WO2005010529A1 - 非特異吸着を抑制した基材表面 - Google Patents

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WO2005010529A1
WO2005010529A1 PCT/JP2004/011123 JP2004011123W WO2005010529A1 WO 2005010529 A1 WO2005010529 A1 WO 2005010529A1 JP 2004011123 W JP2004011123 W JP 2004011123W WO 2005010529 A1 WO2005010529 A1 WO 2005010529A1
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Yukio Nagasaki
Tadahito Takahashi
Kazunori Kataoka
Fumiko Aboshi
Miki Kato
Tomoko Jomura
Hiroshi Kobayashi
Yoshinori Katsuyama
Masami Nakamae
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Tokyo University Of Science, Educational Foundation
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    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to the surface of a substrate, particularly a biosensor chip or the like, and more particularly to a surface treated with a non-crosslinked polymer based on polyethylene glycol (hereinafter sometimes abbreviated as PEG) chain segments.
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention relates to a substrate surface and a biosensor provided with the surface.
  • the present inventors previously constructed a brush-like water-soluble polymer such as polyethylene dalicol on the surface of a substrate, not only to suppress nonspecific adsorption on the sensor surface, but also to stabilize the dispersion of nanoparticles.
  • a brush-like water-soluble polymer such as polyethylene dalicol
  • these inventions are described as having an increased density poly (ethylene oxide) brush-like structure surface (eg, WO 03/07693 33 A 1), poly (ethylene glycol) B) Table of biosensors carrying segment-containing polymer derivatives Surface (for example, JP-A-2003-149492), dispersion-stabilizing functional fine metal particles and semiconductor fine particles (for example, JP-A-200-080903).
  • an increased density poly (ethylene oxide) brush-like structure surface eg, WO 03/07693 33 A 1
  • poly (ethylene glycol) B) Table of biosensors carrying segment-containing polymer derivatives Surface for example, JP
  • a biomolecule such as an antibody is bound to the constructed brush tip and used as a system for sensitively sensing a specific reaction such as antigen recognition.
  • a specific reaction such as antigen recognition.
  • a polymer derived from glycosylethyl (meth) tallylate may be attached to an extra protein binding site on the solid phase surface and included in the measurement sample.
  • a method for preventing nonspecific adsorption of contaminating proteins and the like Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the present inventors have studied to provide a more stable surface capable of suppressing non-specific adsorption as compared with the conventional method as described above, and a surface that can be easily prepared.
  • a solid surface for immunoassay for example, a surface derived from gold, polystyrene, or polyvinylidene fluoride
  • a PEG chain brush can be immobilized on the surface without providing, and without adversely affecting the specific binding capacity of an antibody or an antigen.
  • the recognition ability of antibodies and the like acts in a PEG chain length-dependent manner, a method for performing specific molecular recognition with high sensitivity by designing in consideration of optimization of the chain length and the like was found. .
  • a substance for detecting an analyte or a substrate surface on which the analyte is immobilized wherein the substrate surface is formed at the same time as the substance or the analyte, or After the substance or analyte is immobilized on the substrate, a substrate surface formed by treatment with a non-crosslinked polymer mono-containing solution based on polyethylene glycol chain segments is provided.
  • a non-crosslinked polymer based on a polyethylene glycol chain segment as described above has the formula (I):
  • R 1 is a hydrogen atom, methyl, optionally protected formyl, optionally protected amino, optionally protected hydroxyl, optionally protected hydroxyl or vinylsulfonyl group.
  • L and L 2 independently represent a valence bond or a linker
  • X represents a functional group or a functional moiety for forming a covalent bond or a bond through physical interaction capable of immobilizing the polymer molecule on the surface of the porous particle;
  • n is an integer from 2 to 20 and 00
  • a substrate surface a substrate surface
  • B an aqueous solution of a substance for detecting an analyte modified so as to be immobilized on the substrate surface.
  • a non-crosslinked polymer-containing liquid based on polyethylene dalicol chain segments is contacted simultaneously or subsequently with the substrate surface under conditions sufficient for each to be immobilized on the substrate surface of (A)
  • the method for producing a substrate surface according to claim 1 is provided.
  • a biosensor provided with the above substrate surface is provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the blocking ability of a surface on which human IgG is immobilized and the results of anti-human IgG antibody sending.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in absorption before and after the addition of biotinylated BSA to a streptavidin-immobilized PEGylated gold colloid solution.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of change in the sensorgram when the spr sensor having a biotin-PEG brush surface and a PEGylated gold colloid solution carrying a hestreptavidin-carried and BSA-carried.
  • Figure 4 shows a sensorgram of the PEGylated gold colloid solution carrying anti-biotin antibody contacted with the spr sensor having a brushed PEG brush surface. It is a graph which shows the amount of change.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between acetal-PEG / PAMA surface treatment conditions for magnetic latex and zeta potential.
  • FIG. 6 is a graph showing the dependence of the amount of adsorbed serum albumin on the acetal-PEG / PAMA surface treated and untreated magnetic latex as a function of the number of washings.
  • Fig. 7 shows a comparison of anti-goat IgG detection ability by coating goat IgG antibody carrying dynabeads with a block polymer.
  • the five data on the left are the sensing capabilities of various particles, and the five data on the right are graphs showing non-specific adsorption to particles that do not carry antibodies on the surface.
  • FIG. 8 is a graph showing the S / N obtained from FIG. PEHA-Ph-PEG-0H blocking may be present.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of surface treatment of JSR antibody-loaded magnetic particles with PEHA-Ph-PEG-0H. It is confirmed that non-specific adsorption is extremely suppressed.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of surface treatment of magnetic particles carrying a JSR antibody with PEHA-Ph-PEG-0H. It was confirmed that the antigen detection ability was sufficiently high.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of surface treatment of magnetic particles carrying dynabead antibodies with PEHA-Ph-PEG-0H. It was confirmed that the antigen detection ability was sufficiently high.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of surface treatment of magnetic particles carrying dynabead antibodies with PEHA-Ph-PEG-0H. Nonspecific adsorption is suppressed by surface treatment.
  • Figure 13 shows a table of Dynabeads antibody-loaded magnetic particles using PEHA-Ph-PEG-0H. Indicates surface treatment and S / N.
  • FIG. 14 is a photograph instead of a drawing showing the presence or absence of nonspecific adsorption of a fluorescently labeled protein on a Western blotting PVDF membrane.
  • FIG. 15 is a graph showing a comparison of the surface potential when the glass surface was treated with Acetal-PEG-b-PAMA.
  • FIG. 16 is a photograph in place of a drawing showing the result of performing the Western Plot method according to Example 16.
  • Figure 1 7 is a top silicone surface, poly trimethylene butoxy silyl propyl main Takuri Reto P EG graft copolymer (PT S PM- g- P EG 110 .) The treated surface charge of the case, the untreated silicone surfaces of Compared to figure tffl 5 .
  • Figure 1 8 is poly preparative Increment butoxy silyl propyl methacrylate click Li rate one P EG graph preparative copolymer was coated on (PTS PM- g -P EG 1 100 ) were washed glass table surface, it as a mold
  • PTS PM- g -P EG 1 100 washed glass table surface, it as a mold
  • FIG. 19 is a graph showing the results of comparing the adsorptivity of fluorescence-labeled human IgG to the surface of the silicone after the surface treatment, with respect to the untreated surface.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of comparing the adsorptivity of fluorescence-labeled mouse serum albumin to the silicon surface after surface treatment with the untreated surface.
  • Analytes include biospecific binding pairs, such as antigens or haptens and antibodies, oligonucleic acids and nucleic acids that hybridize under stringent conditions, enzymes and their substrate sugars and lectins, hormones and their receptor proteins And avidin (including streptavidin) and piotin (including testobitin, iminobiotin, and aminobiotin).
  • biospecific binding pairs such as antigens or haptens and antibodies, oligonucleic acids and nucleic acids that hybridize under stringent conditions, enzymes and their substrate sugars and lectins, hormones and their receptor proteins And avidin (including streptavidin) and piotin (including testobitin, iminobiotin, and aminobiotin).
  • the surface of the substrate on which such a substance (which may itself be an analyte) is immobilized is in the form of a solid phase, such as a bioassay chip, biosensor, etc., for detecting these substances. It is a surface, and the material of those surfaces may be any as long as it meets the purpose of the present invention.
  • the substrate surface may be an electrochemical sensor surface commonly used in the art (eg, made of precious metal, metal oxide, etc.), a surface plasmon (SPR) sensor surface (eg, made of precious metal), a quartz oscillation sensor.
  • ELISA immobilized enzyme Immunoassay
  • microplate surface eg, polystyrene, polypropylene, polytetrafluoroethylene
  • plastic surface for protein or nucleic acid plots eg, -trocellulose, etc.
  • microarray surface for nucleic acid hybridization eg, glass, plastic
  • silicon eg, polydimethylsiloxane treatment
  • the substrate and the substrate surface that are integrated are a gold particle surface, a semiconductor particle surface, a magnetic particle surface, a silica particle surface, a porous particle surface, and any one of these particles.
  • Preferred examples include the surface of the latex particles containing the same. Modified so that one or the other of the above specific binding pairs is immobilized on these surfaces, in a manner known per se in the art, e.g., deposition of gold on the surface of the substrate.
  • a member in which a mercapto group is introduced into the terminal of the member can be used.
  • the surface of the substrate of the present invention may be used simultaneously with a substance or an analyte (for example, a member of a specific binding pair) for detecting an analyte modified so as to be immobilized on the surface of the substrate, or on the surface. It is formed by treating the surface of a substrate with a liquid containing a non-crosslinked polymer based on a polyethylene dalicol chain segment after the substance or the analyte is fixed.
  • a substance or analyte for detecting an analyte is formed on a previously immobilized substrate surface, followed by treating the surface with a non-crosslinked polymer based on polyethylene glycol chain segments.
  • Substrate surface the substrate surface to which the substance or analyte is pre-fixed is a surface currently used or proposed for use in the art, as described in detail above. Includes all that apply to the surface.
  • Polymers that can be used effectively for such surface treatment are those represented by formula (I).
  • Specific examples of X in the polymer of the formula (I) include, but are not limited to, a mercapto group (-SH), a silanol group (Si (OH) 3 ), a carboxyl group, and an amino group.
  • X is an oligo or polyimino main chain moiety having a plurality of imino groups (one NH—) in the main chain;
  • R 2 is a hydrogen atom or lower alkyl (for example, a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, Propyl, isopropyl, n-hexyl and the like. same as below. )
  • R 2 is a hydrogen atom or lower alkyl (for example, a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, Propyl, isopropyl, n-hexyl and the like. same as below. )
  • X is an oligo or polymer main chain moiety having a mono or di-lower alkyl-substituted amino group on the side chain, for example,
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl, 1 represents an integer of 1-2000, and L 3 represents
  • Such a polymer having X can be produced, for example, by the method described in X., ⁇ . Agasaki et al., Macromol.Chem.Jtapid Commun. 1997, 18,927, or according to Japanese Patent Application No. 2003-490000. Can be.
  • X is an oligo or polymer main chain moiety having a silanol group (or a trimethoxysilyl group) in the side chain;
  • R 3 , R 4 and L 3 are the same as above, and R 8 is lower alkyl, especially methyl or a hydrogen atom).
  • X like this
  • the polymer having the following structure can be obtained by, for example, hydrolyzing a trial oxysilyl compound which can be produced according to the method described in Y. Nagasaki et al., Or US Pat. No. 5,929,177. Is obtained.
  • X is an oligo or polymer main chain moiety having a carboxyl group in the side chain, for example,
  • X is an oligo or polylactide backbone moiety, for example,
  • q is an integer of 2 to 100, 0000.
  • X-containing polymers are described, for example, in U.S. Patent No. 5,925,720.
  • Other polymers can be obtained according to the method for producing various polymers having X, or by improving them.
  • X is a monomer that can be used for the production of a polymer having a trimethoxysilyl group in the side chain, for example, a copolymer of trimethoxysilylpropyl (meth) acrylate and polyethylene daricol (meth) acrylate. Coalescing, for example, the expression
  • r, s and t are independently an integer from 2 to 10,000, and R 3 is independently a hydrogen atom or a methyl group.
  • the polymer represented by is included in the polymer according to the present invention when the substrate surface is made of silicone.
  • a polymer is useful not only for the treatment of the biosensor surface as described above, but also as a polymer for treating the surface of a column for capillary electrophoresis and other microchannel surfaces.
  • Such a surface is stable against the flow of the sample solution, and also suppresses adsorption of proteins and the like in the biological sample, for example, and prevents clogging and the like.
  • Li when Li is a linker, typical examples thereof include, but are not limited to, one (CH 2 ) P — 0—,-(CH 2 ) q one COO, ⁇ ,> ⁇ CH 2 —— 0—— or one (CH 2 ) r — S—, where p, q and r are each independently 0-8 Is an integer.
  • These linkers have a structure that is incorporated in the L direction of the above formula (I) in the described direction.
  • typical examples of the case where L 2 is a linker include, but are not limited to, one (CH 2 ) k- ,
  • optionally protected amino, optionally protected carboxy, and optionally protected hydroxyl are protected or unprotected by a protecting group known in the technical field such as peptide synthesis. Means a group in the state of
  • protected amino groups include maleimide
  • hydroxyl protecting groups also include p-toluenesulfonyl group.
  • the substrate surface includes a substrate for preparing the substrate surface and an aqueous solution of the above-described modified analyte or an analyte (including an aqueous solution buffered with PBS or the like).
  • the above-mentioned polymer-containing liquid a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, etc., and an aqueous solution which may be buffered with PBS or the like).
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, etc.
  • an aqueous solution which may be buffered with PBS or the like.
  • Sufficient conditions vary depending on the polymer used and the nature of the substrate surface, but at a temperature from 5 ° C to a temperature at which the substance does not denature, for example, at a temperature from 55 ° C to several hours to several 10 hours. Incubation conditions are included '. Further, the conditions for treating the surface of the substrate having the substance fixed in advance with the polymer can be carried out under almost the same conditions as those described above. Thus, the substrate surface of the present invention can be provided.
  • Such polymers are usually in the area a reference of the substrate surface, 1 0- 6 ⁇ 1 0 3 mg / cm 2, preferably 1 0- 4 ⁇ 1 0 2 mg / cm 2, more preferably 1 0- Used to be 3 to 1 Om gZ cm 2 .
  • the initiator 4-hydroxymethyltinolebenzaldehyde dimethyl acetal 1.0 ramol (1.822 mol / l in THF solution, 0.55 ml) was mixed with the solvent tetrahydrofuran (THF) 25
  • THF solvent tetrahydrofuran
  • the mixture was added to the mixture with a micro syringe, and K-naphthalene l.Ommol (0.328 mol / 1-THF solution, 3.05 ml) was added, followed by metallization for 10 minutes.
  • 140 mmol (6.9 ml) of ethylene oxide was added, and the mixture was stirred under water cooling for 2 days to perform anion ring-opening polymerization.
  • the obtained polymer was monomodal and had a number average molecular weight of 6,050. . Comparison of the measured and calculated values of these peaks showed that this polymer had an ethylene oxide skeleton in the main chain, and a hetero-telechelic polyethylene oxide having an acetal group at the ⁇ -terminal and a hydroxyl group at the ⁇ -terminal. Was confirmed.
  • NMR proto nuclear magnetic resonance
  • the obtained polymer was monomodal by gel permeation chromatography. Its number average molecular weight was 6,056, which was almost the same as the theoretical molecular weight of 6,054. Similarly, in the measurement of MALDI-TOF-MS, the obtained polymer was monomodal and had a number average molecular weight of 6,023. Further, as a result of comparing the measured value and the calculated value of these peaks, it was confirmed that this polymer was benzaldehyde-PEG-0H in which the acetal group at the high end was deprotected.
  • the latex solution 25mL and water 125mL and mixed 300mL flask, FeCl 3 After adjusting the pH with hydrochloric acid to 1.7 was added (0. 405 g) and FeS0 4 (0. 25g), with vigorous stirring ammonia Adjust the pH to 9 with water.
  • the obtained polycolloid latates were easily attracted to the magnet, and it was confirmed that ferrite was formed on the surface of the latex.
  • the surface of the gold chip was modified with PEG (preparation of a mixed brush).
  • PEG-modified gold chip was immersed in 0.1 mol / L hydrochloric acid, and gently shaken at room temperature for 3 hours to convert the acetal group at the PEG end into an aldehyde group.
  • the gold chip was immersed in biocytin monohydrazide (EZ-Link TM; PIERCE) dissolved in lOOmM sodium phosphate buffer (pH 5.5, 1M NaCl) to a concentration of lmg / mL. After shaking for 3 hours, the biotin was introduced to the surface of the gold chip.
  • biocytin monohydrazide EZ-Link TM; PIERCE
  • the ozone-cleaned gold substrate (manufactured by Nippon Laser Electronics) was immersed in ImM 4,4'-dithiodibutyric acid (solvent; ethanol) for at least 12 hours in a Petri dish at room temperature, and then washed twice with ethanol.
  • the obtained PEG-modified gold colloid particles had good re-dispersibility after centrifugal purification, and were found to be stable even in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4, 0.15 M NaCl). It was confirmed by the spectrum measurement.
  • acetal-PEG-PAMA 4500/3200
  • Streptavidin-supported PEGylated gold colloid was prepared in the same manner as in Example 2 except that BSA was used instead of streptavidin of Example 2.
  • the dispersion stability of the obtained BSA-supported PEGylated gold colloid was extremely high as in Example 2.
  • Streptavidin-loaded PEGylated gold colloid was prepared in exactly the same manner as in Example 3 except that BSA was used in place of streptavidin of Example 3.
  • the dispersion stability of the obtained BSA-supported PEGylated gold colloid was extremely high as in Example 2.
  • the spr signal was small even for streptavidin-supported PEGylated gold colloid having a PEG chain of 10,000. But PEG 5,000 In addition, gold colloid treated with PEG / PAMA (4500/3200) produced an extremely high signal, confirming that streptavidin supported on gold colloid efficiently interacted with biotin on the surface of the spr sensor. Was.
  • Anti-biotin loading in exactly the same manner as in Example 2 except that anti-biotin antibody and acetal-PEG / PAMA (5660/2780) were used instead of streptavidin and acetal-PEG / PAMA (4500/3200) PEGylated gold colloid was prepared and its dispersion stability was confirmed.
  • PEGylated gold colloid carrying anti-biotin was prepared in the same manner as in Example 3 except that anti-biotin antibody was used instead of streptavidin.
  • Example 7 Confirmation of Molecular Recognition of Anti-Biotin Antibody-Supported PEGylated Gold Colloid
  • the molecular recognition ability of the dispersion-stabilized anti-biotin antibody-supported PEGylated gold colloid thus obtained was determined in the same manner as in Example 4. The operation was confirmed with spr (BIAC0RE1000).
  • Figure 4 shows the results of spr.
  • ACE-PEG-SH IOOOO
  • the zeta potential of the untreated latex shows a negative value of -40 mV, whereas the block-coated one has almost completely shielded the surface potential, and it was confirmed that the uncoated latex was coated neatly. Was confirmed.
  • the nonspecific adsorption performance of the protein to the acetal-PEG / PAMA coated magnetic latex thus prepared was evaluated.
  • the 17.8 g FITC-BSA solution dissolved in 2 mL of the phosphate buffer solution was mixed.
  • the particles were separated using a magnet, and the amount of FITC-BSA was calculated by measuring the fluorescence intensity of the supernatant at an emission wavelength of 520 nm at an excitation wavelength of 490 nm using a fluorescence spectrophotometer.
  • Figure 6 shows the amount of FITC-BSA adsorbed on the particle surface versus the number of washings. Coat the block polymer Although no protein was peeled off by washing without particles, it was confirmed that the coated particles were almost completely removed by washing four times, and that non-specific adsorption could be suppressed.
  • Example 8 Surface treatment was performed in exactly the same manner as in Example 8, except that the magnetic particles of JSR were used instead of the magnetic latex prepared in Reference Example 4.
  • the dispersibility was dramatically improved as compared with the untreated latex.
  • the untreated particles have a high sedimentation velocity, so the zeta potential cannot be measured.However, the zeta positions of the polymer-treated particles are -4 mV and + lmV, respectively, confirming that the surface is shielded. .
  • Example 10 Method of Carrying Out Antibodies on Magnetic Particles Having Tosyl Groups (Dynabeads) and then Surface-Blocking with Acetal-PEG / Polyamine
  • BSA ITB BSA 15mg dissolved in 2mL of 10mMTB (pH 8.12)
  • FIG. 7 shows the results of evaluation of the detection ability of the antigen bound to dynabeads
  • FIG. 8 shows the S / N ratio of each system.
  • the emission intensity derived from the reaction between the enzyme (ALP) and the substrate (4-MUP) is “PEG-b_PAMA + lwt. /.
  • PEHA-Phenyl-PEG-OH 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 wt% and JSR magnetic particle solution (anti-AFP rabbit antibody carrying, 7ug / mg beads ( 0.35ug / test), carboxylic acid surface particles, and magnetic particles: 10mg / ml) are mixed in a one-to-one ratio, stirred with a port tus, and rotated at 4 ° C overnight to perform a surface treatment.
  • 1% BSA PBS Dilute 10-fold with.
  • 1% BSA / PBS 50 L and 50 ⁇ L of magnetic particle solution were added to each of 50% NRS (normal normal heron serum) / PBS, 1% BS A / PBS, NHS (normal human serum), and 1 hour after vortex React by shaking. Separated with a magnet. After washing twice with TBST (Tris buffer 0.15M NaCl containing TWEEN20; 0.05%), 50uL of 3000-fold dilution of anti-AFP-monoclonal antibody ( ⁇ stock solution (Wako 016-14511) 3000 times) ) And shake for 1 hour. Separately wash with a magnet (same as above).
  • anti-mouse alkaline phosphatase IgG antibody stock solution of anti-mouse (goat)-alkaline phosphatase conjugate (sigma A3688) 5000 times; 1% BSA / PBS) and shake for 1 hour. .
  • Example 12 Before adding the primary antibody of Example 11, AFP (o! Phytoprotein; Aspen Bio Inc. 105S (Lot. 990628V1SS) 500K IU / mg) was added to 50% NRS, The measurement was carried out in the same manner as described above, except that the mixture was diluted to 5, 100, 500, and 100,000 I / ml with 1% BSA PBS and NHS and added to each magnetic particle. As a result, it was confirmed that AFP detection was performed even when blocking was performed with PEHA-Ph-PEG-OH.
  • Antigen solution antigen (Goat-IgG) dissolved in TB and used
  • Antibody solution Antibody (Algo Rephosphatase Conjugate Anti Goat-IgG) diluted 30,000-fold with TBS for use
  • Fig. 11 shows the amount of antibody detected
  • Fig. 12 shows the amount of non-specific adsorption. Even when blocking was performed with PEHA_Ph-PEG-0H, the detection sensitivity did not decrease, and it was confirmed that nonspecific adsorption was largely suppressed.
  • Figure 13 shows the S / N ratio. It is more effective than albumin blocking.
  • Detection was performed using fluorescent-labeled streptavidin, using an anti-BSA antibody (Egret) as the primary antibody and a biotin-labeled anti-Egret antibody (donkey) as the secondary antibody.
  • the results are shown in FIG. From the figure, it can be seen that the polymer used in the present invention has a better nonspecific adsorption suppressing effect than the conventionally used gelatin.
  • a PEG graft chain was constructed on the glass substrate surface.
  • Treatment method 1 (Adsorption under acidic conditions in a hot water bath (activation of molecular motion)) ⁇ ⁇ ⁇ 7.5 mM HC to the examiner to match the ionic strength at the time of potential measurement and to promote PAMA protonation 1
  • Prepare 15 ml of an aqueous solution (pH 2.1), adjust 10 ml of 0.5 wt% Acetal-PEG-b-PAMA solution in a hot water bath at 50 ° C and 80 ° C, and adjust the temperature.
  • the glass surface treatment was performed by immersing the glass and keeping it for 1 hour while maintaining the temperature.
  • Treatment method 1 (adsorbed in a high salt concentration aqueous solution at room temperature and under acidic conditions) Prepare 1 ml of 7.5 mM HC 1 aqueous solution ( ⁇ ⁇ 2.1) containing 1 MNaCl, and prepare a concentration of 1 mg / m 1 Was used to dissolve Acetal-PEG-b-PAMA.
  • Main solution Immerse the glass in the solution, leave it at room temperature for 30 minutes, wash it with a 7.5 mM HC1 aqueous solution containing 1 M NaC1 (pH 2.1), and leave it again in the above PEG aqueous solution for 30 minutes. For surface treatment.
  • ⁇ Electric potential measurement Measurement was performed by a laser Doppler method using an Otsuka Electronics L- ⁇ ⁇ -600 type device. The dependence of ⁇ potential on ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ starts from the acidic side, and is raised to ⁇ ⁇ 3, 5, 7, 8 ', 9, and 10.Measurements are performed two to three times for each ⁇ ⁇ , and stable values are obtained. Measured values.
  • Fig. 15 shows the ⁇ ⁇ dependence of the ⁇ potential on the unmodified glass and the surface of the PEG-modified glass subjected to adsorption treatment at 25, 50, and 80 ° C.
  • an alkaline phosphatase-labeled secondary antibody was used to detect the blocking effect of the block copolymer of the present invention in a detection system for single-protein (AFP).
  • AFP single-protein
  • An example is shown in comparison with a blocking agent that has been conventionally used.
  • serum albumin (BSA) and methoxy-polyethylene glycol / polylactic acid were prepared according to the method described in Example 14.
  • Block polymer (PEG-PLA) Were compared for the blocking effect.
  • Detection was carried out using an anti-AFP antibody (Egret) as the primary antibody, and an anti-Agher antibody labeled with anti-Agherfish antibody (donkey) as the secondary antibody. Tonitol nitrate tetrazolium (BCI PZNB PT) was used.
  • FIG. 17 shows the results.
  • the surface treated by the method according to the present invention showed little change in surface potential due to ⁇ ⁇ , was electrically neutral, and had little ionic interaction.
  • Example 1 A batch surface treatment method by applying PTS ⁇ ⁇ -g-PEG or a PEG macroblock monomer having a polymerizable bur group to the surface of a mold when preparing polydimethoxysilyl (P PMS).
  • PTS PM—g—PEG ⁇ a graft copolymer containing PEG directly on the glass surface when polymerizing the base PDMS.
  • Figures 19 and 20 show the results of evaluation of nonspecific adsorption of proteins to the treated surface using fluorescently labeled albumin and IgG, respectively. In all cases, adsorption was significantly reduced by the surface treatment, and the amount of adsorption was large on the untreated silicone surface, while non-specific adsorption was suppressed with good reproducibility on the treated surface.
  • the present invention it is possible to provide a substrate surface in which nonspecific adsorption of contaminant proteins and the like present in a sample such as blood and plasma on the surface of a biosensor substrate is significantly suppressed. Therefore, it can be used in the biosensor manufacturing industry or the biosensor industry, for example, in the clinical diagnosis industry.

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Abstract

被分析物を検出するための物質または被分析物が固定された基材表面であって、基材表面に該物質または被分析物と同時にか、または該表面に該物質または被分析物が固定された後に、ポリエチレングリコール鎖セグメントをベースにする非架橋ポリマー含有液で処理して形成された基材表面が提供される。測定された試料中に共存する夾雑タンパク質等の非特異吸着が有意に抑制される。

Description

明 非特異吸着を抑制した基材表面 技術分野
本発明は、 基材、 特にバイオセンサーチップ等、 の表面に関し、 より 具体的には、 ポリエチレングリコール （以下、 P E Gと略記する場合あ り。）鎖セグメントをベースにする非架橋ポリマーで処理された基材表面、 ならび該表面を備えたバイオセンサーに関する。
背景技術
タンパク質や脂質などの生体分子混在下で特定の物質を検出する免疫 診断法やバイオセンサー等は疾病の早期検出診断法として広く応用され てきている。 しかしながら共存するバイオ分子のバイォセンサー表面へ の非特異吸着が特異的反応と同時に起こるため、 パックグラウンドノィ ズとして妨害し、 これが高感度化の妨げとなってきた。 さらに、 診断粒 子にあっては非特異吸着によるパックグラウンドに加え、 生物学的流体 又はその希釈液中での分散安定化が大きな問題となっていた。 本発明者 らは以前、 ポリエチレンダリコールのような水溶性高分子を基材表面に ブラシ状に構築することにより、 センサー表面の非特異吸着を抑制する だけでなく、 ナノ粒子の分散安定化も向上させ、 新しいバイオ診断ツー ルとしての材料を供給してきた。 具体的には、 これらの発明を記載する ものとして、 増大した密度のポリ （エチレンォキシド） のブラシ様構造 表面 （例えば、 W O 0 3 / 0 7 6 9 3 3 A 1 )、 ポリ （エチレングリコー ル） セグメントを含有するポリマー誘導体を担持するバイオセンサー表 面 （例えば、 特開 2 0 0 3 _ 1 4 9 2 4 5 )、 分散安定化機能性金属微粒 子及び半導体微粒子 （例えば、 特開 2 0 0 2— 0 8 0 9 0 3 ) を挙げる ことができる。
これらの発明では構築したブラシ先端に抗体等のバイオ分子を結合さ せ、 抗原認識等の特異的反応を高感度にセンシ.ングするシステムとして 利用される。 しかしながらブラシ表面はタンパク質等の吸着を極めて妨 げること等の原因により、 ブラシ先端への抗体のようなタンパク質の担 持量を上げることが困難な場合があり、 これが高感度化を妨げることが あった。 別法として、 固相表面に抗体あるいは抗原を結合させた後に、 固相表面の余分なタンパク質結合部位にグリコシルェチル （メタ） タリ レート由来のポリマーを付着させて、 測定試料中に含まれうる夾雑タン パク質等の非特異吸着を防止する方法 （特開平 1 0— 1 2 3 1 3 5号）、 また、 上記のグリコシルェチルに代え、 ポリエチレングリコール鎖を有 する （メタ） アタリ レート由来のポリマーで免疫反応に使用する固相表 面を保護すること （特開平 1 1一 2 8 7 8 0 2号）も、提案されている。
しかし、 これらのポリマーはタンパク質等の非特異吸着を抑制すべき 固相表面への結合性または固定化能が十分でない場合や、 仮に固定化能 を高めた場合には免疫反応に関与する、 例えば、 抗体の抗原に対する特 異的結合能に悪影響を及ぼすことがある。 また、 バイオ特異的結合対、 例えばス トレプトアビジンとピオチンとの親和性を利用して、 予めスト レプトアビジンを担持する固相にビォチン化抗体を結合させ、 該固相を ビォチン化ポリェチレ制することも提案されている （特開平 1 1— 2 1 1 7 2 7号）。 しかし、 この方法は、 固相表面に、 予め、 バイオ特異的結 合対の一員を固定しておく必要がある。 発明の開示
本発明者らは、 以上のような従来法に比べ、 より安定な非特異吸着を 抑制し得る表面であって、 しかも簡単に調製できる表面を提供すべく検 討してきた。 その結果、 意外にも、 実用に供されている抗体または抗原 等を固定化した免疫アツセィ用の固相表面（例えば、金、ポリスチレン、 またはポリフッ化ビニリデン由来の表面） を、 特別な結合手段を設ける ことなく、 しかも抗体または抗原等の特異的結.合能に悪影響を及ぼすこ となく、 P E G鎖ブラシを該表面に固定できることを見出した。 また、 抗体等の認識能が P EG鎖長依存的に作用するため、 該鎖長の最適化等 を考慮した設計をすることにより、 特異的な分子認識を高感度で行う方 法を見出した。
したがって、 本発明によれば、 被分析物を検出するための物質または 被分析物が固定された基材表面であって、 基材表面を該物質または被分 析物と同時にか、 または該表面に該物質または被分析物が固定された後 に、 ポリエチレングリコール鎖セグメントをベースにする非架橋ポリマ 一含有液で処理して形成された基材表面が提供される。
好ましい態様の本発明としては、 上記のポリエチレングリコール鎖セ グメントをベースにする非架橋ポリマーが、 式 （ I ) ：
Rx-L 1-(CH2CH20)n-L2-X ( I )
(式中、 R1は水素原子、 メチル、 保護されていてもよいホルミル、 保護されていてもよいァミノ、 保護されていてもよい力ルポキシ、 保護されていてもよいヒ ドロキシルまたはビニルスルホニル基を表 し、
L および L 2は相互に独立して、原子価結合またはリンカーを表 し、
Xは多孔質粒子表面に当該ポリマー分子を固定することのできる 共有結合または物理的相互作用を介する結合を形成するための官能 基または機能性部分を表し、 そして
nは 2 〜 2 0 ， 0 0 0の整数である）
で表される基材表面が提供される。
別の態様の本発明としては、 （A ) 基材表面を用意し、 （B ) 該基材表 面に固定しうるように修飾された被分析物を検出するための物質の水性 溶液おょぴポリエチレンダリコール鎖セグメントをベースにする非架橋 ポリマー含有液を、 同時かまたは続いて、 それぞれが（A)の基材表面に 固定化されるのに十分な条件下で該基材表面と接触させることを特徴と する請求資 1記載の基材表面の作製方法が提供される。
また、 別の態様の本発明として、 上記の基材表面を備えたバイオセン サーも提供される。
図面の簡単な説明
図 1は、 ヒ ト IgGを固定化した表面のプロッキング能と抗ヒ ト I g G 抗体センジングの結果を示すグラフである。
図 2は、 ス トレプトアビジン固定 PEG化金コロイ ド溶液へのピオチン 化 BSAの添加前後の吸収の変動を示す図である。
図 3は、 ビォチン一 PEGブラシ表面を有する sprセンサーヘストレプ トァビジン担持及び BSA担持 PEG化金コロイ ド溶液を接触させたときの センサーグラムの変化量を示すグラフである。
図 4は、 ピオチン一 PEGブラシ表面を有する sprセンサーへ抗ビォチ ン抗体担持 PEG化金コロイ ド溶液を接触させたときのセンサーグラムの 変化量を示すグラフである。
図 5は、 磁性ラテックスに対するァセタール- PEG/PAMA 表面処理条件 とゼータ電位の関係を示すグラフである。
図 6は、ァセタール- P E G / P A MA表面処理及び未処理磁性ラテツ タスに対するゥシ血清アルプミンの吸着量の洗浄回数に対する依存性を 示すグラフである。
図 7は、 ャギ IgG抗体担持ダイナビーズをブロックポリマーでコーテ イングし、 抗ャギ IgG検出能を比較した。 左側 5つのデータが各種粒子 のセンシング能、 右卿 5つのデータは表面に抗体を担持していない粒子 への非特異吸着を示すグラフである。
図 8は、 図 6より得られた S/Nを示すグラフである。 PEHA-Ph- PEG- 0H のプロッキングがもつともよい。
図 9は、 PEHA- Ph- PEG- 0Hによる JSR抗体担持磁性粒子の表面処理の結 果を示すグラフである。 非特異吸着が極めて抑制されていることが確認 される。
図 1 0は、 PEHA- Ph- PEG- 0Hによる JSR抗体担持磁性粒子の表面処理の 結果を示すグラフである。 抗原検出能が十分高いことが確認された。 図 1 1は、 PEHA- Ph- PEG- 0Hによるダイナビーズ抗体担持磁性粒子の表 面処理の結果を示すグラフである。 抗原検出能が十分高いことが確認さ れた。
図 1 2は、 PEHA- Ph- PEG- 0Hによるダイナビーズ抗体担持磁性粒子の表 面処理の結果を示すグラフである。 非特異吸着が表面処理により抑制さ れている。
図 1 3は、 PEHA- Ph- PEG- 0Hによるダイナビーズ抗体担持磁性粒子の表 面処理、 S/Nを示す。
図 1 4は、 ウェスタンブロッ ト用 P VD F膜への蛍光標識タンパクの 非特異吸着の有無を示す図面に代わる写真である。
図 1 5は、 ガラス表面を Acetal-P E G— b一 P AMAで処理したと きの表面電位の比較を示すグラフである。
図 1 6は、 実施例 1 6によるウェスタンプロッ ト法を実施した結果を 示す図面に代わる写真である。
図 1 7は、 シリコーン表面上を、 ポリ トリメ トキシシリルプロピルメ タクリ レートー P EGグラフト共重合体 （PT S PM— g— P EG110 。） で処理した時の表面電荷を、 未処理のシリコーン表面と比較した図 tffl 5ある。
図 1 8は、 ポリ ト リメ トキシシリルプロピルメタク リ レー ト一 P EG グラフ ト共重合体 (P T S PM- g -P EG1 100) を洗浄したガラス表 面上に塗布し、 それをモールドとしてシリコーンを成型加工すると同時 に処理した時の表面電荷を、 未処理のシリコーン表面、 およびポリェチ レンダリコールホモポリマーで修飾した表面と比較した結果を示すダラ フである。
図 1 9は、 表面処理後のシリ コーン表面に対する、 蛍光標識したヒ ト I g Gの吸着性を未処理表面と比較した結果を示すグラフである。
図 20は、 表面処理後のシリ コーン表面に対する、 蛍光標識したゥシ 血清アルブミンの吸着性を未処理表面と比較した結果を示すグラフであ る。
発明を実施するための最良の形態
本発明にいう、被分析物 （analyte) を検出するための物質または被分 析物には、バイオ特異的結合対、例えば、抗原もしくはハプテンと抗体、 オリゴ核酸とそれにス トリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする核 酸、 酵素とその基質糖とレクチン、 ホルモンとその受容体タンパク質、 アビジン (ス トレプトァビジンを包含する) とピオチン (テスチォビ才 チン、 イミノビォチン、 アミノビォチンを包含する） が挙げられる。 し たがって、 特異的結合対の一員は、 上記の結合対を形成するいずれか一 方を意味する。 - かような物質 （これ自体が被分析物であってもよい） が固定化された 基材表面は、 固相の形態にあり、 これらの物質を検出するためのバイオ アツセィチップ、 バイオセンサー等の表面であり、 それらの表面の素材 は、 本発明の目的に沿うものであれば、 いかなるものであってもよい。 しかし、 基材表面は、 当該技術分野で通常用いられている電気化学セン サー表面、 （例えば、 貴金属、 酸化金属等製）、 表面プラズモン （S P R ) センサー表面 （例えば、 貴金属製）、 水晶発振センサー表面、 固相化酵素 免疫アツセィ （E L I S A ) 用マイクロプレート表面 （例えば、 ポリス チレン、 ポリプロピレン、 ポリテトラフルォロェチレン製）、 タンパク質 ブロッ トもしくは核酸プロッ ト用プラスチック表面 （例えば、 -トロセ ルロース等のセルロース誘導体、 ポリフッ化ビ-リデン、 ナイロン製）、 核酸のハイプリダィゼーシヨン用マイクロアレイ表面（例えば、ガラス、 プラスチック製）、 その他、 ガラス製、 シリコ ン製 （例えば、 ポリジメ チルシロキサン処理） '表面が好ましい。 また、 基材および基材表面が一 体となるような例としては、 金粒子表面、 半導体粒子表面、 磁性体粒子 表面、 シリカ粒子表面、 多孔質粒子表面、 およびこれらの粒子のいずれ か一種を含むラテックス粒子表面等が好ましい例として挙げられる。 上記の特異的結合対の一員または他の一員がこれらの表面に固定しう るように修飾されたものとは、 当該技術分野でそれ自体既知の様式、 例 えば、 基材表面が金の蒸着膜の場合、 該一員の末端にメルカプト基を導 入させたもの等を挙げることができる。
本発明の基材表面は、 基材表面に固定しうるように修飾された被分析 物を検出するための物質または被分析物（例えば、特異的結合対の一員） と同時にか、 または表面に該物質もしくは被分析物が固定された後に、 ポリエチレンダリコール鎖セグメントをベースにする非架橋ポリマー含 有液で基材表面を処理して形成されたものである。 好ましくは、 被分析 物を検出するための物質または被分析物が、予め固定された基材表面に、 その後、 ポリエチレングリコール鎖セグメントをベースにする非架橋ポ リマーで前記表面を処理して形成された基材表面を挙げることができる。 本発明に従えば、該物質または被分析物が、予め固定された基材表面は、 現在、 当該技術分野で使用され、 または使用すべく提案されている表面 であって、 上記に詳述した表面に該当するすべてを包含する。
このような表面処理に効果的に使用できるポリマーは、 式 （ I ) で表 されるものである。 式 （ I ) のポリマーにおける Xの具体例としては、 限定されるものでないが、 メルカプト基 （一 S H)、 シラノール基 （ S i (O H)3)、 カルボキシル基、 アミノ基である。 また、 Xは、 複数のィ ミノ基 （一 N H—） を主鎖に有するオリゴまたはポリイミノ主鎖部分、 例えば、 式
— (CH2CH2NH)m— R 2
(ここで、 R 2は水素原子または低級アルキル （例えば、 炭素原子数 1 〜 6の直鎖もしくは分岐のアルキルであり、 例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 n—へキシル等である。 以下、 同じ。） 基を表 し、 mは 1〜 2 ,000の整数を表す。）
で表される。 また、 Xは、 モノーもしくはジー低級アルキル置換アミノ 基を側鎖に有するオリゴまたはポリマー主鎖部分、 例えば、 式
Figure imgf000010_0001
し 3—— NR5R6
(ここで、 R3、 R4、 R 5および R 6は独立して、 水素原子または低級ァ ルキルを表し、 1は 1〜 2 , 00 0の整数を表し、 L3は、
Figure imgf000010_0002
一 C ONH C 2) P—および一 C〇NR ' (CH2) P—からなる 群より選ばれ、 ここで pは 1〜 1 0の整数であり、 R 7はへテロ原子を含 んでもよい低級アルキルを表す） 表わす。 このような Xを有するポリマ 一 は 、 例 X. 、 \. agasaki et al.,Macromol.Chem.Jt apid Commun.1997, 18,927に記載の方法あるいは、特願 200 3— 4 900 0に従って製造することができる。
また、 Xはシラノール基 （またはトリメ トキシシリル基） を側鎖に有 するオリゴまたはポリマー主鎖部分、 例えば、 式
― (CH2C (R3) -),一 R
Figure imgf000010_0003
(ここで、 R3、R4および L 3は上記に同じであり、 R 8は低級アルキル、 特にメチルであるかまたは水素原子である。）で表される。 このような X を有するポリマーは、 例えば、 上記 Y.Nagasaki et al.， または米国特許 第 5， 9 2 9 , 1 7 7号に記載の方法に準じて、 製造できた、 トリアル コキシシリル体を、 必要により加水分解して得られる。
また、 Xは、 カルボキシル基を側鎖に有するオリゴまたはポリマー主 鎖部分、 例えば、 式
Figure imgf000011_0001
COOH
(ここで、 R 3、 R 4および 1は上記に同じ。）
で表される。 また、 Xはオリゴまたはポリラクチド主鎖部分、 例えば、 式
Figure imgf000011_0002
(ここで、 qは 2〜1 0 , 0 0 0の整数である。） で表される。 このよう な Xを有するポリマーは、 例えば、 米国特許第 5， 9 2 5 , 7 2 0号に 記載されている。 その他のポリマーも、 種々の Xを有するポリマーの製 法に準じて、 または改良して得ることができる。
なお、 Xがトリメ トキシシリル基を側鎖に有するポリマーの製造に使 用できるモノマー、 例えば、 トリメ トキシシリルプロピル （メタ） ァク リ レー トとポリエチレンダリ コール（メタ）アタ リ レー トとの共重合体、 例えば、 式
Figure imgf000012_0001
H—（CH2C (R3))s— (CH2C (R3))— H
I
COO(CH2)3― si (OCH3)3
(ここで、 r、 sおよび tは独立して 2〜 1 0， 000の整数であり、 R 3は独立して水素原子またはメチル基である。）
で表されるポリマーは、 基材表面がシリ コーン製である場合に、 本発明 にいうポリマーに包含される。 このようなポリマーは、 上述のようなバ ィォセンサー表面の処理だけでなく、 キヤビラリー電気泳動用カラム表 面、 その他のマイクロ流路表面を処理するためのポリマーとしても有用 である。 かような表面は試料溶液の流れに対して安定であり、 また、 例 えば生体試料中のタンパク質等の吸着を抑制して、 目づまり等を防止で さる。
さらに、 式 （ I ) における、 L iがリンカーである場合の代表的なも のとしては、 限定されるものでないが、 一（CH2)P— 0—、 -(CH2)q 一 COO 、 ~~ 、〉 ~~ CH2—— 0—— または一（CH 2) r— S— で表される連結基であることができ、 ここで p、 qおよび rはそれぞれ 独立して 0〜 8の整数である。 これらのリンカ一は記載した方向性で上 記の式 （ I ) の L 部分に組み込まれる構造を有する。 一方、 L2がリン カーである場合の代表的なものとしては、 限定されるものでないが、 一 (CH2)k -、
-CO (CH2) - で表される連結基であることが
Figure imgf000012_0002
でき、 ここで、 kおよび 1は 1〜 6の整数である。 これらのリンカ一は 記載した方向性で上記の式 （ I ) の L 2部分に組み込まれる構造を有す る。
さらに、 R 1の定義における保護されていてもホルミルとは、 式
Figure imgf000013_0001
で表され、 1 3ぉょび1 1)は、 相互に独立して、 低級アルキルを表すか、 一緒になつてメチル置換エチレンを表すか、 あるいは R a— O および R b - O - が一緒になつて 〇= を表す （この場合にホルミル O C H —となる）。 また、 保護されていてもよいァミノ、保護されていてもよい カルボキシ、 保護されていてもよいヒ ドロキシルは、 例えばペプチド合 成等の技術分野で周知の保護基により保護されているか、 または未保護 の状態にある基を意味する。 さらに、 保護されたァミノ基にはマレイミ ドが包含され、 ヒ ドロキシル保護基には p —トルエンスルホニル基も包 含される。
本発明に従う、 基材表面は、 基材表面を用意し、 そして上述した修飾 された被分析物を検出するための物質または被分析物の水性溶液 （P B S等で緩衝化された水溶液を包含する。） と、 上記のポリマー含有液 （水 混和性の有機溶媒、 例えば、 メタノール、 エタノール、 テトラヒ ドロフ ラン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド、 等、 および P B S等で緩衝化されていてもよい水性溶液） とを、 同時に用いて、 基材表 面と、 これらの物質およびポリマーが基材表面に固定化されるのに十分 な条件下で、接解させることにより作製できる。十分な条件下としては、 使用するポリマーおよび基材表面の性質によって異なるが、 5°Cから前 記物質が変性しない温度、 例えば、 5 5°Cまでの温度で、 数時間から数 1 0時間インキュベートする条件が挙げられる'。 また、 予め固定された 該物質を有する基材表面をポリマーで処理する条件も、 前記の条件とほ ぼ同じ条件で実施できる。 こうして、 本発明の基材表面が提供できる。 このようなポリマーは、 通常、 基材表面の面積基準で、 1 0— 6〜 1 03 m g / c m2、 好ましくは 1 0- 4〜 1 02m g/ c m2、 さらに好ましく は 1 0- 3〜 1 Om gZ c m2となるように使用される。
以下、 具体例を挙げ、 本発明をさらに説明する。
参考例 1 ： ァセタール一 PEG— 0Hの製造
CH30、
CH 〇 CH20 CH2CH2O f CH2CH2OH
CH30 , アルゴン下、 ナスフラスコ中、 室温において、 開始剤 4-ヒ ドロキシメ チノレベンズアルデヒ ドジメチルァセタール 1.0 ramol (1.822mol/l— THF 溶液、 0.55ml) を溶媒テトラヒ ドロフラン （THF) 25 mlにマイクロシリ ンジで加え、 K— ナフタレン l.Ommol (0.328 mol/1— THF溶液、 3.05 ml) を加えて 10分間メタル化を施した。次いで、エチレンォキシド 140mmol (6.9 ml)を加えて水冷下で 2日間撹拌し、ァニオン開環重合を行った。 その後、純水を数滴加えて反応を停止させ、ジヱチルエーテル沈澱（21)、 クロ口ホルム抽出 （飽和食塩水に対して 3回）、 減圧乾燥、 ベンゼン凍結 乾燥により精製を行った。 この生成物の収量は 4.5g (90%) であった。 ゲルパーミエーションクロマトグラフィ一の測定により、 得られたポ リマーは単峰性であり、 その数平均分子量は 6， 067であり、 仕込み分子 量 6， 000 とほぼ一致していた。
同様に MALDI— TOF— MS (マトリ ックス支援レーザー脱離イオン化飛行 時間型質量分析計） の測定においても、 得られたポリマーは単峰性であ り、 その数平均分子量は 6， 050であった。 また、 これらのピークの測定 値と計算値を比較した結果、 このポリマーはエチレンォキシド骨格を主 鎖に有し、 α —末端にァセタール基、 ω—末端に水酸基を有するヘテロ テレケリックポリエチレンォキシドであることが確認された。
さらに、 得られたポリマーの DMS0中での NMR (プロ トン核磁気共 鳴） スペク トルよ り、 このポリマーはエチレンォキシド骨格を主鎖に有 し、 ひ一末端にァセタール基、 ω—末端に水酸基を有するヘテロテレケ リックポリエチレンォキシドであることが確認された。
参考例 2 ： ベンズアルデヒ ド- PEG - 0Ηの調製
Figure imgf000015_0001
上記までに得られたァセタール -PE0_0H 1. 0gをナスフラスコ中、 35°C において 90%酢酸水溶液 20mlに溶解し、 5時間攪拌する。その後 10N - HC1 を用いて pHを 8に調整し、 純水に対する透析 （区画分子量 3500、 1, 2,
4， 6， 8， 12 時間後に水を交換） を 1 日行い、 次いで減圧乾燥、 ベンゼ ン凍結乾燥により回収した。 この生成物の収量は 0. 88g (88% ) であつ た。
ゲルパーミエーシヨンクロマトグラフィ一の測定によって、 得られた ポリマーは単峰性であった。 またその数平均分子量は 6， 056であり、 理 論分子量 6, 054とほぼ一致していた。 同様に MALDI- TOF- MSの測定においても、得られたポリマーは単峰性 であり、 その数平均分子量は 6， 023であった。 また、 これらのピークの 測定値と計算値を比較した結果、 このポリマーはひ- 末端のァセタール 基が脱保護された、 ベンズアルデヒ ド- PEG- 0Hである事が確認された。
さらに、 得られたポリマーの DMS0中での 1 H- NMR (プロ トン核磁気共 鳴） スペク トルより lOppm付近にアルデヒ ドプロ トンのスぺク トルが見 られ、 この結果からも a - 末端のァセタール基が脱保護されて、 アルデ ヒ ド （ホルミル基） となっていることが確認された。
参考例 3： ΡΕΗΑ- Phenyl- PEG- 0Ηの製造。
H H
¾N〜N〜N〜N〜 N〜 NH-CH2-(Q>- CH20^ CH2CH2O)- CH2CH2OH
I I n-1
H H ベンズアルデヒ ド- PEG - OH 250 mgを、 5mlのメタノールに溶解する。 ナスフラスコに PEGの. 100倍 mol量の PEHA (5mmol, 1. 2ml) を入れ、 こ れを 20mlのメタノールに溶解した後、氷冷しながら 5N- HC1を用いて pH を 6に調整する。 この PEHAメタノール溶液を激しく攪拌しながら、ベン ズアルデヒ ド -PEG- 0H メタノール溶液をゆつく り滴下し、 室温で 4時間 攪拌してシッフ塩基を形成させる。 次いで還元剤として 5mmol (PEG の 100倍 mol量， 約 300mg) の NaBH3CNを 30分おきに計 3回反応溶液に加 えた後、 24時間攪拌する。 得られた反応溶液を純水に対して 2日間透析 する （区画分子量 1， 000、 3, 6, 18， 24， 30, 42, 48時間後に水を交換）。 その後、 減圧濃縮により適当な濃度にし、 凍結乾燥により回収した。 こ の生成物の収量は 75mg ( 30% ) であった。
ゲルパーミエーションクロマトグラフィ一の測定によって、 得られた ポリマーは単峰性であった。 またその数平均分子量は 5, 800であり、 理 論分子量 6, 270とほぼ一致していた。
また、 得られたポリマーの D20中での 1 H— NMR (プロ トン核磁気共鳴） スぺク トノレ力、ら、 ベンズアルデヒ ド -PEG-0Hにおいて lOppm付近に見ら れたアルデヒ ドプロ トンのスぺク トルが消失し、さらに 3. 4ppm付近にァ ミンとベンゼン環に挟まれたメチルプロ トンのものと思われるスぺク ト ルが新たに現れていることから、 α一末端のアルデヒ ドに ΡΕΗΑが還元ァ ミ ノィヒによって結合した、 目的物の PEHA- Phenyl - PEG - 0Η (または PEHA-Ph-PEG-OHとも略記する。） が合成されたことが確認された。
参考例 4 磁性粒子担持ラテックスの調製
スチレン 4mL、水 45mL、過硫酸力リウム 0. 024gを 200mLフラスコに加 え、 70° C， 350rpsで 28時間重合させた。 得られたラテックスは平均粒 径 Ι μ ιηの単分散であることを ΤΕΜ及び動的光散乱測定から確認した。
このラテックス溶液 25mLと水 125mLを 300mLフラスコ中混合し、塩酸 にて pHを 1. 7に調製した後 FeCl3 (0. 405g)及び FeS04 (0. 25g)を添加し、 激しく撹拌しながらアンモニア水によって pHを 9にする。このようにし て得られたフヱリコロイ ドラテツクスは磁石に容易に引き寄せられ、 ラ テックス表面にフェライ トが生成していることが確認された。
参考例 5 金チップ表面の調製
オゾン洗浄した金チップを， lmg/mL となるように 50mM リン酸ナトリ ゥム緩衝液 (pH7. 4, lM NaCl) に溶解させた acetal-PEG-SH (Mn=5, 000) に浸漬させ， 室温で 30分間振盪した。 これを 50mMリン酸ナトリウム緩 衝液 （pH7. 4， 1M NaCl) で 1回洗浄し， 50mM水酸化ナトリウムに 30秒 間浸してから， 再び 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH7. 4， lM NaCl) で 3回洗浄した。 この操作を 2回繰り返した。 更に， このチップを, lmg/mL となるように 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH7. 4, lM aCl) に溶解さ せた MeO- PEG- SH (Mn=2， 000)に浸漬させ、 室温で 30分間振盪した. これ を 50mMリン酸ナトリゥム緩衝液 （pH7, 4， lM aCl) で 1回洗浄し， 50mM 水酸化ナトリウムに 30秒間浸漬させてから， 再び 50mMリン酸ナトリウ ム緩衝液 （pH7. 4, 1M NaCl) で金チップ表面を 3回洗浄した。
この操作を 2回繰り返すことにより， 金チップ表面の PEG修飾を行つ た （混合ブラシの調製）。 次に PEG修飾金チップを 0. lmol/L 塩酸に浸 漬させ， 室温で 3時間， 穏やかに振盪して， PEG末端のァセタール基を アルデヒ ド基に変換した。 次に， lmg/mL となるように lOOmM リン酸ナ トリ ウム緩衝液 （pH5. 5， 1M NaCl) に溶解したビオシチン一ヒ ドラジド (EZ-Link™; PIERCE)に金チップを浸漬させ， 室温で 3時間振盪して， 金 チップ表面にピオチンを導入した。
実施例 1 金表面に対する表面作製
オゾン洗浄した金基板 （日本レーザー電子製） をシャーレ中、 室温に おいて、 ImM 4, 4 ' -dithiodibutyric acid (溶媒；エタノール）に少なく とも 12 時間浸漬した後、 エタノールで 2 回洗浄した。 lmL の蒸留水に EDC (1— ethyl— 3— (3— dimetylaminopropy丄ノ carbodi iraide) 25mg と 9ml のシ ォキサンに溶解した NHS (N- hydroxysuccinimide) 15mgの混合溶液をシャ ーレに加え、洗浄済みの基板を浸し、穏やかに室温で 30分振盪し活性化 させた。
活性化させた基板を表面プラズモンセンサー（日本レーザー電子製、 SPR)にセッ トし、 25° 5 · L/min、 60 z Lの μ L条件で 1 μ Mヒ ト IgGを 表層に固定する。 IgG固定化表面に 25° C、 5L/min、 60 μ ίの条件でエタ ノールァミン（PH8. 6)と lmg/mLァセタール-ポリエチレングリコール - b - ポリ （メタク リル酸 2-N, N-ジメチルアミノエチル）（以後、 Acetal- PEG/PAMAと略記、 PEG鎖長及び PAMA鎖長はそれぞれ 5660及び 2780であ り、 （5660/2780)と略記する）を 2回インジェク トした。 このようにして 得られた表面に対する非特異吸着能及び特異的吸着能を sprを用いて測 定した。 図 1にしめすようにエタノールアミンでブ口ッキングした表面 の リ ゾ チ ー ム 非 特 異 吸 着 能 が 4χ1(Γ2 (° ) に 対 し て 、 acetal_PEG/PAMA (5660/2780)ではほぼ完全に非特異吸着を抑制する表面 が得られた。 また、 抗ヒ ト IgG抗体を接触させると効率的に検出される ことが確認された。
参考例 6 ピオチン標識 BSAの調製方法
50mM炭酸緩衝液 （pH9. 6) lmlに溶解させた BSA (コーンフラクション V WAK0 ) 5mg に， 20mg/ml と なる よ う に DMS0 に溶解させた Biot in- (AC5) 2-0Su (D0JIND0) 21ulを添加し， 室温において 2時間反応 させた. これをゲル濾過して， 未反応の Biotin -（AC5) 2- OSu を除く とと もに， バッファを 20mMリン酸ナトリウム緩衝液 （ρΗ7· 5 0. 15M NaCl , ImM EDTA) に置換した. 得られたピオチン標識 BSAを HABA法により定量 した結果， BSA 1分子あたり， 約 5分子のピオチンが導入されたことが確 p& さ
実施例 2 ス ト レプ ト ア ビジ ン金 コ ロ イ ド粒子の調製 と acetal-PEG-PAMA (4500/3200)による安定化 (SAGCPEG/PAMA (4500/3200)と 表記）
金コロイ ド溶液 （Polyscience, 平均粒径 40nm， 濃度 0. 01 % ) に金コ ロイ ド粒子の 103倍となるように， ス トレプトアビジン （ImnmnoPure) 水溶液を加え， 室温において ί時間インキュベートし， 金粒子表面にス トレプトアビジンを吸着させた. 次いで， 金粒子とポリマーのモル比が
1： 1 X 106となるように acetal-PEG/PA A (4500/3200)水溶液を加えて， 4°C において一晩反応させた. その後， 遠心分離 [4°C， 4000 X g, 30分] し て， 沈渣を回収する操作を 3回繰り返して余剰のストレプトアビジンお よびポリマーを除いた。
得られた PEG修飾金コロイ ド粒子は，遠心精製後の再分散性がよく，10mM リン酸ナトリ ウム緩衝液 （pH7. 4， 0. 15M NaCl) 中でも安定に存在するこ とが UV- vi s スぺク トル測定により， 確認できた。
このよ うにして調製したス トレプトァビジン担持 PEG化金コロイ ドの 認識能を凝集試験による分子認識試験を行った。 PEG 修飾ストレプトァ ビジン金コロイ ド粒子に参考例 6で調製したビォチン導入 BSAを添加し たとき， 吸収スペク トル （800nm— 400nm) におけるピーク トップのシフ トが認められ， 金コロイ ド表面のストレプトァビジンとピオチンの相互 作用が確認できた。 （図 2 )
実施例 3 ス ト レブ トア ビジン担持金コ ロイ ド粒子の調製と acetal- PEG- SH (Mn=10， 000、 5, 000)による安定化（SAGCPEG-SH (10000)及ぴ SAGCPEG - SH (5000)と表記）
実 施 例 2 の acetal-PEG-PAMA (4500/3200) の 代 わ り に MeO- PEG- SH (Mn=10， 000)及び MeO- PEG- SH (Mn=5， 000)を用いたいた以外は 実施例 2と全く同様の方法でストレプトアビジン担持 PEG化金コロイ ド を調製した。 得られたストレブトアビジン担持 PEG化金コロイ ドの分散 安定性は実施例 2と同様極めて高かった。
参考例 7 牛胎児血清アルブミン（BSA)担持 PEG 化金コロイ ドの調製と acetal-PEG-PAMA (4500/3200)による安定化（BSAGCPEG/PAMA (4500/3200) と表記）
実施例 2のス トレプトァビジンの代わりに BSAを用いたいた以外は実 施例 2と全く同様の方法でストレプトァビジン担持 PEG化金コロイ ドを 調製した。 得られた BSA担持 PEG化金コロイ ドの分散安定性は実施例 2 と同様極めて高かった。
参考例 8 牛胎児血清アルブミン （B S A ) 担持 PEG化金コロイ ドの調 製と acetal- PEG - SH (Mn=5, 000)による安定化 (BSAGCPEG-SH (5000)と表 記）
実施例 3のス トレプトァビジンの代わりに BSAを用いたいた以外は実 施例 3と全く同様の方法でストレブトァビジン担持 PEG化金コロイ ドを 調製した。 得られた BSA担持 PEG化金コロイ ドの分散安定性は実施例 2 と同様極めて高かった。
実施例 4 ス トレプトアビジン及び BSA担持 PEG化金コロイ ドの分子認 識能の確認
このようにして得られた分散安定化したス トレプトァビジン及び BSA 担持 PEG化金コロイ ドの分子認識能を spr (BIACORElOOO)にて確認した。 参考例 5で調製したビォチンを有する PEG化金表面に測定温度 25° C, 流速 10 · L/minで， 1%BSA (ゥシ血清アルプミン） を含む 50mMリン酸ナ トリウム緩衝液 （PH7. 4, 0. 15M NaCl) に溶解させた修飾金コロイ ド粒子 を反応させて， 表面プラズモン共鳴測定法により角度変化を測定した。 図 3に sprの結果を示す。 BSAを担持させた金コロイ ドはビォチン化 spr 表面では殆ど関知しない。 また、 PEG鎖 10， 000のストレプトァビジン担 持 PEG化金コロイ ドでも sprシグナルは小さかった。 しかし、 PEG5，000 及び PEG/PAMA (4500/3200)で処理した金コロイ ドは極めて高い信号を出 し、 金コロイ ドに担持したス トレプトァビジンが sprセンサー表面のビ ォチンと効率的に作用していることが確認された。
実施例 5 抗 ビォチ ン抗体担持金 コ ロ イ ド粒子 の 調製 と acetal-PEG-PAMA (5660/2780)による安定化
ス トレプトアビジン及ぴ acetal- PEG/PAMA (4500/3200)の代わりに抗 ビォチン抗体及ぴ acetal- PEG/PAMA (5660/2780)を使った以外実施例 2と まったく同様の方法で抗ビォチン担持 PEG化金コロイ ドの調製を行い、 分散安定化を確認した。
実施例 6 抗 ビォチ ン抗体担持金 コ ロ イ ド粒子の調製 と ace- PEG-SH (Mn=10, 000、 5, 000)による安定化
ストレプトァビジン代わりに抗ビォチン抗体使った以外実施例 3 とま つたく同様の方法で抗ビォチン担持 PEG化金コロイ ドの調製を行い、 分
• 散安定化を確認した。
実施例 7 抗ビォチン抗体担持 PEG化金コロイ ドの分子認識の確認 このようにして得られた分散安定化した抗ビォチン抗体担持 PEG化金コ ロイ ドの分子認識能を実施例 4と全く同様の操作で spr (BIAC0RE1000) にて確認した。 図 4に sprの結果を示す。 抗体を担持した金コロイ ドで はス トレプトァビジン担持 PEG化金コロイ ド（Mn=10000)では検出されな かった ace- PEG- SH (IOOOO)でも高い信号を検出し、 特異的認識能を有す る抗体担持金コロイ ドが供出された。
実施例 8 磁性粒子表面への PEGブロッキング'
参考例 4 で調製したフェライ ト担持ラテックスを用い、 ァセタール -PEG/PAMA で表面処理した。 表 1に示したように、 サンプル管に所定量 のァセタール一 PEG/ . PAMA を量り と り、 ここに lOmM リ ン酸緩衝液 (pH=7. 18) 5mlを加え攪拌溶解させた。 この溶液に磁性ラテックスを加え、 撹拌した後、 洗浄操作（リン酸緩衝液 X 4回）を行い、 未吸着 PEG- b- PAMA の除去をおこなった。洗浄操作終了後、分散安定性の確認を行った上で、 フェライ ト粒子の表面電荷を確認する目的でゼータ電位測定を行った。 表 1ァセタール- PEG/PAMA表面処理条件
Figure imgf000023_0001
リン酸緩衝液： 5raL (pH=7. 1，イオン強度 10mM)
図 5に示すように、 未処理ラテックスのゼータ電位は - 40mV と負の値 を示すのに対し、 ブロックコーティングしたものはほぼ完全に表面電位 が遮蔽されていることが確認され、 きれいにコーティングされているこ とが確認された。
このようにして調製したァセタール- PEG/PAMA コーティング磁性ラテ ックスに対するタンパク質の非特異吸着性能を評価した。 磁性ラテツク ス 2. 5mgにァセタール- PEG/PAMA3. 2m で処理したもの及びしていないも のを上述と同様の条件で用意し、 リン酸緩衝液中（pH=7. l ; I=10mM)で 2mL のリン酸緩衝液に溶解させた FITC- BSA17. 8 · g溶液を混合した。 1時間 後、 磁石を使用して粒子の分離を行い、 上澄み液について蛍光分光光度 計を使用して励起波長 490nmにおける発光波長 520nmの蛍光強度を測定 することで、 FITC - BSA量を算出した。 図 6に洗浄回数に対する粒子表面 に吸着した FITC- BSAの量を示す。プロックポリマーをコーティングして いない粒子では洗浄によってタンパク質がはがれないものの、 コーティ ングした粒子では 4回の洗浄でほぼ完全にはが.され、 非特異的な吸着を 抑制できることが確認された。
実施例 9表面に PEGブラシを有する磁性粒子の調製方法（2)
参考例 4で調製した磁性ラテックスの代わりに JSRの磁性粒子を使つ た以外は実施例 8と全く同様の方法で表面処理を行った。磁性粒子 0. 5mg に対してァセタール- PEG/PAMAを同量及び 10倍量用いて表面処理を行つ たところ、 未処理のラテックスに比べて、 分散性が飛躍的に向上した。 実際未処理の粒子は沈降速度が速いため、 ゼータ電位を測定することが できないものの、 ポリマー処理粒子のゼータ霉位はそれぞれ- 4mV 及び +lmVであり、 表面が遮蔽されていることが確認された。
実施例 10 トシル基を有する磁性粒子（ダイナビーズ） に抗体を担持させ た後にァセタール- PEG/ポリ了ミンによって表面ブロッキングする方法 エツペンドルフチューブにダイナビーズの 10mM トリス緩衝溶液（TBS 溶液 pH=8. 12 ; 0. 15M NaCl) : 46. 9 · L (ダイナビーズ量： 93. 75 · g)及び Goat-IgG/10raM トリス緩衝溶液（TB溶液 pH=8. 12)： 150 // L (抗体量： 30 μ g)を加え、 37° C下にて 30分間反応を行い、 磁石で粒子を回収後、 反応 後未反応物の除去を目的として 10mMTBS (pH=8. 12)で 3回洗浄を行った。
このようにして抗体を担持した磁性粒子表面にプロッキング剤/ TB 溶 液： 150 しを加え、 室温下にて一時間反応を行った。 反応終了後、 未反 応物の除去を目的として 10mMTBS (PH=8. 12)で 3回洗浄を行った。洗浄終 了後、 Anti- Goat- IgG/TB溶液： 150 Lを加え、 室温下にて 1時間反応を 行った。 反応終了後、 未反応物の除去を目的として 10mMTBS (pH=8. 12)で 3回洗浄を行った。洗浄終了後、 白色 96穴プレートに分取し基質として 4-MUP (4-Methylumbl liferyl phosphate, シグマ）： 100 /^ L を加え、 室温 下にて 30分間反応を行った後 0. 5M NaOH水溶液：35 Lを加えることで 反応を終了させた。 反応終了後、 磁石を使用して粒子の分離を行い、 上 澄み液を黒色 96穴プレートに分取した後、マイク口プレートリ一ダーを 使用して励起波長 355nmにおける発光波長 460nmの蛍光強度を測定する ことで、 粒子表面に結合されている Goat - IgGの検出を行った。 なお、 実 験条件は表 2に示した通りである。
表 2ダイナビーズへの抗体担持、 ブロッキング試験条件
Blocking agent Anti Goat
grycme 0.5M NaOH
Run Beads( gj Goat lgG (μ§) PEG-b- PEHA- BSA IgG ALP 4-ΜυΡ(μί)
aq( L) PAMA(ML) PEG(ML) (ML) conjugate(jjL)
A-1 31.25 50(lwt%) 50 (P/B=l) 一
A-2 31.25 50(10wt%) 50(P B=1) 一
A-3 31.25 10 ■ ""- 一 50(P/B=1) 一 50 100 35
A-4 31.25 • ~~ 一 50(P/B=10) 一
A-5 31.25 • -~ 一 一 50
C-1 31.25 50(lwt%) 50 一
C-2 31.25 50(10wt%) 50 一 一
C-3 31.25 ― 50 50 100 35
* lOmMTB ： Trizma- base : 1. OM HC1： 蒸留水： pH=8. 12
* lOmMTBS ： Trizma- base : 1. OM HC1 : 蒸留水： ρΗ=8· 15 0. 15 M NaCl lwt%グリシン/ TB ： 10mMTB50mLにグリシン 0. 5gを溶解させたものを 使用した
* 10wt%ダリシン/ TB ： 10mMTB50mLにグリシン 5gを溶解させたものを使 用した
* BSA I TB ： 10mMTB (pH8. 12) 2mLに BSA15mgを溶解させたものを使用し た
* PEG-b-PAMA / TB ： lOmMTB (pH8. 12) 5raLに PEG - b - PAMAlmgを溶解させ たものを使用した
* PEHA-Ph-PEG I TB ： lOmMTB (pH8. 12) に PEHA— Ph— PEGlmgを溶角军さ せたもの使用した
* Anti Goat IgG ALP conjugate ： 原液を 30, 000倍に希釈し使用した
* 4-MUP (Substrate) ： 4-Methylumbl l if eryl phosphate
図 7にはダイナビーズに結合された抗原の検出能評価結果を示し、 図 8 には各系の S/N比を示した。図 Ίに示した Control系において酵素（ALP) と基質（4- MUP)の反応に由来する発光強度は、 「PEG- b_PAMA+lwt。/。ダリシ ン J > 「 PEG— b— PAMA+10wy%グ リ シ ン」 > 「 PEHA— Ph— PEG (P/B=l) 」 > 「PEHA- PEG (P/B=10)」 〉 「BSA」 となることが確認された。 図 8に示した よ う に 各 系 の S/N 比 は 「 PEHA- Ph- PEG (P/B=10) 」 〉 「 BSA」 〉 「 PEHA— Ph— PEG (P/B=l) 」 〉 「 「 PEG - b— PAMA+10wy% グ リ シ ン 」 > 「PEG - b-PAMA+lwt。/。グリシン」 となることが確認された。 この結果より、 ブロッキング剤として PEHA- PEG (P/B=10)系がもっとも良いことがわか つた 実施例 11 PEHA- Phenyl- PEG- OHによる表面処理（JSR磁性粒子）
PEHA-Phenyl-PEG-OH 0、 0. 5、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0wt %の各濃度と、 JSR磁性粒子溶液（抗 AFPラビット抗体担持、 7ug/mg beads (0. 35ug/test)、 カルボン酸表面粒子、 磁性粒子： 10mg/ml) を 1対 1で混和し、 ポルテッ タスで攪拌後 4°Cにて終夜回転することにより表面処理を行い 1 %BSA PBSで 1 0倍希釈する。
の 50%NRS (正常ゥサギ血清） /PBS、 1%BS A/PBS, NHS (正常人血清） をそれぞれ 1%BSA/PBS50 L及ぴ磁性粒子溶液を 50 μ L加え， ボルテッ タス撹拌後 1時間振とうすることにより反応させる。 磁石により分離 TBST (トリスバッファー 0. 15M NaClに TWEEN20； 0. 05%含有）で 2回洗浄し た後、 抗 AFP-モノクロナール抗体（巿販原液 （Wako 016 - 14511) の 3000 倍希釈を 50uL)を加え、 1時間振とう反応させる。 磁石により分離洗浄 する (同上）。 その後アンチマウスアル力リホスファターゼ IgG抗体（抗 マウス (ャギ) - アル力リフォスファターゼ · コンジユゲート (sigma A3688)の原液を 5000倍希釈。 1%BSA/PBS)を加え、 1時間振とう反応させ る。洗浄後基質溶液 4MUP (シグマ） 120uLを加え撹拌後室温で 30分静置後 0. 5規定の NaOH40 i L加えて反応を停止。 この溶液を lOOuLをプレート (ヌンク 437111) に移し、 プレートリーダー（Ex/Em= 355/460nra)で測定 した。
図 9に示すように PEHA- Ph-PEG- 0H で処理することにより非特異吸着 (NSB)が抑制されていることが確認された。 また、図 1 0に示すように高 感度検出が可能となった。
実施例 12実施例 11の一次抗体を加える前に AFP ( o!フエトプロテイン； Aspen Bio Inc. 105S (Lot. 990628V1SS) 500K IU/mg) を 50%NRS、 1 %BSA PBS、 NHSを用いて 5、 100、 500、 lOOOIU/mlに希釈調製し、 各磁 性粒子に加えた以外、 同様の方法で測定を行った。 この結果、 PEHA-Ph-PEG-OHでプロッキングをしても AFP検出が行われることを確認 した。
実施例 13 PEHA-Ph-PEG-OHによるダイナビーズ（表面トシル基） のブ 口ッキング
① チューブに所定量のビーズ溶液及び抗原溶液を加え室温下にて l. Ohr反応を行い、 TBSで洗浄を行った。
② ①に PEHA- Ph- PEG- 0Hを加え室温下にて 1. Ohr反応を行い、 TBSで洗 浄を行った。
③ ②を 96穴プレートに分注し抗体溶液を加え室温下にて 1. Ohr反応を 行い、 TBSで洗浄を行った （実施例 12と同様の方法）。
③ ③に基質（4- MUP)を加え室温下にて 0. 5hr反応を行い、 0. 5M NaOH水 溶液を加え反応を終了させた。
④ 磁石を使用してビーズを固定し、 上澄み液を新しい 96穴プレートに 分注した後、 プレートリーダーを使用して Ex/Em=355nra/460nmにおける 発光強度を測定することで抗原の検出を行つた。
⑤別途、①の処理を省き、②〜⑤の処理を行い、非特異吸着量を求めた。
抗原塗布ダイナビーズの調整条件および評価
Figure imgf000030_0001
*抗原溶液：抗原（Goat-IgG)を TBに溶解させ使用した
*0.65¥1:%ブロック剤溶液： 種々のプロック剤（PEHA- Ph- PEG、 BSA)を TB に溶解させ使用した
*抗体溶液 ： 抗体（アル力 リ フォスファ ターゼコ ンジユゲー ト Anti Goat-IgG)を TBSで 30, 000倍に希釈し使用した
* 質： 4-Methy lumber iferyl phosphate (4-MUP)
抗体検出量を図 1 1、 非特異吸着量を図 1 2に示す。 PEHA_Ph- PEG- 0Hで プロッキングした場合にも検出感度は低下せず、 非特異吸着が大きく抑 制されていることが確認された。
図 1 3に S/N比を示す。 アルブミンブロッキングに比べて効果的であ る。
実施例 1 4 ウェスタンプロッ ト法 （ 1 )
B SA検出系としてウェスタンブロット法を用い、 各種プロッキング 剤と本発明で用いるポリマーの比較を行った。 S D Sポリアクリルァミ ドゲル電気泳動 （S D S— PAGE) により分離した B SAを、 ゲルか らポリフッ化ビニリデン （PVD F) 膜 （ィモビロン P、 日本ミ リポア 社製） に 1 c m2あたり 1 mAの定電流で、 2時間転写を行った。 ゼラ チン （E I Aグレード試薬、 パイオラッド社製）、 ァセタ^"ルーポリエチ レンダリコール/ポリメタタリル酸ジメチルァミノエチルプロック重合 体 （acetal— P E G— b— P AMA)、 及びメ トキシ一ポリエチレングリ コ一ル ポリ乳酸ブロック重合体 （ P L Aの分子量の違いによ り、 methoxy- P E G— P LA 5 0 0 0と methoxy— P E G— P LA 5 0 0の 2種類を用いた） を用いて、 ブロッキング剤の性能比較を行った。 ブロッキング操作は、 転写した膜を 1 %ポリマー含有 P B S溶液に浸漬 し、室温で 2時間または 4 °Cで一晩、軽く振とうすることにより行った。 検出は、 一次抗体として抗 B S A抗体 （ゥサギ）、 二次抗体として、 ビ ォチン標識抗ゥサギ抗体 （ロバ） を用い、 蛍光標識ス トレプトアビジン により行った。 結果を図 14に示す。 図から、 従来汎用されているゼラ チンに比べて、 本発明で用いるポリマーでは良好な非特異吸着抑制効果 が観察される。
実施例 1 5 ガラス表面の P EGコーティング処理
本発明の表面処理剤を用いてガラス基盤表面に P EGグラフト鎖を構 築した。 測定には、 分子量の異なる二種類の Acetal-PEG-b-PAMA (サ ンプル①： P E G Mw = 4,6 0 0、 P AM A Mw= 3,8 0 0および サンプル②： P EG M = 1 0,000 , PAMA Mw= 3,800) を用いた。 ζ電位測定に用いるガラス板 （ 1 5 X 30 X l mm) は、 使 用前に濃硫酸：過酸化水素水 = 1 ： 1のピラニア溶液を用いて 80°Cで 1時間煮沸洗浄を施し、 脱イオン水で数回置換したあと超音波洗浄を 1 0分間おこなった。
コーティング処理：処理法① （湯浴中、 酸性条件下で吸着 （分子運動 の活性化） ζ電位測定時のイオン強度に合わせ、また PAMA のプロ ト ン化促進のため試験官に 7.5 mMの HC 1水溶液 （p H = 2.1 ) 1 5 m 1 を調製し、 5 0 °Cおよび 8 0 °Cの湯浴中で、 0.5 w t %の Acetal-PEG-b-PAMA溶液 1 0m l を調整、 温度を保ったまま、 ガラス を浸漬し 1時間静置することにより、 ガラス表面処理を行った。
処理法② （高塩濃度水溶液中において、 室温 ·酸性条件下で吸着） 1 M N a C 1含有 7.5 mM H C 1 水溶液（ρ Η 2.1 ) 1 0 m 1を 調製し、 1 m g/m 1の濃度で Acetal-PEG-b-PAMA を溶解した。本溶 液中にガラスを浸漬し 30分室温で静置し、 1M N a C 1含有 7.5 m M HC 1水溶液 （p H2.1) で洗浄し、 再び上記の P E G水溶液に 3 0分静置することにより表面処理を行った。
以上のサンプルを用い、 表面処理による電気浸透流の抑制効果を ζ電 位の ρ Η依存性をもとに評価した。
ζ電位測定：大塚電子株式会社製 L Ε Ζ Α— 600型装置を用い、 レ 一ザ一ドップラー法により測定をおこなった。 ζ電位の ρ Η依存性は酸 性側から初めて、 ρ Η 3、 5、 7、 8'、 9、 1 0と上げていき、 測定は 各 ρ Ηにっき 2〜 3回おこない、 安定した値を測定値とした。
ζ電位の ρ Η依存性：未修飾ガラスと 25、 50、 8 0°Cに置いて吸 着処理を施した P E G修飾ガラス表面における ζ電位の ρ Η依存性を図 1 5に示す。 Acetal-PEG-b-PAMA を用いることにより、 未修飾ガラス に比較して、 p Hによる表面電位の変動が小さく、 表面が外部環境の影 響を受けにくい表面が構築された。
実施例 1 6 ウェスタンブロッ ト法 （2)
ウェスタンブロッ ト法における発色系として、 アル力リフォスファタ ーゼ標識二次抗体を用い、 ひ一フヱ トプロテイン （以下、 AF P) の検 出系における本発明のプロック共重合体のプロッキング効果を、 従来汎 用されているブロッキング剤と比較した例を示す。 サンプルとして、 ① 1 0倍希釈した正常人血清で 8,0 0 0 I U/m 1 となるように AF P を希釈したもの、 およぴ②蛋白濃度 20 μ g/m 1の細胞抽出液で 8, 000 1 U/m 1 となるように AF Pを希釈したものを用い、 実施例 1 4に記載した方法に準じて、 ゥシ血清アルブミン （B SA) とメ トキシ —ポリエチレングリコール/ポリ乳酸プロック重合体（P EG- P L A) におけるプロッキング効果の比較を行った。
検出は、 一次抗体として抗 A F P抗体 （ゥサギ）、 二次抗体として、 ァ ルカリフォスファターズ標識 抗ゥサギ抗体（ロバ）を用い、気質として、 5—プロモー 4一クロ口一 3—インドリノレフォスフェー ト/ニ トロプノレ ーテトラゾリ ゥム （B C I PZNB PT) を用いた。
結果を図 1 6に示す。 図から従来汎用されている B S Aに比較して、 本発明における表面処理剤 MethoxyP EG-P LA 500 0において、 良好な非特異吸着抑制効果によるバックグラウンドの低減が観察された。 図 1 6中の略号および各施行番号は、 以下の意味を有する。
A ： B S Aを用いた場合
① 一次抗体 5 0 0 0倍希釈、 二次抗体 2 500倍希釈
② 一次抗体 5 0 0 0倍希釈、 二次抗体 5 000倍希釈
③ 一次抗体 5 0 0 0倍希釈、 二次抗体 1 0000倍希釈
④ 一次抗体 1 0 0 00倍希釈、 二次抗体 2500倍希釈
⑤ 一次効体 1 0 0 00倍希釈、 二次抗体 5000倍希釈
⑥ 一次抗体 1 0 0 00倍希釈、 二次抗体 1 0000倍希釈
B ： ： MethoxyP E G -P LA 5000を用いた場合
⑦ 一次抗体 5 0 0 0倍希釈、 二 .次抗体 2500倍希釈
⑧ 一次抗体 5 0 0 0倍希釈、 二 .次抗体 5000倍希釈
⑨ 一次抗体 5 0 0 οί¾· 釈、 一次抗体 1 0 0 0 0倍希釈
⑩ 一次抗体 1 0 0 00倍希釈、 二次抗体 2500倍希釈
⑪ 一次抗体 1 0 0 00倍希釈、 二次抗体 5000倍希釈
⑫ 一次抗体 1 0 0 00倍希釈、 二次抗体 1 0000倍希釈 実施例 1 7 P EGセグメントを含有するグラフト共重合体を用いたマ イク口流路の表面処理
シリコーンコンパゥンド表面を、 P E Gグラフトポリマーで修飾する ことによる表面の改質、 およびタンパク吸着について検討した。
シリコーンコンパウンドの作製： ダウコ一ニング社製 S I L I GAR
D 1 8 4 E LA S TME R K I T を用い、 S I L I CONE E LAS TMER ： S I L I CONE E LA S TMER CUR I N G AGENT= 1 0 : 1 (重量比） を混合して、ガラス製の型に流し、 6 5でで 1時間、 さらに 1 0 0°Cで 1時間処理することにより、 シリコ ーン基板の成型加工を行った。
上記の方法で調製したシリコーン表面を洗浄の後、 ポリメ トキシシリ ルプロピルメタクリ レート一 P EGグラフト共重合体 (P T S PM- g — P EG oo P EGホモポリマー （P EG1 10。） を室温で 4時間反 応させ、 シリ コーン表面を P EGブラシで修飾した。
上記の方法で調製した表面における、 ζ電位の比較を行った。 その結 果を図 1 7に示す。 本発明による方法で処理した表面は、 ρ Ηによる表 面電位の変化が少なく、 電気的に中性であり、 イオン的相互作用の少な い表面であることが示された。
実施例 1 8ポリジメ トキシシリル （P PMS) を作成する際にモール ド表面に P T S ΡΜ- g - P E G又は重合性ビュル基を有する P E Gマ ク口モノマーを塗っておくことによる一括表面処理法。
基盤となる P DM Sを重合する際に、 ガラス表面に直接 P E Gを含む グラフ ト共重合体、 P T S PM— g— P EG^。。をスピンコートし、 そ のガラスをモールドとして、 P D M Sの重合と同時に P E Gによる表面 処理を行い、 ζ電位による評価を行った。
上記方法により処理した表面の、 ζ電位、 およびゥシ血清の非特異吸 着性を評価した。 その結果を.、 図 1 8に示す。 未処理のシリ コーン表面 力 S、 マイナスに帯電しているのに対し、 P T S P M— g — P E G 丄 0 0 で処理した表面は、 p H 4 〜 8の範囲で、 ほぼ中性を示し、 P E Gブラ シで表面が修飾されたことが示された。
また、 処理表面へのタンパク質の非特異吸着を蛍光標識したアルブミ ン、 および I g Gを用いて評価した結果を、 それぞれ図 1 9 ， 2 0に示 す。いずれのタンパク質の場合も表面処理により吸着性が著しく減少し、 しかも未処理のシリコーン表面では吸着量のばらつきが大きいのに対し、 処理表面では再現性よく、 非特異吸着の抑制が達成された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 バイオセンサー基材表面への血液、 血漿等の試料中 に存在する夾雑タンパク質等の非特異吸着を有意に抑制した基材表面を 提供できる。 したがって、 バイオセンサーの製造業またはバイオセンサ 一を用いる、 例えば臨床診断業において利用できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 被分析物を検出するための物質または被分析物が固定された基材表 面であって、 基材表面を該物質または被分析物と同時にか、 または該表 面に該物質または被分析物が固定された後に、 ポリエチレングリコール 鎖セグメントをベースにする非架橋ポリマー含有液で処理して形成され た基材表面。
2. 被分析物を検出するための物質または被分析物が特異的結合対の一 員である請求項 1記載の基材表面。
3. 特異的結合対の一員が抗原、 ハプテン、 抗体、 オリゴ核酸、 酵素、 酵素の基質、 糖、 レクチン、 ホルモン、 受容体タンパク質、 アビジンお よびピオチンからなる群より選ばれる請求項 2記載の基材表面。
4. ポリエチレングリコール鎖セグメントをベースにする非架橋ポリマ 一が、 式 （ I ) ：
R1— 一（CH2CH2O)n— L2— X ( I ) (式中、 R1は水素原子、 メチル、 保護されていてもよいホルミル、 保護されていてもよいァミノ、 保護されていてもよいカルボキシ、 保護されていてもよいヒ ドロキシルまたはビニルスルホニル基を表 し、
Lェおよび L 2は相互に独立して、原子価結合またはリンカ一を表 し、
Xは多孔質粒子表面に当該ポリマー分子を固定することのできる 共有結合または物理的相互作用を介する結合を形成するための官能 基または機能性部分を表し、 そして
nは 2〜20，000の整数である） で表される請求項 1記載の基材表面。
5 . Xがメルカプト基、 シラノール基、 カルボキシル基、 アミノ基、 ま たはモノーもしくはジー低級アルキル置換ァミノ基を側鎖に有するオリ ゴまたはポリマー主鎖部分、 メルカプト基を側鎖に有するオリゴまたは ポリマー主鎖部分、 シラノール基を側鎖に有するオリゴまたはポリマー 主鎖部分、 力ルポキシル基を側鎖に有するオリゴまたはポリマー主鎖部 分、 スルホ基を側鎖に有するオリゴまたはポリマー主鎖部分、 ヒ ドロキ シル基を側鎖に有するオリゴまたはポリマー主鎖部分、 複数のィミノ基 (一 N H—） を主鎖に有するオリゴまたはポリイミン主鎖部分、 オリゴ またはボリラクチド主鎖部分からなる群より選ばれる請求項 4記載の基
6 . 基材表面が電気化学センサー表面、 表面プラズモンセンサー表面、 水晶発振センサー表面、 固相化酵素免疫アツセィ （E L I S A ) 用マイ クロプレート表面、 タンパク質プロッ トもしくは核酸プロッ ト用プラス チックフィルム表面、 および核酸のハイプリダイゼーシヨン用マイクロ ァレイ表面からなる群より選ばれる請求項 1記載の表面。
7. 基材表面が金粒子表面、 半導体ナノ粒子表面、 磁性体粒子表面、 シ リカ粒子表面、 多孔質粒子表面、 およびこれらの粒子のいずれか一種を 含むラテックス粒子表面からなる群より選ばれる請求項 1記載の表面。
8. ( A ) 基材表面を用意し、
( B ) 該基材表面に固定しうるように修飾された被分析物を検出するた めの物質または被分析物の水性溶液およびポリエチレングリコール鎖セ グメントをベースにする非架橋ポリマー含有液を、同時かまたは続いて、 それぞれが （A ) の基材表面に固定化されるのに +分な条件下で該基材 表面と接触させることを特徴とする請求項 1記載の基材表面の作製方法
9. ポリエチレングリコール鎖セグメントをベースにする非架橋ポリマ 一が、 式 （ I ) ：
R 1 - L！ - (CH2 CH2 θ)η - L 2 - X ( I ) (式中、 R1は水素原子、 メチル、 保護されていてもよいホルミル、 保護されていてもよいァミノ、 保護されていてもよいカルボキシ、 保護されていてもよいヒ ドロキシルまたはビニルスルホニル基を表 し、
L およぴし 2は相互に独立して、原子価結合またはリンカーを表 し、
Xは多孔質粒子表面に当該ポリマー分子を固定することのできる 共有結合または物理的相互作用を介する結合を形成するための官能 基または機能性部分を表し、 そして
nは 2〜 20,000の整数である）
で表される請求項 7記載の方法。
1 0. 請求項 1〜 6のいずれかの一項に記載の基材表面を備えたバイオ センサ一。
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