KR100848105B1

KR100848105B1 - 단백질을 포함하는 폴리다이아세틸렌 센서칩 및 그제조방법

Info

Publication number: KR100848105B1
Application number: KR1020060127701A
Authority: KR
Inventors: 오민규; 안동준; 김종만; 김경우; 최현; 이길선
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-14
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2008-07-24
Also published as: KR20080054955A

Abstract

본 발명은 단백질을 포함하는 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene) 센서칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 분석대상에 대응되는 프루브(probe) 단백질, 폴리다이아세틸렌 소포(vesicle), 및 기판을 결합시켜 분석대상에 별도의 표지처리 없이 빠른 응답시간을 보이는 센서칩 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 단백질 또는 미생물의 검출을 위한 프루브로서의 단백질을 폴리다이아세틸렌 소포에 결합시킴과 아울러, 상기 소포를 글래스슬라이드에 마이크로어레이 형태로 점적, 고정화하여 센서칩을 제조할 수 있으며, 상기 센서칩은 프루브 단백질과 단백질, 또는 프루브 단백질과 미생물의 특정 결합에 의해서만 소포의 색전이 및 형광 발현을 일으킬 수 있어, 본 발명의 마이크로어레이 형태의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 분석대상에 대한 별도의 표지 없이도, 그리고 종래 액상 반응에 비해 훨씬 적은 양의 폴리다이아세틸렌 및 분석대상물로, 단백질-단백질 또는 단백질-세포 수준의 반응을 검출할 수 있다. 나아가, 고감도를 나타내면서도 소형화를 달성하여 휴대가 용이한 장점 또한 가지고 있다. 특히, 입수가 용이하고 소독제나 환경 변화에 대한 내성이 강해 생화학무기로의 활용가능성이 높은 탄저균에 대해서도 짧은 시간 내에 정확한 분석이 가능함을 확인한 바, 진단분야 등에서의 이용가능성도 매우 높은 것으로 판단된다.

폴리다이아세틸렌, 센서칩, 마이크로어레이, 색전이, 형광, 탄저균

Description

단백질을 포함하는 폴리다이아세틸렌 센서칩 및 그 제조방법 {Polydiacetylene Sensor Chip Comprising Protein and Manufacturing Process thereof}

도 1은 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조 및 분석대상물 검출에 대한 일실시예의 개략도이다.

도 2는 본 발명의 단백질(제 2 항체) 검출결과에 대한 일실시예를 촬영한 사진이다.

도 3은 프루브 단백질이 없는 경우 검출결과를 촬영한 사진이다.

도 4는 프루브 단백질과 결합하지 않는 제 2 항체 검출결과를 촬영한 사진이다.

도 5는 본 발명의 대장균 검출결과에 대한 일실시예를 촬영한 사진이다.

도 6은 본 발명의 대장균 검출결과에 대한 또 다른 실시예를 촬영한 사진이다.

도 7은 본 발명의 탄저균 검출결과에 대한 일실시예를 촬영한 사진이다.

본 발명은 단백질을 포함하는 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene) 센서칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 분석대상에 대응되는 프루브(probe) 단백질이 결합된 폴리다이아세틸렌 소포(小胞. vesicle)를 기판에 결합시켜 분석대상에 별도의 표지처리 없이 빠른 응답시간을 보이는 센서칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.

나노바이오센서란 첨단 나노기술에 의해 개선된 바이오센서로서 생체인지물질과의 결합에 의한 반응을 신호로 변환시키며, 특정한 물질에 대해 빠른 검사가 가능한 센서를 가리킨다. 이는 생물학적 개념의 효소-기질 복합체와 같은 원리로 하나의 리간드는 상기 리간드에 대한 특이 성분을 가지는 한 가지 물질에 대해서만 반응성을 보이며, 그 반응성 정도를 측정한다는 원리이다. 나노기술을 응용한 소형화된 바이오센서는 인체손상을 극소화하여 무통 인체진단을 가능하게 하며, 단일 세포를 직접 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한 나노기술을 응용한 높은 안정성, 빠른 응답시간, 고감도, 높은 선택성 등 동작특성이 향상된 바이오센서는 인체진단의 연속측정을 가능하게 하며 단분자 단위의 분석을 수행할 수 있게 한다

한편, 공액 폴리다이아세틸렌 소포는 독특한 발색 성질 때문에 화학적 또는 생물학적 센서로서 많은 연구가 이루어지고 있다. 10,12-펜타코사디이노익 애시드 (10,12-pentacosadiynoic acid. PCDA)와 같은 다이아세틸렌 단량체는 자외선 조사 하에서 1,4-첨가반응을 통해 중합이 이루어지며, 그 형태는 엔-인(ene-yne) 결합이 교대로 나타나는 중합사슬로서, 리포좀(liposome)과 유사한 소포를 형성한다.

상기 폴리다이아세틸렌 소포는 외부 교란, 예컨대 열, pH, 물리적 또는 화학적 자극, 또는 용매 등에 의해 청색에서 적색으로 변색하는 양색 발현능을 보인다. 나아가, 적색의 폴리다이아세틸렌 소포는 형광을 발현하는 성질까지 가지고 있어, 이러한 성질을 이용하여 각종 센서로서 개발되어 왔다. 예를 들어, 폴리다이아세틸렌 센서는 인플루엔자 바이러스, 콜레라 독성물질, 대장균, 올리고누클레오타이드, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides), 항체 및 항원 등을 성공적으로 검출해냈다.

그러나, 지금까지 바이오센서로서의 폴리다이아세틸렌의 적용은 대부분 수용액 상에서 이루어져, 다량의 소포, 항체 및 분석대상물질이 필요한 단점이 있었다. 이러한 한계 때문에 고체 물질 상에 고정화된 미세 패턴 형태의 바이오센서, 즉 바이오칩으로의 가능성이 모색되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 분석대상에 대응되는 프루브(probe) 단백질이 결합된 폴리다이아세틸렌 소포를 기판에 결합시킨 센서칩을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 폴리다이아세틸렌 센서칩을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여,

기판;

상기 기판에 결합되고, 하기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌(diacetylene)이 중합된 소포(vesicle); 및

상기 소포에 결합된 프루브(probe) 단백질

을 포함하는 것을 특징으로 한다:

A-(L₁)_d-(CH₂)_e-C≡C-C≡C-(CH₂)_f-(L₂)_g-B (1)

상기 식에서

d + g는 0, 1 또는 2이고,

e + f는 2 내지 50의 정수이고,

e 및 f는 1보다 큰 정수이고,

A 및 B는 서로 동일하거나 또는 동일하지 않고, 메틸기, 아민기, 카르복실기, 하이드록시기, 말레이미드기, 바이오틴(biotin)기, 하이드록시석신이미드(hydroxysuccinimide)기, 벤조산기 또는 에스테르기이고,

L₁ 및 L₂는 서로 동일하거나 또는 동일하지 않고, 탄소수가 2 이상인 알킬기, 하나 이상의 에틸렌옥시드기, 아민기, 아미드기, 에스테르기 또는 카르보닐기임.

또한, 상기 다이아세틸렌의 일부는 A 또는 B가 바이오틴기 또는 하이드록시석신이미드기인 것이 바람직하다.

또한, 상기 기판과 소포 사이, 상기 소포와 프루브 단백질 사이, 또는 상기 기판과 소포 사이 및 상기 소포와 프루브 단백질 사이가, 아비딘(avidin)-바이오틴 결합, 스트렙타비딘(streptavidin)-바이오틴 결합, 또는 하이드록시석신이미드에 의한 아민 치환결합인 것이 바람직하다.

또한, 상기 다이아세틸렌은 10,12-펜타코사디이노익 애시드 (10,12-pentacosadiynoic acid. PCDA) 또는 PCDA-아닐린(PCDA-aniline), 및 10,12-펜타코사디이노익 애시드-2,2'-(에틸렌디옥시)-비스-(에틸아미드)-석시닉 안하이드라이드-노르말-하이드록시석신이미드 [10,12-pentacosadiynoic acid-2,2'-(ethylenedioxy)-bis-(ethylamide)-succinic anhydride-normal-hydroxysuccinimide. PCDA-EDEA-SA-NHS]의 혼합물인 것이 바람직하다.

또한, 상기 PCDA (또는 PCDA-아닐린) : PCDA-EDEA-SA-NHS의 몰비는 100 : 5 내지 25 인 것이 바람직하다.

또한, 상기 다이아세틸렌은 10,12-펜타코사디이노익 애시드-바이오틴 (10,12-pentacosadiynoic acid-Biotin. PCDA-바이오틴)을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 PCDA (또는 PCDA-아닐린) : PCDA-EDEA-SA-NHS : PCDA-바이오틴의 몰비는 100 : 3 내지 15 : 2 내지 10 인 것이 바람직하다.

또한, 상기 다이아세틸렌은 PCDA-아미노부티릭 애시드 (PCDA-aminobutyric acid. PCDA-ABA), 및 PCDA-바이오틴의 혼합물인 것이 바람직하다.

또한, 상기 PCDA-ABA : PCDA-바이오틴의 몰비는 100 : 5 내지 25 인 것이 바 람직하다.

또한, 상기 다이아세틸렌에 추가로 지질(lipid)이 첨가된 것이 바람직하다.

또한, 상기 지질은 1,2-디미리스토일-락-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-phosphocholine. DMPC)인 것이 바람직하다.

또한, 상기 지질은 다이아세틸렌 : 지질 = 100 : 0.001 내지 70의 몰비로 첨가되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 프루브 단백질은 항체인 것이 바람직하다.

또한, 상기 기판은 아민, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 말레이미드 또는 탄수화물로 표면이 개질된 유리, 금속 또는 플라스틱 재질의 기판인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법은,

(A) 상기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌을 소수성 용매에 용해시키고 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하거나, 물 또는 친수성 용매에 직접 혼합하는 단계;

(B) 상기 혼합된 다이아세틸렌 혼합물을 초음파 처리하여 분산시키는 단계;

(C) 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액을 기판에 점적(spotting)하는 단계; 및

(D) 상기 점적된 다이아세틸렌 분산액을 고정화시키는 단계

를 포함하고, 상기 단계 (B) 이후에,

(E) 상기 다이아세틸렌에 프루브 단백질을 반응시키는 단계; 및

(F) 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액에, 또는 상기 다이아세틸렌 분산액으로 점적된 상기 기판에 자외선을 노광시켜 상기 다이아세틸렌을 중합시키는 단계

를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 단계 (A)의 소수성 용매는 클로로포름, 디메틸포름아미드(dimethylformamide. DMF), 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide. DMSO), 디클로로메탄, 헥산, 사이클로헥산, 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran. THF), 아세톤, 알콜 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 (A)에서 상기 소수성 용매에 용해시킨 후, 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하기 전에,

질소 또는 비활성 기체 (inert gas)를 주입하여 상기 소수성 용매를 제거하는 단계

를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 친수성 용매는 완충액을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 (A)의 물 또는 친수성 용매에 혼합한 후 70 내지 95 ℃에서 10 내지 30 분간 가열하는 단계

를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 상기 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들 이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 외부 자극에 의해 청색에서 적색으로 색전이를 일으키고 적색 형광을 나타내는 폴리다이아세틸렌 소포에 프루브(probe) 단백질을 결합시키고, 상기 소포를 기판에 결합시킨 폴리다이아세틸렌 센서칩을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.

여기서, 폴리다이아세틸렌은 상기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌 단량체를 정렬, 중합시켜 제조한다.

본 발명은 색전이 및 형광을 발현할 뿐만 아니라, 구조적으로 상기 기판 및 프루브 단백질을 매개하는 폴리다이아세틸렌 소포가 기판 및 단백질과 각각 결합할 수 있도록 상기 다이아세틸렌의 일부가 그 말단에 바이오틴기 또는 하이드록시석신이미드기를 가지는 것이 바람직하다.

특히, 상기 기판과 소포 사이, 상기 소포와 프루브 단백질 사이, 또는 상기 기판과 소포 사이 및 상기 소포와 프루브 단백질 사이가, 아비딘-바이오틴 결합, 스트렙타비딘-바이오틴 결합, 또는 하이드록시석신이미드에 의한 아민 치환결합에 의해 결합되는 것이 바람직하다. 이를 통해, 프루브 단백질에 일정한 방향성을 부여함으로써 분석 효율을 높일 수 있게 된다.

아비딘-바이오틴 결합, 스트렙타비딘-바이오틴 결합, 또는 하이드록시석신이미드에 의한 아민 치환결합에 의해 상기 기판 및 프루브 단백질과 결합하는 다이아세틸렌의 예로는 PCDA-EDEA-SA-NHS (화학식 2), 및 PCDA-바이오틴 (화학식 3) 등을 들 수 있다.

이들 결합용 다이아세틸렌과 기타 다이아세틸렌, 예컨대 PCDA (화학식 4), PCDA-아닐린 (화학식 5), PCDA-ABA (화학식 6), 또는 PCDA-mBzA (화학식 7)를 혼합하여 본 발명의 소포용 다이아세틸렌 혼합물을 준비한다.

상기 혼합물 중, PCDA-바이오틴의 바이오틴기가 기판 또는 프루브 단백질의 아비딘(또는 스트렙타비딘)과 결합함으로써 상기 소포가 기판 또는 프루브 단백질에 결합되고, PCDA-EDEA-SA-NHS의 하이드록시석신이미드기가 기판 또는 프루브 단백질의 아민기로 치환되면서 상기 소포가 기판 또는 프루브 단백질에 결합하게 된다.

본 발명의 다이아세틸렌 혼합물은 기타 다이아세틸렌 : 결합용 다이아세틸렌 몰비가 100 : 5 내지 25 일 때, 그리고 하이드록시석신이미드기를 가진 다이아세틸렌과 바이오틴기를 가진 다이아세틸렌을 동시에 포함하는 경우에는 예컨대, PCDA : PCDA-EDEA-SA-NHS : PCDA-바이오틴의 몰비가 100 : 3 내지 15 : 2 내지 10 의 수준일 때 결합효율 및 분석효율이 높은 것으로 조사되었으며, 이러한 결과는 유사한 다른 단량체에서도 동일한 경향을 보였다.

나아가, 상기 다이아세틸렌에 추가로 1,2-디미리스토일-락-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-phosphocholine. DMPC. 화학식 8)과 같은 지질(lipid)을 첨가하는 경우 분석에 소요되는 시간이 단축되고 색전이가 더욱 선명하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 소포에 지질이 첨가됨에 따라 다이아세틸렌의 정렬이 흐트러져 수소결합력이 약화되고, 때문에 소포가 외부 자극에 더욱 민감하게 반응하는 결과를 초래하기 때문이다. 이러한 지질의 첨가량은 다이아세틸렌 : 지질 = 100 : 0.001 내지 70의 몰비로 첨가되는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 프루브 단백질은 단백질 또는 미생물을 검출할 수 있으면 그 종류에 제한이 없으나, 효소 또는 항체, 그 중에서도 특히 항체인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 기판은 아민, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 말레이미드 또는 탄수화물로 표면이 개질된 유리, 금속 또는 플라스틱 재질의 기판인 것이 바람직하며, 특히 아민으로 표면이 개질된 유리기판이 바람직하다.

한편, 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법은, 먼저 상기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌을 소수성 용매에 용해시키고 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하거나, 물 또는 친수성 용매에 직접 혼합하는 단계로부터 시작된다. 이때 상기 소수성 용매에 용해시킨 후, 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하기 전에, 질소 또는 비활성 기체 (inert gas)를 주입하여 상기 소수성 용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 소수성 용매는 상기 다이아세틸렌을 용해시킬 수 있는 것이면 제한이 없으며, 일반적으로 클로로포름, DMF, DMSO, 디클로로메탄, 헥산, 사이클로헥산, THF, 아세톤, 알콜 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하고, 특히 클로로포름이 바람직하다.

그리고, 상기 친수성 용매로는 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술포닉 애시드 (2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonic acid. HEPES), 인산 완충 함염물 (phosphate buffered saline. PBS), 2-(N-모르폴리노)에탄술포닉 애시드 [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid. MES]와 같은 완충액을 포함할 수 있다.

또한, 상기 물 또는 친수성 용매에 혼합한 후 70 내지 95 ℃에서 10 내지 30 분간 가열하여 다이아세틸렌 단량체들을 정렬함으로써 이후 자외선 조사에 의한 중합시 중합도를 높일 수 있다.

상기 혼합된 다이아세틸렌 혼합물은 그 다음 초음파 처리하여 분산시키게 된다. 초음파 처리를 거친 다이아세틸렌 분산액은 여과한 후 저온에서 안정화시킨 다. 이때 분산액에 바로 자외선을 조사하여 광중합시키는 것도 가능하나, 중합효율을 고려하면 이후 기판에 점적(spotting) 후 중합시키는 것이 더 바람직하다.

상기 다이아세틸렌 소포를 기판에 고정시키는 단계는 다음과 같다.

우선 기판과 소포 사이가 아비딘 또는 스트렙타비딘-바이오틴 결합으로 연결되는 경우는 아민으로 표면이 개질된 기판에 바이오틴기를 가진 화합물을 반응시켜 기판으로부터 바이오틴기가 노출되도록 한 다음, 상기 노출된 바이오틴기를 아비딘 또는 스트렙타비딘과 반응시킴으로써 기판으로부터 최종적으로 아비딘 또는 스트렙타비딘이 노출되도록 한다. 여기에 앞서 제조한 다이아세틸렌 분산액을 상기 기판에 점적하여, 상기 다이아세틸렌의 바이오틴기와 기판으로부터 노출된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 결합시킴으로써 소포를 기판에 고정화시킨다. 상기 바이오틴기를 가진 화합물은 바이오틴-노르말-하이드록시석신이미드(Biotin-normal-hydroxysuccinimide. 바이오틴-NHS)인 것이 특히 바람직하다.

기판과 소포 사이가 하이드록시석신이미드의 아민 치환결합으로 직접 연결되는 경우는 소포의 하이드록시석신이미드기를 기판의 아민으로 치환함으로써 직접 고정화가 이루어진다.

한편, 분석대상물과 직접 반응하는 프루브 단백질은 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액, 상기 기판에 고정화된 다이아세틸렌 소포, 또는 자외선 조사에 의한 광중합이 이루어진 폴리다이아세틸렌 소포 중 어느 경우에도 결합이 가능하나, 기판에 고정화시키기 전 다이아세틸렌 분산액 상태에서 프루브 단백질과 혼합하여 결합시키는 것이 결합효율 면에서 바람직하다.

상기 소포와 프루브 단백질 사이는 프루브 단백질의 아민기가 소포의 하이드록시석신이미드기를 치환결합함으로써 연결된다.

또는 프루브 단백질을 바이오틴-NHS와 같은 바이오틴 함유 화합물과 반응시켜 바이오틴기가 말단에 위치하도록 처리하고, 소포의 바이오틴기에는 별도의 아비딘 또는 스트렙타비딘을 결합시킴으로써, 결과적으로 소포의 아비딘 또는 스트렙타비딘과 프루브의 바이오틴을 결합시키는 것도 가능하다. 이러한 결합 방식은 아비딘(또는 스트렙타비딘)과 바이오틴의 반응속도가 빠르다는 장점과 함께, 소포 위에 프루브의 오리엔테이션(방향성)을 일정하게 유지할 수 있다는 장점이 있어, 분석대상물과의 반응성을 향상시키고 분석효율을 높이는 결과를 가져온다.

상단의 소포는 바이오틴기 및 하이드록시석신이미드기가 노출되어 있는 중합 전의 소포로서 발색 및 형광을 띠지 않고 있다.

이를 프루브 단백질로서 1차 항체와 결합시킨 후 아비딘이 노출되어 있는 기판에 점적, 자외선 조사하면, 소포의 바이오틴기가 기판의 아비딘과 결합하고, 1차 항체의 아민기가 소포의 하이드록시석신이미드기를 치환결합하였으며, 중합 결과 소포는 청색을 띠게 된다 (중단).

여기에 분석대상물로서 2차 항체를 통과시키면, 상기 2차 항체는 소포에 결합된 1차 항체와 반응하고, 그 결과 소포는 적색으로 색전이가 일어나며, 형광을 발현하여 분석이 가능하게 된다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.

실시예

실시예 1-1: PCDA - EDEA - SA - NHS 제조

하이드록시석신이미드기를 포함하는 다이아세틸렌 중 하나인 PCDA-EDEA-SA-NHS를 다음과 같이 합성하였다.

30 ml의 디메틸포름아미드(dimethylformamide. DMF)에 말단이 아민으로 치환되어 있는 PCDA-EDEA (J.-M. Kim, E.-K. Ji, S.-M. Woo, H.-W. Lee, and D.J. Ahn, “Immobilized polydiacetylene vesicles on solid substrates for use as chemosensors,” Advanced Materials, 15, 1118-1121 (2003)) 1 g (1.98 mmol)을 넣은 용액을 먼저 준비하고, 이것을 역시 30 ml DMF에 0.792 g (7.92 mmol)의 석시닉 안하이드라이드 (succinic anhydride)가 녹아 있는 용액에 적하(dropwise)시키고, 하루 동안 실온에서 교반시켰다. 그 다음 진공에서 농축시켜 수득한 잔류물을 에틸아세테이트에 용해시키고 물과 함께 추출했다. 이렇게 수득한 유기층을 모아 농축시켜 하얀색의 파우더(PCDA-EDEA-SA)를 얻었다 (1.07 g, 89 %).

그런 다음 얻어진 파우더 (0.40 g, 0.66 mmol PCDA-EDEA-SA)를 30 ml 클로로포름에 녹이고 여기에 0.23 g (1.98 mmol) 노르말-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)와 0.51 mg (2.64 mmol) (1-에틸디메틸아미노프로필)-카르보디이미드((1-ethyldimethylaminopropyl)-carbodiimide. EDC)를 함께 넣어주고 0 ℃ 에서 하루 동안 교반시켰다. 역시 진공에서 농축시키고 에틸아세테이트에 넣어 용해시킨 후 그 용액을 물과 함께 추출했다. 그 때의 유기층을 모아 농축시켜 최종 적으로 PCDA-EDEA-SA-NHS 파우더를 수득했다 (0.24 g, 51 %).

실시예 1-2: PCDA -아닐린 제조

기타 다이아세틸렌 중 하나인 PCDA-아닐린을 다음과 같이 합성하였다.

메틸렌 클로라이드(methylene chloride) 5 ㎖에 0.5 g (1.33 mmol)의 PCDA를 넣은 후, 질소가스를 공급한 상태에서 이 용액에 0.33 ml (3.99 mmol)의 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride)를 실온에서 30 분 동안 적하시켰다.

진공에서 이를 농축시킨 후 다시 5 ml의 메틸렌 클로라이드에 용해시켰다. 이를 20 ml의 메틸렌 클로라이드에 0.3 ml (3.2 mmol)의 아닐린과 0.44 ml (3.2 mmol)의 트리에탄올아민(triethanolamine. TEA)를 녹인 용액에 실온에서 적하시키고, 하룻밤 동안 교반했다.

그 후 이를 다시 진공에서 농축시키고 나서 얻어지는 잔류물을 다시 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 그 용액을 물과 함께 추출했다. 얻어진 유기층을 모으고 농축시킨 후 얻어지는 잔류물은 실리카를 이용한 크로마토그래피를 통해 정제한 후, 이를 메틸렌 클로라이드에 다시 용리(elution)시키고, 재결정과정을 통해 0.5 g (38.2 %)의 PCDA-아닐린 파우더를 얻었다.

실시예 2-1: 소포( 小胞 . vesicle ) 제조 (1)

PCDA (GFS chemicals), PCDA-EDEA-SA-NHS (실시예 1-1), PCDA-바이오틴 (Y. K. Jung, H. G. Park, and J. M. Kim, "Polydiacetylene (PDA)-based colorimetric detection of biotinstreptavidin interactions", Biosens . Bioelectron ., 21, 1536-1544 (2006))을 8.5 : 1 : 0.5의 몰비로 혼합하고, 클로로포름에 용해시켰다. 용해된 혼합물에 질소를 주입하여 상기 클로로포름 제거했다. 여기에 상기 PCDA 등의 총농도가 1.0 mM이 되도록 완충용액 (HEPES, 5 mM, pH=8.0)을 첨가하고, 80 ℃에서 15 분간 가열하였다. 상기 혼합물에 15 분간 초음파 처리 (Fisher Sonic Dismembrator Model 550 W, 동력의 25 %)하여, 단량체들을 정렬한 후 0.8 ㎛ PTFE 필터로 여과하고, 4 ℃에서 12 시간 동안 냉각시켰다.

실시예 2-2: 소포 제조 (2)

실시예 2-1과 동일한 과정을 거치되, PCDA 대신 PCDA-아닐린 (실시예 1-2)을 사용하였다.

실시예 2-3: 소포 제조 (3)

PCDA-s-Biotin (Y. K. Jung, H. G. Park, and J. M. Kim, "Polydiacetylene (PDA)-based colorimetric detection of biotinstreptavidin interactions", Biosens. Bioelectron ., 21, 1536-1544 (2006)) 0.548325 mg과 PCDA-ABA (J.-M. Kim, J.-S. Lee, H. Choi, D. Sohn, and D.J. Ahn, "Rational design and in-situ FTIR analyses of colorimetrically reversible polydiacetylene supramolecules", Macromolecules, 38, 9366-9376 (2005)) 4.48227 mg을 각각 DMSO (Junsei) 1 ml에 섞은 후 80 ℃에서 가열하여 녹였다. 별도로 3.051 mg의 DMPC (Sigma)를 삼각플라스크에 넣고 1 ㎖의 클로로포름으로 녹였다. DMPC가 완전히 용해되면 질소를 불어 말려 삼각플라스크 바닥에 얇은 막을 형성하게 하고, 1 mM 농도가 되도록 증류수를 채운 다음, 단량체가 잘 분산될 수 있도록 80 ℃에서 15 분 동안 물중탕하여 교반시켰다. 이때 미리 만들어 놓은 PCDA-s-Biotin 용액과 PCDA-ABA 용액을 조금씩 가 했다 (PCDA-ABA : DMPC : PCDA-s-Biotin = 6.5 : 3 : 0.5). 물중탕이 끝나면 단량체가 분산된 용액을 10 W의 강도로 15 분간 초음파 처리 (Fisher Sonic Dismembrator Model 550 W, 동력의 25 %)했다. 초음파 처리가 끝나면 0.8 ㎛의 나일론 필터로 걸러준 후 4 ℃에서 8 시간 이상 냉장보관했다.

실시예 2-4: 소포 제조 (4)

실시예 2-1과 동일한 과정을 거치되, PCDA-바이오틴은 사용하지 않았다 (PCDA : PCDA-EDEA-SA-NHS = 9 : 1).

실시예 3: 글래스슬라이드 ( 아비딘 ) 준비

1 mg의 바이오틴-NHS (Pierce)를 1 ml의 DMSO (Junsei)에 녹인 다음 여기에 3 ml의 PBS 완충액 (Pierce)을 섞었다. 여기에 아민 코팅된 글래스슬라이드 (NC-AMCS, Nuricell co.)를 4 시간 동안 상온에서 침지시켰다. 별도로 0.1 mg의 아비딘 (Sigma)을 PBS 용액 1ml에 용해시켜 아비딘 용액을 제조하고, 상기 글래스슬라이드를 아비딘 용액에 2 시간 동안 상온에서 침지시켜 본 발명에 사용되는 글래스슬라이드를 준비하였다.

실시예 4-1: 프루브 단백질 결합 및 고정화 (1)

실시예 2-1의 소포 용액 200 ㎕에 1.0 mg/㎖의 제 1 항체 (대장균 표면단백질 검출용 토끼 생성 항체. Fitzgerald Industries International, Inc.) 용액 6 ㎕를 첨가하고, 상온에서 4 시간 동안 인큐베이팅했다. 상기 제 1 항체가 결합된 소포 용액을 실시예 3의 아비딘 코팅 글래스슬라이드에 점적했다 (Nano-plotter v 1.2, GeSim, German). 37 ℃에서 2 시간 동안 고정화한 후, 증류수로 1 분간 세척 한 다음, 1 mW/㎠의 254 nm UV를 3 분간 조사하여 상기 소포 단량체를 중합시켰다.

실시예 4-2: 프루브 단백질 결합 및 고정화 (2)

실시예 2-2의 소포 용액 200 ㎕에 1.0 mg/㎖의 제 1 항체 (항대장균 항체. Fitzgerald Industries International, Inc.) 용액 6 ㎕를 첨가하고, 상온에서 4 시간 동안 인큐베이팅했다. 상기 제 1 항체가 결합된 소포 용액을 실시예 3의 아비딘 코팅 글래스슬라이드에 점적했다 (Nano-plotter v 1.2, GeSim, German). 37 ℃에서 2 시간 동안 고정화한 후, 증류수로 1 분간 세척한 다음, 1 mW/㎠의 254 nm UV를 8 분간 조사하여 상기 소포 단량체를 중합시켰다.

실시예 4-3: 프루브 단백질 결합 및 고정화 (3)

실시예 2-3의 소포 용액을 실시예 3의 아비딘 코팅 글래스슬라이드에 점적하고(Nano-plotter v 1.2, GeSim, German), 37 ℃에서 2 시간 동안 고정화한 후, 증류수로 1 분간 세척했다. 여기에 제 1 항체 (항대장균 항체. Fitzgerald Industries International, Inc.) 용액 10 ㎕를 상기 글래스슬라이드 위에 뿌리고, 커버글라스를 덮어 상온에서 2 시간 동안 인큐베이팅한 후, 다시 증류수로 세척했다. 여기에 1 mW/㎠의 254 nm UV를 8 분간 조사하여 상기 소포 단량체를 중합시켰다.

실시예 4-4: 프루브 단백질 결합 및 고정화 (4)

실시예 2-4의 소포 용액을 아민 코팅 글래스슬라이드에 점적하고(Nano-plotter v 1.2, GeSim, German), 37 ℃에서 2 시간 동안 고정화한 후, 증류수로 1 분간 세척했다. 여기에 1 mW/㎠의 254 nm UV를 3 분간 조사하여 상기 소포 단량체 를 중합시켰다. 여기에 2.0 mg/㎖의 제 1 항체 (항탄저균포자 항체. anti-Bacillus antracis spore antibody. Abcam) 용액 6 ㎕를 상기 글래스슬라이드 위에 뿌리고, 커버글라스를 덮어 상온에서 1 시간 동안 인큐베이팅한 후, 다시 증류수로 세척했다.

실시예 5-1: 제 2 항체 검출

150 ㎍/㎖의 형광 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate. FITC)-공액 항토끼(anti-rabbit) 제 2 항체 (Sigma Aldrich Co.) 7 ㎕를 상기 실시예 4-1의 글래스슬라이드 위에 분산시킨 후, 커버글래스로 덮고 상온에서 4 시간 동안 인큐베이팅한 다음, 증류수로 3 회 세척하고 색전이 및 형광도를 관찰하였다 (Olympus BX51).

실시예 5-2: 대장균 검출 (1)

E. coli (10⁸ CFU/ml) 및 Bacillus subtilis (10⁸ CFU/ml) 7 ㎕를 상기 실시예 4-2의 글래스슬라이드 위에 분산시킨 후, 커버글래스로 덮고 상온에서 12 시간 동안 인큐베이팅한 다음, 증류수로 3 회 세척하고 색전이 및 형광도를 관찰하였다 (Olympus BX51).

실시예 5-3: 대장균 검출 (2)

E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, 및 Listeria monocytogenes (각 10⁸ CFU/ml) 각 7 ㎕를 상기 실시예 4-3의 글래스슬라이드 위에 분산시킨 후, 커버글래스로 덮고 상온에서 2 시간 동안 인큐베이팅한 다음, 증류수 로 3 회 세척하고 색전이 및 형광도를 관찰하였다 (Olympus BX51).

실시예 5-4: 탄저균 검출

Bacillus anthracis (탄저균, ATCC 14578. 10⁸ CFU/ml. 포자 상태) 및 Bacillus subtilis (10⁸ CFU/ml. 포자 상태) 7 ㎕를 상기 실시예 4-4의 글래스슬라이드 위에 분산시킨 후, 커버글래스로 덮고 상온에서 5 시간 동안 인큐베이팅한 다음, 증류수로 3 회 세척하고 색전이 및 형광도를 관찰하였다 (Olympus BX51).

비교예 1: 제 1 항체 결여시

상기 실시예 1-1, 2-1, 3, 4-1 및 5-1을 거치되, 실시예 4-1에서 소포 용액과 제 1 항체 용액의 반응과정을 생략했다.

비교예 2: 항생쥐 제 2 항체 사용시

상기 실시예 1-1, 2-1, 3, 4-1 및 5-1을 거치되, 실시예 5-1에서 항토끼 제 2 항체 대신 항생쥐 제 2 항체를 사용하였다.

시험예 1: 제 1 항체 - 제 2 항체 존재시

도 2는 상기 실시예 1-1, 2-1, 3, 4-1 및 5-1의 과정을 거친 결과를 촬영한 사진이다. 도 2(A)는 제 2 항체를 반응시키기 전의 형광사진으로서, 아무런 형광이 나타나지 않음을 알 수 있다. 실시예 5-1의 제 2 항체는 형광으로 표지되어 있어, 515 nm에서 녹색 필터로 모니터링이 가능하다. 따라서, 제 2 항체를 반응시킨 후 녹색 필터로 관찰하면 도 2(B)와 같이 녹색 형광을 관찰할 수 있다. 또한, 상기 제 2 항체의 결합으로 인해 본 발명의 소포가 교란된 결과 적색 형광 역시 발현 하게 되는 바, 580 nm에서 적색 필터로 모니터링 한 결과 도 2(C)에서 확인할 수 있는 바와 같이 적색 형광을 관찰할 수 있었다. 뿐만 아니라, 본 발명의 소포의 고정화를 확인하기 위해, 상기 글래스슬라이드를 5 분간 가열하고, 적색 필터로 관찰한 결과 소포 교란의 결과인 적색 형광을 관찰할 수 있었다.

시험예 2: 제 1 항체 결여시

상기 비교예 1의 과정을 수행한 후 580 nm에서 적색 필터로 모니터링한 결과, 제 2 항체 처리 후에도, 도 3(A)에서와 같이 아무런 형광이 발현되지 않았음을 확인할 수 있다. 5 분간 가열하고 적색 필터로 모니터링한 결과 도 3(B)에서와 같이 소포 자체는 고정화되어 있음을 알 수 있다.

시험예 3: 항생쥐 제 2 항체 사용시

상기 비교예 2의 과정을 수행한 후 515 nm에서의 녹색 필터 [도 4(A)]및 580 nm에서의 적색 필터 [도 4(B)]로 모니터링한 결과, 아무런 형광도 관찰되지 않았다. 5 분간 가열하고 적색 필터로 모니터링한 결과 도 4(C)에서와 같이 소포 자체는 고정화되어 있음을 알 수 있다.

시험예 4: 제 1 항체 - 대장균 존재시 (1)

도 5는 상기 실시예 1-2, 2-2, 3, 4-2 및 5-2의 과정을 거친 결과를 촬영한 사진이다. 좌측 상단의 사진은 상기 E. coli의 결합으로 인해 본 발명의 소포가 교란된 결과 적색으로 색전이가 일어났으나, Bacillus subtilis를 반응시킨 우측 상단의 사진에서는 박테리아 세포와의 결합이 이루어지지 않아 소포의 교란이 없고 그 결과 색전이 또한 일어나지 않았음을 확인할 수 있다. 본 발명의 소포의 고정 화를 확인하기 위해, 상기 글래스슬라이드를 5 분간 가열하고 관찰한 결과, 도 5의 하단에서와 같이 소포 교란의 결과인 적색으로의 색전이는 양쪽 모두에서 관찰할 수 있었다.

시험예 5: 제 1 항체 - 대장균 존재시 (2)

도 6은 상기 실시예 2-3, 3, 4-3 및 5-3의 과정을 거친 결과를 촬영한 사진이다. 좌측 상단의 사진은 상기 E. coli의 결합으로 인해 본 발명의 소포가 교란된 결과 적색으로 색전이가 일어났으나, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, 또는 Listeria monocytogenes를 반응시킨 나머지 사진에서는 박테리아 세포와의 결합이 이루어지지 않아 소포의 교란이 없고 그 결과 색전이 또한 일어나지 않았음을 확인할 수 있다.

시험예 6: 제 1 항체 - 탄저균 존재시

도 7은 상기 실시예 2-4, 4-4 및 5-4의 과정을 거친 결과를 촬영한 사진이다. 좌측 사진은 상기 Bacillus anthracis의 결합으로 인해 본 발명의 소포가 교란된 결과 적색으로 색전이가 일어났으나, Bacillus subtilis를 반응시킨 우측 사진에서는 박테리아 세포와의 결합이 이루어지지 않아 소포의 교란이 없고 그 결과 색전이 또한 일어나지 않았음을 확인할 수 있다.

시험예들의 결과를 종합하면, 제 1 항체와 제 2 항체 또는 제 1 항체와 미생물의 특정 결합에 의해서만 소포의 색전이 및 형광 발현을 일으킬 수 있어, 본 발명의 마이크로어레이 형태의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 단백질-단백질 또는 단백질-미생물 수준의 반응을 검출하는 바이오센서로서 활용이 가능하다. 특히, 탄저 균은 입수가 용이하고 소독제나 환경 변화에 대한 내성이 강해 생화학무기로 전용될 위험성이 높아서 이에 대한 신속, 간편하면서도 정확한 분석기법이 강하게 요구되어 온 바, 본 발명의 센서칩은 이러한 요구를 충족시킬 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명에서는 제 1 항체와 제 2 항체 또는 제 1 항체와 박테리아로 실험하였으나, 프루브 단백질을 적절히 선택하면 콜레라 독성물질, 포스포라이페이즈(phospholipases), HIV 프로티에이즈 (HIV protease), MAP 카이네이즈 (MAP kinases), MEK 카이네이즈 (MEK kinases), 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 (Phosphoinositide 3-kinases), X인자 (Factor X), PDGF, FGF, ICAM, VCAM, E-셀렉틴(E-selectin), 트롬빈(thrombin), 브라디키닌(bradykinin), PGF2 등의 단백질, 대장균이나 탄저균, 바실러스, 살모넬라, 리스테리아, 결핵균, 불루셀라, 레지오넬라, 비브리오 등의 미생물 세포, 독감 바이러스, 간염바이러스, AIDS 바이러스, 헤퍼스바이러스, 한탄바이러스, 로타바이러스 등의 바이러스 등을 동일한 방식으로 검출할 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

본 발명에 따르면 단백질 또는 세포 검출을 위한 프루브로서의 단백질을 폴리다이아세틸렌 소포에 결합시킴과 아울러, 상기 소포를 글래스슬라이드에 마이크로어레이 형태로 점적, 고정화하여 센서칩을 제조할 수 있으며, 상기 센서칩은 단백질과 단백질 (예, 제 1 항체와 제 2 항체) 또는 단백질과 세포 (예, 항체와 세포)의 특정 결합에 의해서만 소포의 색전이 및 형광 발현을 일으킬 수 있어, 본 발명의 마이크로어레이 형태의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 분석대상에 대한 별도의 표지 없이도, 그리고 종래 액상 반응에 비해 훨씬 적은 양의 폴리다이아세틸렌 및 분석대상물로, 단백질-단백질 또는 단백질-세포 수준의 반응을 검출할 수 있다. 나아가, 고감도를 나타내면서도 소형화를 달성하여 휴대가 용이한 장점 또한 가지고 있다. 특히, 입수가 용이하고 소독제나 환경 변화에 대한 내성이 강해 생화학무기로의 활용가능성이 높은 탄저균에 대해서도 짧은 시간 내에 정확한 분석이 가능함을 확인한 바, 진단분야 등에서의 이용가능성도 매우 높은 것으로 판단된다.

Claims

기판;

10,12-펜타코사디이노익 애시드 (10,12-pentacosadiynoic acid. PCDA) 또는 PCDA-아닐린(PCDA-aniline), 및 10,12-펜타코사디이노익 애시드-2,2'-(에틸렌디옥시)-비스-(에틸아미드)-석시닉 안하이드라이드-노르말-하이드록시석신이미드 [10,12-pentacosadiynoic acid-2,2'-(ethylenedioxy)-bis-(ethylamide)-succinic anhydride-normal-hydroxysuccinimide. PCDA-EDEA-SA-NHS]의 혼합물 [PCDA (또는 PCDA-아닐린) : PCDA-EDEA-SA-NHS의 몰비는 100 : 5 내지 25 임], 또는 PCDA-아미노부티릭 애시드 (PCDA-aminobutyric acid. PCDA-ABA) 및 PCDA-바이오틴의 혼합물 [PCDA-ABA : PCDA-바이오틴의 몰비는 100 : 5 내지 25 임]인 다이아세틸렌이 중합되고, 상기 기판에 결합되는 소포(vesicle); 및

상기 소포에 결합된 프루브(probe) 단백질

을 포함하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
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제 1 항에 있어서,

상기 다이아세틸렌은 10,12-펜타코사디이노익 애시드-바이오틴 (10,12-pentacosadiynoic acid-Biotin. PCDA-바이오틴)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 6 항에 있어서,

상기 PCDA : PCDA-EDEA-SA-NHS : PCDA-바이오틴의 몰비는 100 : 3 내지 15 : 2 내지 10 인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
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제 1 항에 있어서,

상기 다이아세틸렌에 추가로 지질(lipid)이 첨가된 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 10 항에 있어서,

상기 지질은 1,2-디미리스토일-락-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-phosphocholine. DMPC)인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 10 항에 있어서,

상기 지질은 다이아세틸렌 : 지질 = 100 : 0.001 내지 70의 몰비로 첨가되는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 1 항에 있어서,

상기 프루브 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 1 항에 있어서,

상기 기판은 아민, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 말레이미드 또는 탄수 화물로 표면이 개질된 유리, 금속 또는 플라스틱 재질의 기판인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
(A) 10,12-펜타코사디이노익 애시드 (10,12-pentacosadiynoic acid. PCDA) 또는 PCDA-아닐린(PCDA-aniline), 및 10,12-펜타코사디이노익 애시드-2,2'-(에틸렌디옥시)-비스-(에틸아미드)-석시닉 안하이드라이드-노르말-하이드록시석신이미드 [10,12-pentacosadiynoic acid-2,2'-(ethylenedioxy)-bis-(ethylamide)-succinic anhydride-normal-hydroxysuccinimide. PCDA-EDEA-SA-NHS]의 혼합물 [PCDA (또는 PCDA-아닐린) : PCDA-EDEA-SA-NHS의 몰비는 100 : 5 내지 25 임], 또는 PCDA-아미노부티릭 애시드 (PCDA-aminobutyric acid. PCDA-ABA) 및 PCDA-바이오틴의 혼합물 [PCDA-ABA : PCDA-바이오틴의 몰비는 100 : 5 내지 25 임]인 다이아세틸렌을 소수성 용매에 용해시키고 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하거나, 물 또는 친수성 용매에 직접 혼합하는 단계;

(B) 상기 혼합된 다이아세틸렌 혼합물을 초음파 처리하여 분산시키는 단계;

(C) 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액을 기판에 점적(spotting)하는 단계; 및

(D) 상기 점적된 다이아세틸렌 분산액을 고정화시키는 단계

를 포함하고, 상기 단계 (B) 이후에,

(E) 상기 다이아세틸렌에 프루브 단백질을 반응시키는 단계; 및

(F) 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액에, 또는 상기 다이아세틸렌 분산액으로 점적된 상기 기판에 자외선을 노광시켜 상기 다이아세틸렌을 중합시키는 단계

를 추가로 포함하는 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene) 센서칩의 제조방법.
제 15 항에 있어서,

상기 단계 (A)에서 상기 소수성 용매에 용해시킨 후, 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하기 전에,

질소 또는 비활성 기체 (inert gas)를 주입하여 상기 소수성 용매를 제거하는 단계

를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법.
제 15 항에 있어서,

상기 친수성 용매는 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법.
제 15 항에 있어서,

상기 단계 (A)의 물 또는 친수성 용매에 혼합한 후 70 내지 95 ℃에서 10 내지 30 분간 가열하는 단계

를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법.
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