JP2008170417A - 非特異吸着防止剤ならびにプローブ結合粒子およびそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】製造が容易であり、かつ、十分なノイズ低減効果を有する非特異吸着防止剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法を提供する。
【解決手段】非特異吸着防止剤の製造方法は、（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、（Ｂ）アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンとを反応させる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、例えば免疫診断用粒子の表面に適用可能な非特異吸着防止剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法に関する。

近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子などの固相を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出法として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。これらの検出技術の発展により、理論上は一分子の検査対象物質の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、血清などの生体分子混在下で特定の物質を検出する診断では、共存する生体分子や２次抗体、発光基質などが固相へ非特異的に吸着し、その結果、ノイズが増加して高感度化の妨げとなっている。そのため、免疫診断測定においては、特異的に結合する物質以外の物質が免疫反応に使用する固相表面に吸着すること（非特異吸着）による感度の低下を軽減するため、通常、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の生物由来物質をブロッキング剤（または「非特異吸着防止剤」ともいわれる。）として用いることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減させている。

しかしながら、このようなブロッキング操作を施しても、なお、非特異的な吸着が残るうえ、このような生体由来のブロッキング剤を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の可能性があること等から、化学合成による高性能のブロッキング剤の開発が望まれている。

化学合成によるブロッキング剤としては、ポリオキシエチレンを側鎖に有するビニルモノマーの共重合体が提案されているが（特許文献１）、このような共重合体の製造では、分子量の再現性に乏しく、結果として、ブロッキング効果の再現性に乏しい。他に、片末端にアミノ基を２個有するポリオキシエチレンが提案されているが（特許文献２）、このようなブロッキング剤は固相への相互作用が不十分であり、添加したブロッキング剤の多くが水相中に残存し、経済的でない。さらに、ポリオキシエチレン／ペンタエチレンヘキサミンブロック共重合体がブロッキング剤として提案されているが（特許文献３）、このような共重合体の合成では、ポリオキシエチレンの両末端がペンタエチレンヘキサミンで修飾された化合物が生成しやすく、製造・精製に困難を要する。また、ポリオキシエチレン／ペンタエチレンヘキサミンブロック共重合体と類似のブロッキング剤として、アセタール末端のポリオキシエチレンを中間体とした製造方法が開示されているが（特許文献４）、この製造方法では、ポリオキシエチレンの二量体が多く生成し、製造・精製に問題がある。
特開平１１−２８７８０２号公報 特許第３４０７３９７号明細書 特開２００６−２２６９８２号公報 再公表特許第ＷＯ２００５／０１０５２９号明細書

本発明の目的は、製造が容易であり、十分なノイズ低減効果を有する化学合成の非特異吸着防止剤ならびにプローブ結合粒子およびそれらの製造方法を供することである。

本発明者らは、この課題を解決するために、非特異吸着防止剤として製造が容易な合成方法を見いだし、さらには、本非特異吸着防止剤を用いて、免疫診断用粒子を処理することにより、該粒子がシグナル増強効果を発現することを見いだし、本発明を完成した。

本発明の一態様に係る非特異吸着防止剤の製造方法は、
（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、
（Ｂ）アミノ基およびイミノ基（−ＮＨ−）あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンとを反応させる。

上記非特異吸着防止剤の製造方法において、
前記（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物は、
ポリオキシエチレンモノメチルエーテルと、
ｐ−トルエンスルホン酸クロライドとを、
アミン化合物の存在下で反応させた反応物であることができる。

上記非特異吸着防止剤の製造方法において、
前記アミン化合物は、トリメチルアミン塩酸塩、トリメチルアミン臭化水素酸塩、トリメチルアミンフッ化水素酸塩、トリメチルアミン硫酸塩、トリメチルアミン硝酸塩、トリメチルアミンリン酸塩、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンからなる群から選ばれる１種以上であることができる。

上記非特異吸着防止剤の製造方法において、
前記アミン化合物が、トリメチルアミン塩酸塩とトリメチルアミン以外のアミン化合物を混合したものであることができる。

本発明の一態様に係る非特異吸着防止剤は、下記一般式（１）で表される化合物を含む。

・・・・・（１）
［式中、ｎは４〜２０００で表される数であり、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立に、水素原子、または、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を１〜１１個有する基を示し、かつ、Ｒ^１およびＲ^２に含まれるアミノ基およびイミノ基の合計は２〜１１個である。］
上記非特異吸着防止剤において、上記一般式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ下記一般式（２ａ）および（２ｂ）で表される基であることができる。

・・・・・（２ａ）

・・・・・（２ｂ）
［式中、ｘ１およびｘ２はそれぞれ１〜４で表される数であり、ｙ１およびｙ２はそれぞれ０〜１１で表される数であり、ｙ１＋ｙ２は２〜１１である。］
本発明の一態様に係るプローブ結合粒子の製造方法は、
粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
上記非特異吸着防止剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、を含む。

上記プローブ結合粒子の製造方法において、前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有することができる。

上記プローブ結合粒子の製造方法において、前記粒子は、磁性粒子であることができる。

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記プローブ結合粒子の製造方法によって得られる。

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記非特異吸着防止剤を表面に有する。

上記非特異吸着防止剤は、製造が容易であり、かつ、化学合成品であることから生物汚染の可能性がないうえ、従来用いられてきた非特異吸着防止剤に比べて、ノイズ低減効果が高い。

また、上記非特異吸着防止剤は、免疫診断に使用される粒子（例えば磁性粒子）に用いた場合にシグナル増強効果を発現することができる。

以下、本発明の一実施形態に係る非特異吸着防止剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法について説明する。

１．非特異吸着防止剤およびその製造方法
本発明の一実施形態に係る非特異吸着防止剤は、（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と（Ｂ）アミノ基およびイミノ基（−ＮＨ−）あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンとの反応生成物である。本実施形態に係る非特異吸着防止剤は例えば、粒子のシグナル増強剤として好適である。また、本実施形態に係る非特異吸着防止剤は上記反応生成物それ自体であってもよいし、あるいは、必要に応じて溶媒を含んでいてもよい。

以下、本実施形態に係る非特異吸着防止剤の製造および構成について説明する。

１．１．（Ａ）トシル化物
（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物とは、ポリオキシエチレンモノメチルエーテルをトシル化することにより得られるα−メチル−ω−トシルポリオキシエチレンである。なお、本発明において、「トシル化」とは、水酸基（−ＯＨ）をｐ−トルエンスルホニルオキシ基（−ＯＴｓ基）に変換することをいう。

本実施形態において、ポリオキシエチレンモノメチルエーテルは、公知のものを使用することができ、例えば、日本油脂社製ユニオックスＭシリーズ、日本乳化剤社製ＭＰＧシリーズ、ライオン社製レオソルブＰＥＭシリーズなどとして、各種分子量のものが工業的に入手可能である。

ポリオキシエチレンモノメチルエーテルの分子量は、好ましくは２００〜１００，０００、さらに好ましくは１，０００〜１０，０００である。分子量が２００未満あるいは１００，０００を超えると、いずれもノイズ低減効果およびシグナル増強効果が不足する場合がある。

ポリオキシエチレンモノメチルエーテルをトシル化する方法としては、公知の方法を適用することができ、例えば、ポリオキシエチレンモノメチルエーテルとｐ−トルエンスルホン酸塩とを反応させることにより、ポリオキシエチレンモノメチルエーテルが有する末端水酸基の水素原子がトシル基に変換される。ｐ−トルエンスルホン酸塩としては、特に限定されないが、ｐ−トルエンスルホン酸クロライド等を挙げることができる。この工程は、典型的には、ポリオキシエチレンモノメチルエーテルをピリジン、ジクロロメタン、アセトニトリル等の有機溶剤に溶解した後、必要に応じてアミン化合物からなるアミン触媒を併用して、ポリオキシエチレンモノメチルエーテル１ｍｏｌ当たり１〜５ｍｏｌのｐ−トルエンスルホン酸クロライドを添加し、室温で１０分〜２４時間反応させることにより行う。以上により、α−メチル−ω−トシルポリオキシエチレンが得られる。

ここでアミン触媒としては、トリメチルアミン塩酸塩、トリメチルアミン臭化水素酸塩、トリメチルアミンフッ化水素酸塩、トリメチルアミン硫酸塩、トリメチルアミン硝酸塩、トリメチルアミンリン酸塩、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどを単独で、または、併用して使用することが好ましい。また、トリメチルアミン塩酸塩とその他のアミン化合物を併用して使用することが、反応時間の短縮、トシル化率の向上のため、特に好ましい。アミン触媒の好ましい使用量は、アミン触媒を単独で使用する場合には、ポリオキシエチレンモノメチルエーテル１ｍｏｌ当たり１．５〜１０ｍｏｌであり、トリメチルアミン塩酸塩とその他のアミンを併用して使用する場合には、トリメチルアミン塩酸塩０．１〜３ｍｏｌ、その他のアミン１．５〜１０ｍｏｌである。反応後のα−メチル−ω−トシルポリオキシエチレンは、ジエチルエーテル、ヘキサンなどで沈殿させて精製してもよい。このような沈殿精製により、残余のｐ−トルエンスルホン酸塩を除去することができ、以下のポリアミンとの副反応を防止することができる。

１．２．（Ｂ）ポリアミン
本実施形態に係る非特異吸着防止剤の製造に用いることのできるポリアミンは、（Ｂ）アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンである。

アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で２個以下有するアミン化合物、すなわち、モノアミンやジアミンを用いると、生成する非特異吸着防止剤と固相との相互作用が不十分であり、添加した非特異吸着防止剤の多くが水相中に残存するため、経済的でないうえに、非特異吸着防止剤で処理した後の洗浄で脱離しやすいために、ノイズ低減効果が不十分である。また、脱離した非特異吸着防止剤が、検査系に添加されるタンパクなどを阻害して、シグナルを低下させる場合がある。

一方、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で１３個以上有するポリアミンを用いると、非特異吸着防止剤で処理した後の固相表面がアミノ基に基づいてカチオン性となり、非特異吸着が増加し、ノイズを悪化させる場合がある。

（Ｂ）アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンとして、具体的には、ジメチレントリミン、トリメチレンテトラミン、テトラメチレンペンタミン、ペンタメチレンヘキサミン、ヘキサメチレンヘプタミン、ヘプタメチレンオクタミン、オクタメチレンノナミン、ノナメチレンデカミン、デカメチレンウンデカミン、ウンデカメチレンドデカミンなどのポリメチレンアミン；ジエチレントリミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ヘキサエチレンヘプタミン、ヘプタエチレンオクタミン、オクタエチレンノナミン、ノナエチレンデカミン、デカエチレンウンデカミン、ウンデカエチレンドデカミンなどのポリエチレンアミン；スペルミン、スペルミジンなどのプロピレン−ブチレン系アミン類などを挙げることができ、これらは単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。非特異吸着防止剤としての水への溶解性およびノイズ低減効果などを考慮すると、（Ｂ）ポリアミンはポリエチレンアミンであることが好ましく、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミンであることがより好ましく、ペンタエチレンヘキサミンであることがさらに好ましい。

１．３．非特異吸着防止剤の製造
（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と（Ｂ）アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンとの反応は、典型的には、（Ａ）トシル化物のモル数に対し、２倍〜１００倍の（Ｂ）ポリアミンを溶解した溶液に、室温〜６０℃で、１〜２４時間かけて（Ａ）の溶液を滴下しながら反応させることにより行うことができる。この工程で好適に使用できる溶媒は、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミドなどの非プロトン系の極性溶剤である。以上の工程により、本実施形態に係る非特異吸着防止剤が生成する。

生成した非特異吸着防止剤は、ジエチルエーテル、イソプロピルアルコールなどの有機溶媒で沈殿させて精製することが好ましい。このときの有機溶媒として、非極性溶媒と極性溶媒の混合溶媒、例えば、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒なども好適に使用できる。その他の精製方法として、生成した非特異吸着防止剤溶液を水に溶解して、透析チューブ、ダイアライザー、アシライザーなどにより低分子化合物を除去してもよい。この場合、水に溶解する前に有機溶剤をエバポレーターで除去しても良い。このような精製により、残余のポリアミンやトシル化合物、触媒などを除去することができ、ノイズ低減効果を高く維持することができる。

１．４．非特異吸着防止剤の構造
本実施形態に係る非特異吸着防止剤の典型的な構造は、α−メチル−ω−ポリアミノ化ポリオキシエチレンである。

本実施形態に係る非特異吸着防止剤は、ポリアミンの末端１級アミノ基とポリオキシエチレンの末端とが結合してもよいし、ポリアミンの非末端の２級アミノ基とポリオキシエチレンの末端とが結合してもよい。

また、１分子のポリアミンに対し、２分子以上のポリオキシエチレンが結合していてもよい。すなわち、ポリアミンの末端１級アミノ基および非末端の２級アミノ基の両方がそれぞれポリオキシエチレンの末端に結合していてもよい。

ノイズ低減効果およびシグナル増強効果の観点から、本実施形態に係る好ましい非特異吸着防止剤の構造は、１分子のポリアミンに対して、１分子のポリオキシエチレンが結合した構造である。１分子のポリアミンに対して１分子のポリオキシエチレンが結合した非特異吸着防止剤をカラム精製により単離してもよい。なお、１分子のポリアミンに対して、何分子のポリオキシエチレンが結合しているかは、液体クロマトグラフィーによる分子量測定により判別可能である。

本実施形態に係る非特異吸着防止剤において、ポリアミンの末端１級アミノ基または２級アミノ基とポリオキシエチレンの末端とが結合している場合、本実施形態に係る非特異吸着防止剤は例えば、下記一般式（１）で表される構造である化合物を含むことができる。

・・・・・（１）
［式中、ｎは４〜２，０００で表される数であり、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立に、水素原子、または、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を１〜１１個有する基を示し、かつ、Ｒ^１およびＲ^２に含まれるアミノ基およびイミノ基の合計は２〜１１個である。］
上記一般式（１）において、ｎは２０〜２００であるのが好ましい。

この場合、上記一般式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ下記一般式（２ａ）および（２ｂ）で表される基であってもよい。

・・・・・（２ａ）

・・・・・（２ｂ）
［式中、ｘ１およびｘ２はそれぞれ１〜４で表される数であり、ｙ１およびｙ２はそれぞれ０〜１１で表される数であり、ｙ１＋ｙ２は２〜１１である。］
上記一般式（２）において、ｘ１およびｘ２は２であるのが好ましく、ｙ１およびｙ２はそれぞれ１〜６（ただし、ｙ１＋ｙ２＝２〜１１を満たす。）であることがより好ましい。

１．５．非特異吸着防止剤の用途およびプローブ結合粒子の製造
本実施形態に係る非特異吸着防止剤は、従来の免疫診断測定において用いられたアルブミン、カゼイン、ゼラチン等を代替することにより、さらに非特異吸着を抑制して、ノイズを低減することができる。

例えば、プレート法において、プレートへ抗体などのプローブを結合した後、本実施形態に係る非特異吸着防止剤を添加して、プレート表面を処理することができる。

また、本実施形態に係る非特異吸着防止剤は例えば、プローブ結合粒子の製造に好適に使用することができる。本実施形態に係るプローブ結合粒子の製造方法は、粒子の表面にプローブを結合させる工程と、本実施形態に係る非特異吸着防止剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程とを含む。

ここで、本実施形態に係る非特異吸着防止剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程は、例えば、本実施形態に係る非特異吸着防止剤を粒子の表面に所定時間接触させることにより行うことができる。これにより、粒子表面における非特異吸着を抑制し、ノイズを低減することができる。また、この工程は例えば、本実施形態に係る非特異吸着防止剤の溶液中に粒子を分散させた状態で行うことができる。

この場合、プローブを結合させる粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を少なくとも表面に有することが好ましい（その理由については後述する）。また、この場合、粒子は磁性粒子であることが好ましい。

より具体的には、例えば、イムノクロマト法において、着色粒子に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係る非特異吸着防止剤を添加して、着色粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。また、例えば、ＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡなどのアッセイ法において、磁性粒子の表面に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係る非特異吸着防止剤を添加して、該磁性粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。

以上に説明したように、本実施形態に係る非特異吸着防止剤によれば、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減することができる。

本実施形態に係る非特異吸着防止剤を用いて、特にカルボキシル基、活性エステル基、トシル基、エポキシ基などの活性基を少なくとも表面に有する粒子（例えば磁性粒子）を処理する場合、非特異吸着防止剤中のアミノ基と粒子表面の活性基とが共有結合を形成し、免疫診断用抗体の配向性を向上させることから、シグナルを増強する効果が発現する。また、非特異吸着防止剤の脱離を抑制することができるため、界面活性剤などを含むバッファー類に対して、極めて安定性に富んだ検査試薬となる。

本実施形態に係る非特異吸着防止剤が特に良好な効果を発現する担体は、カルボキシル基を有する粒子（例えば磁性粒子）である。その好ましい処理方法としては、カルボキシル基を有する粒子を水溶性カルボジイミドなどで活性エステルとし、免疫診断プローブを結合した後、本実施形態に係る非特異吸着防止剤（シグナル増強剤）で処理する方法が挙げられる。

本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上述のプローブ結合粒子の製造方法によって得ることができる。例えば、本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上述の非特異吸着防止剤を表面に有することができる。

２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

２．１．実施例１
平均分子量４，０００のポリオキシエチレンモノメチルエーテル（日本油脂（株）製、商品名「ユニオックスＭ−４０００」）１０ｇをピリジン１００ｇに溶解させ、攪拌機付きセパラブルフラスコに入れた。別の容器にてｐ−トルエンスルホン酸クロライド２ｇをピリジン２０ｇに溶解させて得られた溶液を、前記セパラブルフラスコに１時間かけて滴下し、さらに室温で６時間反応させた。得られた反応物をジエチルエーテル１Ｌに滴下し、沈殿精製することにより、残余のｐ−トルエンスルホン酸塩を除去して、ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物（Ａ−１）８ｇを得た。

また、ペンタエチレンヘキサミン（Ｂ−１）２ｇを溶解させた５０ｇの水溶液を攪拌しながら、室温で２時間かけて、トシル化物（Ａ−１）８ｇを溶解させた８０ｇの水溶液を滴下しながら反応させた。得られた反応物をジエチルエーテル１Ｌに滴下し、沈殿精製することにより残余のペンタエチレンヘキサミン（Ｂ−１）を除去し、さらに真空乾燥することにより、非特異吸着防止剤（Ｃ−１）６ｇを得た。この非特異吸着防止剤（Ｃ−１）の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量４，２００をメインピークとするブロードなピークであり、高分子量側にわずかなショルダーが見られた。滴定による塩基価は、１．１ｍｍｏｌ／ｇであった。

次いで、カルボキシル基を有する磁性粒子（ＪＳＲ社製ＭＡＧ１１０１）１ｍｇを分散させた固形分濃度１％の水分散体に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）水溶液を添加して室温で２時間回転攪拌することにより、カルボキシル基を活性化した。これを磁気分離して上清を捨てた後、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ（株）製）１０μｇを加え３時間室温で反応させた。反応後、非特異吸着防止剤（Ｃ−１）の０．４％水溶液に、上記粒子の水分散体１２５μＬ加え、さらに１５時間室温で反応させた。これを磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、一次プローブとして抗ＡＦＰ抗体を結合したプローブ結合粒子（免疫検査用粒子）を得た。得られたプローブ結合粒子の分散液１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させた。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁気分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、化学発光量を測定した。

化学発光の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置（商品名：Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７）を用いた。その結果、シグナル強度は１２３５６３ＲＩＵであった。また、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原の標準検体５０μｌの代わりに、ＡＦＰ抗原を含まないＦＣＳ５０μｌを用いた以外は、上記と同様にしてノイズ強度を測定したところ、６７ＲＩＵであった。

２．２．比較例１
実施例１において、ペンタエチレンヘキサミン（Ｂ−１）の代わりにエチレンジアミンを使用した以外は、実施例1と同様にして、比較例１の非特異吸着防止剤を得た。比較例１
の非特異吸着防止剤の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量４０００をメインピークとするブロードなピークであった。滴定による塩基価は、０．２ｍｍｏｌ／ｇであった。シグナル強度は、１０９１０４ＲＩＵ、ノイズ強度は、１０５ＲＩＵであった。

２．３．比較例２
実施例１において、ペンタエチレンヘキサミン（Ｂ−１）の代わりに分子量約１２００のポリエチレンイミン（１分子中の平均アミノ基数２８個）を使用した以外は、実施例１と同様にして、比較例２の非特異吸着防止剤を得た。比較例２の非特異吸着防止剤の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量１１０００のブロードなピークであった。滴定による塩基価は、２．５ｍｍｏｌ／ｇであった。シグナル強度は、６５５０３ＲＩＵ、ノイズ強度は、１８０ＲＩＵであった。

２．４．比較例３
実施例１において、非特異吸着防止剤（Ｃ−１）の代わりに牛血清アルブミンを使用した以外は、実施例１と同様にして、シグナルおよびノイズを測定した。シグナル強度は、９２７６２ＲＩＵであり、ノイズ強度は、８３ＲＩＵであった。

２．５．比較例４
実施例１において、非特異吸着防止剤（Ｃ−１）を使用しなかった以外は、実施例１と同様にして、シグナルおよびノイズを測定した。シグナル強度は、９４６７３ＲＩＵであり、ノイズ強度は、１２３ＲＩＵであった。

以上の結果より、実施例１の非特異吸着防止剤（Ｃ−１）は、（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、（Ｂ）アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンとの反応物であるため、非特異吸着防止剤として牛血清アルブミンを使用した場合（比較例３）および非特異吸着防止剤を使用しなかった場合（比較例３）と比較して、十分なノイズ低減効果を有することが確認された。

これに対して、比較例１の非特異吸着防止剤は、（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で２個以下有するポリアミンとの反応物であるため、ノイズ低減効果が不充分であった。また、比較例２の非特異吸着防止剤は、（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で１３個以上有するポリアミンとの反応物であるため、ノイズが増加した。

２．５．実施例２
平均分子量５，０００のポリオキシエチレンモノメチルエーテル（Ｆｌｕｋａ社製）１００ｇ、トリメチルアミン塩酸塩５ｇ、トリプロピルアミン８ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸クロライド８ｇをアセトニトリル３００ｇに溶解し、攪拌機付きセパラブルフラスコに入れ、攪拌しながら３０℃で２時間反応させることにより、ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物（Ａ−２）の溶液を得た。

また、ペンタエチレンヘキサミン（Ｂ−２）４７ｇをアセトニトリル２３０ｇに溶解し、別の攪拌機付きセパラブルフラスコに入れ、攪拌しながら４０℃に保ち、上記トシル化物（Ａ−２）を1時間かけて滴下し、さらに９時間攪拌を続けて反応させた。反応後、室温で１６時間静置し、沈殿した副生成物をデカンテーションで除いた。デカンテーションで得られた上清をエバポレーターで濃縮し、これを水５００ｇに溶解してからろ過し、さらにダイアライザーを用いて精製することにより、非特異吸着防止剤（Ｃ−２）の２％水溶液を得た。この非特異吸着防止剤（Ｃ−２）の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量５，２００をメインピークとするピークであり、高分子量側にわずかなショルダーが見られた。プロトンＮＭＲによるイミノ基に隣接するＣＨのピーク面積とエーテル結合のＣＨのピーク面積の比から、ポリオキシエチレンモノメチルエーテルとペンタエチレンヘキサミンは１：１で結合していることを確認した。

次いで、カルボキシル基を有する磁性粒子（ＪＳＲ社製ＭＡＧ２３０３）１ｍｇを分散させた固形分濃度１％の水分散体に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）水溶液を添加して室温で２時間回転攪拌することにより、カルボキシル基を活性化した。これを磁気分離して上清を捨てた後、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ（株）製）１０μｇを加え３時間室温で反応させた。反応後、非特異吸着防止剤（Ｃ−１）の０．４％水溶液に、上記粒子の水分散体１２５μＬ加え、さらに１５時間室温で反応させた。これを磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、一次プローブとして抗ＡＦＰ抗体を結合したプローブ結合粒子（免疫検査用粒子）を得た。得られたプローブ結合粒子の分散液１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させた。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁気分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、化学発光量を測定した。

化学発光の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置（商品名：Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７）を用いた。その結果、シグナル強度は１８２９８３ＲＩＵであった。また、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原の標準検体５０μｌの代わりに、ＡＦＰ抗原を含まないＦＣＳ５０μｌを用いた以外は、上記と同様にしてノイズ強度を測定したところ、７２ＲＩＵであった。

２．６．比較例５
実施例２において、ペンタエチレンヘキサミン（Ｂ−２）の代わりにエチレンジアミンを使用した以外は、実施例２と同様にして、比較例５の非特異吸着防止剤を得た。比較例５の非特異吸着防止剤の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量５０００をメインピークとするピークであった。滴定による塩基価は、シグナル強度は、１３５８７２ＲＩＵ、ノイズ強度は、１０７ＲＩＵであった。

２．７．比較例６
実施例２において、ペンタエチレンヘキサミン（Ｂ−２）の代わりに分子量約１２００のポリエチレンイミン（１分子中の平均アミノ基数２８個）を使用した以外は、実施例２と同様にして、比較例６の非特異吸着防止剤を得た。比較例６の非特異吸着防止剤の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量１２０００のブロードなピークであった。シグナル強度は、７２３７７ＲＩＵ、ノイズ強度は、１９３ＲＩＵであった。

２．８．比較例７
実施例２において、非特異吸着防止剤（Ｃ−２）の代わりに牛血清アルブミンを使用した以外は、実施例２と同様にして、シグナルおよびノイズを測定した。シグナル強度は、１２９２４６ＲＩＵであり、ノイズ強度は、９０ＲＩＵであった。

２．９．比較例８
実施例２において、非特異吸着防止剤（Ｃ−２）を使用しなかった以外は、実施例２と同様にして、シグナルおよびノイズを測定した。シグナル強度は、１２７１９５ＲＩＵであり、ノイズ強度は、１３１ＲＩＵであった。

以上の結果より、実施例２の非特異吸着防止剤（Ｃ−２）は、（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、（Ｂ）アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンとの反応物であるため、非特異吸着防止剤として牛血清アルブミンを使用した場合（比較例７）および非特異吸着防止剤を使用しなかった場合（比較例７）と比較して、十分なノイズ低減効果を有することが確認された。

これに対して、比較例５の非特異吸着防止剤は、（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で２個以下有するポリアミンとの反応物であるため、ノイズ低減効果が不充分であった。また、比較例６の非特異吸着防止剤は、（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を合計で１３個以上有するポリアミンとの反応物であるため、ノイズが増加した。

Claims (11)

1. （Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物と、
   （Ｂ）アミノ基およびイミノ基（−ＮＨ−）あるいはいずれか一方を合計で３〜１２個有するポリアミンとを反応させる、非特異吸着防止剤の製造方法。
2. 前記（Ａ）ポリオキシエチレンモノメチルエーテルのトシル化物は、
   ポリオキシエチレンモノメチルエーテルと、
   ｐ−トルエンスルホン酸クロライドとを、
   アミン化合物の存在下で反応させた反応物である、請求項１に記載の非特異吸着防止剤の製造方法。
3. 前記アミン化合物は、トリメチルアミン塩酸塩、トリメチルアミン臭化水素酸塩、トリメチルアミンフッ化水素酸塩、トリメチルアミン硫酸塩、トリメチルアミン硝酸塩、トリメチルアミンリン酸塩、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンからなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載の非特異吸着防止剤の製造方法。
4. 前記アミン化合物が、トリメチルアミン塩酸塩とトリメチルアミン以外のアミン化合物を混合したものである、請求項２または３に記載の非特異吸着防止剤の製造方法。
5. 下記一般式（１）で表される化合物を含む、非特異吸着防止剤。
   

   

   ・・・・・（１）
   ［式中、ｎは４〜２，０００で表される数であり、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立に、水素原子、または、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を１〜１１個有する基を示し、かつ、Ｒ^１およびＲ^２に含まれるアミノ基およびイミノ基の合計は２〜１１個である。］
6. 上記一般式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ下記一般式（２ａ）および（２ｂ）で表される基である、請求項５に記載の非特異吸着防止剤。
   

   

   ・・・・・（２ａ）
   

   

   ・・・・・（２ｂ）
   ［式中、ｘ１およびｘ２はそれぞれ１〜４で表される数であり、ｙ１およびｙ２はそれぞれ０〜１１で表される数であり、ｙ１＋ｙ２は２〜１１である。］
7. 粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
   請求項５または６に記載の非特異吸着防止剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、
   を含む、プローブ結合粒子の製造方法。
8. 前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有する、請求項７に記載のプローブ結合粒子の製造方法。
9. 前記粒子は、磁性粒子である、請求項７または８に記載のプローブ結合粒子の製造方法。
10. 請求項７ないし９のいずれかに記載のプローブ結合粒子の製造方法によって得られるプローブ結合粒子。
11. 請求項５または６に記載の非特異吸着防止剤を表面に有する、プローブ結合粒子。