CN101490536B - 非分离式测定方法 - Google Patents

Abstract

公开了与特异性结合反应有关的测定方法，其与已知方法相比更简单化。能够产生化学发光的化合物被固定化在固体支持物上，作为用于捕获样品中分析物的特异结合性配对成员。可以激活所述化学发光化合物并且被结合于特异结合性配对成员的活化剂化合物被过量地与样品一起添加至所述固体支持物。在活化剂结合物已经被特异性地结合的位点，引发剂溶液的添加引起化学发光反应。该测定方法被称为非分离式测定法，因为在检测步骤之前，不需要除去或者分离过量的检测标签(活化剂结合物)。该方法适用于多种类型的测定，包括免疫测定、受体-配体测定和核酸杂交测定。

Description

非分离式测定方法

相关申请的交叉引用

本申请要求申请人在2006年5月9日提交申请的另案待审的临时申请系列号No.60/798,839的优先权。

技术领域

本发明涉及新颖的与特异性结合反应有关的测定方法，其与已知方法相比更简单化。该测定方法被称为非分离式测定法，因为在检测步骤之前，它们不需要除去或者分离过量的检测标签。该方法适用于多种类型的测定，包括免疫测定、受体-配体测定和核酸杂交测定。

背景技术

人们在测定方法开发、尤其是免疫测定开发的领域已经付出了巨大的努力，以简化测定设计方案，同时保留它们在灵敏度、动态范围、耐用性、较宽的应用性和自动化适用性方面主要的优点。已经有一种方法用于设计所谓的同质测定形式，无需对添加的可检测地标记的特异性结合伴侣进行分离。这类方法依赖于设计出结合反应的结果或者是开启、或者是关闭的检测原理。相反，异质测定形式依赖于在定量之前结合的和游离的可检测地标记的特异性结合伴侣的物理分离。

在同质酶免疫测定领域，已经公开了许多美国专利。许多专利开发了抗体-抗原结合反应来激活或抑制标记酶：美国专利Nos.3,817,837；3,852,157；3,875,011；3,966,556；3,905,871；4,065,354；4,043,872；4,040,907；4,039,385；4,046,636；4,067,774；4,191,613；4,171,244；以及4,785,080。其他的同质免疫测定涉及多种通过抗体或者其他的荧光猝灭剂的猝灭荧光方法：美国专利Nos.3,998,943；3,996,345；4,174,384；4,161,515；4,208,479和4,160,016。在归为免疫测定类型的领域还有其他的美国专利，包括：美国专利Nos.3,935,074；4,130,462；以及4,193,983。美国专利No.4,160,645公开了一种使用电子传递催化剂作为标签的测定方法。该催化剂(标签)通过结合至抗体而失活。

Campbell等(Biochem.J.，216，185-194(1983))公开了一种检测方法，其以竞争性测定形式采用在偶联于抗原(Ag-L)的化学发光供体与偶联于抗体(Ab-F)的荧光受体之间的能量传递。复合抗原最终发射荧光剂的波长，同时游离抗原发射化学发光标签的特征波长。接着，测量两种波长的光强度，并且将两种信号的比率与样品中分析物的含量相联系。

已知还有多种其他的同质免疫测定法：Rubenstein等，美国专利No.3,817,837(同质酶免疫测定)；Ullman，美国专利No.3,996,345(荧光猝灭同质免疫测定)；Maggio，美国专利No.4,233,402(酶通道同质酶免疫测定)；以及Boguslaski等，加拿大专利1,082,577(半抗原-辅助因子同质酶免疫测定)。

Ullman的美国专利6,406,913公开的测定方法包括在一定条件下处理疑似含有分析物的介质，使得该分析物可以引起光敏剂和化学发光的化合物密切接近。该光敏剂产生单线态氧，当其处于密切接近时，其通过溶液扩散并且激活化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光量与介质中分析物含量有关。在一个实施方式中，至少一种的光敏剂或者化学发光化合物与悬浮的粒子有关，并且特异结合性配对成员与其结合。

McCapra的美国专利5,516,636公开的测定方法包括特异性结合测定，其利用敏化剂作为标签。当通过辐射、电子传递、电解、电致发光或者能量传递而被激化时，该敏化剂达到激发态，其(a)刚一与分子氧相互作用就产生单线态氧，或者(b)刚一与无色染料相互作用就被氧还原，产生过氧化氢。与激发的敏化剂，连同外加的其他试剂一起，进行相互作用中的任何一种，皆可产生可检测信号。

Levison的美国专利6,911,305公开了一种方法，用于在第一薄膜上检测结合于敏化剂、或用敏化剂标记的探针的多聚核苷酸分析物。使该薄膜与其上固定化有化学发光的前体成分的第二薄膜相接触；该前体能够产生可引发的化学发光化合物。在第二薄膜上，该敏化剂被激发而产生单线态氧，用于与化学发光前体进行反应，从而形成可引发的化学发光化合物。然后可引发的化学发光化合物被引发，在所述第二薄膜上产生可检测的光信号。

美国专利6,994,980和6,723,851公开的方法用于通过使用在与酶反应后变成沉淀的或结合于分析物或分析物周围区域的化合物来检测分析物。该酶可以在测定方法中作为与可特异性地结合分析物的物质的结合物而被供应。在一个液体组合物的实施方式中，以游离的形式供应化合物，用于与酶进行反应。在酶促反应导致沉淀发生后，通过在碱性pH下吖啶酯部分非酶催化的化学发光反应，检测沉淀的化合物，所述吖啶酯部分被包含在具有过氧化氢的分子内部。在结合的酶和结合的化学发光化合物之间没有酶促反应发生。

尽管人们在设计同质的、或者非分离式的测定形式方面作了相当大的努力，但这些方法仍然未受到广范的商业使用。异质测定法预料作为更简单的测定法而被开发并大量生产，虽然操作上更复杂。特别地，在高容量的临床免疫诊断的领域和较小的临床核酸诊断领域，异质测定形式占统治地位。在该应用领域内，测试形式将有利于方案可以简单化、复杂度可以降低、并且兼容性可以提高、同时可以通过除去多余步骤而提高自动化。

发明内容

在一个方面，本发明提供新颖的与特异性结合反应有关的测定方法，尤其是免疫测定法、受体测定法和核酸杂交测定法，其与已知方法相比更简单化。该方法的特征在于使用固定化化学发光化合物和结合于特异性结合伴侣的活化剂化合物，用于诱导化学发光反应。分析物介导的共定位的化学发光标签化合物和活化剂结合物引起随后所发生的化学发光反应仅在被结合的分析物分子的位点处发生。未结合的过量活化剂结合物的存在不参与或者不妨碍化学发光反应。其结果是，发射的化学发光强度与分析物的数量成正比。在一个实施方式中，通过在检测步骤之前除去分离和洗涤步骤而使测定方法简单化，并且因此可以被认为是非分离式测定法。

具体而言，本发明提供一种用于检测含有或者疑似含有分析物的样品中的分析物的特异性结合测定法，包括提供固体支持物，所述固体支持物上固定有化学发光化合物和用于所述分析物的第一特异性结合伴侣，其中，一种活化剂化合物的结合物和所述分析物两者中的至少一个结合到被固定的所述第一特异性结合伴侣，使得所述活化剂化合物可操作地接近被固定的所述化学发光化合物，其中所述活化剂化合物的结合物包含结合于第二特异性结合伴侣的活化剂化合物，以及，添加引发剂溶液使得被固定的所述化学发光化合物和被结合的所述活化剂化合物之间因发生反应而产生化学发光，从而用于检测所述分析物在样品中的存在、位置或含量，其中所述化学发光化合物是所述活化剂化合物的催化底物，所述活化剂化合物是：1)过氧化物酶，其中所述化学发光化合物是过氧化物酶的底物，所述引发剂溶液是包含过氧化物化合物的水溶液，或2)选自于过渡金属盐及复合物、过氧化物酶和含有过渡金属的酶中的至少一种，其中所述过渡金属选自于铁、铜、钴、锌、锰和铬中的至少一种，所述引发剂溶液是包含过氧化物化合物的水溶液，以及当存在所述活化剂化合物和所述引发剂溶液时，所述化学发光化合物被氧化而产生化学发光；所述特异性结合伴侣是抗体、结合蛋白或核酸。

附图说明

图1是根据本发明使用标记的捕获抗体进行免疫测定的检测步骤的示意图。

图2是根据本发明使用标记的封闭蛋白质和未标记的捕获抗体进行的另一种免疫测定法的检测步骤的示意图。

图3是根据本发明使用标记的固体表面和未标记的捕获抗体进行的另一种免疫测定法的检测步骤的示意图。

图4是一图表，显示了在使用固定在微孔板的孔中的标记的捕获抗体和过量的用于检测的抗IgG-HRP结合物的非分离式免疫测定法中的IgG抗原检测。

图5是一图表，显示了在使用标记的封闭蛋白质和固定在微孔板的孔中的未标记的捕获抗体以及过量的用于检测的抗IgG-HRP结合物而进行的根据本发明的非分离式免疫测定法中的IgG抗原检测。

图6是根据本发明使用标记的捕获核酸进行的核酸杂交测定法的检测步骤的示意图。

图7是根据本发明使用标记的固相、固定化的捕获抗体和标记的分析物或分析物类似物进行的竞争性免疫测定的检测步骤示意图。

图8是根据本发明进行的另一种免疫测定法中的检测步骤示意图，其利用生物素-抗生物素蛋白的结合而产生标记的固体表面，并且使标签和捕获抗体保持接近。

图9是根据本发明进行的另一种免疫测定法中的检测步骤示意图，其也利用生物素-抗生物素蛋白的结合而产生标记的固体表面，并且使标签和捕获抗体保持接近。

具体实施方式

定义

烷基--含有1-20个碳的支链、直链或者环烃基团，其可以用1个以上除H之外的低级烷基取代基取代。在此使用的低级烷基是指含有8个以下碳的那些烷基。

分析物--测定中在待检测样品中的物质。一种以上具有对分析物的特异性结合亲合力的物质将被用于检测分析物。该分析物可以是蛋白质、肽、抗体、或半抗原，与该半抗原结合的抗体可以被制备。该分析物可以是核酸或低聚核苷酸，该低聚核苷酸可以被互补的核酸或低聚核苷酸结合。该分析物可以是任何其他的形成特异结合性配对成员的物质。其他示例性的分析物类型包括：药物比如甾族化合物、激素、蛋白质、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、可随意使用的药物、维生素、抗菌药物、抗真菌药物、抗病毒药物、嘌呤、抗肿瘤药试剂、安非他明、氮杂化合物、核苷酸、和前列腺素，以及所有这些药物的代谢产物、杀虫剂和杀虫剂的代谢产物，以及受体。分析物还包括细胞、病毒、细菌和真菌。

抗体--包括完全免疫的球蛋白以及天然的和改造的片段。

芳烷基--用芳基取代的烷基。例子包括苯甲基、二苯甲基(benzyhydryl)、三苯甲基、和苯乙基。

芳基--含有芳香环的基团，该基团含有1至5个碳环的芳香环，其可以用1个以上除H之外的取代基取代。

生物材料--包括，例如：全血、抗凝血的全血、血浆、血清、组织、动植物细胞、细胞内容物、病毒、以及真菌。

化学发光化合物--经历以下反应的化合物，该反应导致其被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物。该激发态可以是单线激态或三重激态。该激发态可以刚一衰减成基态就直接发光，或者可以将激发能传递至发射能受体，借此返回到基态。在该过程中，能量受体跃迁至激发态并发光。

杂烷基--一种烷基，其上至少一个环或非末端链中的碳原子被选自N、O、或S的杂原子取代。

杂芳基--一种芳基，其上1至3个环中碳原子被选自N、O、或S的杂原子取代。例举的基团包括：吡啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、喹啉基和吖啶基。

磁性粒子--在此使用磁性粒子包含具有磁性响应成分的颗粒材料。磁性响应包括强磁性、顺磁性和超顺磁性材料。一种示例性的磁性响应材料是磁铁矿粉。粒子可以具有磁性响应、并且被一种以上非磁性响应层包围的实心部分。另一方面，磁性响应部分可以是围绕层，或者可以是设置在非磁性响应核内部的粒子。

样品--在测定中含有或者疑似含有待测分析物的混合物。分析物包括，例如：蛋白质、肽、核酸、激素、抗体、药物、和甾族化合物。可以在本发明方法中使用的典型样品包括：体液，比如血液，其可以是当收集血液标本时通常发现的抗凝血的血液、血浆、血清、尿液、精液、唾液、细胞培养物、组织提取液等等。其他类型的样品包括：溶剂、海水、工业用水样品、食品样品和环境样品比如土壤或水、植物材料、真核生物、细菌、质粒、病毒、真菌、以及源于原核生物的细胞。

固体支持物--具有测定成分被固定化在其表面上的材料。所述材料可以为如下形式：颗粒、微粒、纳米颗粒、金属胶体、纤维、纸张、珠子、膜片、滤纸及其他支持物比如试管、微孔板、芯片、载玻片、和微阵列。

特异结合性配对成员、特异性结合伴侣--一种分子，其包括对另一种物质具有特异性结合亲合力的生物分子，所述另一种物质包括：DNA、RNA、低聚核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、肽、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。特异性结合伴侣可以结合于一种以上分子的活化剂或化学发光化合物。

取代--是指基团上至少一个氢原子被非氢基团置换。应该注意，关于取代基团，本文中指的是可以存在多个置换位点，除非另有明确说明。

试验设备--用于含有根据本发明测定法的样品及其他成分的容器或装置。其内包括，例如：各种尺寸和形状的试管、微孔板、芯片以及其上形成或印刷阵列的载玻片、测试条和膜片。

本发明涉及快速而简单的测定方法，其利用特异性结合配对反应来检测物质的存在、位置或含量。该方法需要使用固定化的化学发光化合物、用于诱导化学发光反应的结合于特异性结合伴侣的活化剂化合物、以及引发剂溶液。该方法涉及一种以上用于检测分析物的特异性结合配对反应。标记的特异性结合伴侣结合于分析物的结果是，使活化剂接近固定化化学发光化合物，以使得其可以有效激活刚一添加引发剂溶液就产生化学发光的反应。将被活化剂标记的特异性结合伴侣，以过量至结合所有的分析物所需要的量，提供给系统。在添加引发剂溶液和检测之前，不必除去过量的未结合的活化剂结合物，因为其未参与反应。

因此本发明的方法区别于常规试验方法之处在于，化学发光化合物和活化剂两者都被约束在固体支持物处，以可操作的接近性允许刚一添加引发剂溶液就进行化学发光反应。过量未固定化的活化剂的存在，如果不除去，不会消除其进行敏感的特异性结合测定的能力。这一现象是不希望有的或不可预测的。

重要地，研究发现，使固定化化学发光化合物和活化剂的方法逆转的测定形式不允许以无洗涤步骤的形式有效地进行测定。当活化剂被固定化在固体支持物上、并且化学发光化合物作为与特异性结合伴侣的结合物被提供(其中特异性结合伴侣用于直接或间接结合于分析物)、接着添加引发剂溶液时，不能将产生的光量与分析物含量相关联。在不结合任何特殊的理论的情况下，人们相信至少一种对这些逆转形式的失效做出贡献的因素是：过量的未结合于分析物的化学发光化合物-特异性结合伴侣结合物不能自由移动到测定溶液或混合物周围并且可操作地接近固定化的活化剂。

在一个实施方式中，提供了测定方法，尤其结合性测定方法，其中通过至少一种因分析物的存在而进行的特异性结合反应，使固定化化学发光化合物和活化剂结合物可操作地接近。其中，被结合的活化剂结合物激活刚一添加引发剂溶液就产生化学发光的反应，用于检测分析物的存在、位置或含量。

在一个实施方式中，本发明的方法不同于常规试验方法之处还在于，不除去以大大过量于特异性地与分析物相联接的量所存在的未结合的活化剂结合物。可以将含有分析物、活化剂结合物、和引发剂溶液的样品依序添加至试验容器，无需洗涤或者分离、以及发光读取。另一方面，在导入引发剂溶液之前，可以将样品和活化剂结合物预混合并添加至试验容器，所述试验容器含有用于捕获分析物的特异性结合伴侣并含有固定化的化学发光标签。不需要洗涤或分离过量的未结合的活化剂结合物。另一个与本技术领域已知的常规化学发光测定法差别化的关键点在于该事实：参与光产生的化学发光化合物和活化剂(例如过氧化物酶)都不能自由地扩散进入溶液。两者都受空间制约。部分由于该结果，信号产生趋于短暂。

使用化学发光底物和酶标记的结合物的常规测定法以大大过量于标签酶的量提供底物。通常，底物/酶的摩尔比率往往可以超过十的九次幂，即，过量十亿倍。被认为有必要供应这样极大过量的化学发光化合物，以确保充分的底物供应，用于连续的酶法转化，并且该过程确保在测定中足够的检测灵敏度。申请人发现，有可能设计出高灵敏度的测定方法，其将化学发光化合物对活化剂的比率减小了几个数量级。就这点来说，这些方法基本上不同于已知的方法。

省去如上所述和如下所述示例性测定法显示的洗涤和分离步骤，从而提供了使测定方案设计简单化的机会。操作步骤数量的减少可以降低测定时间、由不完全的洗涤带来的内测定变化性、以及成本。同时，增强了自动化和小型化测定性能的能力，以及自动化和小型化伴随的所有固有优点。

根据本发明的方法进行的测定包含四个步骤。在第一步，将固体支持物提供于试验设备中，用于特异性捕获所研究的分析物。该固体支持物上设有固定化的用于直接或间接地结合待检测的分析物的特异性结合伴侣。该固体支持物上进一步设有固定化于其上的化学发光标记性化合物。可以以如下详述的许多不同方式提供化学发光标签。在各个变体中，化学发光标签都稳定地或者不可逆以使其固定不动的方式附着于物质或材料上。所谓“不可逆地”，意思是指，在想要进行的测定中，在使用条件下基本上不从固体支持物上除去化学发光标签。在使用的条件下，预期提供被动的或非共价的连接方法，只要标签稳定地被附接并保留在固体支持物上。在第二步，将含有分析物的样品和活化剂结合物导入具有被固体支持物固定化的用于分析物的特异性结合伴侣的试验设备，并且允许形成特异性结合复合物。样品和活化剂结合物可以被分别地依序添加或同时添加，或者可以被预混合并作为组合添加。在此刻可以插入允许结合反应发生的任选滞后时间。而且，如有必要，可以包括任选的洗涤步骤以便从样品中除去无关的材料。在第三步，添加引发剂溶液以产生化学发光，用于检测分析物。最后，检测化学发光。典型地，测量峰值光强度水平或总的累积光强度。该光量可以根据通常已知的方法绘制校准曲线而与分析物含量相关联。当刚一添加引发剂溶液就紧跟着发生光发射时，优选用用机械方法定时测量的开始来进行利用合适注射器的添加，或者用已暴露于检测器的试验设备进行添加。在该检测中，第三和第四步基本上同时进行。通过参考进行特异性结合测定方法方面的标准文献、并且利用作为指导的如下详述的具体例子，通过常规实验，可以轻易地确定最优的反应物的量、体积、稀释度、特异性结合配对反应的培育时间、反应物的浓度等。

测定形式和固体支持物

在本发明的方法中，将化学发光标记性化合物固定化至测试体系的成分。这可以以数种方式中的任一方式完成。在本发明的实施方式中，化学发光标签变成被固定化至固体支持物的表面。提供一种方法用于将分析物吸引至表面，例如通过未标记的用于分析物的特异性结合伴侣来进行。借助于可使活化剂接近附着于固体支持物的固定化的化学发光标签的特异性结合反应，使该化学发光标签变得与活化剂相关联。然后，添加引发剂溶液并且测量化学发光。

在一个实施方式中，化学发光标签共价联接至固定化的用于分析物的特异性结合伴侣。一个实施例系是固定化在微孔板的孔上或粒子上的标记的捕获抗体或抗体片段。特异性结合伴侣的固定化可以通过共价连接或者通过吸附步骤进行。在这种图1中描绘的方式中，借助于以“夹心”形式结合分析物的两种特异性结合伴侣，化学发光标签变得与活化剂相关联。在图2中描绘的另一个实施方式中，化学发光标签被共价连接于以任意方式固定化在固体支持物上的辅助物质。辅助物质的固定化可以通过共价连接或者通过吸附步骤进行。因此该标签被近乎均匀地分配在固体支持物表面的周围。提供一种方法用于将分析物吸引至表面，例如通过未标记的用于分析物的特异性结合伴侣来进行。借助于可使活化剂接近附着于辅助物质的化学发光标签的特异性结合反应，该化学发光标签变得与活化剂相关联，该辅助物质被附接或者被动地涂到支持物表面上。在另一个实施方式中，化学发光标签被共价连接至固定化的对分析物特异性捕获抗体具有结合亲合力的通用抗体。在另一个实施方式中，与化学发光标签共价连接的辅助物质是蛋白质或肽。例举的蛋白质包括白蛋白或链霉抗生物素蛋白。通过使用生物素-化学发光化合物结合物，可以提供化学发光化合物用于固定化。这类测定形式或者通过直接固定化至固体支持物、或者通过使用通用捕获成分比如物种特异性抗免疫球蛋白的间接连接，可以提供作为生物素结合物的用于分析物的特异性结合伴侣。在另一个实施方式中，与化学发光标签共价连接的辅助物质是合成聚合物。使用聚合的辅助物用于固定化化学发光化合物的测定形式，或者通过直接固定化至固体支持物、或者通过使用通用捕获成分比如物种特异性免疫球蛋白的间接连接，可以提供作为生物素结合物的用于分析物的特异性结合伴侣。

在另一个实施方式中，化学发光标签被共价连接至固体支持物的表面。如图3所示，标签因此被近乎均匀地分配在固体支持物表面的周围。提供一种方法，用于将分析物吸引至表面，例如通过未标记的用于分析物的特异性结合伴侣来进行。借助于可使活化剂接近直接附着于支持物表面的化学发光标签的特异性结合反应，该化学发光标签变得与活化剂相关联。然后，无需洗涤或分离，添加引发剂溶液并且测量化学发光。

在另一个实施方式中，使用分析物的类似物，包括活化剂-分析物类似物结合物。在另一个实施方式中，使用标记的分析物，包括活化剂-分析物结合物。活化剂-分析物类似物结合物或者活化剂-分析物结合物与分析物将竞争性地与用于分析物的特异性结合伴侣相结合。显而易见，在这类测定方法中，在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈负相关性。(图7)

除通过用于结合抗原或其他蛋白质或其他抗体的抗体经由免疫测定法进行化学发光标签的连接之外，本发明的方法可以使用化学发光标记的核酸，用于通过互补核酸的结合来检测核酸。在这点上，该使用就核酸的大小而言没有特别限定，仅有的标准是，互补伴侣有足够的长度以允许稳定的杂交。在此使用的核酸包括基因长度的核酸、核酸的较短碎片、多聚核苷酸和低聚核苷酸，其中任何一种可以是单链的或者是双链的。在本发明的使用核酸作为特异性结合伴侣的实施方式中，核酸被共价连接或者物理地固定化在固体支持物的表面上，以捕获分析物核酸。可以将化学发光标签附接于俘获核酸，大略如图6所示，或者可以按如上所述将标签与支持物相关联。该俘获核酸将具有与分析物核酸的序列区域完全的或者基本上完全的序列互补性。当基本上互补时，俘获核酸可以具有不与分析物互补的末端突出部分、末端环状部分或内部环状部分，只要其不会妨碍或者抑制与分析物的杂交。反向位置也可以出现在其中突出或环位于分析物核酸内部的位置。俘获核酸、分析物核酸、活化剂结合物、以及第三核酸允许杂交。该第三核酸与分析物核酸的序列区域基本上互补，所述序列区域不同于与俘获核酸互补的区域。俘获核酸和活化剂结合物核酸与分析物的杂交可以依序或者是同时地连续进行。该工艺的结果是，借助于可使活化剂接近附接于支持物表面的化学发光标签的特异性杂交反应，使该化学发光标签变得与活化剂相关联。按如上所述提供引发剂溶液并且检测化学发光。

另一个实施方式包括一种变化，其中，使用分析物与活化剂的结合物。该分析物核酸-活化剂结合物和分析物核酸将竞争性地与用于分析物核酸的特异性结合伴侣相结合。显而易见，在这类测定方法中，在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈负相关性。

除基于抗体和基于核酸的体系之外，其他特异性结合配对，例如通常为本领域的普通技术人员所熟知的结合测定法，可以用作根据本发明的试验方法的基础。也可以使用抗体-半抗原配对。示例性的配对有：荧光素/抗荧光素配对、地高辛配基/抗地高辛配基配对、以及硝基苯基/抗硝基苯基配对。作为另一个例子，可以使用众所周知的(链霉)抗生物素蛋白/生物素结合配对。为显示其中可以使用该结合配对的一种方式，可以将链霉抗生物素蛋白-化学发光标签结合物共价连接或者吸附到固体支持物上。然后添加用生物素标记的分析物和活化剂结合物，其中结合物被附接于抗生物素抗体或者抗分析物抗体。在复合物被形成后，添加引发剂溶液并且按上述方法进行检测。在另一个实施方式中，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白被沉积在固体支持物上。生物素-化学发光化合物结合物被结合于抗生物素蛋白，并且生物素化抗体也被结合。在另一个实施方式中，生物素被连接于固体支持物，并且被用于捕获抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。生物素化抗体也被结合。或者通过将生物素-化学发光化合物结合物结合于(链霉)抗生物素蛋白、或者通过将表面直接用化学发光化合物标记，可以将化学发光化合物附着于固体支持物。本技术领域已知的附加的特异性结合伴侣包括：抗体的Fab部分、凝集素-碳水化合物、蛋白质A-IgG、以及激素-激素受体。应理解，可以使用化学发光化合物间接结合于固体支持物以服务于本发明。对于本领域的技术人员而言，这些例子及其他例子皆被认为在发明方法的范围之内。

在本发明的实施方式中有用的固体支持物可以是各种材料、各种孔隙度、各种形状、和各种尺寸。已经在结合测定法中使用的材料包括：96孔微孔板、384孔微孔板或更多孔数的微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素、纸质或塑料测试条、胶乳粒子、直径为0.10-50μm的聚合物粒子、直径为0.10-50μm的二氧化硅粒子、磁性粒子尤其是平均直径为0.1-10μm的磁性粒子、各种材料的纳米颗粒、以及金属胶体。这些材料可以全部提供对于连接化学发光标签和对于固定化特异性结合伴侣有用的固体支持物。磁性粒子可以包括磁性金属、金属氧化物或金属硫化物核心，其通常被吸附性或共价性结合层包围，以屏蔽磁性成分。磁性成分可以是铁、氧化铁或者硫化铁、其中铁是Fe²⁺或Fe³⁺或两者混合物。该类可使用的材料包括，例如：磁铁矿、磁赤铁矿、和黄铁矿。其他磁性金属氧化物包括MnFe₂O₄、NiFe₂O₄、和CoFe₂O₄。磁性成分可以，例如，是被非磁性壳包围的实心，或者可以是分散有磁性和非磁性材料的核心，或者可以是包围非磁性核心的层、其任选地被另一种非磁性的壳包围。在这样的磁性粒子中的非磁性材料可以是：二氧化硅、合成聚合物比如聚苯乙烯、Merrifield树脂、聚丙烯酸酯或苯乙烯-丙烯酸酯共聚物，或者其可以是天然聚合物比如琼脂糖或葡聚糖。

本发明公开教导了使这些材料功能化的方法，用于本发明的测定方法。特别地，公开了一些方法，用于将化学发光标记性化合物和特异性结合伴侣(例如抗体)，这两者都附接至相同的表面、尤其附接至微孔板的孔或微粒。在测定中使用的合适支持物包括：合成聚合物支持物，比如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯(例如，胺化聚苯乙烯或羧基化聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氯乙烯，玻璃珠，二氧化硅粒子，功能化的二氧化硅粒子，金属胶体，琼脂糖，硝化纤维，尼龙，聚偏氟乙烯，表面改性的尼龙等等。

化学发光标签化合物

在本发明的实施方式中用作化学发光标签的化合物具有通式CL-L-RG，其中，CL代表化学发光部分，L代表连接化学发光部分和活性基团的连接部分，而RG代表用于偶联于另一种材料的活性基团部分。术语“化学发光基团”和“化学发光部分”可互换地使用，如同术语“连接部分”和“连接基团”那样。该化学发光部分CL包括经受与活化剂反应的化合物，该反应导致其被转化为激活的化合物。激活的化合物与引发剂溶液的反应形成电子激发态化合物。该激发态可以是单线激态或三重激态。该激发态可以刚一衰减成基态就直接发光，或者可以将激发能传递至发射能受体，借此返回到基态。在该过程中，能量受体跃迁至激发态并发光。优选，但并非必需，CL基团、活化剂和引发剂溶液的化学发光反应快速发生在非常短暂的时间间隔整个期间；在一个实施方式中，发光反应在几秒内达到峰强度。

在本发明的一个具体实施方式中，化学发光化合物能够被氧化，从而当存在活化剂和引发剂溶液时产生化学发光。通过连接物和活性基团的结合可以用作化学发光标签的化合物的示例性种类包括：芳香环状二酰基酰肼，例如氨基苯二酰一肼(luminol，鲁米诺)；以及在结构上相关的环状酰肼，包括：异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-1，2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2，3-二羧酸酰肼、菲-1，2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼，以及在Masuya等的美国专利No.5,420,275和Yamaguchi的美国专利No.5,324,835中公开的其他2，3-二氮杂萘二酮类似物。

据认为，任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物将具有本发明中使用的化学发光标签化合物的化学发光部分的功能。本技术领域已知有许多各种结构分类的化合物在这些条件下可以产生化学发光，这样的化合物包括：呫吨染料例如荧光素、曙红、罗达明染色剂、或对甲氨基酚染料、芳香胺和杂环胺。另一个例子是化合物MCLA，即，2-甲基-6-(对甲氧苯基)-3，7-二氢化咪唑并[1，2-a]吡嗪-3-酮，其具有下述化学式：

另一个例子是吲哚基醋酸，另一个是异丁醛，后者的典型地附有用于提高可见光产出的荧光能量受体。三羟基芳香化合物焦性没食子酸、间苯三酚和红棓酚个别地或者其组合是其他的化合物例子，它们可以用作本发明的化学发光标记性化合物中的化学发光的部分。

在一个实施方式中，在包括本发明方法中有用的9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇在内的化学发光标签化合物组包括具有下述式I的9，10-二氢化吖啶类化合物：

其中，基团R¹-R¹¹中的至少一个是具有下式的标记性取代基：

-L-RG

其中，L是连接基团，其可以是化学键或另一种二价或多价的基团；RG是反应基团，其使化学发光标记性化合物能够被结合于另一种化合物；R¹、R²和R³是含有1到50个非氢原子的有机基团，并且R⁴-R¹¹中的每一个是氢或无干扰性的取代基。标记性取代基-L-RG可存在于R¹或R²的一个上，虽然其还可以作为取代基存在于R³上或者存在于R⁴-R¹¹中的一个上。

在式I的化合物中的基团R¹和R²可以是含有1到约50个选自于C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子的任何有机基团，其使光产生。所述使光产生是指，当式I的化合物经受本发明的反应时，激发态产物化合物被产生并且其可以涉及一种以上化学发光中间体的产生。激发态产物可以直接地发射光，或者可以通过能量传递而将激发能传递至荧光受体，引起光从荧光受体发出。在一种实施方式中，R¹和R²选自于含1-20个碳原子的取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的芳烷基。当R¹或R²是取代基时，其可以用1-3个选自于以下的基团取代：羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基基团、季铵基团、以及季鏻基团。在一种实施方式中，R¹或R²用式-L-RG的标记性取代基取代，此处L是连接基团，而RG是反应基团。

基团R³是含有1到50个除满足基团中原子的原子价所要求的必需数量的H原子之外的非氢原子的有机基团，所述非氢原子选自于C、N、O、S、P、Si和卤素原子。在一个实施方式中，R³含有1到20个非氢原子。在另一个实施方式中，有机基团选自由含1-20个碳原子的烷基、取代烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的芳烷基所构成的组。在另一个实施方式中，用于R³的基团包括取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、取代或未取代的苯甲基、烷氧基烷基、羧基烷基和烷基磺酸基团。基团R³可以被结合于R⁷或R⁸以构成5元环或6元环。在一个实施方式中，R³用式-L-RG的标记性取代基取代。

在式I的化合物中，基团R⁴-R¹¹中的每一个各自独立地是H或取代基团，其允许产生激发态产物，并且通常含有1到50个选自于C、N、O、S、P、Si和卤素的原子。有代表性的取代基团可以包括，但不限于：烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、卤素、氨基、取代氨基、羧基、烷氧羰基、氨甲酰、氰基、以及磺酸酯基团。相邻基团的配对，例如R⁴-R⁵或者R⁵-R⁶，可以被结合一起，从而形成包括至少一种融合于环中的附接有两个基团的5元环或6元环的碳环或杂环体系。这样融合的杂环可以含有N、O或S原子，并且可以如上所述含有除H之外的环取代基。基团R⁴-R¹¹中有一个以上可以是式-L-RG的标记性取代基。在一个实施方式中，R⁴-R¹¹选自氢、卤素和烷氧基比如甲氧基、乙氧基、叔丁氧基等等。在另一个实施方式中，所述化合物中的R⁵、R⁶、R⁹或R¹⁰基团之一为卤素，而R⁴-R¹¹中的其他基团皆为氢原子。

取代基团可以以各种量并入、并且选择在9，10-二氢化吖啶环上的环或者链位置，以改变化合物的特性或者便于合成。这些特性包括，例如，化学发光量子产率、酶反应速度、最大光强度、光发射持续时间、光的发射波长以及在反应介质中的溶解度。具体的取代基和它们的效果被显示在下述具体的实施例中，然而，无论如何不应将其视为对本发明保护范围的限制。为便于合成式I的化合物，优选其R⁴至R¹¹中每一个皆为氢原子。

在另一个实施方式中，化合物组为下式II，其中，R⁴至R¹¹中的每一个都是氢。基团R¹、R²和R³如以上所定义的。

式I或II的标记性化合物具有作为基团R¹或R²上取代基的基团-L-RG。在一个实施方式中，标记性化合物为式III。

有代表性的标记性化合物以及它们在连接于其他分子和固体表面的用途在下述具体的实施例中有描述。

另一类化学发光部分包括在美国专利No.5,491,072、5,523,212、5,593,845和6,030,803中公开的9，10-二氢化吖啶酯、硫酯和氨磺酰。在该类中，化学发光标记性化合物具有下式IV所示的化学发光部分CL，其中，Z是O、S或NR¹¹SO₂Ar，其中R¹¹是烷基或芳基，其中Ar是芳基或烷基取代芳基，其中R¹是C_1-8烷基、卤素取代的C_1-8烷基、芳烷基、芳基、或者用下述基团取代的芳基：烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷氧基、烷氧基烷基、卤素、羰基、羧基、氨甲酰、氰基、三氟甲基、三烷基铵、硝基、羟基、氨基和巯基；其中，R²选自于烷基、杂烷基、芳基、以及芳烷基；并且其中，R^3-10中每一个皆是氢或者1个或2个选自于烷基、烷氧基、羟基、以及卤素的取代基；并且R^3-10中的剩余基团是氢。在一个实施方式中，R^3-10中每一个皆是氢并且R¹是标记性取代基。在另一个实施方式中，R^3-10中一个是标记性取代基并且R^3-10中的其它基团是氢。

另一类化学发光部分包括在美国专利No.5,922,558、6,696,569和6,891,057中公开的杂环化合物。在一个实施方式中，这些化合物包括杂环，该杂环包含其上可键合环外双键的含氮、氧或硫的五元环或六元环或多元环基团，该杂环的末端碳原子可用选自氧和硫原子的两种原子取代。

在另一个实施方式中，化学发光标记性化合物具有下式V所示的化学发光的9，10-二氢化吖啶部分CL，其中，R¹选自于含1-20个碳原子的烷基、烯基、炔基、芳基、以及芳烷基，其中的任何一个可以用1-3个选自于以下的基团取代：羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基团、季铵基团或季鏻基团；其中，X选自于C₁-C₈烷基、芳基、芳烷基、具有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、葡糖基基团和化学式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基基团(其中R′和R″是独立地选自于C₁-C₈烷基、氰基烷基、芳基和芳烷基)、三烷基甲硅烷基基团、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵以及三烷基鏻阳离子；其中，Z¹选自于O和S原子；其中，R⁶选自于取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、苯甲基、烷氧基烷基和羧基烷基基团；其中，R^7-14中每一个是氢或者其中1个或2个是选自于烷基、烷氧基、羟基以及卤素的取代基，并且R^7-14中的剩余基团是氢。在一个实施方式中，R^7-14中每一个皆是氢并且R¹是标记性取代基。在另一个实施方式中，R^7-14中的一个基团是标记性取代基并且R^7-14中的其它基团是氢。

在另一个实施方式中，化学发光标记性化合物具有下式VI所示的化学发光部分CL，其中，R¹选自于含1-20个碳原子的烷基、烯基、炔基、芳基、以及芳烷基，其中的任何一个可以用1-3个选自于以下的基团取代：羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基团、季铵基团或季鏻基团；其中，X选自于C₁-C₈烷基、芳基、芳烷基、具有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、葡糖基基团和化学式PO(OR1′)(OR1″)所示的鏻酰基基团(其中R′和R″是独立地选自于C₁-C₈烷基、氰基烷基、芳基和芳烷基)、三烷基甲硅烷基基团、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵以及三烷基鏻阳离子；其中，Z¹和Z²中每一个选自O和S原子，并且其中R₂和R₃独立地选自氢和C₁-C₈烷基。

连接基团(L)。在本发明中使用的任何化学发光化合物中的连接基团可以是键、原子、二价基团和多价基团、或者是直链或支链原子，其中一些可以是环状结构的一部分。该取代基通常含有1至约50个非氢原子、更通常含有1至约30个非氢原子。在另一个实施方式中，含有链的原子选自C、O、N、S、P、Si、B以及Se原子。在另一个实施方式中，含有链的原子选自C、O、N、P以及S原子。在链中除碳原子以外的原子的数量通常是1-10。卤素原子可以作为取代基存在于链或环上。典型的包含连接的取代基的官能团包括：亚烷基，亚芳基，亚链烯基，醚，过氧化物，羰基例如酮、酯、碳酸酯、硫酯，或者酰胺基，胺，脒，氨基甲酸酯，脲，亚胺，酰亚胺，酰亚胺盐，碳二亚胺，肼，重氮，磷酸二酯，磷酸三酯，磷酸酯，硫醚，二硫化物，亚砜，砜，磺酸酯，硫酸酯，以及硫脲基团。在另一个实施方式中，基团是含1-20个原子的亚烷基链，其末端为：-CH₂-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、-NRC(＝S)-、或者-C(＝O)NR-基团，其中R是C_1-8烷基。在另一个实施方式中，连接基团是含3-30个原子的聚(亚烷氧基)链，其末端为：-CH₂-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、-NRC(＝S)-、或者-C(＝O)NR-基团，其中R是C_1-8烷基。

反应基团。反应基团RG是原子或基团，其存在可以促进通过共价连接或者物理力而键合于另一种分子。在一些实施方式中，例如，当反应基团是离去基团比如卤素原子或甲苯磺酸盐基团、并且化学发光标记性化合物被通过亲核置换反应而共价连接于另一种化合物上时，本发明的化学发光标记性化合物连接至另一种化合物将涉及从反应基团上丧失一种以上原子。在其他实施方式中，当发生加成反应例如Michael加成时、或者当反应基团是异氰酸酯或者异硫氰酸酯基团时，化学发光标记性化合物通过形成共价键而连接至另一种化合物将涉及反应基团内部键的重组。在另一些其他的实施方式中，连接不会涉及共价键形成，但涉及物理力，而在这样情况下反应基团保持不变。而物理力是指吸引力，比如氢键吸引力、静电吸引力或者离子吸引力；疏水性吸引力比如碱基堆积；以及特异性亲合力相互作用比如生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用、抗原-抗体相互作用、以及核苷酸-核苷酸相互作用。

表1.用于将标签化学结合至有机分子和生物分子的反应基团

a)胺反应基团。

b)硫醇反应基团。

3)羧酸反应基团。

4)羟基反应基团。

5)醛/酮反应基团。

-NH₂  -ONH₂  -NHNH₂

6)其他反应基团。

在一个实施方式中，反应基团包括OH、NH₂、ONH₂、NHNH₂、COOH、SO₂CH₂CF₃、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺醚和顺丁烯二酰亚胺基团。

双功能偶联剂还可以用于用适度反应性的基团将标签偶联到有机分子和生物分子上(参见L.J.Kricka，配体-结合物测定法。Marcel Dekker公司出版，纽约，1985年，第18-20页、表2.2；和T.H.Ji，“双功能试剂”，Methods in Enzvmology.91，580-609(1983))。有两种类型的双功能试剂：并入最终结构的双功能试剂，以及不并入最终结构、并且仅起偶联两种反应物作用的双功能试剂。

活化剂结合物

活化剂化合物成为活化剂-特异性结合伴侣结合物的一部分。结合物具有双重作用：1)在测定中，通过特异性结合伴侣部分直接地或者通过中间的特异性结合伴侣而经受与分析物含量成比例的特异性结合反应，和2)通过活化剂部分激活化学发光化合物。结合物的活化剂部分是具有活化化学发光化合物的效果的化合物，使得当存在引发剂溶液时产生化学发光。能够用作活化剂的化合物包括具有类似过氧化物酶活性的含有过渡金属盐和复合物以及酶的化合物，尤其是含有过渡金属的酶，更尤其是含有过氧化物酶。在活化剂化合物中有用的过渡金属包括周期表中第3-12族的那些过渡金属，尤其是铁、铜、钴、锌、锰和铬。应该注意，决定着信号产生的活化剂分子可以在物理上限制的半径内起作用，并且仅与有限供应的化学发光化合物相接触。如果活化剂具有这种潜力，这似乎阻止了较大的催化转化。

可以经受化学发光反应的过氧化物酶包括，例如：乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶、钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶、木质素过氧化物酶和来源于Arthromyces ramosus的过氧化物酶、以及在白腐真菌中产生的Mn依赖性过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。已知不是酶、但具有类似过氧化物酶活性的模拟过氧化物酶的化合物包括：铁复合物，比如亚铁原卟啉、以及Mn-TPPS₄(Y.-X.Ci等，Mikrochem J.，52，257-62(1995))。上述这些物质催化底物的化学发光氧化，并且应明确地认为包含于本发明所使用的过氧化物酶含义的范围内。

过氧化物酶和生物分子的结合物或者复合物还可以被使用于产生化学发光的方法中，仅有的附带条件是结合物显示出过氧化物酶活性或者类似过氧化物酶活性。可以结合于一个以上过氧化物酶分子的生物分子包括：DNA、RNA、低聚核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、肽、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。还可以在本发明的方法中使用包含或者结合过氧化物酶的复合物，比如脂质体、胶束、囊泡和为连接生物分子而被功能化的聚合物。

物质的组成

在本发明的另一个实施方式中，提供包含在其上固定化有化学发光化合物的固体支持物的测试材料。在一个实施方式中，化学发光化合物选自如上所述化学发光化合物组。在另一个实施方式中，化学发光化合物是过氧化物酶的底物。固定化在固体支持物上的化学发光化合物的量可以在荷载密度范围内变化。作为例子，当固体支持物是颗粒材料时，可以采用的荷载范围为100-0.01μg化学发光化合物/每毫克粒子。在另一个实施例中，可以采用的荷载范围为5-0.1μg化学发光化合物/每毫克粒子。该化学发光化合物通常随机或均匀地分布到固体支持物之上。其可以被固定化在固体支持物的表面上或者在可到达的孔内部。化学发光化合物可以通过共价连接而被固定化到固体支持物上。本实施方式中，具有反应基团的化学发光标记性化合物与存在于固体支持物上的官能团起反应，以便在化学发光化合物和固体支持物之间形成共价键。在一个可替代的实施方式中，可以利用一种以上中间物质将化学发光化合物固定到固体支持物上。在一个实施例中，生物素被共价附接于固体支持物，共价附接的生物素被结合于链霉抗生物素蛋白，并且生物素-化学发光化合物结合物然后被结合。在另一个实施例中，链霉抗生物素蛋白被吸附到固体支持物上，并且生物素-化学发光化合物结合物然后被结合。在另一个实施例中，结合于辅助蛋白质比如白蛋白的化学发光化合物被吸附或者共价连接到固体支持物上。在另一个实施例中，结合于抗体的化学发光化合物被吸附或者共价连接到固体支持物上。

固体支持物可以是各种材料、各种孔隙度、各种形状、以及各种尺寸，例如96孔的微孔板、384孔的微孔板、或更高孔数的微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素、纸质或者塑料测试条、胶乳粒子、直径为0.10-50μm的聚合物粒子、直径为0.10-50μm的二氧化硅粒子、磁性粒子、尤其是平均直径为0.1-10μm的磁性粒子、以及纳米颗粒。在一个实施方式中，固体支持物包括直径为0.10-50μm的聚合物粒子或二氧化硅粒子，并且可以是如上定义的磁性粒子。

本发明的固定化化学发光化合物包括附着于固体支持物的化学发光标签，其中，通过具有通式CL-L-RG的化学发光标记性化合物而提供化学发光标签，其中，CL代表化学发光部分，L代表将化学发光部分连接至反应基团的连接部分，并且RG代表用于偶联于另一种材料的活性基团部分。化学发光部分CL包括一种化合物，所述化合物经受与活化剂的反应而导致其被转化为激活的化合物。激活的化合物与引发剂溶液的反应形成电子激发态化合物。化学发光部分包括在标题“化学发光标签化合物”下的上述每一类化合物，其包括但不限于氨基苯二酰一肼、以及在结构上相关的环状酰肼、9，10-二氢化吖啶酯、硫酯和氨磺酰、以及9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫代缩二乙醇类化合物。在本发明的另一个实施方式中，提供包含其上固定化有化学发光化合物的固体支持物的测试材料和至少一种特异性结合物质，所述特异性结合物质对于分析物有特异性结合亲合力，或者对于另一种物质有特异性结合亲合力，所述另一种物质对于分析物有特异性结合亲合力。在这些实施方式中，固定化的化学发光化合物是如上刚刚描述的由于包含其上固定化有化学发光化合物的固体支持物的实施方式。固定化的特异性结合物质通过一种以上特异性亲合力结合反应而直接或间接地结合分析物。该特异性的结合物质包括，但不限于：抗体和抗体片段、抗原、半抗原和它们的同源抗体、生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、蛋白质A和IgG、互补核酸或低聚核苷酸、凝集素和碳水化合物。

本发明的另一个实施方式包括在测定中形成的信号系统，其包含其上固定化有下述物质的固体支持物：1)化学发光化合物，2)至少一种特异性的结合物质，其对于分析物有特异性结合亲合力或者对于另一种物质有特异性结合亲合力，所述另一种物质对于分析物有特异性结合亲合力，3)分析物，以及4)活化剂结合物。术语“固体支持物”、“化学发光化合物”和“特异性结合物质”的含意和包含这些术语的实施方式与如上所述被认为是本发明组成的测试材料的含意和实施方式相同。可以形成本发明信号系统的组成部分的分析物包括上述鉴别的任何分析物，其存在、位置或含量在测定中被确定。活化剂结合物包括被连接至分析物-特异性结合伴侣结合物的活化剂化合物。结合物具有双重作用：1)在测定中，通过特异性结合伴侣部分直接地或者通过中间的特异性结合伴侣而特异性地结合至分析物上，和2)通过活化剂部分激活化学发光化合物。结合物的活化剂化合物部分是具有激活化学发光化合物的效果的化合物，使得当存在引发剂溶液时产生化学发光。能够用作活化剂的化合物包括具有类似过氧化物酶活性的化合物，其含有过渡金属盐和复合物以及酶、尤其是含有过渡金属的酶、更尤其是含有过氧化物酶。在活化剂化合物中有用的过渡金属包括周期表中第3-12族的那些过渡金属，尤其是铁、铜、钴、锌、锰和铬。可以经受化学发光反应的过氧化物酶包括，例如：乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶、钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶、木质素过氧化物酶、来源于Arthromyces ramosus的过氧化物酶、在白腐真菌中产生的Mn依赖性过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。具有类似过氧化物酶活性的其他化合物包括铁复合物，比如亚铁原卟啉、和Mn-TPPS₄。

引发剂溶液

引发剂溶液提供了产生化学发光所需的激发态化合物所需要的反应物。该反应物可以是一种对于通过直接与化学发光标签反应而进行化学发光反应所必需的反应物。其可以具有代替该功能或者除该功能之外的促进活化剂化合物功能的作用。例如，当活化剂是过氧化物酶时，将会发生这种情况。在一个实施方式中，引发剂溶液包含过氧化物化合物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。例举的过氧化物包括过氧化氢、过氧化脲和过硼酸盐。在引发剂溶液中使用的过氧化物浓度可以在一定数值范围内变化，典型地，该范围为约10^-8M至约3M、更通常为约10^-3M至约10^-1M。有代表性的实施方式使用作为活化剂的过氧化物酶结合物、被9，10-二氢化吖啶标记的分析物的特异性结合伴侣(其中，通过特异性结合伴侣与上述式III的化合物反应而提供9，10-二氢化吖啶标签)、以及包含过氧化氢的引发剂溶液。该过氧化物与过氧化物酶反应，估计可能是在酶的活性部位将铁的氧化态变成了不同的氧化态。这种改变了状态的酶和保持与酶接近的9，10-二氢化吖啶标签反应。化学发光反应包含由化学发光化合物与过氧化物形成的中间体的进一步反应，以产生最终的反应产物和光。

将某些增强化合物并入引发剂溶液可以促进的酶反应性或者减少背景信号，或者同时具有这两种功能。这些增强剂中包括已知可增强其他的过氧化物酶反应的酚类化合物和芳香胺，如美国专利No.5,171,668和5,206,149所述，现将其引入本文作为参考。在美国专利5,512,451中公开了取代的和未被取代的芳基硼酸化合物和它们的酯和酐衍生物，将其引入本文作为参考，在此也考虑将其归入在本发明中有用的增强剂范围内。例举的增强剂包括，但不限于：对苯基苯酚、对碘苯酚、对溴苯酚、对羟基肉桂酸、对咪唑基苯酚、醋氨酚、2，4-二氯苯酚、2-萘酚以及6-溴-2-萘酚。还可以使用选自如上所述这些种类的一种以上增强剂的混合物。

被发现有效增强由本发明的化合物产生化学发光的辅助增强剂是吩恶嗪和吩噻嗪的衍生物，它们具有下式。

在吩恶嗪和吩噻嗪增强剂的氮原子上被取代的R基包括：1-8个碳原子的烷基，以及用磺酸盐或羧酸盐基团取代的1-8个碳原子的烷基。例举的增强剂包括：3-(N-吩噻嗪基)-丙烷磺酸盐、3-(N-吩恶嗪基)丙烷磺酸盐、4-(N-吩恶嗪基)丁烷磺酸盐、5-(N-吩恶嗪基(phenoxazinyl))-戊酸盐、以及N-甲基吩恶嗪(N-methylphenoxazine)和相关同系物。在引发剂溶液中使用的增强剂浓度可以在一定数值范围内变化，典型地，该范围为约10^-5M至约10^-1M、更通常为约10^-4M至约10^-2M。

检测本发明的反应是用引发剂溶液进行的，该引发剂溶液是典型的缓冲水溶液。合适的缓冲液包括任何常用的能够保持环境允许的化学发光反应进行的缓冲液。典型地，引发剂溶液将具有约5至约10.5的pH值。示例性的缓冲液包括：磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐、碳酸盐、三(羟基-甲基氨基)甲烷[tris]、甘氨酸、麦黄酮(Tricine)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、二乙醇胺MOPS、HEPES、MES等等。

引发剂溶液还可以含有一种以上清洁剂或者聚合物表面活性剂，以增强产光反应的发光效率或者提高测定的信/噪比。在本发明的实施方式中有用的非离子表面活性剂包括，例如：聚氧乙烯化烷基酚类、聚氧乙烯化醇类、聚氧乙烯化醚类和聚氧乙烯化山梨糖醇酯类。可以使用包括季铵盐化合物比如CTAB和季鏻盐化合物在内的单体阳离子表面活性剂。还可以使用包括那些含有季铵和鏻盐基团的阳离子表面活性剂的聚合型阳离子表面活性剂。

在一个实施方式中，引发剂溶液是包括缓冲水溶液的组合物，过氧化物浓度为约10^-5M至约1M，并且增强剂浓度为约10^-5M至约10^-1M。该组合物可以任选地含有包括表面活性剂、金属螯合剂以及防腐剂在内的添加剂，以抑制或最小化微生物污染。

检测

通过任何合适的已知手段比如光度计、X射线胶片、高速感光胶片、CCD摄像机、闪烁计数器、化学光度计或可见光手段，可以检测通过本发明的方法发射的光。每种检测手段具有不同的光谱灵敏度。人眼是优选地对绿光灵敏，CCD摄像机显示出对红光的最高灵敏度，X射线胶片具有对紫外线、蓝光或绿光的最大应答，这些都是可利用的。检测装置的选择将取决于其应用和成本、方便性考虑、以及是否需要产生经常记录。在那些光发射时程较快的实施方式中，优选进行引发剂反应以便在使用检测装置时产生化学发光。作为例子，可以在适合于接受试管或微孔板的壳体内，在放置于光度计中或者被置于CCD摄像机前的试管或微孔板中进行检测反应。

应用

本发明的测定方法发现了在许多类型的特异性结合配对测定法中的应用性。在这些应用中，首要的应用是化学发光酶联免疫测定法，比如ELISA。进行免疫化学步骤的各种测定形式和方案已为本领域技术人员所熟知，并且包括竞争性测定法试和夹心测定法。可以通过根据本发明的免疫测定法测试的物质种类包括：蛋白质、肽、抗体、半抗原、药物、甾族化合物及其他通常在免疫测定技术领域已知的物质。

本发明的方法还可用于核酸检测。在一个实施方式中，一种方法利用了酶标记的核酸探针。例举的方法包括：溶液杂交测定法、Southern blotting中的DNA检测、通过Northern blotting的RNA检测、DNA测序、DNA指纹图谱法、集落杂交以及噬菌斑杂交法(plaque lift)，其进行过程对本领域的技术人员而言是众所周知的。

除上述的抗原-抗体、半抗原-抗体或者抗体-抗体配对之外，特异性结合配对还可以包括互补的低聚核苷酸或多聚核苷酸、抗生物素蛋白-生物素、链霉抗生物素蛋白-生物素、激素-受体、凝集素-碳水化合物、IgG-蛋白质A、结合蛋白-受体、核酸-核酸结合蛋白、以及核酸-抗核酸抗体。在筛选药物候选对象中使用的受体测定法是本发明方法的另一应用领域。这些结合配对的任何一种皆可以适合于在本发明方法的三组分夹心技术或者如上所述的二组分竞争性技术中使用。

本发明的目的还在于提供根据本发明的方法进行测定的试剂盒。试剂盒在包装产品组合中可以包括：化学发光标签，其或者是游离的标签化合物、化学发光标记的特异性结合伴侣、化学发光衍生的固体支持物比如颗粒或者微孔板，或者是化学发光标记的辅助物质比如封闭性蛋白质；同时还有引发剂溶液和使用说明书。如果化学发光标记是由使用者进行的话，试剂盒还可以任选地含有活化剂结合物、分析物标准样、对照物、稀释剂和反应缓冲液。

实施例

实施例1.化合物1的合成

使用DCC作为偶联剂，通过碘化羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺反应，合成了碘化羧酸酯NHS酯。使用在美国专利申请公开2005/0158815中公开的方法制备化合物B。

在氩气保护下，向无水DMF(50mL)中二硫酯B(1.808g，5.00mmol)的溶液中添加NaH(在矿物油中60％，0.200g，5.00mmol)。在室温下反应后4h后，添加NHS 3-碘化丙酸酯A(1.485g，5.00mmol)，并且将得到的混合物搅拌过夜。在真空中除去DMF。用CH₂Cl₂/EtOAc(40∶1)进行柱层析，得到1.770g的黄色固体化合物1(产率67％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ2.30(s，3H)，2.74(t，2H)，2.83(s，4H)，3.01(t，2H)，5.31(s，2H)，6.88(t，2H)，7.07(m，2H)，7.11-7.18(m，3H)，7.27(m，4H)，7.82(dd，1H)，7.89(dd，1H)ppm。

实施例2.化合物2的合成

使用在美国专利申请公开2005/0158815中公开的方法制备化合物C。在氩气保护下，将二硫酯C(0.692g，1.50mmol)和NaH(在矿物油中60％，0.060g，1.50mmol)在无水DMF(20mL)中的混合物在室温下搅拌4小时，得到稍混浊的溶液。然后添加5mL的DMF中的NHS 6碘化己酸酯A(n＝4)(0.661g，1.95mmol)。在16h后，于真空下除去DMF。向残余物添加10mL的丙酮，接着添加20mL的乙醚。倾析上清液。以相同的工序洗涤沉淀物三次。在真空干燥后，得到了1.200g的黄色固体化合物2。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ1.15(m，2H)，1.33-1.47(m，4H)，2.01(p，2H)，2.38(t，2H)，2.67(t，2H)，2.75(t，2H)，2.82(s，4H)，2.88(t，2H)，5.32(s，2H)₅6.88-6.93(m，2H)，7.00(t，2H)，7.08-7.28(m，7H)，7.83(d，1H)，7.92(d，1H)ppm。

实施例3.化合物3和4的合成

在氩气保护下，将二硫酯C(1.00g，2.10mmol)和NaH(在矿物油中60％，0.087g，2.16mmol)在无水DMF(20mL)中的混合物在室温下搅拌4小时，得到稍混浊的溶液。然后添加在DMF(5mL)中的N-6碘化己氧基琥珀酰亚胺D(0.82g，2.52mmol)。将混合物搅拌过夜，此后在真空下除去DMF。用30mL乙醚洗涤残余物四次，得到1.35g的化合物3。

将化合物3(0.25g)溶于5mL甲醇中，向其内添加5.0mL的50％的NH₂OH水溶液。溶液搅拌2天后，在真空下蒸去溶剂。用6x20mL的乙醚洗涤残余物，得到0.21g的化合物4。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ1.14(m，4H)，1.40(m，4H)，1.94(p，2H)，2.65-2.71(m，4H)，2.84(t，2H)，3.55(t，2H)，5.31(s，2H)，6.88(d，2H)，6.98(q，2H)，7.10(m，4H)，7.12-7.27(m，3H)，7.85(t，2H)ppm。

实施例4.化合物5和6的合成

在氩气保护下，将二硫酯C(1.32g，2.78mmol)和NaH(在矿物油中60％，0.114g，2.86mmol)在30mL无水DMF中的混合物于室温下搅拌4小时。然后添加10mL的DMF中的化合物E(1.014g，3.61mmol)。将混合物搅拌过夜，此后在真空下除去DMF。用20mL乙醚洗涤残余物三次，得到2.10g的化合物F。

将化合物F(2.25g)溶于15mL的在甲醇中7N NH₃和10mL的28％氨水溶液的混合物中。搅拌3天后，在真空下除去溶剂。用乙醚(3x50mL)洗涤残余物，并且用H₂O/2-丙醇重结晶，得到1.20g的化合物5。

向在9.0mL干燥DMF中化合物5(0.300g的话，0.563mmol)的悬浮液中添加1.20mL的三乙胺。将混合物搅拌5min，得到稍混浊的溶液。向该溶液中添加6-马来酰亚胺己酸NHS酯(化合物G，0.260g，0.843mmol)。在5min内得到透明溶液。在16hrs后，在真空下除去DMF。用乙醚(4x30mL)洗涤残余物，然后溶于甲醇(2mL)，并且用乙醚(50mL)沉淀。得到0.400g浅黄色泡沫状固体化合物6。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ1.26(t，11H)，1.49-1.58(m，6H)，1.90(p，2H)，2.08(t，2H)，2.68(m，4H)，2.80(t，2H)，3.00(t，2H)，3.15(q，6H)，3.42(t，2H)，5.28(s，2H)，6.73(s，2H)，6.85(d，2H)，6.96(m，2H)，7.07(m，4H)，7.18-7.25(m，3H)，7.83(m，2H)ppm。

实施例5.辅助标记性化合物7-12

在美国专利6,858,733中公开了下述所列其他示例性的标签化合物的制备方法。

实施例6.辅助的标记性化合物

分别从N-甲基-9，10-二氢化吖啶和N-苯基-9，10-二氢化吖啶出发，按照类似于在制备化合物1中使用的反应步骤，制备出化合物13和14。在这些结构中，M代表带正电荷的相反离子，比如Li⁺或Na⁺。

实施例7.标记性化合物15的制备

在用NaH于DMF中形成硫代丁酸阴离子(enethiolate anion)后，实施例4中的化合物C被用碘代NHS酯H进行S-烷基化。将产物通过用2-丙醇重结晶进行精制。

实施例8.9，10-二氢化吖啶标记的抗体的制备

实施例3中的9，10-二氢化吖啶标记化合物3被用于标记绵羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoresearch)。在0.1M硼酸盐缓冲液、pH 8.25中0.24mg抗体的溶液和在500μLDMF中的化合物3(10∶1摩尔比的化合物3∶抗体)于在室温下反应15min，然后在4℃下过夜。使溶液穿过脱盐柱(BioRad)，用PBS缓冲液洗脱，以便除去未结合的标签。通过收集500μL的组分，得到了混有任何未反应抗体的标记的抗体。

通过化学发光测定法测试组分的标记抗体的含量。将1或10μL等分组分与50μL的0.4M HCl+3.6％过氧化脲混合，接着在Turner Designs TD-20e光度计中在试管内注射50μL的0.5M NaOH。从注射时开始测量来自发光脉冲的总的累积强度。保留显示化学发光的那些组分。组分8在产物中占有最大含量。

实施例9.用9，10-二氢化吖啶标记的BSA的制备

实施例3中9，10-二氢化吖啶标记的化合物3被用于标记牛血清白蛋白(BSA)。使在500μL的0.1M硼酸盐缓冲液、pH 8.25中的0.1g BSA溶液与42μL的于100μL的DMF中23.4mg化合物3的溶液(10∶1摩尔比的化合物3∶BSA)在室温下反应15min，然后在4℃下过夜。使溶液穿过脱盐柱(BioRad)，用PBS缓冲液洗脱，以便除去未结合的标签。通过收集500μL组分，得到了混有任何未反应的BSA的标记的BSA。

按实施例8中的化学发光测定法测试组分中标记的BSA的含量。保留显示化学发光的组分。组分7在产物中占有最大含量。

实施例10.被9，10-二氢化吖啶功能化的微孔的制备

通过使用EDC作为偶联剂，使被羧基功能化的白色聚苯乙烯96孔微孔板(Biosystems)与化合物5偶联。制备化合物5在DMF和0.1M的MES缓冲液(70∶30(v/v))所组成的溶液(pH 4)中的原液。将0.2mL等分的原液添加至平板的各个孔，这些孔已经预先在MES缓冲液中洗涤。添加在MES缓冲液中的EDC，并且使混合物反应过夜。除去上清液，并且这些孔依序用水洗涤两次、用甲醇洗涤六次。

实施例11.用9，10-二氢化吖啶标记的聚(甲基丙烯酸酯)微粒物的制备

通过回流四个小时，使安伯来特树脂(Amberlite resin，IRP-64，100-400目，2.50g)与SOCl₂反应。冷却该反应，并且在真空下除去挥发物。然后将小球悬浮在50mL的CH₂Cl₂中，向其中添加17.0mL的三乙胺，接着添加15.0mL的1，2-乙二胺。在氩气保护下将混合物搅拌过夜。通过添加100mL的甲醇分散颗粒物，然后过滤。用甲醇和CH₂Cl₂洗涤滤出的颗粒物，并且风干。得到的颗粒物重2.80g，计算的NH₂含量是2.86mmol/g。

在氩气保护下，将在10mL无水DMF中的用1，2-乙二胺修饰颗粒物(100mg)与10mg的化合物2一起在室温下搅拌过夜。将混合物过滤，并且用甲醇洗涤颗粒物。在风干后，回收的功能化颗粒物重102mg。

在可选的另一种方法中，通过按上述方法与SOCl₂反应，将2.50g的安伯来特树脂转化为酸性氯化物形式，然后与4.32g的N-羟基琥珀酰亚胺在50mL的四氢呋喃和6.8mL的三乙胺中起反应，从而制备出被NHS酯功能化的颗粒物。这些颗粒物与含有游离末端NH₂基团的化合物5起反应，达到偶联效果。

实施例12.被9，10-二氢化吖啶标记的微粒物与抗体的结合

将20mg重量的、含有未反应的末端NH₂基团的、实施例11中的用9，10-二氢化吖啶标记的安伯来特颗粒物，进一步在室温下与在1mL无水DMF中的102mg二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(约5当量)反应15min。通过离心分离颗粒物，并且用10x1mL的DMF洗涤。得到的游离NHS酯在0.1M硼酸盐缓冲液、pH 8.5、2mM的EDTA中被偶联于绵羊抗小鼠IgG(0.5mL的1.8mg/mL原液)，在4℃下过夜。将反应混合物在13k rpm下离心，并且除去上清液。将颗粒物在离心柱(spin column)上用PBS+0.05％吐温-20洗涤若干次。

通过在1.0mL的封闭性缓冲液(1xPBS中1％的BSA、1％蔗糖)中于37℃下培育1小时，用BSA封闭所得到的被抗体标记的颗粒物。该颗粒物用吐温-PBS洗涤缓冲液进行洗涤，并且储存于1.0mL的1XPBS中。

实施例13.用9，10-二氢化吖啶标记的磁性微粒物的制备

制备4mg化合物5在0.7mL的DMF和0.3mL的0.1M MES缓冲液所组成的溶液(pH4)中的原液。将0.1mL等分原液添加至50mg的已经在MES缓冲液中洗涤过的羧基化聚苯乙烯颗粒物(Dynal Dynabeads M-270型羧酸)。混合物用0.67mL的MES缓冲液和0.23mL的DMF稀释。添加EDC(23mg)，并且将混合物摇动过夜。除去上清液，并且颗粒物依序用2x1mL的水和6x1mL的甲醇洗涤，并且再悬浮于1mL的甲醇中。

测试颗粒物的标记结合。将10μL等分的颗粒物(含有约0.5mg的颗粒物)添加至0.5mL的水中，制备出1mg/mL的原液。使100μL等分原液与过量的HRP反应5min。用4x1mL的水洗涤颗粒物，然后悬浮在1mL的水中。注射含有25mM tris、pH 8.0、8mM对羟基肉桂酸、1mM EDTA、0.2％吐温-20和0.1M过氧化脲的引发剂溶液1(10μL)，在光度计中记录化学发光的闪光。观察到相比空白18RLU的6040RLU信号。

将5mg份的颗粒物用2x200μL的0.1MMES缓冲液、pH 4洗涤，然后再悬浮于117μL的MES缓冲液中。将绵羊抗小鼠IgG(0.15mg，来自1.8mg/mL原液)添加至颗粒物，并且将混合物摇动30分钟。添加5mg的EDC，并且将混合物摇动4个小时。除去上清液，并且用3x500μL的PBS-T(PBS+0.05％吐温-20)洗涤小球。将颗粒物再悬浮于500μL的封闭性缓冲液(PBS+1％BSA+1％蔗糖)和5mg的EDC中，在室温下搅拌15min，并且在4℃下搅拌过夜。除去上清液，颗粒物用2x500μL的PBS-T洗涤，并且再悬浮于1mL的PBS中。

实施例14.使用标记的捕获抗体进行微孔板免疫测定

将来自实施例8中标记抗体制备的含有产物的组分以1∶100的比例在PBS缓冲液中稀释。将50μL等分稀释液添加至白色聚苯乙烯96孔板上26个孔的每一个中。该平板在室温下在轨道摇床上摇动5分钟。除去溶液，并且将孔用PBS-T洗涤三次，在各个步骤后除去所有的洗涤缓冲液。

将绵羊抗小鼠IgG F(ab’)2-HRP结合物(Jackson Immunoresearch)在1XPBS中包含2.5％BSA和1％蔗糖的结合缓冲液中以1∶1.2x10的比例稀释。作为另一种选择，结合物还可以在其他的基质比如FBS中稀释。将等分的稀释结合物分配入26个孔中。通过与抗IgGF(ab’)2-HRP结合溶液中0ng/mL的溶液一起进行2倍稀释，从而制备出含有100ng/mL-0.048ng/mL的IgG标准液。将标准液和零含量液分配入孔中，达到50μL/孔的终体积。将平板在平板摇床上室温下培育1hr。

将平板转移至Luminoskan平板光度计。无需除去结合物溶液，通过依序注射100μL的引发剂溶液1产生发光，并且读取各个孔中的累积强度5秒。绘制得到的测定结果如图4所示。该测定法允许在全程测试的整个期间用超过零信号的零+2标准偏差的最低校准进行定量。

实施例15.未标记的捕获抗体和标记BSA微孔板免疫测定法

添加50μL等分的未标记绵羊抗小鼠IgG(H+L)、40μg/mL的1XPBS，以便涂敷白色聚苯乙烯96孔板上26个孔的每一个。该平板在室温下在轨道摇床上摇动5分钟。除去溶液，并且将孔用PBS-T洗涤三次，在各个步骤后除去所有的洗涤缓冲液。

将来自实施例9中标记BSA的制备的含有产物的组分用PBS缓冲液+1％蔗糖稀释至50μL/mL。将100μL等分稀释液添加至白色聚苯乙烯96孔板的26孔的每一个。该平板在37℃下保温1hr。除去溶液，并且将孔用PBS-T洗涤三次，在各个步骤后除去所有的洗涤缓冲液。

将绵羊抗小鼠IgG F(ab’)2-HRP结合物(Jackson Immunoresearch)在包含1XPBS中2.5％BSA和1％蔗糖的结合物缓冲液中以1∶1.2x10⁶稀释。将等分的稀释结合物分配入26个孔中。通过与抗IgG F(ab’)2-HRP结合溶液中0ng/mL的溶液一起进行2倍稀释，制备出含有100ng/mL-0.048ng/mL的IgG标准液。将标准液和零含量溶液分配入孔中，达到50μL/孔的终体积。将平板在平板摇床上室温下培育1hr。

将平板转移至Luminoskan平板光度计。无需除去结合溶液，通过依序注射100μL的引发剂溶液1，产生发光，并且读取各个孔中的累积强度5秒。绘制得到的测定结果如图5所示。该测定法允许在全程测试的整个期间用超过零信号的零+2标准偏差的最低校准进行定量。

在对照实验中，从孔中除去溶液，并且分析溶液，结果显示，光发射来源于孔的表面而非来自溶液。

实施例16.通过使用标记的磁性微粒物进行微粒物免疫测定

用PBS-T将足以提供每次反应50μg的一定量实施例13中的9，10-二氢化吖啶和抗体共同标记的磁性微粒物洗涤三次，并且再悬浮于在含有1％BSA和1％蔗糖的1XPBS缓冲液中以1∶1.2x10⁶的比例稀释的绵羊抗小鼠IgG F(ab’)2-HRP结合物溶液中。将该颗粒物悬浮液分配入白色聚苯乙烯96孔板上26个孔中。通过在孔中进行2倍连续稀释至终浓度100ng/mL-0.048ng/mL或0ng/mL，制备出绵羊抗小鼠IgG F(ab’)2-HRP结合物溶液中的IgG标准试样。将各个标准液和零含量溶液分配入孔中，使得最终反应体积为50μL/孔。将平板在摇床上室温下培育1hr。

将平板转移至Luminoskan平板光度计。无需除去结合物溶液，通过依序注射100μL的引发剂溶液1产生发光，并且读取各个孔的累积强度5秒。绘制得到的测定结果，使IgG定量。

实施例17.通过使用标记的安伯来特微粒进行微粒免疫测定

用PBS-T将足以提供每个反应100μg的一定量实施例13中的9，10-二氢化吖啶和抗体共同标记的磁性微粒物洗涤三次，并且再悬浮于在含有1％BSA和1％蔗糖的1XPBS缓冲液中以1∶1.2x10⁶的比例稀释的绵羊抗小鼠IgGF(ab’)2-HRP结合物溶液中。将该颗粒物悬浮液分配入白色聚苯乙烯96孔板上26个孔中。通过在孔中进行2倍连续稀释至终浓度100ng/mL-0.048ng/mL或0ng/mL，制备出绵羊抗小鼠IgG F(ab′)2-HRP结合物溶液中的IgG标准液。将各个标准液和零含量溶液分配入孔中，使得最终反应体积为50μL/孔。将平板在摇床上室温下培育1hr。

将平板转移至Luminoskan平板光度计。无需除去结合物溶液，通过依序注射100μL的引发剂溶液1产生发光，并且读取各个孔中的累积强度5秒。绘制得到的测定结果，使IgG定量。

实施例18.制备用9，10-二氢化吖啶标记的用羧基修饰的微粒物

根据实施例13中描述的所述程序，通过EDC偶联将具有0.0282meq/g羧基荷载的羧酸修饰的聚苯乙烯1μm微粒物(Seradyn)结合于化合物5。用0.39mg的化合物5(0.74μmol)处理52.5mg份的微粒物(1.48μmolCOOH)，以确保保留一些未反应的COOH基团。通过在pH 4的MES缓冲液中进行EDC偶联，游离的COOH基团被偶联于绵羊抗小鼠IgG(1.48μmol)。通过使用离心柱，用吐温-PBS缓冲液洗涤除去未反应的抗体。

实施例19.制备用9，10-二氢化吖啶标记的修饰的磁性二氧化硅微粒物

通过Stoeber方法用正硅酸四乙酯(27.0g)和3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(3.0g)的混合物涂敷商业上得到的粒度范围为1-5μm的磁铁矿粉(10.0g)。随后用3.75g的3-氨基丙基三乙氧基硅烷进行附加的涂敷。

按如下方法使氨基丙基硅烷-修饰的磁性二氧化硅颗粒物与实施例2中的化合物2起反应。在1.5mL离心管中，将25mg份的氨基丙基功能化的磁性颗粒物与1mL的DMF混合。将5μL等分的DMF中化合物2为1mg/mL的溶液添加至粒子悬浮液，并且将混合物在摇床上摇动过夜。在磁格栅(magnetic rack)上除去上清液，并且依序用数份甲醇、接着数份DMF洗涤颗粒物。

实施例20.通过使用9，10-二氢化吖啶标记的修饰的磁性二氧化硅微粒物进行TSH夹心免疫 测定

通过用1.2mL的DMF中128mg同型双功能(homobifunctional)连接物二琥珀酰亚胺基氧化辛二酸酯(DSS)的溶液激活颗粒物25分钟，使实施例19中用9，10-二氢化吖啶标记的颗粒物共价连接至小鼠抗TSH抗体。在磁格栅上除去上清液，并且用DMF洗涤颗粒物。

通过添加在0.1m硼酸盐缓冲液、pH 8.25中0.225mg抗体的溶液，并且摇动混合物45分钟，从而将活化粒子偶联于抗体，然后在4℃下储存过夜。用PBS-T洗涤得到的涂敷有抗体的颗粒物，然后在含有1％BSA和1％蔗糖的PBS缓冲液中于37℃下封闭1hr。在PBS-T缓冲液中洗涤颗粒物，接着用PBS洗涤，并且在PBS缓冲液中作为20mg/mL的悬浮液进行储存。

使用白色聚苯乙烯微孔板以容纳颗粒物和规定的反应容器，进行免疫测定。所述孔在使用之前用含有1％BSA和1％蔗糖(1％封闭剂)的PBS缓冲液进行封闭，并且用PBS-T洗涤。在1％封闭剂中以1∶15,000的比例稀释1mg/mL的山羊抗TSH-HRP结合物(信号抗体)原液。将浓度为100μIU/mL的TSH标准原液以1∶2稀释度的比例连续稀释至0.00076μIU/mL。从储存缓冲液中分离出颗粒物并且再悬浮于HRP结合物溶液中。将等分的含有0.1mg颗粒物的颗粒悬浮液添加至足够数量的孔中，以允许在所需浓度范围、典型地为12.5-0.002μIU/mL范围内重复测定。将TSH标准试样分配到孔中。将包含1％封闭剂或者胎牛血清(FBS)的空白样添加至完全相同的孔中。该平板用平板密封器覆盖，并且在37℃下摇动培育1小时。以依序的方式通过注射引发剂溶液2并且测量光来读取发光2或5秒。引发剂溶液2含有25mM tris、pH 8.0、8mM对羟基肉桂酸、1mM EDTA、0.2％吐温-20和5mM过氧化脲。

TSH浓度μIU/mL	信号-空白
		12.5	196.5
6.25	140.9
		3.13	88.3
1.56	47.4
		0.78	24.1
0.39	11.5
		0.20	6.39
0.097	3.46
		0.048	2.02

实施例21.制备用9，10-二氢化吖啶标记的修饰的聚苯乙烯微粒物

按照在实施例19和20中描述的方法，用9，10-二氢化吖啶标记化合物2和小鼠抗TSH抗体使Dynal M-270胺功能化的聚苯乙烯微粒物功能化。

实施例22.通过使用9，10-二氢化吖啶标记的修饰的聚苯乙烯颗粒物进行TSH夹心免疫测定

根据实施例20的一般方案，使用实施例21的颗粒物进行TSH夹心免疫测定。

TSH浓度μIU/mL	信号-空白
		12.5	588.6
6.25	303.6
		3.13	149.7
1.56	68.43
		0.78	30.66
0.39	13.89
		0.20	6.95
0.097	3.31
		0.048	1.50
0.024	0.925

实施例23.制备用9，10-二氢化吖啶标记的修饰的聚苯乙烯微粒物

按照如下方法，用9，10-二氢化吖啶标记化合物2使Dynal M-270胺功能化的磁性聚苯乙烯微粒物功能化。除去等分的颗粒悬浮液，倾析上清液，并且依序用水、乙腈和DMF洗涤颗粒物。在1.5mL离心管中，将25mg份的颗粒物与1mL的DMF混合。将5μL等分的DMF中化合物2的1mg/mL溶液添加至颗粒悬浮液，并且将混合物在摇床上摇动过夜。在磁格栅上除去上清液，并且依序用数份甲醇、接着数份DMF洗涤颗粒物。

将250μL的DMF中生物素-NHS酯的1mg/mL溶液添加至1mL的DMF中12.5mg上述颗粒物中。将混合物旋转振荡30s，并且在摇床上摇动过夜。除去上清液，并且用DMF洗涤颗粒物，然后用PBS缓冲液洗涤。

将1mL的PBS中200μg链霉抗生物素蛋白添加至颗粒物，混合物旋转振荡1min，然后在摇床上于37℃下摇动1h。除去上清液，用PBS-吐温缓冲液洗涤颗粒物，然后在含有1％BSA和1％蔗糖的PBS缓冲液中于37℃下封闭1hr。在PBS-吐温缓冲液中洗涤颗粒物，接着用PBS洗涤。

使PBS中的颗粒悬浮液与14μg生物素化的绵羊抗小鼠TSH抗体于37℃下反应1h。除去上清液，用PBS-吐温缓冲液洗涤颗粒物，接着用PBS洗涤。将得到的粒子再悬浮于浓度为20mg/mL的PBS中。

实施例24.用9，10-二氢化吖啶标记的修饰的聚苯乙烯微粒物的另一种制备方法

在上述实施例的方法，用9，10-二氢化吖啶标记化合物2使Dynal M-270胺功能化的磁性聚苯乙烯微粒物功能化。使用称作生物素-PEG 4-NHS和生物素-PEG 12-NHS的商品化合物，使生物素结合于颗粒物。

按照上述实施例所述的方法，进行所有后面的步骤，即，链霉抗生物素蛋白和生物素化绵羊抗小鼠TSH抗体的结合。

实施例25.通过使用实施例24的聚苯乙烯颗粒物进行TSH夹心免疫测定

将通过使用生物素-PEG 12-NHS而制备的实施例24的颗粒物用于进行TSH夹心免疫测定。使用白色聚苯乙烯微孔板以容纳颗粒物和规定的反应容器，进行免疫测定。在使用前用1％封闭剂将孔封闭，并且用PBS-T洗涤。在1％封闭剂中以1∶15,000的比例稀释1mg/mL的山羊抗TSH-HRP结合物(信号抗体)原液。将浓度为100μIU/mL的TSH标准原液以1∶2的稀释度在FBS中连续稀释至0.00076μIU/mL。从储存缓冲液中分离出颗粒物并且再悬浮于HRP结合物溶液中。将等分的含有0.05mg颗粒物的颗粒悬浮液添加至足够数量的孔中，以允许在所需浓度范围、典型地在12.5-0.002μIU/mL范围内重复测定。将TSH标准试样分配到孔中。将包含1％封闭剂或FBS的空白样添加至完全相同的孔中。用平板密封器覆盖平板，并且于37℃下摇动培育1小时。以依序的方式通过注射引发剂溶液2并且测量光来读取发光2或5秒。

TSH浓度μIU/mL	信号-空白
		1.25	492.3
6.25	291.7
		3.13	147.4
1.56	72.07
		0.78	32.21
0.39	14.31
		0.20	7.04
0.097	3.34
		0.048	1.90
0.024	0.655

得到了几乎与实施例24中使用生物素-PEG 4-NHS制备的颗粒物进行测定的相同结果。

实施例26.根据文中描述的合成方法、但是具有下述变化，制备实施例19中描述的其它许多 类型的颗粒物

1.以正硅酸四乙酯对3-氨基丙基三乙氧基硅烷的下述比率涂敷磁铁矿粉：97.5∶2.5、95∶5、90∶10、80∶20、以及60∶40，没有附加的3-氨基丙基三乙氧基硅烷涂层。

2.使25mg涂敷的磁铁矿粉与下述荷载的化合物2反应：125μg、12.5μg、5μg、以及2.5μg。

3.将通过使用5μg和2.5μg化合物2制备的颗粒物用0.45mg、0.225mg、或0.1125mg抗小鼠TSH抗体涂敷。

4.使25mg涂敷的磁铁矿粉与5μg的化合物1b反应。

根据如上所述方法，所有的颗粒物被成功地用于进行TSH夹心免疫测定。

实施例27.生物素-9，10-二氢化吖啶结合物的制备

在室温下，在100mL圆底烧瓶中加入430mg(0.82mmol)的9，10-二氢化吖啶化合物和250mg(1mmol)的生物素、15mL的DMSO、以及0.45mL的4-甲基-吗啉(NMM)。将混合物搅拌30min，直到所有固体溶解。然后添加1份380mg的HATU(Aldrich产品目录No.44，546-0)，并搅拌持续过夜。用30mL乙醚稀释DMSO，引起凝胶分离。倾析出溶剂，并且用乙醚洗涤凝胶若干次。将得到的胶状混合物溶于甲醇，并且通过闪光色谱法(flashchromatography)、用10％甲醇/CH₂Cl₂洗脱来进行纯化，得到250mg(产率32％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ7.85-7.81(m，2H)，7.28-6.83(m，11H)，5.26(s，2H)，4，4(m 1H)，4.2(s，1H)，3.2-3.0(m，4H)，2.82-2.76(m，3H)，2.70-2.55(m，5H)，2.15(m，2H)，1.88-1.82(m，2H)，1.63-1.50(m，6H)，1.41-1.38(m，2H)ppm。

实施例28.使用链霉抗生物素蛋白和生物素-9，10-二氢化吖啶结合物进行微孔板免疫测定

根据图8中描述的方式进行测定。添加100μL等分的浓度为IX PBS中15μg/mL的链霉抗生物素蛋白以涂敷白色聚苯乙烯96孔板的孔。在室温下将平板在轨道摇床上摇动1h。除去溶液，并且将孔用PBS-T洗涤三次，在各个步骤后除去所有的洗涤缓冲液。

将200μL等分含有1％BSA和1％蔗糖(1X封闭剂)的PBS缓冲液添加至白色聚苯乙烯96孔板的孔。平板于37℃下保持1hr。除去溶液，并且将孔用PBS-T洗涤三次，在各个步骤后除去所有的洗涤缓冲液。

将多份在含有1.5当量生物素的1X封闭剂中的实施例27的生物素-9，10-二氢化吖啶化合物溶液添加至每个孔中。在室温下将平板在轨道摇床上摇动1h。除去溶液，并且将孔用PBS-T洗涤三次，在各个步骤后除去所有的洗涤缓冲液。

结合生物素的小鼠抗人TSH结合物(2.45mg/mL)以1∶20,000的比例在1X封闭剂中稀释。将100μL的等分稀释结合物分配入孔中。在室温下将平板在轨道摇床上摇动1h。除去溶液，并且将孔用PBS-T洗涤三次，在各个步骤后除去所有的洗涤缓冲液。

通过与抗TSH-HRP结合物溶液中0μIU/mL的溶液一起进行4倍稀释，制备出含有12.5μIU/mL-0.048μIU/mL的TSH标准液。将标准液和零含量溶液分配入孔中，达到终体积50μL/孔。

在1％封闭剂中以1∶30,000的比例稀释山羊抗人TSH-HRP结合物(信号抗体)。将50μL等分的信号抗体和TSH稀释液添加至各个孔，并且将平板于37℃下培育1h。

将平板转移至Luminoskan平板光度计。无需除去结合物溶液，通过依序注射100μL的引发剂溶液2产生发光，同时读取各个孔的累积强度5秒。

TSH浓度μIU/mL	信号-空白
		12.5	535.95
3.13	181.65
		0.78	69.57
0.20	40.58
		0.048	33.60
0.012	31.46
		0.0	29.82

实施例29.排除信号抗体的对照试验

通过排除结合HRP的信号抗体，改变实施例28的免疫测定方案。

TSH浓度μIU/mL	信号-空白
		12.5	0.727
3.13	0.189
		0.78	0.079
0.20	0.023
		0.048	0.027
0.012	0.023

被检测出的化学发光水平基本上为测试背景信号的水平，所述测试背景信号的水平显示了具有被结合得接近固定化化学发光化合物的活化剂结合物的必要性。

实施例30.其它的引发剂溶液组合物的研究

在模型免疫测定体系中评价不同引发剂溶液的效果。通过使用含有6.25μIU/mL(信号)或0μIU/mL(空白)的TSH的样品，进行实施例20的方案。

增强剂	浓度	过氧化物	浓度	S/B
					对羟基肉桂酸	8mM	过氧化脲	5mM	6.5
对羟基肉桂酸	80μM	过氧化脲	5mM	8.1
					对羟基肉桂酸	32μM	过氧化脲	5mM	9.6
对羟基肉桂酸	16μM	过氧化脲	5mM	10.9
					对羟基肉桂酸	11μM	过氧化脲	5mM	10.2
对羟基肉桂酸	8μM	过氧化脲	5mM	9.8

上述数据显示，在本发明的引发剂溶液中可以使用各种浓度的增强剂。

实施例31.其它的引发剂溶液组合物的研究

在模型免疫测定体系中评价不同引发剂溶液的效果。通过使用含有6.25μIU/mL(信号)或0μIU/mL(空白)的TSH的样品，进行实施例20的方案。

增强剂	浓度	过氧化物	浓度	S/B
					对羟基肉桂酸	8μM	过氧化脲	10mM	5.3
对羟基肉桂酸	8μM	过氧化脲	25mM	5.3
					对羟基肉桂酸	8μM	过氧化脲	37.5mM	5.0
对羟基肉桂酸	8μM	过氧化脲	50mM	5.1
					对羟基肉桂酸	8μM	过氧化脲	100mM	4.1

上述数据显示，在本发明的引发剂溶液中可以使用各种浓度的过氧化物。

实施例32.其它的引发剂溶液组合物的研究

在模型免疫测定体系中评价不同引发剂溶液的效果。通过使用含有6.25μIU/mL(信号)或0μIU/mL(空白)的TSH的样品，进行实施例20的方案。

增强剂	浓度	过氧化物	浓度	S/B
					对苯基苯酚	8μM	过氧化脲	1mM	7.9
对苯基苯酚	8μM	过氧化脲	2.5mM	6.2
					对苯基苯酚	8μM	过氧化脲	5mM	7.3
对苯基苯酚	100μM	过氧化脲	1mM	6.0
					对碘代苯酚	100μM	过氧化脲	2.5mM	8.4
对苯基苯酚	100μM	过氧化脲	5mM	10.6

上述数据显示，在本发明的引发剂溶液中可以使用各种浓度的增强剂和过氧化物。

实施例33.其它的引发剂溶液组合物的研究

在模型免疫测定体系中评价不同引发剂溶液的效果。通过使用含有6.25μIU/mL(信号)或0μIU/mL(空白)的TSH的样品，进行实施例20的方案。

增强剂	浓度	过氧化物	浓度	S/B
					对羟基肉桂酸	8μM	过氧化脲	5mM	3.4
d-荧光素	8μM	过氧化脲	5mM	5.7
					6-溴代-2-萘酚	8μM	过氧化脲	5mM	9.6
2-萘酚	8μM	过氧化脲	5mM	7.5
					对碘代苯酚	8μM	过氧化脲	5mM	5.3
对苯基苯酚	8μM	过氧化脲	5mM	8.5

上述数据显示，在本发明的引发剂溶液中可以使用各种不同的增强剂。

可以对上述利用不同含量的颗粒物、信号抗体、不同的培育条件、发光读出时间、以及附加的洗涤和分离步骤的所有具体方案做出改进，皆在本发明的保护范围内。

Claims (22)

1.一种用于检测含有或者疑似含有分析物的样品中的分析物的特异性结合测定法，其特征在于，提供固体支持物，所述固体支持物上固定有化学发光化合物和用于所述分析物的第一特异性结合伴侣，其中，一种活化剂化合物的结合物和所述分析物两者中的至少一个结合到被固定的所述第一特异性结合伴侣，使得所述活化剂化合物可操作地接近被固定的所述化学发光化合物，其中所述活化剂化合物的结合物包含结合于第二特异性结合伴侣的活化剂化合物，以及，添加引发剂溶液使得被固定的所述化学发光化合物和被结合的所述活化剂化合物之间因发生反应而产生化学发光，从而用于检测所述分析物在样品中的存在、位置或含量，其中所述化学发光化合物是所述活化剂化合物的催化底物，

所述活化剂化合物是：

1)过氧化物酶，其中所述化学发光化合物是过氧化物酶的底物，所述引发剂溶液是包含过氧化物化合物的水溶液，或

2)选自于过渡金属盐及复合物、过氧化物酶和含有过渡金属的酶中的至少一种，其中所述过渡金属选自于铁、铜、钴、锌、锰和铬中的至少一种，所述引发剂溶液是包含过氧化物化合物的水溶液，以及当存在所述活化剂化合物和所述引发剂溶液时，所述化学发光化合物被氧化而产生化学发光；

所述特异性结合伴侣是抗体、结合蛋白或核酸。

2.如权利要求1所述的测定法，其特征在于，所述活化剂化合物的结合物包含：

a)结合于第二特异性结合伴侣的活化剂化合物，所述第二特异性结合伴侣结合于所述分析物，或

b)结合于分析物或分析物类似物的活化剂化合物，其中所述化学发光的含量与所述样品中的分析物含量反向相关。

3.如权利要求1所述的测定法，其特征在于，所述测定法为夹心免疫测定法、或竞争性免疫测定法。

4.如权利要求1所述的测定法，其特征在于，所述化学发光化合物

a)共价连接于所述固体支持物，或者

b)共价连接于固定在所述固体支持物上的辅助物质，或者

c)共价连接于固定在所述固体支持物上的特异结合性配对成员。

5.如权利要求1所述的测定法，其特征在于，所述分析物是靶核酸，被固定的所述第一特异性结合伴侣是与所述靶的第一区域互补的核酸，所述活化剂化合物的结合物是结合于与所述靶的第二区域互补的核酸的活化剂化合物。

6.如权利要求1所述的测定法，其特征在于，使用过量的所述活化剂化合物的结合物，使得一部分所述活化剂化合物的结合物的保持未结合，以及在添加所述引发剂溶液之前不除去未结合的所述活化剂化合物的结合物。

7.如权利要求1所述的测定法，其特征在于，被固定的所述第一特异性结合伴侣

a)共价连接于所述固体支持物，或者

b)间接地连接于所述固体支持物。

8.如权利要求1所述的测定法，其特征在于，所述化学发光化合物包含化学发光部分和连接部分，其中所述化学发光部分选自于下述化合物：芳香环状二酰基酰肼、MCLA、吲哚基醋酸、异丁醛、三羟基芳香化合物、呫吨染料、9，10-二氢化吖啶酯、9，10-二氢化吖啶硫酯、9，10-二氢化吖啶氨磺酰、9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛类化合物、具有下述化学式的9，10-二氢化吖啶类化合物：

其中，R¹选自于烷基、烯基、炔基、芳基以及含1-20个碳原子的芳烷基，其中所述碳原子中的任何一个被1-3个选自于羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基团、季铵基团或季鏻基团的基团取代或者不被取代；X选自于C₁-C₈烷基、芳基、芳烷基、具有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、葡糖基基团和化学式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基基团、三甲硅烷基团、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵以及三烷基鏻阳离子，其中R′和R″独立地选自于C₁-C₈烷基、氰基烷基、芳基和芳烷基；Z¹选自于O和S原子；R⁶选自于取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、苯甲基、烷氧基烷基和羧基烷基基团；所述取代基R^7-14中的0个或1个或2个选自于烷基、烷氧基、羟基以及卤素，而R^7-14中剩余基团是氢、以及具有下述化学式的化合物：

其中，R¹选自于烷基、烯基、炔基、芳基、以及含1-20个碳原子的芳烷基，所述碳原子中的任何一个被1-3个选自于羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基团、季铵基团或季鏻基团的基团取代或者不被取代；X选自于C₁-C₈烷基、芳基、芳烷基、具有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、葡糖基基团和化学式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基基团、三甲硅烷基基团、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵以及三烷基鏻阳离子，其中R′和R″独立地选自于C₁-C₈烷基、氰基烷基、芳基和芳烷基；Z¹和Z²各自选自于O原子和S原子；R²和R³独立地选自于氢和C₁-C₈烷基。

9.如权利要求8所述的测定法，其特征在于，所述连接部分包含具有1-20个原子的末端为-CH₂-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、-NRC(＝S)-或-C(＝O)NR-基团的亚烷基链、或具有3-30个原子的末端为-CH₂-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、-NRC(＝S)-或-C(＝O)NR-基团的聚(亚烷基-氧)链，其中R是C_1-8烷基。

10.如权利要求1所述的测定法，其特征在于，所述固体支持物选自于微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素测试条、纸测试条、塑料测试条、胶乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子、金属胶体以及磁性粒子。

11.一种特异性结合测定法，用于检测含有或者疑似含有分析物的样品中的所述分析物，该测定法包括：

a)提供：

1)样品，

2)固体支持物，在其上固定有化学发光化合物和用于所述分析物的第一特异性结合伴侣，以及

3)活化剂化合物的结合物，其包含活化剂化合物，所述活化剂化合物结合于用于所述分析物的第二特异性结合伴侣；

b)使所述固体支持物与所述样品和所述活化剂化合物的结合物相接触，以引起所述样品中的分析物结合于被固定的第一特异性结合伴侣，并且引起所述活化剂化合物的结合物结合于所述分析物，其中所述分析物与被固定的第一特异性结合伴侣和所述活化剂化合物的结合物这两者的结合使得所述活化剂化合物接近被固定的所述化学发光化合物；

c)提供引发剂溶液，以使被固定的所述化学发光化合物与被结合的所述活化剂化合物之间因发生反应而产生化学发光；

d)检测所述产生的化学发光；以及

e)使所述产生的化学发光与所述样品中所述分析物的存在、位置或含量相关联，其中所述化学发光化合物是所述活化剂化合物的催化底物，

所述活化剂化合物是：

1)过氧化物酶，其中所述化学发光化合物是过氧化物酶的底物，所述引发剂溶液是包含过氧化物化合物的水溶液，或

2)选自于过渡金属盐及复合物、过氧化物酶和含有过渡金属的酶中的至少一种，其中所述过渡金属选自于铁、铜、钴、锌、锰和铬中的至少一种，所述引发剂溶液是包含过氧化物化合物的水溶液，以及当存在所述活化剂化合物和所述引发剂溶液时，所述化学发光化合物被氧化而产生化学发光；

所述特异性结合伴侣是抗体、结合蛋白或核酸。

12.一种特异性结合测定法，用于检测含有或者疑似含有分析物的样品中的所述分析物，该测定法包括：

a)提供：

1)样品，

2)固体支持物，在其上固定有化学发光化合物和用于所述分析物的第一特异性结合伴侣，以及

3)活化剂化合物的结合物，其包含活化剂化合物，所述活化剂化合物结合于用于分析物或者分析物类似物；

b)使所述固体支持物与所述样品和所述活化剂化合物的结合物相接触，以引起所述样品中的所述分析物和所述活化剂化合物的结合物竞争性地结合于被固定的第一特异性结合伴侣，其中所述活化剂化合物的结合物与被固定的第一特异性结合伴侣的结合使得所述活化剂化合物接近所述化学发光化合物；

c)提供引发剂溶液，以使被固定的所述化学发光化合物与被结合的所述活化剂化合物之间因发生反应而产生化学发光；

d)检测所述产生的化学发光；以及

e)使所述产生的化学发光与所述样品中所述分析物的存在、位置或含量相关联，

其中所述化学发光化合物是所述活化剂化合物的催化底物，

所述活化剂化合物是：

1)过氧化物酶，其中所述化学发光化合物是过氧化物酶的底物，所述引发剂溶液是包含过氧化物化合物的水溶液，或

2)选自于过渡金属盐及复合物、过氧化物酶和含有过渡金属的酶中的至少一种，其中所述过渡金属选自于铁、铜、钴、锌、锰和铬中的至少一种，所述引发剂溶液是包含过氧化物化合物的水溶液，以及当存在所述活化剂化合物和所述引发剂溶液时，所述化学发光化合物被氧化而产生化学发光；

所述特异性结合伴侣是抗体、结合蛋白或核酸。

13.一种包含化学发光化合物和固体支持物的材料，所述化学发光化合物被固定在所述固体支持物上，该材料用于如权利要求1至12中任一项所述的测定法，所述化学发光化合物包含化学发光部分和连接部分，其中所述化学发光部分选自于下述化合物：9，10-二氢化吖啶酯、9，10-二氢化吖啶硫酯、9，10-二氢化吖啶氨磺酰、9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛类化合物、具有下述化学式的9，10-二氢化吖啶类化合物：

其中，R¹选自于烷基、烯基、炔基、芳基以及含1-20个碳原子的芳烷基，所述碳原子中的任何一个被1-3个选自于羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基团、季铵基团或季鏻基团的基团取代或者不被取代；X选自于C₁-C₈烷基、芳基、芳烷基、具有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、葡糖基基团和化学式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基基团、三甲硅烷基团、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵以及三烷基鏻阳离子，其中R′和R″独立地选自于C₁-C₈烷基、氰基烷基、芳基和芳烷基；Z¹选自于O原子和S原子；R⁶选自于取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、苯甲基、烷氧基烷基和羧基烷基基团；所述取代基R^7-14中的0个或1个或2个选自于烷基、烷氧基、羟基以及卤素，而R^7-14中剩余基团是氢。

14.如权利要求13所述的材料，其特征在于，所述连接部分包含具有1-20个原子的末端为-CH₂-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、或-C(＝O)NR-基团的亚烷基链、或具有3-30个原子的末端为-CH₂-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-或-C(＝O)NR-基团的聚(亚烷基-氧)链，其中R是C_1-8烷基。

15.如权利要求13所述的材料，其特征在于，所述化学发光化合物共价连接于：

a)所述固体支持物、或

b)固定在所述固体支持物上的辅助物质。

16.如权利要求15所述的材料，其特征在于，所述辅助物质选自于蛋白质、肽、血清白蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、抗体、免疫球蛋白以及合成聚合物，并且任选地，所述辅助物质共价连接于所述固体支持物。

17.一种化学发光标记的固体支持物，所包含的固体支持物被固定在化学发光的9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛化合物上，其中所述化学发光标记的固体支持物通过固体支持物与具有下述化学式的化合物进行反应而制备：

其中M是碱金属离子。

18.如权利要求13所述的材料、或者如权利要求17所述的化学发光标记的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物选自微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素测试条、纸测试条、塑料测试条、胶乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子、金属胶体以及磁性粒子。

19.如权利要求13所述的材料、或者如权利要求17所述的化学发光标记的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物选自微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素测试条、纸测试条、塑料测试条、胶乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子、金属胶体以及磁性粒子，所述材料还包括至少一种被固定的用于分析物的特异性结合伴侣，其中所述结合伴侣选自于抗体、结合蛋白以及核酸。

20.一种固体支持物，其上固定有下述物质：

1)化学发光化合物，

2)对于分析物有特异性结合亲合力的第一特异性结合伴侣；

3)特异性地结合于所述第一特异性结合伴侣的分析物，以及

4)活化剂化合物的结合物，其包含结合于第二特异性结合伴侣的活化剂化合物，所述第二特异性结合伴侣对于所述分析物具有特异性结合亲合力，其中所述活化剂化合物的结合物特异性地结合于所述分析物，并且被结合的所述活化剂化合物可操作地接近被固定的所述化学发光化合物，

其中，所述化学发光化合物是所述活化剂化合物的催化底物，

所述活化剂化合物是：

a)过氧化物酶，其中所述化学发光化合物是过氧化物酶的底物，或

b)选自于过渡金属盐及复合物、过氧化物酶和含有过渡金属的酶中的至少一种，其中所述过渡金属选自于铁、铜、钴、锌、锰和铬中的至少一种；

所述特异性结合伴侣是抗体、结合蛋白或核酸。

21.一种固体支持物，其上固定有下述物质：

1)化学发光化合物，

2)对于分析物有特异性结合亲合力的特异性结合伴侣；

3)特异性地结合于所述特异性结合伴侣的分析物类似物-活化剂化合物的结合物或分析物-活化剂化合物的结合物，其中被结合的所述活化剂化合物可操作地接近被固定的所述化学发光化合物，

其中，所述化学发光化合物是所述活化剂化合物的催化底物，

所述活化剂化合物是：

a)过氧化物酶，其中所述化学发光化合物是过氧化物酶的底物，或

b)选自于过渡金属盐及复合物、过氧化物酶和含有过渡金属的酶中的至少一种，其中所述过渡金属选自于铁、铜、钴、锌、锰和铬中的至少一种；

所述特异性结合伴侣是抗体、结合蛋白或核酸。

22.如权利要求20或21所述的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物选自微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素测试条、纸测试条、塑料测试条、胶乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子、金属胶体以及磁性粒子，所述化学发光化合物是过氧化物酶的底物，所述结合伴侣选自抗体、结合蛋白以及核酸，所述活化剂化合物是过氧化物酶，并且当添加包含过氧化物化合物的引发剂溶液时，被结合的所述活化剂化合物与被固定的所述化学发光化合物发生反应而产生化学发光。

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