CN107850548A - 脑脊液的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明包括用于检测生物样本中脑脊液（CSF）存在的方法和试条，所述方法包括去除唾液酸转铁蛋白和选择性地检测或测量所述生物样本中的无唾液酸转铁蛋白。
Description
相关申请
本申请要求于2015年6月18日提交的美国临时申请号62/181,469的优先权，其内容通过引用整体并入本申请。
背景技术
由脊柱外科手术过程中的偶发性硬脊膜损伤造成的脊髓液漏是较为常见的并发症，其发生率为2-17%[1-6]。通常情况下，手术时就会发现脊髓液漏并成功修复。在偶然情况下，比如，如果小的硬脊膜损伤在手术中未被发现或最初的修复不理想，脊髓液漏会延迟出现。脊柱外科医生经常会遇到术后积液，而这些积液可能或可能并不代表脑脊液（CSF）漏。这一问题在治疗退行性疾病的腰椎手术中更为常见。如果患者表现为位置性头疼或具有清晰的液漏，则更易做出诊断。但是，由于患者的症状通常不具有典型表现，在术后阶段有时候很难区分皮下积液与CSF。患者可能表现为吸气时的鼓起皮下积液，而该液体的性质尚不确定。在作手术决定时，理想的情况是快速确定脑脊液漏的诊断，以便能够启动修复。尤其是存在可能导致脑膜炎的皮肤引流时，该修复需要手术干预。知道该积液是否为皮下积液是有利的，因为皮下积液通常保守治疗，无需返回手术室。当前，为区分CSF和皮下积液，必须将液体样本送到使用电泳技术的实验室，而得到结果可能花费3到5天。
利用电泳和质谱仪将蛋白质的分离与检测相结合已成功地应用于识别CSF中的蛋白质生物标记。作为关键的诊断标记，CSF的蛋白生物标记中的转铁蛋白（TF）同种型不仅已经用于检测液溢中的CSF漏，还用于检测多种疾病，包括早期口腔癌[8]、慢性酒精中毒[9]、以及糖尿病肾脏疾病[10]。
本领域中依然需要用于快速检测CSF漏的方法。
发明内容
本发明的基础在于开发一种新型方法以选择性测定CSF β2-转铁蛋白，即一种无唾液酸转铁蛋白(aTF)生物标记。具体地，已经开发出一种从血清和其他样本中选择性去除唾液酸转铁蛋白(sTF)的方法，以能够检测CSF衍生的aTF。
在一些实施方式中，本发明涉及一种用于检测生物样本中脑脊液（CSF）存在的方法，包括以下步骤：
a. 获取生物样本；
b. 以足够生成氧合唾液酸转铁蛋白（sTF）的量将氧化剂添加至所述样本，其中所述氧合sTF在末端残基中包括醛基；
c. 使从步骤b得到的样本与包括酰肼反应基的试剂相接触，其中所述氧合sTF与所述酰肼反应基结合以形成络合物；
d. 从所述样本中去除所述络合物以形成残余样本；以及
e. 检测残余样本中的残余转铁蛋白的存在；
其中检测到生物样本中的残余转铁蛋白指示CSF的存在。
在另一方面，本发明涉及一种用于从生物样本中去除唾液酸转铁蛋白（sTF）的方法，包括：
a. 获取生物样本；
b. 以足够生成氧合sTF的量将氧化剂添加至样本，其中所述氧合sTF在末端残基中包括醛基；
c. 使从步骤b得到的样本与包括酰肼反应基的试剂相接触，其中所述氧合sTF与所述酰肼反应基结合以形成络合物；
d. 从所述样本中去除所述络合物。
在又一些实施例中，本发明包括一种用于在术中或术后检测受治疗者的CSF漏的方法，包括：
a. 在术前获取受治疗者的第一生物样本并测量存在于所述第一样本中的转铁蛋白；以及
b. 在术中或术后获得受治疗者的第二生物样本并测量存在于所述第二样本中的转铁蛋白；
其中存在于所述第二样本中的转铁蛋白量高于存在于第一样本中的转铁蛋白量指示CSF漏。
在另一些实施例中，本发明涉及一种用于检测或测量样本中转铁蛋白的试条，包括：
a. 样本装载区；
b. 位于所述样本装载区下游的过滤区，其中所述过滤区包括与sTF结合的固定的试剂；以及
c. 位于过滤区下游的结合区，包括抗转铁蛋白抗体。
附图说明
通过以下对本发明的优选实施例的更为具体的描述，本发明的上述和其它目的、特征和优点将会变得显而易见，如附图所示，其中在不同的视图中，相同的附图标记表示相同的部分。附图不一定按比例绘制，重点在于阐述本发明的原理。
图1A和1B示出了存在于转铁蛋白糖型中的聚糖的结构。图1示出了血清sTF的结构及图1B示出了CSF sTF和aTF（即β2TF）的结构。
图2A，2B和2C示出了用于测定TF糖型的基于电泳的分析结果。图2A示出了使用NHS-罗丹明对TF糖型sTF和aTF进行的荧光标记；图2B示出了将罗丹明标记的aTF与罗丹明标记的sTF分离。图2C示出了针对罗丹明标记的TF的检测限度。
图3A和3B示出了用于将TF糖型与缓冲液多糖分离的单步高碘酸盐聚糖氧化。图3A示出了末端唾液酸的高碘酸盐氧化以及使用SiMAG-酰肼的捕获。图3B示出了用于去除捕获的TF糖型并回收上清液的磁性分离器。图3C示出了通过电泳在缓冲液里进行aTF和痕量sTF的分离和检测。
图4A、4B、4C和4D示出了在CSF和血清的混合物中使用单步高碘酸盐氧化将sTF从TF糖型分离。图4A示出了对从CSF和血清二者中去除的sTF进行琼脂糖凝胶分离和检测。图4B示出了分别在单步高碘酸盐氧化之前和之后的CSF和血清中的TF的定量。图4C示出了在单步高碘酸盐氧化之后在CSF和血清的不同混合物中的残余TF（主要是aTF）的定量。图4D示出了在从CSF和不同血清的混合物（1:1 v/v 比例）中有选择地去除sTF后对TF进行的检测(S1:年龄 29/非洲裔男性，S2:年龄41/白人男性，S3：年龄61/西班牙裔女性，S4:年龄21/非洲裔女性)。
图5A和5B示出了用于分离TF糖型的两步酶氧化。图5A示出了去除唾液酸、氧化半乳糖，然后捕获和去除氧合sTF。(B)，用于TF糖型分离的两步酶氧化定量。
具体实施方式
以下描述本发明的优选实施例。
在本文中，除非特别指出，单数意图包括一个或多个。例如，“粒子”包括一个或多个粒子。
转铁蛋白（TF）是一种分泌型糖蛋白，具有多种糖型，包括在其非还原端用带负电荷的唾液酸残基封闭的聚糖[11,12]。TF在铁的体内平衡和转运以及保护身体免受与未结合铁相关的自由基损害方面发挥着重要的作用[13]。血清中的TF由679个氨基酸残基（~78kDa MW）组成并在天冬酰胺Asn432和Asn630上具有两个糖基化位点，该位点常被含有各种末端（非还原末端）唾液酸（或N-乙酰神经氨酸）残基的N-联聚糖占据，导致TF糖型的异构种群[11,14]（图1A和1B）。血清中的TF仅由完全唾液酸化的糖型组成。相比较而言，CSF中的TF（也称为β2-转铁蛋白（β2TF））以唾液酸（sTF）和无唾液酸的糖型（aTF）的混合物存在[7,12]（图1A和1B）。据推测，通过脑神经氨酸酶的作用，CSF中的aTF源自血清sTF[15]。多年来，已设计了许多方法以检测作为CSF液漏的生物标记的TF同种型，以及中枢神经系统的各种失调[16,17]。已经开发了基于电泳的不同分离方法以分离TF同种型，包括等电聚焦[18]、免疫固定凝胶电泳[19]、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[20]和毛细管电泳（CE）[21]。
本发明包括一种简单快速的方法，使得脊柱外科医生能够直接从生物样本（如术后引流）中检测和/或测量CSF。当在病人的术后切口的手术部位检测到液漏时，脊柱外科医生可能会面临关于患者护理的重大紧迫决定。在一些实施例中，本发明包括使用化学和/或酶促方法以特异性氧化生物样本（诸如血清）中的sTF，使其与酰肼试剂（诸如酰肼磁性微粒）缀合并从样本中选择性去除，这样通过适于在快速实时“试条”分析中使用的方法，可以快速检测CSF衍生的aTF。
该生物样本可以是疑似含有CSF、转铁蛋白和/或无唾液酸转铁蛋白的任何样本。示例性的生物样本包括例如血清、血液、血浆、鼻分泌液、耳分泌液、活组织检查样品、淋巴液样品、来自头部或脊柱伤口或穿刺的液体以及来自手术切口部位的液体。在某些实施例中，生物样本是血清。在另一些实施例中，在术中或术后从受治疗者（诸如人类患者）获取生物样本。在又一些实施例中，从手术切口处或术后积液中获取生物样本。术语“受治疗者”意图包括动物受治疗者，包括但不限于，人类受治疗者。在一些实施例中，生物样本从人类受治疗者或人类器官中获取。
本文描述的方法包括将氧化剂添加至生物样本以生成氧合sTF。氧化剂是可以将TF中的醇基氧化成醛基的氧化剂（诸如轻度氧化剂）。在一些实施例中，氧化剂是化学或酶促剂。在一些实施例中，氧化剂是将醇基氧化成在TF末端残基的醛的氧化剂。末端残基是位于转铁蛋白分子的非还原末端的单糖残基。在唾液酸转铁蛋白（sTF）中，末端残基是唾液酸残基。唾液酸残基可以从sTF中去除，例如通过神经氨酸酶来处理。当从sTF中去除唾液酸基团时，末端单糖残基是半乳糖。示例性的氧化剂包括例如高碘酸盐，诸如高碘酸盐（例如高碘酸钠和高碘酸钾）。氧化剂还包括例如酶，诸如半乳糖氧化酶。
氧合sTF是氧化反应（诸如轻度氧化反应）的产物。在一些实施例中，氧合sTF包括（例如TF的寡糖侧链中）的醛基。在一些实施例中，醛基位于末端单糖残基中。氧合sTF的非限制性实例是其中末端唾液酸的C-7位置为醛基的sTF（参见，例如，图1A）。氧合sTF的另一非限制性实例是其中已去除末端唾液酸且末端半乳糖的C-6位是醛基的sTF（参见，例如，图5A）。
包含酰肼基团的试剂包括，例如，包含酰肼反应基的任何物质、化合物或组合物。羰基和酰肼官能团的反应可以形成来自腙键形成物的缀合。在一些实施例中，包含酰肼反应基的试剂是包含酰肼官能基团的化学试剂。在另一些实施例中，包含酰肼基团的试剂是包含酰肼反应基的固体载体。该载体可以是有机或无机的，并且包括例如珠、颗粒、薄膜、膜、管、孔、条、棒、平面（例如平板，纸状物等）、纤维等等。固体载体的其它实例包括例如聚合物（诸如硝化纤维素和醋酸纤维素）。酰肼部分可以结扎或以其他化学方式结合到任何固体载体。在一些实施例中，包含酰肼反应基的试剂是颗粒。酰肼颗粒的制备描述于例如Hermanson 2013, Bioconjugate Techniques, 3rd Edition, London, UK: AcademicPress。酰肼颗粒也可以从市场上购得。可以对酰肼颗粒进行处理、包衣或官能化，使得酰肼反应基存在于颗粒的表面上。在另一些实施例中，试剂是磁性酰肼颗粒，例如磁性酰肼微粒或纳米颗粒（例如，SiMAG酰肼）。在又一些实施例中，试剂是聚合物载体，例如已经被处理、包衣或官能化使得酰肼官能团存在的硝化纤维素。在另一些实施例中，所述酰肼试剂是生物素化的酰肼，例如（生物素酰肼）和6-（生物素酰氨基）己烷酰肼。
在本发明的一些实施例中，使生物样本中的氧合sTF与包含酰肼反应基的试剂接触以形成络合物或缀合物，并从样品中除去该络合物或缀合物。可以通过任何适当的手段从样本中去除该络合物或缀合物。例如，当包含酰肼反应基的试剂是颗粒时，可以使用诸如过滤、离心分离、沉降等适当的方法从样品中除去颗粒。在另一实施例中，当包含酰肼反应基的试剂是磁性颗粒时，可以使用磁性分离器除去络合物或缀合物。在又一实施例中，当所述酰肼试剂是生物素化的酰肼时，所述生物素化络合物或缀合物可以使用抗生物素蛋白-，链霉亲和素-或其它生物素结合蛋白来捕获。例如，可使用链霉素偶联的检测技术捕获生物素化络合物。在一些实施例中，使用链霉亲和素包覆的颗粒（例如，链霉亲和素包覆的磁性颗粒）捕获生物素化络合物。这些颗粒包括与链霉亲和素共价结合的颗粒或珠。
在去除络合物或缀合物之后，与进行sTF氧化和去除之前的样本相比，剩余的样品（在本文中称为“残余样本”）具有更少的sTF。 例如，当如上所述使用磁性酰肼颗粒和磁性分离器时，上清液包含残余转铁蛋白。在一些实施例中，残余样本中几乎没有sTF，例如，残余样本含有约5%或更少的最初存在于样本（即在进行sTF的氧化和移除之前）中的sTF。在又一些实施例中，残余样本中完全不含sTF。残余样本中依然存在的转铁蛋白被称为残余转铁蛋白。
如上文所述，CSF中的TF以唾液酸（sTF）和无唾液酸转铁蛋白（aTF）的混合物存在。相反地，在血清中，转铁蛋白仅由完全唾液酸化糖型组成。从生物样本中去除sTF使得无唾液酸转铁蛋白的检测和测量成为可能。由于CSF中发现了无唾液酸转铁蛋白（并且在血清中没有正常发现），检测或测量到生物样本中的无唾液酸转铁蛋白指示CSF漏。例如，可以使用抗转铁蛋白抗体来检测或测量残余转铁蛋白或无唾液酸转铁蛋白。在一些实施例中，通过免疫测定法（例如竞争性免疫测定法、夹心免疫测定法、横向流动免疫测定法和/或ELISA）来检测或测量残余转铁蛋白。在一些实施例中，使用标记的抗转铁蛋白抗体检测或测量残余转铁蛋白。本领域技术人员将会理解，可以使用标准曲线测量样本中的转铁蛋白或残余转铁蛋白的量。
在一些方面，抗转铁蛋白抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、或抗体的转铁蛋白结合片段（诸如Fab片段）。可以使用本领域技术人员公知的常规方法制备抗转铁蛋白抗体，所述常规方法例如Harlow，E.，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1999中所述的方法，或者可以从商业供应商处购买。在一些实施例中，本文中描述的方法和试条包括使用两种抗体（例如，在结合区中的抗体和试条捕获区中的抗体）。这两种抗体可以是不同类型的，例如，第一抗体可以是小鼠单克隆抗体，第二抗体可以是兔多克隆抗体，反之亦然；或者这两种抗体可以结合转铁蛋白的不同抗原表位。
在另一些实施例中，使用ELISA（酶联免疫吸附测定法）检测残余转铁蛋白，其中将残余样本添加至用抗转铁蛋白抗体包覆的固体载体（例如，多孔板），随后将标记的检测抗体添加至固体载体。在一些实施例中，所述标记的检测抗体是标记的抗转铁蛋白抗体。标记的检测抗体例如可以是与可检测标记共轭的抗体，例如，荧光标记、显色标记、生物素分子和/或金粒子。在某些方面，标记的检测抗体是生物素化的抗体，其可以通过添加链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶络合物、除去未结合的缀合物、并添加过氧化物酶底物（如TMB（3,3'，5,5'-四甲基联苯胺）或 ABTS（2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））来检测。
在又一些方面，使用试条检测转铁蛋白或残余转铁蛋白。在一些实施例中，试条包括样本装载区和位于样本装载区下游的结合区，其中结合区包括抗转铁蛋白抗体。在一些方面，所述结合区中的抗转铁蛋白抗体是标记抗体。当标记的抗转铁蛋白抗体变得可见或以其他方式被检测时，检测和/或测量转铁蛋白。在另外的一些方面，所述试条还包括在所述结合区下游的捕获区，所述捕获区包括结合抗转铁蛋白抗体-转铁蛋白络合物的捕获试剂。在另外的实施例中，捕获试剂固定在试条中。在又一些方面，捕获试剂是抗体。在又一些实施例中，试条还包括对照区，所述对照区包括对照试剂。对照试剂可以是对标记抗体具有结合亲和性的抗体。
如上文所述，本发明进一步包括在术中或术后检测受治疗者中的CSF漏的方法，包括：a. 在术前获取受治疗者的第一生物样本并测量存在于所述第一样本中的转铁蛋白；以及b. 在术中或术后获得受治疗者的第二生物样本并测量存在于所述第二样本中的转铁蛋白；其中存在于所述第二样本中的转铁蛋白量高于存在于第一样本中的转铁蛋白的量表示CSF漏。在一些方面，如上文所述，例如，通过免疫测定法检测转铁蛋白。在又一些实施例中，使用试条测量转铁蛋白。在某些方面，样本在获取后被稀释。在又一些方面中，在测量转铁蛋白之前，将sTF从第一样本和第二样本中去除。
如上文所述，本发明还包括一种用于检测或测量样本中转铁蛋白的试条，包括：a.样本装载区；b. 位于所述样本装载区下游的过滤区，其中所述过滤区包括与sTF结合的固定的试剂；以及c. 位于过滤区下游的结合区，包括抗转铁蛋白抗体。在一些实施例中，试条还包括对照区，该对照区例如包括对照试剂抗体。如上文所述，在一些实施例中，对照试剂是对标记的抗体和标记的抗体络合物具有结合亲和力的抗体，例如，如果标记的抗体是兔抗体，则对照抗体可以是山羊抗兔抗体。在又一些方面，试条进一步包括位于结合区下游的捕获区，其中该捕获区包括结合所述抗转铁蛋白抗体-转铁蛋白络合物的捕获试剂；例如，该捕获试剂是抗转铁蛋白抗体。在某些方面，捕获试剂被固定在测试条上。在进一步的实施例中，结合区中的抗转铁蛋白抗体被标记。
在某些方面，在试条上与sTF结合的固定的试剂是与氧合sTF结合的试剂，其中氧合sTF在sTF的末端残基包括醛基。在一些实施例中，试剂例如包括酰肼反应基。在另一些实施例中，过滤区包括硝化纤维素、PVDF（聚偏二氟乙烯膜）或其他膜。在另外一些实施例中，膜包括酰肼反应基，例如可以对硝化纤维素膜进行包衣或官能化，使得存在并优选地固定酰肼反应基。在又一些实施例中，过滤区包括本文所述的酰肼颗粒，其中该颗粒固定在过滤区中。由此，生物样本中的sTF可以保留在试条的过滤区，并且残余转铁蛋白可以通过横向流动在试条上移动。
横向流动和横向流动试条在本领域是公知的。在示例性方法中，将测试样本添加至测试表面，一般来说随后添加追踪（chase）缓冲液。追踪缓冲液促进了液体在测试表面上的流动。试条还包含标记的抗体，诸如附着在抗体上的金颗粒。样本（转铁蛋白或残余转铁蛋白）中存在的分析物可以结合到标记的抗体，并且络合物通过毛细管作用迁移穿过膜。然后，分析物和标记络合物可以结合到固定在膜上的抗体，从而在测试区中产生可检测的指示剂（例如，彩色线）。如果样品中没有分析物存在，则缀合物迁移经过测试区，并不与膜测试线上的抗体结合。可选地，对照试剂可以捕获和结合多余的缀合物。在一些实施例中，对照试剂和由其产生的线是指示该测试正确运行的对照物。在一些实施例中，可以在约1~60分钟，或约1~30分钟，或约1~15分钟内读取结果。
在另一些实施例中，本发明涉及一种用于检测样本中转铁蛋白存在的一种设备，其中设备包括本文中描述的试条，以及含有该试条的外壳，其中外壳包括至少一个开口以将样本加载区内的试条的表面暴露给样本。在一些实施例中，该设备是掌上型设备。
在又一些方面，本发明包括一种试剂盒，该试剂盒包括本文中描述的试条或设备，以及含有氧化剂的容器。在一些实施例中，氧化剂是高碘酸钠或高碘酸钾。在又一些实施例中，氧化剂是半乳糖氧化酶。
本文描述的各实施例涉及标记的抗体的使用。示例性标记包括例如酶及其在底物上的生成物、胶体金属颗粒、掺入染料的胶乳和染料颗粒。酶可以在底物上反应，以生成可以例如通过吸收颜色（如紫外线、可见光、红外线）或通过荧光检测到的产物。在又一些实施例中，标记可以是荧光标记、发色标记、生物素分子和/或金属颗粒。 在一些方面，金属颗粒可以包含铂、金、银、硒或铜或任何其他显示特征颜色的金属化合物。适用于本发明的金属颗粒可以通过常规方法制备。例如，金溶胶颗粒的制备描述于Frens，Nature 241：20-22（1973）。
在又一些实施例中，试条包括载体（塑料、纸板、或其他刚性或半刚性材料，以及位于载体顶部的膜（在一些实例中，膜是硝化纤维素膜或PVDF膜）。膜包括如本文所述的样品加载区和结合区。膜也可以包括捕获区和/或对照区。
本发明还包括一种检测生物样本中的转铁蛋白或测量生物样本中的转铁蛋白的量的方法，包括使样本与本文所述的试条、设备或试剂盒接触，其中本发明包括一种检测或测量结合区或捕获区中的、或位于结合区或捕获区下游的转铁蛋白。在一些实施例中，转铁蛋白是β2-转铁蛋白，例如无唾液酸转铁蛋白。在某些方面，样本是生物样本。在又一些实施例中，本发明涉及一种检测生物样本中CSF存在的方法，包括使样本与本文所述的试条、设备或试剂盒接触的方法，其中该方法包括检测或测量结合区或捕获区中的、或位于结合区或捕获区下游的转铁蛋白。
本发明通过以下实施例来说明，这些实施例并不意味着以任何方式进行限制。
示例
2. 材料和方法
2.1 酶促反应和标记
将人血清sTF（10mg / mL，Sigma）溶于1X 糖化缓冲液（Glycobuffer）（20mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5，包括5mM CaCl 2）中。将人sTF溶液在37℃用神经氨酸酶（在1X 糖化缓冲液中，1mg / mL，Sigma）隔夜处理以产生TF。根据制造商的方案，用NHS-罗丹明（Pierce）标记sTF和aTF。在PD MiniTrap G-25柱（GE Heathcare）上通过柱色谱法除去所有未反应的罗丹明。
在人CSF（PrecisionMed）、混合人血清（Innovative Research Inc.）和个体的人血清样品上（BioreclaimationIVT）上进行包括神经氨酸酶（Sigma）和半乳糖氧化酶（Sigma）的两步酶促反应。首先，在1x糖化缓冲液中将CSF和血清分别稀释2倍和200倍。用神经氨酸酶（10μL，1mg/ml）在37℃分别处理稀释的CSF（10 µL）和稀释的血清（10 µL）1小时，然后用半乳糖氧化酶进行不同次数的处理，在37℃溶于100mM，ph7.2，Tris缓冲液（0.5KU/mL中的10μL）。
2.2 琼脂糖凝胶电泳
将0.4g琼脂糖粉末（Sigma）溶于40mL 1X Tris-硼酸盐缓冲液（89mM Tris碱和89mM硼酸，pH8.0）中后，通过在微波炉中熔化琼脂糖来制备琼脂糖凝胶（1％），然后将熔化的琼脂糖溶液倒入浇铸盘中，在室温下冷却后形成固体凝胶。通过将罗丹明标记的蛋白（20-320ng在10μL中）与30％甘油（2μL）混合来制备负载样品。装载蛋白质样品后，将凝胶在200V电泳15分钟。
2.3 高碘酸盐氧化
使用1 mM NaIO4在4℃（冰上）进行轻度高碘酸盐氧化30分钟，以氧化TF中的非还原端唾液酸残基。在高碘酸盐氧化过程中产生的过量高碘酸盐和甲醛通过PD Mini Trap G-25柱（GE Heathcare）除去。在脱盐并使用G-25柱与100mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液进行缓冲液交换后，用SiMAG-酰肼微粒（Chemicell）捕获含有氧化唾液酸残基的TF。
2.4 唾液酸蛋白的耦合和分离
在用pH7.0的100mM磷酸钠缓冲液对SiMAG-酰肼颗粒（10mg / ml）洗涤两次后，将颗粒与含有氧化唾液酸残基的TF在20℃温育3小时。使用磁性分离器将蛋白质-颗粒缀合物搓成颗粒。收集保留在上清液中的蛋白质，并用Amicon超离心过滤器（Ultracel-3K）浓缩。通过琼脂糖凝胶电泳或使用转铁蛋白ELISA试剂盒（Abcam）分析含有aTF的浓缩样品。
2.5 ELISA测定
测试样品中的人TF可以用转铁蛋白ELISA测定试剂盒（Abcam）检测。简言之，将标准品或测试样品加入预先用TF特异性抗体包衣的96-孔板中，然后加入特异性的生物素化的TF检测抗体，并用洗涤缓冲液洗涤该板。加入链霉亲和素-过氧化物酶复合物，并用洗涤缓冲液洗去未结合的缀合物。TMB用于可视化链霉亲和素-过氧化物酶酶促反应，因为TMB被过氧化物酶催化产生蓝色产物，加入酸性终止溶液后变成黄色。立即使用酶标仪（SpectraMaxM5，Molecular Devices）在450nm的波长下测量黄色的吸光度。详细的ELISA方案遵循制造商的指南（Abcam）。
3. 结果和讨论
使用神经氨酸酶从sTF产生aTF。除去无唾液酸的残基后，用NHS-罗丹明标记TF（图2A）。罗丹明标记的aTF和sTF可以使用琼脂糖凝胶电泳分离（图2B）。结果表明更多的负电荷sTF迁移更接近阳极。另外，可以在人血浆中选择性检测罗丹明标记的转铁蛋白（图2B）。罗丹明标记的TF的检测限度为2μg/ mL（图2C），这与通过免疫固定（IFE）凝胶电泳检测相似[19]。
由于人血清TF是具有两个含非还原末端唾液酸残基（sTF）的聚糖的糖蛋白而CSF含有sTF和aTF二者[7,12]，轻度高碘酸盐氧化[22]使得sTF可俘获为腙（图3A）。因此，我们选择性地去除sTF以促进CSF中aTF的检测（图3A）。通过用高碘酸钠进行轻度处理，将sTF中的末端唾液酸残基氧化为其醛衍生物[22,23]，并通过共价缀合到稳定腙键形式的SiMAG-酰肼（磁性酰肼微粒）以捕获氧合sTF。然后使用磁性分离器容易地去除sTF-珠缀合物（图3b）。作为对概念的证明，我们将不同浓度（100μL）的sTF和aTF进行轻度的高碘酸盐氧化（1mM NaIO4，4℃，30分钟），从而在sTF中的末端唾液酸残基的C-7位选择性地引入醛。在sephadexg-25柱上脱盐除去未反应的氧化试剂后，用200μL的simag-酰肼（10mgml）在20℃下温育3小时捕获含醛基的sTF。用磁性分离器除去捕获的sTF，并用琼脂糖凝胶电泳分析含微量残余sTF的aTF的上清液（图3C）。结果显示，通过用SiMAG-酰肼共价捕获选择性地去除了sTF，并且aTF保留在上清液缓冲液。在高浓度的sTF（0.8mg / mL）中，由于所需的SiMAG-酰肼数量不足以捕获sTF，约50％的sTF保留在上清液缓冲液中。当我们将SiMAG-酰肼（20mg/ mL）的量加倍时，残余sTF依然降至<3％（数据未显示）。这种轻度的高碘酸盐氧化在30分钟内迅速并选择性地将醛基引入sTF（图3C），并且与SiMAG-酰肼磁性微粒的缀合可以在3小时内完成，要求总的预处理时间<5小时。在这些结果的鼓舞下，我们应用了开发的协议来检测由脑脊液和血清混合物组成的样品中的CSF aTF。
罗丹明标记的（200倍）稀释的血清和罗丹明标记的（2倍）稀释的CSF的混合物（10μL）进行轻度的高碘酸盐氧化以验证试验含有CSF和血清的样品的概念。按照上述协议从血清和CSF中选择性分离sTF后，分析琼脂糖凝胶中的残余sTF（图4A）。血清中的sTF水平高于CSF中的sTF，并且通过轻度的高碘酸盐氧化和使用SiMAG-酰肼捕获，成功地除去了存在于血清和CSF中的所有sTF（图4A中的底部条带）。
由于血清和CSF中存在蛋白质的复杂混合物，不可能在琼脂糖凝胶中直接检测到aTF条带。因此，进行人转铁蛋白酶联免疫吸附测定法（ELISA）以特异性捕获TF从而检测CSF和血清中的残余TF（图4B）。CSF中残余TF（aTF）的量明显高于血清中残余TF（未捕获sTF）的量。然而，由于唾液酸残基的不完全氧化或捕获效率低，痕量残余TF（未捕获的sTF）仍然存在于血清中。基于TF在ELISA中的标准曲线（数据未显示），血清中残余痕量TF的水平为〜7ng / mL，与缓冲液对照的水平相似。相比之下，CSF中的残余TF（aTF）为约60ng / mL，相当于CSF中TF初始量的三分之一（〜170ng / mL）。由于在脑脊液中只有约30％的TF是aTF，这个结果是预期的[7]。我们制备不同体积比的血清和脑脊液混合物以模拟脑脊液漏的实际情况。在用上述方法从血清和CSF的混合物中选择性除去sTF后，通过ELISA试剂盒测定残余TF（主要是aTF）（图4C）。结果表明，来自血清和CSF混合物中的残余TFs的量与来自缓冲液中不同量的CSF中的残余TF的量相同，即与血清和CSF混合物的稀释度相同。此外，我们使用多个血清样品（S1：29岁/非洲裔男性，S2：41岁/白人男性，S3：61岁/西班牙裔女性，S4：21岁/非洲裔女性）制备混合物（1：1 v / v比率）的CSF和各种血清并选择性去除sTF。通过ELISA试剂盒测量来自不同血清样品和CSF的混合物的初始TF和残余TF（图4D）。无论血清类型如何，均能清楚地检测到CSF的残余TF（主要是aTF），并且血清中残余的TF的量与阴性对照（仅缓冲液）相似。
虽然我们可以通过选择性去除sTF来区分CSF和血清，但是当分析CSF和血清的混合物时，需要完全去除血清sTF来准确测定CSF中的aTF。因此，我们研究了在sTF中产生醛基的两步酶促（神经氨酸酶和半乳糖氧化酶）反应，因为酶显示出非常高的底物特异性。 因为在CSF衍生的aTF中既没有非还原性末端唾液酸残基也没有半乳糖残基[7]，所以两步酶促反应应该是定量的并选择性地将半乳糖残基的C-6位上的醛基引入sTF（图5A）。将稀释（2倍）CSF和（200倍）血清的10-μL样品在37℃添加至神经氨酸酶（10μL1mg / mL）和半乳糖氧化酶（10μL0.5KU / mL）中。将样品用两种酶处理不同的时间后，向反应混合物中加入SiMAG-酰肼（100μL10mg/ mL），并在20℃再温育3小时以捕获氧合sTF。用磁性分离器降低微粒捕获的氧合sTF后，用ELISA测定上清液中残余的TF（图5B）。结果显示，我们可以在这个两步酶促反应中完全去除血清sTF，尽管这个程序需要24小时。然而，尽管这个两步过程可以成功地去除所有的sTF，但是这个预处理步骤需要24小时，时间太长不能适应外科医生的临时决定。因此，今后的工作将着眼于提高高碘酸盐预处理的选择性，以及减少两步酶预处理所需的时间。
脑脊液的快速而敏感的检测对于做出关于病人护理的实时关键决策至关重要[24]。例如，如果在手术后发生脑脊液漏，患者可能需要迅速返回手术室以探查和修复脑脊液漏，这又会治疗位置性头痛和与受污染的皮肤接触引起的潜在感染，从而增加发展脑膜炎的风险。在首次注意到液体时，如果外科医生不确定液体中是否含有CSF，外科医生通常只能等待确认分析，这会延迟行动并导致患者预后较差。在某些情况下，病人可能不会出现头痛的典型表现，这可能会进一步推迟脑脊液漏诊的诊断。因此，能够检测脑脊液的快速检测将使脊柱外科医生立即做出临床决定，从而改善患者预后。
β2转铁蛋白（β2TF）的形成由中枢神经系统内的神经氨酸酶活性介导[25]。因此，β2TF代表针对CSF漏的潜在高度选择性标记蛋白，因为它仅位于CSF中，其作为无唾液酸化的TF糖型（aTF）存在。这种解剖选择性使得能够开发一种用于快速和选择性去除液漏样品中的血清sTF的预处理方法，其能够检测CSF相关的β2TF（aTF）。快速的预处理方法也将促进易于使用的TF测试试剂盒的商业开发。
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尽管已经参照本发明的优选实施例具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将会理解，可以在其中进行形式和细节上的各种改变而不脱离所附权利要求中所包含的本发明的范围。
Claims (86)
1.一种用于检测生物样本中脑脊液（CSF）存在的方法，包括以下步骤：
a. 获取生物样本；
b. 以足够生成氧合唾液酸转铁蛋白（sTF）的量将氧化剂添加至所述样本，其中所述氧合sTF在末端残基中包括醛基；
c. 使从步骤b得到的样本与包括酰肼反应基的试剂相接触，其中所述氧合sTF与所述酰肼反应基结合以形成络合物；
d. 从所述样本中去除所述络合物以形成残余样本；以及
e. 检测残余样本中的残余转铁蛋白的存在；
其中检测到生物样本中的残余转铁蛋白指示CSF的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述残余转铁蛋白包括β2-转铁蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是高碘酸盐。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是高碘酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是半乳糖氧化酶，并且其中在氧化前使用神经氨酸酶处理所述样本。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过共价结合，所述氧合sTF 结合到所述酰肼反应基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有酰肼反应基的所述试剂是磁性酰肼颗粒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述磁性酰肼颗粒是磁性酰肼微粒。
9.根据权利要求7和8任一所述的方法，其特征在于，使用磁性分离器去除所述络合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在使用所述磁性分离器后，所述残余转铁蛋白位于所述上清液中。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有酰肼反应基的所述试剂是生物素化的酰肼，并且其中所述络合物是生物素化络合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，使用生物素结合蛋白捕获所述生物素化络合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述生物素结合蛋白是抗生物素或链霉亲和素。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，使用链霉素偶联颗粒捕获所述生物素化络合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，链霉素偶联颗粒是磁性颗粒。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样本是血清、血液、血浆、鼻分泌液、耳分泌液、活组织检查样品、淋巴液样品、来自头部或脊柱伤口或穿刺的液体、以及来自手术切口部位的液体。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述生物样本是血清。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样本是在术中或术后从患者获取的样本。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述样本是在脊柱手术期间或之后从患者获取的。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本是术中或术后从患者的切口位置获取的。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本是从术后积液中获取的。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用免疫测定法检测所述残余转铁蛋白。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，使用夹心免疫测定法检测所述残余转铁蛋白。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，使用ELISA检测所述残余转铁蛋白。
25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，通过竞争性免疫测定法检测所述残余转铁蛋白。
26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用试条检测所述残余转铁蛋白。
27.根据权利要求1和22任一项所述的方法，其特征在于，使用抗转铁蛋白抗体检测所述残余转铁蛋白。
28.根据权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述残余样本添加至用抗转铁蛋白抗体包覆的固体载体。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，标记的检测抗体添加至固体载体。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述标记的检测抗体是抗转铁蛋白抗体。
31.根据权利要求29和30任一项所述的方法，其特征在于，所述标记的检测抗体是与荧光标记、显色标记、生物素分子和/或金粒子共轭的抗体。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述标记的检测抗体是生物素化抗体。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于检测受治疗者的脑脊液漏。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述受治疗者已经进行了脊柱手术。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述脊柱手术是腰椎手术。
36.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本在获取后被稀释。
37.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述试条包括：
a. 样本装载区；以及
b. 位于包括抗转铁蛋白抗体的样本装载区下游的结合区。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述抗转铁蛋白抗体是可检测标记的。
39.根据权利要求37和38任一项的方法，其特征在于，所述试条进一步包括位于所述结合区下游的捕获区，其中所述捕获区包括结合所述抗转铁蛋白抗体-转铁蛋白络合物的捕获试剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述试条进一步包括位于所述结合区下游的捕获区，其中所述捕获区包括结合所述抗转铁蛋白抗体-转铁蛋白络合物的捕获试剂，并且其中所述捕获试剂是固定的。
41.根据权利要求39和40任一项的试条，其特征在于，所述捕获试剂是抗转铁抗体。
42.一种用于从生物样本中去除唾液酸转铁蛋白（sTF）的方法，包括：
a. 获取生物样本；
b. 以足够生成氧合sTF的量将氧化剂添加至样本，其中所述氧合sTF在末端残基中包括醛基；
c. 使从步骤b得到的样本与包括酰肼反应基的试剂相接触，其中所述氧合sTF与所述酰肼反应基结合以形成络合物；
d. 从所述样本中去除所述络合物。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是高碘酸盐。
44.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是高碘酸钠。
45.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是半乳糖氧化酶，并且其中在氧化前使用神经氨酸酶处理所述样本。
46.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，通过共价结合，所述氧合sTF 结合到所述酰肼反应基。
47.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，含有酰肼反应基的所述试剂是磁性酰肼颗粒。
48.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述磁性酰肼颗粒是磁性酰肼微粒。
49.根据权利要求47和48所述的方法，其特征在于，使用磁性分离器去除所述络合物。
50.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，含有酰肼反应基的所述试剂是生物素化的酰肼，并且其中所述络合物是生物素化络合物。
51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，使用生物素结合蛋白捕获所述生物素化络合物。
52.根据权利要求51所述的方法，其特征在于，所述生物素结合蛋白是抗生物素或链霉亲和素。
53.根据权利要求52所述的方法，其特征在于，使用链霉素偶联颗粒捕获所述生物素化络合物。
54.根据权利要求53所述的方法，其特征在于，链霉素偶联颗粒是磁性颗粒。
55.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述生物样本是鼻分泌液、耳分泌液、血液、血清、来自头部或脊柱伤口或穿刺的液体、或来自手术切口部位的液体。
56.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述生物样本是血清。
57.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述生物样本是在术中或术后从患者获取的样本。
58.根据权利要求57所述的方法，其特征在于，所述样本是在脊柱手术期间或之后从患者获取的。
59.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述样本是术中或术后从患者的切口位置获取的。
60.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述样本是从术后积液中获取的。
61.一种用于在术中或术后检测受治疗者的CSF漏的方法，包括：
a. 在术前获取受治疗者的第一生物样本并测量存在于所述第一样本中的转铁蛋白；以及
b. 在术中或术后获得受治疗者的第二生物样本并测量存在于所述第二样本中的转铁蛋白；
其中存在于所述第二样本中的转铁蛋白量高于存在于第一样本中的转铁蛋白量指示CSF漏。
62.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，使用免疫测定法检测所述转铁蛋白。
63.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，使用试条检测所述转铁蛋白。
64.根据权利要求61至63任一项所述的方法，其特征在于，使用抗转铁蛋白抗体检测所述转铁蛋白。
65.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，所述受治疗者已经进行了脊柱手术。
66.根据权利要求65所述的方法，其特征在于，所述脊柱手术是腰椎手术。
67.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，所述样本在获取后被稀释。
68.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，在测量所述转铁蛋白之前，从所述第一样本以及所述第二样本去除sTF。
69.根据权利要求68所述的方法，其特征在于，β2-转铁蛋白被测量。
70.一种用于检测或测量样本中转铁蛋白的试条，包括：
a. 样本装载区；
b. 位于所述样本装载区下游的过滤区，其中所述过滤区包括与sTF结合的固定的试剂；以及
c. 位于过滤区下游的结合区，包括抗转铁蛋白抗体。
71.根据权利要求70所述的试条，进一步包括具有对照抗体的对照区。
72.根据权利要求70和71任一项所述的试条，包括位于所述结合区下游的捕获区，其中所述捕获区包括结合所述抗转铁蛋白抗体-转铁蛋白络合物的捕获试剂。
73.根据权利要求72所述的试条，其特征在于，所述捕获试剂是抗转铁蛋白抗体。
74.根据权利要求70所述的试条，其特征在于，所述结合区中的抗转铁蛋白抗体是可检测标记的。
75.根据权利要求74所述的试条，其特征在于，所述抗转铁蛋白抗体是与荧光标记、显色标记、生物素分子和/或金粒子共轭的抗体。
76.根据权利要求72和73任一项所述的试条，其特征在于，所述捕获试剂是固定的。
77.根据权利要求70所述的试条，其特征在于，与sTF结合的固定的试剂是与氧合sTF结合的试剂，其中氧合sTF在sTF的末端唾液酸残基包括醛基。
78.根据权利要求77所述的试条，其特征在于，所述试剂包括酰肼反应基。
79.根据权利要求78所述的试条，其特征在于，所述试剂是包括酰肼反应基的颗粒。
80.一种用于检测样本中转铁蛋白存在的设备，其特征在于，所述设备包括：
a. 根据权利要求70至79任一项所述的试条；
b. 含有所述试条的外壳，其中所述外壳包括至少一个开口以将样本加载区内的试条的表面暴露给样本。
81.根据权利要求75所述的设备，其特征在于，所述设备是掌上型设备。
82.一种试剂盒，包括根据权利要求70至79任一项所述的试条，以及含有氧化剂的容器。
83.一种试剂盒，包括根据权利要求81或82所述的设备，以及含有氧化剂的容器。
84.一种检测生物样本中的转铁蛋白或测量生物样本中的转铁蛋白的量的方法，包括使样本与权利要求70至79任一项所述的试条、或权利要求80至81所述的设备、或权利要求82至83所述的试剂盒接触，其中所述方法包括检测或测量所述结合区中的、或位于所述捕获区下游的转铁蛋白。
85.根据权利要求84所述的方法，其特征在于，所述样本是生物样本。
86.根据权利要求84所述的方法，其特征在于，所述方法用于检测CSF漏，并且其中所述样本是从受治疗者获取的生物样本。
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