmula como la siguiente:

1

en la que cada uno de R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, l representa un número entero de 1 a 2000, L_{3} es seleccionado del grupo que consiste en:

2

-CONR^{7}(CH_{2})_{p}- en donde p representa un número entero de 1 a 10, y R^{7} representa un alquilo inferior que puede tener un heteroátomo. Los polímeros que tienen un X como el anteriormente explicado se producen mediante un método como el mencionado por Y. Nagasaki et al., Macromol. Chem. Rapid Commun. 1997, 18, 972, o en la Solicitud de Patente Japonesa nº 2003-49000.

En otra realización, X representa una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo silanol, con una fórmula como la siguiente:

3

en la que R^{3}, R^{4} y L_{3} significan lo mismo que se definió anteriormente, y R^{8} significa un alquilo inferior, en particular metilo, o un átomo de hidrógeno. Los polímeros que tienen un X como el anteriormente definido se producen a partir de un trialcoxisililo, según se prepara mediante el método de los anteriormente mencionados Y. Nagasaki et al. o de la Patente de EE.UU. 5.929.177, o a partir de la hidrólisis de dicho trialcoxisililo cuando es necesario.

En otra realización, X representa una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo carboxilo, representado por una fórmula como la siguiente:

4

en la que R^{3}, R^{4} y l significan lo mismo que se definió anteriormente.

En otra realización, X representa una porción de cadena principal de una oligolactida o polilactida representada por una fórmula como la siguiente:

5

en la que q representa un número entero de 2 a 10.000.

\newpage

Los polímeros que tienen un X como el anteriormente explicado se mencionan, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nº 5.925.730. Se pueden producir otros polímeros de acuerdo con procedimientos de producción de polímeros que tienen diversas clases de X, o mediante la modificación de los procedimientos.

Cuando, en la fórmula (I), L_{1} representa un conector, los ejemplos típicos del mismo incluyen, aunque de forma no restrictiva, grupos conectores como los siguientes:

6

en donde p, q y r representan independientemente un número entero de 0 a 8. Estos conectores se incorporan estructuralmente, en una dirección como la mencionada, a la porción de L_{1} en la fórmula (I) anteriormente mencionada.

Cuando L_{2} representa un conector, los ejemplos típicos del mismo incluyen, aunque de forma no restrictiva, grupos conectores como los siguientes:

7

en donde cada uno de k y l representa un número entero de 1 a 6. Estos conectores se incorporan estructuralmente, en una dirección como la mencionada, a la porción de L_{2} en la fórmula (I) anteriormente mencionada.

En la definición de R^{1} anteriormente mencionada, el formilo que puede estar protegido tiene una fórmula como la siguiente:

8

en la que R_{a} y R_{b}, considerados separadamente, significan alquilo inferior y, considerados conjuntamente, significan etileno sustituido con metilo; o R_{a}-O y R_{b}-O, considerados conjuntamente, significan O= (en cuyo caso, se muestra el formilo OCH- per se). El amino que puede estar protegido, el carboxilo que puede estar protegido y el hidroxilo que puede estar protegido significan o bien grupos que están protegidos por grupos protectores conocidos en el campo de la síntesis peptídica o similar, o bien grupos no protegidos. Además, el grupo amino protegido incluye maleimida, y el grupo protector para el hidroxilo incluye el grupo p-toluenosulfonilo.

La superficie de sustrato del presente invento se prepara mediante un procedimiento que comprende preparar una superficie de sustrato y poner tanto una disolución acuosa (que incluye una disolución acuosa tamponada con PBS o similar) de la anteriormente mencionada sustancia para detectar un analito o del analito per se modificado, como el anteriormente mencionado líquido (un disolvente orgánico miscible con agua, tal como metanol, etanol, tetrahidrofurano, dimetilformamida o dimetilsulfóxido, y una disolución acuosa que puede estar tamponada con PBS o similar) que contiene un polímero, simultáneamente en contacto con dicha superficie de sustrato bajo unas condiciones suficientes bajo las cuales tanto dicha sustancia como dicho polímero resultan completamente inmovilizables sobre dicha superficie de sustrato. En cuanto a dichas condiciones suficientes, se puede mencionar una incubación durante un tiempo que varía de varias a muchas horas a una temperatura que varía de 5ºC a una temperatura a la cual no se desnaturaliza la sustancia anteriormente mencionada, tal como, por ejemplo, 55ºC, aunque estas condiciones pueden variar dependiendo de las propiedades del polímero y de la superficie de sustrato utilizados. Una superficie de sustrato sobre la que se ha inmovilizado previamente la sustancia anteriormente mencionada es también tratada con polímero bajo unas condiciones casi iguales a las anteriores. De esta manera, se proporciona la superficie de sustrato del presente invento. El polímero anteriormente mencionado se utiliza habitualmente en una relación de 10^{-6} a 10^{3} mg/cm^{2}, preferiblemente de 10^{-4} a 10^{2} mg/cm^{2}, más deseablemente de 10^{-3} a 10 mg/cm^{2}, con respecto al área de la superficie de sustrato.

A continuación se explica este invento con más detalle mediante los ejemplos de trabajo.

Ejemplo de Referencia 1

Producción de acetal-PEG-OH

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En un matraz con forma de huevo y bajo una atmósfera de argón a temperatura ambiental, se añadieron 1,0 milimoles del acetal dimetílico del 4-hidroximetilbenzaldehído (1,822 moles/l - disolución en THF, 0,55 ml) como iniciador a 25 ml de tetrahidrofurano (THF) como disolvente con una microjeringa y luego se añadieron 1,0 milimoles de K-naftaleno (0,328 moles/l - disolución en THF, 3,05 ml), y, de esta manera, se llevó a cabo la metalización durante 10 minutos. Luego se añadieron 140 milimoles de óxido de etileno (6,9 ml) y se agitó la mezcla resultante durante dos días bajo enfriamiento con agua, y, de esta manera, se llevó a cabo una polimerización aniónica con apertura de anillo. Posteriormente se añadieron varias gotas de agua pura para detener la reacción y luego se llevó a cabo una purificación mediante precipitación con éter dietílico (2 l), extracción con cloroformo (tres veces frente a agua salina saturada), secado bajo presión reducida y liofilización en benceno. El rendimiento del producto así obtenido fue 4,5 g (90%).

De acuerdo con una medición mediante cromatografía de filtración en gel, el polímero obtenido era monomodal y tenía un peso molecular medio numérico de 6067, el cual casi coincidía con el peso molecular teórico de 6000.

Además, una medición mediante espectrometría de masas con ionización-desorción por laser asistida por matriz, acoplada a un analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS; del inglés, matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry), enseñó que el polímero obtenido era monomodal y tenía un peso molecular medio numérico de 6050. Además, como resultado de la comparación entre el valor medido y el valor calculado de los picos, se confirmó que este polímero era poli(óxido de etileno) heterotelequélico que tenía un esqueleto de óxido de etileno en su cadena principal, tenía un grupo acetal en el extremo \alpha y tenía un grupo hidroxilo en el extremo \omega.

Además, del espectro de resonancia magnética nuclear de protones (^{1}H-NMR; del inglés, ^{1}H-nuclear magnetic resonance) del obtenido polímero en DMSO, se confirmó que este polímero era poli(óxido de etileno) heterotelequélico que tenía un esqueleto de óxido de etileno en su cadena principal, y tenía un grupo acetal en el extremo \alpha y un grupo hidroxilo en el extremo \omega.

Ejemplo de Referencia 2

Producción de benzaldehído-PEG-OH

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En un matraz con forma de huevo, se disolvieron 1,0 g del acetal-PEG-OH obtenido en el Ejemplo anterior en 20 ml de una disolución acuosa de ácido acético al 90% y se agitó la mezcla resultante durante cinco horas. Posteriormente, se ajustó el pH de la mezcla a 8 con el uso de HCl 10 N y luego se dializó la mezcla (corte de pesos moleculares: 3500; se sustituyó el agua después de 1, 2, 4, 6, 8 y 12 horas) frente a agua pura durante un día y se sometió posteriormente a secado bajo presión reducida y a liofilización en benceno, para la recuperación. El rendimiento del producto así recuperado fue 0,88 g (88%).

De acuerdo con la medición por cromatografía de filtración en gel, el polímero obtenido era monomodal y tenía un peso molecular medio numérico de 6056, el cual casi coincidía con el peso molecular teórico de 6054.

Además, la medición mediante MALDI-TOF-MS enseñó que el polímero obtenido era monomodal y tenía un peso molecular medio numérico de 6023. Además, como resultado de la comparación entre el valor medido y el valor calculado de los picos, se confirmó que este polímero era benzaldehído-PEG-OH cuyo grupo acetal del extremo \alpha había sido desprotegido.

En el espectro de resonancia magnética nuclear de protones (^{1}H-NMR) del polímero obtenido, en DMSO, el espectro del protón aldehídico se observó cerca de 10 ppm y, también a partir de este resultado, se confirmó que este polímero se había convertido en un aldehído (grupo formilo), con un grupo acetal desprotegido en el extremo \alpha.

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Ejemplo de Referencia 3

Producción de PEHA-fenil-PEG-OH

11

Se disolvieron 250 mg de benzaldehído-PEG-OH en 5 ml de metanol. Se introdujo PEHA (5 milimoles, 1,2 ml) en un matraz con forma de huevo, en una cantidad molar 100 veces la de PEG, y luego se disolvió dicho PEHA en 20 ml de metanol. Se ajustó el pH de la mezcla resultante a 6 con HCl 5 N bajo enfriamiento con hielo. A esta disolución metanólica de PEHA que estaba siendo enérgicamente agitada, se añadió lentamente, gota a gota, la disolución metanólica de benzaldehído-PEG-OH. Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiental durante cuatro horas y, de esta manera, se formó una base de Schiff. Luego se añadieron 5 milimoles (una cantidad molar 100 veces la de PEG; aproximadamente 300 mg) de NaBH_{3}CN como agente reductor a la disolución de reacción, tres veces en total en un intervalo de 30 minutos, y se agitó la mezcla resultante durante 24 horas. La disolución de reacción así obtenida fue dializada (corte de pesos moleculares: 1000; se sustituyó el agua después de 3, 6, 18, 24, 30, 42 y 48 horas) frente a agua pura durante dos días. Posteriormente, se ajustó apropiadamente la concentración mediante un secado bajo presión reducida y luego se recuperó el producto mediante liofilización en benceno. El rendimiento del producto así obtenido fue 75 mg (30%).

De acuerdo con la medición por cromatografía de filtración en gel, el polímero obtenido era monomodal y tenía un peso molecular medio numérico de 5800, el cual casi coincidía con el peso molecular teórico de 6270.

En el espectro de resonancia magnética nuclear de protones (^{1}H-NMR) del polímero obtenido, en D_{2}O, el espectro del protón aldehídico que se había observado cerca de 10 ppm en el benzaldehído-PEG-OH había desaparecido y, además, se observó cerca de 3,4 ppm un nuevo espectro que parecía haber sido causado por un protón metílico entre la amina y el anillo de benceno. A partir de estos resultados, se confirmó que, como se deseaba, se había sintetizado PEHA-fenil-PEG-OH (o PEHA-Ph-PEG-OH).

Ejemplo de Referencia 4

Preparación de látex que soporta partículas magnéticas

Se introdujeron 4 ml de estireno, 45 ml de agua y 0,024 g de persulfato potásico en un matraz de 200 ml de capacidad y se dejó polimerizar la mezcla resultante durante 28 horas a 70ºC y 350 rps. Mediante TEM y medición de la dispersión lumínica dinámica, se confirmó que el látex así obtenido estaba monodisperso con un tamaño medio de partícula de 1 \mum.

Se mezcló una disolución de este látex en una cantidad de 25 ml con 125 ml de agua en un matraz de 300 ml de capacidad. Una vez que se hubo ajustado el pH a 1,7 con ácido clorhídrico, se añadieron FeCl_{3} (0,405 g) y FeSO_{4} (0,25 g) y, con agitación enérgica, se ajustó el pH de la mezcla resultante a 9 con agua amoniacal. El látex ferricoloidal así obtenido era fácilmente atraído por un imán, y, de este modo, se confirmó que se había formado ferrita sobre la superficie del látex.

Ejemplo de Referencia 5

Preparación de la superficie de un chip de oro

Un chip de oro que había sido lavado con ozono fue sumergido en acetal-PEG-SH (Mn = 5000) que había sido disuelto en tampón de fosfato sódico 50 mM (pH de 7,4, NaCl 1 M) de modo que la concentración pudiera ser 1 mg/ml, y fue luego sacudido durante 30 minutos a temperatura ambiental. El chip fue lavado una vez con tampón de fosfato sódico 50 mM (pH de 7,4, NaCl 1 M) y fue luego sumergido en hidróxido sódico 50 mM durante 30 segundos y fue de nuevo lavado tres veces con tampón de fosfato sódico 50 mM (pH de 7,4, NaCl 1 M). Esta operación se repitió dos veces. Además, el chip fue sumergido en MeO-PEG-SH (Mn = 2000) que había sido disuelto en tampón de fosfato sódico 50 mM (pH de 7,4, NaCl 1 M) de modo que la concentración pudiera ser 1 mg/ml, y fue luego sacudido durante 30 minutos a temperatura ambiental. El chip fue lavado una vez con tampón de fosfato sódico 50 mM (pH de 7,4, NaCl 1 M) y fue luego sumergido en hidróxido sódico 50 mM durante 30 segundos, y, posteriormente, la superficie del chip de oro fue de nuevo lavada tres veces con tampón de fosfato sódico 50 mM (pH de 7,4, NaCl 1 M).

Esta operación se repitió dos veces y, de esta manera, la superficie del chip de oro resultó modificada con PEG (preparación de un cepillo mixto). A continuación, el chip de oro modificado con PEG fue sumergido en ácido clorhídrico (0,1 moles/l) y fue luego sacudido suavemente durante tres horas a temperatura ambiental, y, de este modo, el grupo acetal del extremo del PEG resultó convertido en un grupo aldehído. A continuación, el chip de oro fue sumergido en biocitina-hidrazida (EZ-Link®, PIERCE) que había sido disuelta en tampón de fosfato sódico 100 mM (pH de 5,5, NaCl 1 M) de modo que la concentración pudiera ser 1 mg/ml, y fue luego sacudido durante tres horas a temperatura ambiental, y, de esta manera, se introdujo biotina en la superficie del chip de oro.

Ejemplo 1 Preparación de una superficie sobre la superficie de oro

Un sustrato de oro (fabricado por Nippon Laser Electronics LAB) que había sido lavado con ozono fue sumergido en ácido 4,4'-ditiodibutírico 1 mM (disolvente: etanol) durante al menos 12 horas en una placa de Petri a temperatura ambiental y fue luego lavado con etanol. A la placa de Petri se añadió una disolución mixta de 25 mg de EDC [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida] que habían sido disueltos en 1 ml de agua destilada, y 15 mg de NHS (N-hidroxisuccinimida) que habían sido disueltos en 9 ml de dioxano. El sustrato que había sido lavado fue sumergido en la disolución mixta y fue luego suavemente sacudido durante 30 minutos, y, de esta manera, resultó activado.

Se dispuso el sustrato así activado en un sensor de resonancia de plasmón superficial [SPR (del inglés, surface plasmon resonace), fabricado por Nippon Laser Electronics LAB] y luego se inmovilizó IgG humana 1 \muM sobre la capa superficial bajo unas condiciones de 25ºC, 5 \mul/min, 60 \mul. A la superficie así preparada con IgG inmovilizada se inyectaron dos veces etanolamina (pH de 8,6) y 1 mg/ml de acetal-polietilenglicol-b-poli(metacrilato de 2-N,N-dimetilaminoetilo) [al que en adelante se hace referencia como acetal-PEG/PAMA; la longitud de la cadena de PEG y la longitud de la cadena de PAMA eran 5660 y 2780, respectivamente; en adelante abreviadas como (5660/2780)] bajo unas condiciones de 25ºC, 5 \mul/min, 60 \mul. Se midieron la adsorbencia inespecífica y la adsorbencia específica de la superficie así obtenida con SPR. Como se muestra en la Figura 1, la adsorbencia inespecífica para lisozima de la superficie que había sido bloqueada con etanolamina fue 4 x 10^{-2} (º), mientras que la superficie que había sido bloqueada con acetal-PEG/PAMA (5660/2780) inhibía casi completamente la adsorción inespecífica. También se confirmó que el anticuerpo anti-IgG humana que había sido puesto en contacto resultaba eficazmente detectado.

Ejemplo de Referencia 6

Método para preparar BSA marcada con biotina

A 5 mg de BSA (Fracción V de Cohn, WAKO) que habían sido disueltos en 1 ml de tampón de ácido carbónico 50 mM (pH de 9,6) se añadieron 21 \mul de biotina-(AC_{5})_{2}-OSu (DOJINDO) que habían sido disueltos en DMSO de modo que la concentración pudiera ser 20 mg/ml, y, de esta manera, se hizo que la mezcla resultante reaccionara durante dos horas a temperatura ambiental. Se filtró la mezcla por gel, y se eliminó por ello la biotina-(AC_{5})_{2}-OSu sin reaccionar, y se sustituyó además el tampón por un tampón de fosfato sódico 20 mM (pH de 7,5, NaCl 0,15 M, EDTA 1 mM). La cantidad de la BSA marcada con biotina así obtenida fue determinada mediante el método HABA. Se confirmó que se habían introducido aproximadamente cinco moléculas de biotina por molécula de BSA.

Ejemplo 2 Preparación de partículas coloidales de estreptavidina-oro, y estabilización con acetal-PEG-PAMA (4500/3200) [a las que se hace referencia como SAGCPEG/PAMA (4500/3200)]

A una disolución coloidal de oro (PolyScience; tamaño medio de partícula: 40 nm; concentración: 0,01%) se añadió una disolución acuosa de estreptavidina (ImmunoPure) en una cantidad 10^{3} veces la de la disolución coloidal de oro, y se incubó la mezcla resultante a temperatura ambiental durante una hora, y, de esta manera, la estreptavidina quedó adsorbida en la superficie de las partículas de oro. Luego se añadió una disolución acuosa de acetal-PEG-PAMA (4500/3200) de modo que la relación molar de las partículas de oro al polímero pudiera ser 1:1 x 10^{6}, y se hizo que la mezcla resultante reaccionara a 4ºC durante la noche. Más adelante, se repitió tres veces una operación de centrifugación (4ºC, 4000 x g, 30 minutos) para recuperar el residuo precipitado y, de esta manera, se eliminaron la estreptavidina y el polímero superfluos.

Se confirmó mediante espectrometría UV-Vis que las así obtenidas partículas coloidales de oro modificadas con PEG mostraban una buena capacidad de redispersión después de la purificación por centrifugación, y existían establemente en tampón de fosfato sódico 10 mM (pH de 7,4, NaCl 0,15 M).

La capacidad de reconocimiento del coloide de oro PEGilado que soporta estreptavidina así obtenido fue examinada mediante una prueba de reconocimiento molecular con ensayo de aglutinación. Cuando una BSA con biotina introducida como la preparada en el Ejemplo de Referencia 6 fue añadida a las partículas coloidales de oro-estreptavidina modificadas con PEG, se observó un desplazamiento del pico máximo en el espectro de absorción (800 nm - 400 nm) y, de esta manera, se confirmó la interacción entre la estreptavidina de la superficie del coloide de oro y la biotina (Figura 2).

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Ejemplo 3

(Sólo para referencia y comparación)

Preparación de partículas coloidales de oro que soportan estreptavidina, y estabilización con acetal-PEG-SH (Mn = 10.000, 5000) [a las que se hace referencia como SAGCPEG/SH (10.000) y SAGCPEG/SH (5000)]

Se preparó un coloide de oro PEGilado que soportaba estreptavidina de una manera exactamente igual que en el Ejemplo 2 salvo por que se sustituyó el acetal-PEG-PAMA (4500/3200) por MeO-PEG-SH (Mn = 10.000) y MeO-PEG-SH (Mn = 5000). La estabilidad en dispersión del así obtenido coloide de oro PEGilado que soporta estreptavidina era acusadamente elevada como en el Ejemplo 2.

Ejemplo de Referencia 7

Preparación de un coloide de oro PEGilado que soporta albúmina sérica bovina (BSA), y estabilización con acetal-PEG-PAMA (4500/3200) [al que se hace referencia como BSAGCPEG/PAMA (4500/3200)]

Se preparó un coloide de oro PEGilado que soportaba estreptavidina de un modo exactamente igual que en el Ejemplo 2 salvo por que se sustituyó la estreptavidina por BSA. La estabilidad en dispersión del así obtenido coloide de oro PEGilado que soporta BSA era acusadamente elevada como en el Ejemplo 2.

Ejemplo de Referencia 8

Preparación de un coloide de oro PEGilado que soporta albúmina sérica bovina (BSA), y estabilización con acetal-PEG-SH (Mn = 5000) [al que se hace referencia como BSAGCPEG/SH (5000)]

Se preparó un coloide de oro PEGilado que soportaba estreptavidina de un modo exactamente igual que en el Ejemplo 3 salvo por que se sustituyó la estreptavidina por BSA. La estabilidad en dispersión del así obtenido coloide de oro PEGilado que soporta BSA era acusadamente elevada como en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4 Confirmación de la capacidad del coloide de oro PEGilado que soporta estreptavidina y BSA para reconocer moléculas

La capacidad del así obtenido coloide de oro PEGilado que soporta estreptavidina y BSA, estabilizado en dispersión, para reconocer moléculas fue confirmada con SPR (BIAcore 1000). Se hizo que la superficie de oro PEGilado que tenía biotina, que había sido preparada en el Ejemplo de Referencia 5, reaccionara con partículas coloidales de oro modificadas que habían sido disueltas en un tampón de fosfato sódico 50 mM (pH de 7,4, NaCl 0,15 M) que contenía BSA al 1%, a una temperatura de medición de 25ºC y con un caudal de 10 \mul/min, y, de esta manera, se midió el cambio de ángulo mediante el método de la resonancia de plasmón superficial.

En la Figura 3 se muestran los resultados de la SPR. Apenas se reconoció coloide de oro que soportaba BSA en la superficie de SPR biotinada. El coloide de oro PEGilado que soportaba estreptavidina y tenía una cadena de PEG de 10.000 también proporcionó una señal de SPR pequeña. Sin embargo, el coloide de oro que había sido tratado con PEG 5000 y PEG-PAMA (4500/3200) proporcionó una señal muy intensa, y, de esta manera, se confirmó que la estreptavidina soportada por el coloide de oro interaccionaba eficazmente con la biotina presente en la superficie del sensor de SPR.

Ejemplo 5 Preparación de partículas coloidales de oro que soportan un anticuerpo anti-biotina, y estabilización con acetal-PEG-PAMA (5660/2780)

Se preparó un coloide de oro PEGilado que soportaba un anticuerpo anti-biotina de una manera exactamente igual que en el Ejemplo 2 salvo por que se sustituyeron la estreptavidina y el acetal-PEG-PAMA (4500/3200) por un anticuerpo anti-biotina y acetal-PEG-PAMA (5660/2780). Se confirmó que el así obtenido coloide de oro PEGilado que soporta un anticuerpo anti-biotina había sido estabilizado en dispersión.

Ejemplo 6

(Sólo para referencia y comparación)

Preparación de partículas coloidales de oro que soportan un anticuerpo anti-biotina, y estabilización con acetal-PEG-SH (Mn = 10.000, 5000)

Se preparó un coloide de oro PEGilado que soportaba un anticuerpo anti-biotina de una manera exactamente igual que en el Ejemplo 3 salvo por que se sustituyó la estreptavidina por un anticuerpo anti-biotina. Se confirmó que el así obtenido coloide de oro PEGilado que soporta un anticuerpo anti-biotina había sido estabilizado en dispersión.

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Ejemplo 7 Confirmación del reconocimiento molecular del coloide de oro PEGilado que soporta un anticuerpo anti-biotina

La capacidad del así obtenido coloide de oro PEGilado que soporta un anticuerpo anti-biotina, estabilizado en dispersión, para reconocer moléculas fue confirmada con SPR (BIAcore 1000) exactamente del mismo modo que en el Ejemplo 4.

En la Figura 4 se muestran los resultados de la SPR. El coloide de oro que soportaba anticuerpo detectó una señal con sensibilidad elevada también en el caso de ace-PEG-SH (10.000), mientras que el coloide de oro PEGilado (Mn = 10.000) que soportaba estreptavidina fue incapaz de detectar una señal. De esta manera, se proporcionó un coloide de oro que soporta anticuerpo, que presenta una capacidad de reconocimiento específica.

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Ejemplo 8 Bloqueo de PEG en la superficie de partículas magnéticas

Un látex que soportaba ferrita como el preparado en el Ejemplo de Referencia 4 fue superficialmente tratado con acetal-PEG/PAMA. Como se muestra en la Tabla 1, se puso una cierta cantidad de acetal-PEG/PAMA en un tubo de muestras al cual se añadieron 5 ml de tampón de fosfato 10 mM (pH = 7,18), y luego se agitó y disolvió la mezcla resultante. Se añadió el látex magnético a la disolución resultante y se agitó, y posteriormente se sometió la mezcla resultante a una operación de lavado (tampón de fosfato x cuatro veces), y, de esta manera, se eliminó el PEG-b-PAMA no adsorbido. Una vez concluida la operación de lavado, se examinó la estabilidad en dispersión y luego se llevó a cabo una medición del potencial zeta con objeto de confirmar la carga superficial de partículas de ferrita.

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TABLA 1 Condiciones del tratamiento superficial con acetal-PEG/PAMA

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12

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Como se muestra en la Figura 5, el potencial zeta del látex no tratado era -40 mV, un valor negativo. Por otra parte, se confirmó que el potencial superficial del látex revestido de bloques había sido casi completamente blindado y que el revestimiento era perfecto.

El látex magnético revestido con acetal-PEG/PAMA así preparado fue evaluado con respecto a la adsorción inespecífica de proteína. Se trató el látex magnético, en una cantidad de 2,5 mg, con 3,2 mg de acetal-PEG/PAMA bajo unas condiciones iguales a las anteriormente mencionadas. Aparte de eso, se preparó un látex magnético no tratado en una cantidad de 2,5 mg. Cada uno de estos látices magnéticos fue mezclado con 17,8 \mug de una disolución de FITC-BSA que había sido disuelta en 2 ml de tampón de fosfato (pH = 7,1; I = 10 mM). Después de una hora, se separaron las partículas con un imán y se midió, con el uso de un espectrofluorómetro, la intensidad de la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 520 nm, que corresponde a una longitud de onda de excitación de 490 nm, en el sobrenadante, y, de esta manera, se calculó la cantidad de FITC-BSA. En la Figura 6 se muestra la cantidad de FITC-BSA adsorbida por la superficie de las partículas en relación con el número de lavados. El lavado no desprendió proteína de las partículas que no habían sido revestidas con el polímero de bloques, mientras que la proteína se desprendió casi completamente de las partículas revestidas después de cuatro procesos de lavado, y, de esa manera, se confirmó que se inhibía la adsorción inespecífica.

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Ejemplo 9 Método para la preparación de partículas magnéticas que tienen un cepillo de PEG en su superficie (2)

Se llevó a cabo un tratamiento superficial de la misma manera que en el Ejemplo 8 salvo por que el látex magnético, como se preparó en el Ejemplo de Referencia 4, fue sustituido por partículas magnéticas de JSR. Las partículas magnéticas, en una cantidad de 0,5 mg, fueron superficialmente tratadas con acetal-PEG/PAMA en una cantidad igual a la de las partículas magnéticas y luego en una cantidad 10 veces la de las partículas magnéticas. Las partículas así tratadas mostraban una capacidad de dispersión notablemente aumentada en comparación con el látex no tratado. Las partículas no tratadas presentaban una elevada velocidad de sedimentación y, por lo tanto, no se pudo medir el potencial zeta en ellas. Por otra parte, las partículas tratadas con polímero tenían un potencial zeta de -4 mV y +1 mV, y, de esta manera, se confirmó que la superficie había sido blindada.

Ejemplo 10 Método por el cual se preparan partículas magnéticas (Dynabeads) que tienen un grupo tosilo para soportar un anticuerpo, y cuya superficie es después bloqueada con acetal-PEG/poliamina

Se introdujeron 46,9 \mul de una disolución de Dynabeads (cantidad de Dynabeads: 93,75 \mug) en un tampón de Tris 10 mM (disolución de TBS; pH = 8,12; NaCl 0,15 M) y 150 \mul de IgG de cabra (cantidad de anticuerpo: 30 \mug)/disolución de tampón de Tris 10 mM (disolución de TBS; pH = 8,12) y luego se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante 30 minutos a 37ºC. Una vez recuperadas con un imán, las partículas fueron lavadas tres veces con TBS 10 mM (pH = 8,12) con objeto de eliminar la materia sin reaccionar.

Se añadieron 150 \mul de una disolución de agente bloqueante/TB a las partículas magnéticas que soportaban anticuerpo de la manera anteriormente mencionada y luego se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante una hora a temperatura ambiental. Una vez concluida la reacción, las partículas fueron lavadas tres veces con TBS 10 mM (pH = 8,12) con objeto de eliminar la materia sin reaccionar. Una vez concluido el lavado, se añadieron 150 \mul de disolución de anti-IgG de cabra/TB y luego se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante una hora a temperatura ambiental. Una vez concluida la reacción, las partículas fueron lavadas tres veces con TBS 10 mM (pH = 8,12) con objeto de eliminar la materia sin reaccionar. Una vez concluido el lavado, se distribuyeron las partículas en una placa blanca de 96 pocillos y luego se añadieron 100 \mul de 4-MUP (fosfato de 4-metilumbeliferilo; Sigma) como sustrato. Se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante 30 minutos a temperatura ambiental y luego se añadieron 35 \mul de una disolución acuosa 0,5 M de NaOH para detener la reacción. Una vez concluida la reacción, se separaron las partículas con un imán y luego se distribuyó el sobrenadante en una placa negra de 96 pocillos y se midió la intensidad de la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 460 nm, que corresponde a una longitud de onda de excitación de 355 nm, mediante un dispositivo lector de microplacas. De esta manera, se detectó la IgG de cabra que se había enlazado a la superficie de las partículas. Las condiciones de este experimento son como las mostradas en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

13

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En la Figura 7 se muestran los resultados de la evaluación de la capacidad para detectar un antígeno que había sido enlazado a Dynabeads, y en la Figura 8 se muestra la relación S/N de los sistemas. En la Figura 7, las intensidades de la luminiscencia que fue causada por la reacción entre la enzima (ALP) y el sustrato (4-MUP) en el sistema testigo estaban en el orden siguiente: "PEG-b-PAMA + glicocola al 1% en peso" > "PEG-b-PAMA + glicocola al 10% en peso" > "PEHA-Ph-PEG (PB = 1)" > "PEHA-Ph-PEG (PB = 10)" > "BSA". Como se ve en la Figura 8, las relaciones S/N de los sistemas estaban en el orden siguiente: "PEHA-Ph-PEG (PB = 10)" > "BSA" > "PEHA-Ph-PEG (PB = 1)" > "PEG-b-PAMA + glicocola al 10% en peso" > "PEG-b-PAMA + glicocola al 1% en peso". A partir de estos resultados, se supo que el sistema de PEHA-Ph-PEG (PB = 10) era el mejor como agente bloqueante.

Ejemplo 11 Tratamiento superficial con PEHA-fenil-PEG-OH (partículas magnéticas JSR)

Se mezcló PEHA-fenil-PEG-OH, en una concentración de 0, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 y 4,0% en peso, con una disolución de partículas magnéticas JSR [que soportaban anticuerpo de conejo anti-AFP, 7 \mug/mg de glóbulos (0,35 \mug/ensayo), partículas con superficie de ácido carboxílico, partículas magnéticas: 10 mg/ml] en una relación de 1:1. Una vez agitada con formación de remolinos, la mezcla resultante fue hecha girar durante la noche a 4ºC, y, de esta manera, se llevó a cabo el tratamiento superficial. Luego se diluyó la mezcla hasta la concentración de 1/10 con BSA al 1%.

Se añadieron 50 \mul de BSA al 1%/PBS y 50 \mul de disolución de partículas magnéticas a 10 \mul de cada uno de: suero normal de conejo (NRS; del inglés, normal rabbit serum) al 50%/PBS, BSA al 1%/PBS y suero humano normal (NHS; del inglés, normal human serum). Una vez agitada con formación de remolinos, la mezcla resultante fue sacudida durante una hora y, de esta manera, fue dejada reaccionar. Las partículas fueron separadas mediante un imán y fueron luego lavadas dos veces con TBST (tampón de Tris que contenía NaCl 0,15 M y 0,05% de Tween 20). Posteriormente, se añadieron 50 \mul de un anticuerpo monoclonal anti-AFP [se diluyó la disolución madre comercial (Wako 016-14511) hasta la concentración de 1/3000] y se sacudió la mezcla resultante durante una hora, y, de esta manera, se dejó reaccionar. Las partículas fueron luego separadas mediante un imán y fueron lavadas (de la misma manera que antes). Más adelante, se añadió anticuerpo IgG anti-fosfatasa alcalina de ratón [se diluyó la disolución madre del producto de conjugación de anti-fosfatasa alcalina de ratón (cabra) (Sigma A3688) hasta la concentración de 1/5000; BSA al 1%/PBS] y se sacudió la mezcla resultante durante una hora, y, de esta manera, se dejó reaccionar. Después de un lavado, se añadieron 120 \mul de una disolución del sustrato 4-MUP (Sigma) y, después de una agitación, se dejó la mezcla resultante en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiental. Luego se añadieron 40 \mul de NaOH 0,5 N para detener la reacción. Se llevaron 100 \mul de la disolución resultante a una placa (Nunc 437111) y se realizó la medición con un dispositivo lector de placas (Ex/Em = 355/460 nm).

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Como se muestra en la Figura 9, se confirmó que el tratamiento con PEHA-fenil-PEG-OH inhibía la adsorción inespecífica o el enlace inespecífico (NSB; del inglés, non-specific bonding). Además, como se muestra en la Figura 10, se alcanzó una detección con una sensibilidad elevada.

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Ejemplo 12

Antes de que se añadiera el anticuerpo primario del Ejemplo 11, se diluyó AFP [\alpha-fetoproteína; AspenBio Inc. 105S (Lote 990628V1SS) 500 kUI/mg] hasta 5, 100, 500 y 1000 UI/ml con NRS al 50%, BSA al 1%/PBS y NHS, y se añadió cada dilución a las partículas magnéticas. Luego se llevó a cabo la medición, por lo demás de la misma manera que en el Ejemplo 11. Se confirmó que se detectaba AFP a pesar del bloqueo con PEHA-fenil-PEG-OH.

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Ejemplo 13 Bloqueo de Dynabeads (grupo tosilo superficial) con PEHA-fenil-PEG-OH

(1) Se introdujo cierta cantidad de disolución de glóbulos y disolución de antígeno en un tubo y se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante 1,0 horas a temperatura ambiental, y luego se lavaron los glóbulos con TBS.

(2) Se añadió PEHA-fenil-PEG-OH a (1) y se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante 1,0 horas a temperatura ambiental, y luego se lavaron los glóbulos con TBS.

(3) Se distribuyó (2) en una placa de 96 pocillos y luego se añadió la disolución de anticuerpo, y se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante 1,0 horas a temperatura ambiental, y luego se lavaron los glóbulos con TBS (el mismo método que en el Ejemplo 12).

(4) Se añadió el sustrato (4-MUP) a (3) y se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante 0,5 horas a temperatura ambiental, y luego se añadió una disolución acuosa 0,5 M de NaOH para detener la reacción.

(5) Se inmovilizaron los glóbulos con un imán y se distribuyó el sobrenadante en una nueva placa de 96 pocillos. Con el uso de un dispositivo lector de placas, se midió la intensidad de la emisión lumínica a Ex/Em = 355/460 nm, y, de esta manera, se detectó el antígeno.

(6) Aparte de lo anterior, se llevó a cabo el tratamiento de (2) a (5) sin el tratamiento de (1), y, de esta manera, se halló la cantidad de adsorción inespecífica.

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(Tabla pasa a página siguiente)

14

101

La cantidad de anticuerpo detectado se muestra en la Figura 11 y la cantidad de adsorción inespecífica se muestra en la Figura 12. Se confirmó que la sensibilidad de la detección no disminuía ni siquiera cuando se llevaba a cabo el bloqueo con PEHA-fenil-PEG-OH, y que la adsorción inespecífica resultaba notablemente restringida.

En la Figura 13 se muestra la relación S/N. Es más eficaz que el bloqueo de la albúmina.

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Ejemplo 14 Técnica de transferencia Western (1)

Mediante el uso de la técnica de transferencia Western como un sistema de detección de BSA, se realizó una comparación entre los agentes bloqueantes y el polímero del presente invento. La BSA que había sido separada por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE; del inglés, SDS polyacrylamide gel electrophoresis) fue transferida desde el gel a una membrana de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (Immobilon-P fabricado por Nippon Millipore Co.) con una corriente constante de 1 mA por 1 cm^{2} durante dos horas. La comparación relativa a la eficacia como agentes bloqueantes se realizó entre gelatina (reactivo de calidad EIA, fabricado por Bio-Rad Co.), polímero de bloques de acetal-polietilenglicol/poli(metacrilato de dimetilaminoetilo) (acetal-PEG-b-PAMA) y polímero de bloques de metoxi-polietilenglicol/poli(ácido láctico) (se utilizaron dos especies de distinto peso molecular, es decir, metoxi-PEG-PLA5000 y metoxi-PEGPLA500). La operación de bloqueo se llevó a cabo de la manera siguiente: una membrana a la que se había transferido BSA fue sumergida en una disolución de PBS que contenía polímero al 1% y fue suavemente sacudida durante dos horas a temperatura ambiental o durante la noche a 4ºC. La detección se llevó a cabo mediante estreptavidina fluorescentemente marcada y con el uso de un anticuerpo anti-BSA (conejo) como anticuerpo primario, y de un anticuerpo (burro) anti-conejo, marcado con biotina. Los resultados se muestran en la Figura 14, en la que se ve que el polímero del presente invento consiguió un excelente efecto de restricción de la adsorción inespecífica en comparación con la gelatina convencionalmente utilizada.

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Ejemplo 15 Tratamiento de revestimiento de una superficie de vidrio con PEG

Mediante el uso de un agente para tratamientos superficiales del presente invento, se construyó una cadena con injerto de PEG sobre la superficie de un sustrato de vidrio. Para la medición se usaron dos especies de acetal-PEG-b-PAMA [muestra (1): peso molecular del PEG = 4600; peso molecular del PAMA = 3800; (2): peso molecular del PEG = 10.000; peso molecular del PAMA = 3800]. La placa de vidrio (15 x 30 x 1 mm) que se iba a utilizar para la medición del potencial \zeta fue sometida, antes de su uso, a ebullición-lavado durante una hora a 80ºC con la utilización de una disolución "piraña" de ácido sulfúrico concentrado:agua con peróxido de hidrógeno = 1:1. Una vez que la disolución piraña hubo sido sustituida varias veces por agua desionizada, la placa de vidrio fue sometida a una limpieza ultrasónica durante 10 minutos.

Tratamiento (1) de revestimiento (adsorción en un baño de agua caliente y bajo condiciones ácidas; activación de movimiento molecular): en armonía con la intensidad iónica en el momento de la medición del potencial \zeta, y con el fin de acelerar la protonación del PAMA, se preparó una disolución acuosa 7,5 mM de HCl (pH = 2,1) en un tubo de ensayo y, con el uso de 10 ml de esta disolución, se produjo una disolución de acetal-PEG-b-PAMA al 0,5% en peso en un baño de agua caliente a 50ºC y 80ºC. Se sumergió el vidrio en esta disolución de acetal-PEG-b-PAMA durante una hora con la temperatura mantenida y, de esta manera, se trató la superficie de vidrio.

Tratamiento (2) de revestimiento (adsorción en una disolución acuosa con elevada concentración de sal y bajo condiciones ácidas a temperatura ambiental): se prepararon 10 ml de una disolución acuosa 7,5 mM de HCl (pH = 2,1) que contenía NaCl 1 M y se disolvió acetal-PEG-b-PAMA, en una concentración de 1 mg/ml, en la disolución acuosa. Se sumergió el vidrio en la disolución resultante y se dejó en ella en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiental. Luego se lavó el vidrio con una disolución acuosa 7,5 mM de HCl (pH = 2,1) que contenía NaCl 1 M y posteriormente se dejó reposar durante 30 minutos en la disolución acuosa de PEG anteriormente mencionada, y, de esta manera, se trató la superficie de vidrio.

Las muestras así preparadas fueron utilizadas para la evaluación del efecto del tratamiento superficial sobre la restricción del flujo electrosmótico basándose en la dependencia del potencial \zeta con el pH.

Medición del potencial \zeta: la medición fue llevada a cabo mediante el método del láser-Doppler con el uso de un aparato LEZA-600 de Otsuka Electronics Co., Ltd. Para la medición de la dependencia del potencial \zeta con el pH, se elevó el valor del pH desde la zona ácida; es decir, pH de 3, 5, 7, 8, 9 hasta 10. Se realizaron dos o tres mediciones en cada pH y se empleó un valor estable como valor de medición.

Dependencia del potencial \zeta con el pH: en la Figura 15 se muestra una comparación de la dependencia del potencial \zeta con el pH entre la superficie del vidrio no modificado y la superficie del vidrio modificado con PEG que había sido sometido a un tratamiento de adsorción a 25, 50 y 80ºC. El uso de acetal-PEG-b-PAMA proporcionó una superficie en la que el cambio de potencial superficial causado por el pH era pequeño y que apenas era sensible al ambiente externo, en comparación con el vidrio no modificado.

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Ejemplo 16 Técnica de transferencia Western (2)

Mediante el uso de un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina como sistema revelador del color en una técnica de transferencia Western, se realizó una comparación entre el copolímero de bloques del presente invento y agentes bloqueantes convencionalmente utilizados, en relación con el efecto bloqueante en un sistema para detectar \alpha-fetoproteína (a la que más adelante se hace referencia como AFP). Como muestras, se prepararon (1) AFP diluida hasta 8000 UI/ml con suero humano normal que había sido diluido hasta un valor 1/10, y (2) AFP diluida hasta 8000 UI/ml con un extracto celular que tenía una concentración de proteína de 20 \mug/ml. Mediante el uso de estas muestras y de acuerdo con un método como el mencionado en el Ejemplo 14, se realizó una comparación entre albúmina sérica bovina (BSA) y polímero de bloques de metoxi-polietilenglicol/poli(ácido láctico) (PEG-PLA) en cuanto al efecto bloqueante.

Para la detección, se usaron un anticuerpo (conejo) anti-AFP como anticuerpo primario y un anticuerpo (burro) anti-conejo, marcado con fosfatasa alcalina, como anticuerpo secundario, y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitroazul de tetrazolio (BCIP/NBPT) como sustrato.

Los resultados se muestran en la Figura 16, en la que se ve que el agente de tratamiento superficial metoxiPEG-PLA5000 del presente invento consiguió la reducción del fondo a causa de su excelente efecto de restricción de la adsorción inespecífica en comparación con la BSA convencionalmente utilizada.

Los números y abreviaturas de la Figura 16 tienen los significados siguientes:

A: se usó BSA

(1) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/5000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/2500.

(2) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/5000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/5000.

(3) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/5000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/10.000.

(4) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/10.000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/2500.

(5) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/10.000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/5000.

(6) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/10.000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/10.000.

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B: se usó metoxiPEG-PLA5000

(7) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/5000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/2500.

(8) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/5000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/5000.

(9) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/5000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/10.000.

(10) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/10.000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/2500.

(11) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/10.000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/5000.

(12) Anticuerpo primario diluido hasta un valor 1/10.000; anticuerpo secundario diluido hasta un valor 1/10.000.

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Ejemplo 17

(Sólo para referencia y comparación)

Tratamiento superficial de un microcircuito con un copolímero injertado que contiene un segmento de PEG

Se tomó en consideración la modificación de una superficie de un compuesto de silicona con un polímero de injerto de PEG, y la adsorción de proteínas.

Preparación del compuesto de silicona: mediante el uso del kit de elastómero Sylgard 184, fabricado por Dow Corning Co., se preparó una mezcla de elastómero de silicona:agente de curado para elastómero de silicona = 10:1 (en peso), se vertió en un molde hecho de vidrio y se trató durante una hora a 65ºC y después durante una hora a 100ºC para obtener una base de silicona.

La superficie de silicona que había sido preparada mediante el método anteriormente mencionado fue lavada y fue luego dejada reaccionar con copolímero injertado de poli(metacrilato de metoxisililpropilo)-PEG (PTSPM-g-PEG_{1100}) y homopolímero de PEG (PEG_{1100}), con cada uno durante cuatro horas a temperatura ambiental, y, de esta manera, la superficie de silicona resultó modificada con un cepillo de PEG.

Se realizó una comparación relativa al potencial \zeta entre las superficies que habían sido preparadas de la forma anteriormente mencionada. El resultado se muestra en la Figura 17. Como se ve en la Figura 17, la superficie que había sido tratada mediante el método del presente invento sólo mostraba un pequeño cambio de potencial \zeta causado por el pH, era eléctricamente neutra y presentaba una débil interacción iónica.

Ejemplo 18

(Sólo para referencia y comparación)

Método de tratamiento superficial colectivo en el que, cuando se forma polidimetoxisililo (PPMS), se aplica PTSPM-g-PEG o macromonómero de PEG que tiene un grupo vinilo polimerizable a la superficie del molde

Cuando se hizo polimerizar el PDMS que iba a ser la base, la superficie de vidrio fue directamente revestida por rotación con el copolímero injertado que contenía PEG, es decir, con PTSPM-g-PEG_{1100}. El vidrio así revestido fue utilizado como molde, mediante lo cual el PDMS polimerizó y simultáneamente resultó superficialmente tratado con PEG. Luego se llevó a cabo la evaluación mediante el potencial \zeta.

La superficie que había sido tratada de la manera anteriormente mencionada fue evaluada con respecto al potencial \zeta y a la adsorción inespecífica de suero bovino. Los resultados se muestran en la Figura 18. La superficie de silicona no tratada estaba negativamente cargada, mientras que la superficie de silicona tratada con PTSPM-g-PEG_{1100} era casi neutra en un intervalo de pH de 4 a 8, lo que significa que la superficie había sido modificada con un cepillo de PEG.

La adsorción inespecífica de proteína por la superficie tratada fue evaluada mediante el uso de IgG y albúmina fluorescentemente marcadas. Los resultados se muestran en la Figura 19 y la Figura 20. El tratamiento superficial consiguió una acusada reducción de la adsorbencia relativa a ambas proteínas. Además, mientras que la superficie de silicona no tratada mostraba una gran dispersión en la cantidad de adsorción, la superficie tratada restringía la adsorción inespecífica con una buena reproducibilidad.

Aplicabilidad industrial

Este invento proporciona una superficie de sustrato de biosensor en la que está significativamente restringida la adsorción inespecífica de impurezas proteicas, tales como sangre y plasma, que existen en una muestra. Por lo tanto, este invento es utilizable en industrias de fabricación de biosensores y en el campo del diagnóstico clínico en que se utilizan biosensores.

Claims

1. Una superficie de sustrato sobre la cual se inmoviliza una sustancia para detectar un analito o el analito per se, superficie que se forma mediante el tratamiento de la superficie de sustrato con un líquido que contiene un polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol, y tratamiento que se lleva a cabo simultáneamente con la inmovilización de dicha sustancia o analito o una vez que dicha sustancia o analito ha sido inmovilizado sobre dicha superficie,

en que el polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol tiene una fórmula (I) como la siguiente:

(I)R^{1}-L_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-L_{2}-X

X representa una parte funcional para formar un enlace covalente o un enlace por medio de interacción física mediante el cual se inmoviliza dicha molécula de polímero sobre la superficie de partículas porosas finas; y

n representa un número entero de 2 a 20.000,

en que X es seleccionado del grupo que consiste en una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo amino sustituido con mono- o di-alquilo inferior; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo mercapto; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo silanol; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo carboxilo; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo sulfo; una porción de cadena principal de un oligómero o polímero que tiene, en la cadena lateral, un grupo hidroxilo; una porción de cadena principal de un oligoimino o poliimino que tiene una pluralidad de grupos imino (-NH-) en la cadena principal; y una porción de cadena principal de una oligolactida o polilactida.

2. Una superficie de sustrato de la reivindicación 1, en que la sustancia para detectar un analito o el analito per se es un miembro ligante de una pareja de enlace específica.

3. Una superficie de sustrato de la reivindicación 2, en que el miembro ligante de una pareja de enlace específica es seleccionado del grupo que consiste en antígeno, hapteno, anticuerpo, oligonucleótido, enzima, sustrato de enzima, azúcar, lectina, hormona, receptor proteico, avidina y biotina.

4. Una superficie de sustrato de la reivindicación 1, que es seleccionada del grupo que consiste en la superficie de un sensor electroquímico, la superficie de un sensor de resonancia de plasmón superficial, la superficie de un sensor de cuarzo, la superficie de una microplaca para un inmunoensayo con enzimas ligadas en fase sólida (ELISA), la superficie de una película de plástico para transferencia de proteínas o transferencia de ácido nucleico, y la superficie de una microrred para la hibridación de ácido nucleico.

5. Una superficie de la reivindicación 1, en que la superficie de sustrato es seleccionada del grupo que consiste en la superficie de una partícula de oro, la superficie de una nanopartícula semiconductora, la superficie de una partícula magnética, la superficie de una partícula de sílice, la superficie de una partícula porosa fina, y la superficie de una partícula de látex que contiene una de las partículas anteriormente mencionadas.

6. Un método para producir una superficie de sustrato de la reivindicación 1, que comprende (A) preparar una superficie de sustrato y (B) poner, ya sea simultánea o sucesivamente, tanto una disolución acuosa de una sustancia para detectar un analito o el analito per se que se ha modificado para que sea inmovilizable sobre dicha superficie de sustrato, como un líquido que contiene un polímero no reticulado basado en un segmento de cadena de polietilenglicol, en contacto con dicha superficie de sustrato bajo unas condiciones bajo las cuales tanto dicha sustancia o dicho analito como dicho polímero no reticulado resulten completamente inmovilizables sobre dicha superficie de sustrato de (A),

(I)R^{1}-L_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-L_{2}-X

n representa un número entero de 2 a 20.000,

7. Un biosensor que está provisto de una superficie de sustrato de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Una superficie de sustrato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que X es una porción de cadena principal de un oligoimino o poliimino que tiene una pluralidad de grupos imino (-NH-).