BRPI0711388B1

BRPI0711388B1 - método para detectar um analito em uma amostra em um procedimento de ensaio

Info

Publication number: BRPI0711388B1
Application number: BRPI0711388-9A
Authority: BR
Inventors: Hashem Akhavan-Tafti
Original assignee: Beckman Coulter, Inc
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2007-05-07
Publication date: 2021-02-23
Also published as: CN101473216A; BRPI0711388A2; CN101490536B; CN101473216B; CN101490536A

Abstract

MÉTODOS DE ENSAIO DE NÃO-SEPARAÇÃO. Trata-se de métodos de ensaio que envolvem reações de ligação específica que são simplificados comparados com métodos conhecidos. Um composto capaz de produzir quimiluminescência é imobilizado sobre um suporte sólido como se fosse um elemento de um par de ligação específica para capturar um analito de uma amostra. Um composto ativador que ativa o composto quimiluminescente e é conjugado com um elemento do par de ligação específica é adicionado em excesso juntamente com a amdstra ao suporte sólido. A adição de uma solução ativadora origina uma reação quimiluminescente nos sítios onde o conjugado ativador foi especificamente ligado. Os métodos de ensaio são designados ensaios de não-separação, pois esses não exigem a remoção ou separação de excesso de marcador de detecção (conjugado ativador) antes da etapa de detecção. Os métodos são aplicáveis a vários tipos de ensaios inclusive imunoensaios, ensaios de ligante-receptor e ensaios de hibridização de ácido nucléico.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao pedido Provisório copendente do Requerente N° de série 60/798.839 depositado em 9 de maio de 2006.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a novos métodos de ensaio que envolvem reações de ligação específicas que são simplificados comparados com métodos conhecidos. Os métodos de ensaio são chamados ensaios de não-separação, pois esses não requerem remoção ou separação de excesso de marcador de detecção antes da etapa de detecção. Os métodos são aplicáveis a vários tipos de ensaios inclusive imunoensaios, ensaios ligante-receptor e ensaios de hibridi- zação de ácido nucleico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Um grande esforço foi feito no campo de desenvolvimento de ensaio, em particular, em desenvolvimento de imunoensaio para simplificar o desenho de ensaios enquanto preserva seus benefícios essenciais em sensibilidade, faixa dinâmica, robustez, ampla aplicabilidade e adequação à automação. Uma abordagem serve para desenvolver autodenominadas formas de ensaio homogêneo onde nenhuma separação de um parceiro de ligação específico detectavelmente marcado adicionado é usada. Esse tipo de metodologia conta com o planejamento de um princípio de detecção que é tanto ativado como desativado como resultado da reação de ligação. Em contrapartida, as formas de ensaios heterogêneos contam com a separação física de parceiros de ligação específicos detectavelmente marcados ligados e livres antes da quantificação.

[004] Inúmeras patentes U.S. foram emitidas no campo de imu- noensaio enzimático homogêneo. Muitas exploram a reação de ligação anticorpo:antígeno tanto para ativar como para inibir uma enzima marcadora: Patentes Nos U.S. 3.817.837; 3.852.157; 3.875.011; 3.966.556; 3.905.871; 4.065.354; 4.043.872; 4.040.907; 4.039.385; 4.046.636; 4.067.774;4.191.613; e 4.171.244, 4.785.080. Outros imunoensaios homogêneos envolvem vários métodos para supressão de fluorescência através de anticorpos ou outros supressores fluorescentes: Patente Nos U.S. 3.998.943; 3.996.345; 4.174.384; 4.161.515; 4.208.479 e 4.160.016. Ainda outras patentes U.S. nesse campo de tipos variados de imunoensaio incluem: Patente Nos U.S. 3.935.074; 4.130.462; e 4.193.983. A Patente U.S. N° 4.160.645 descreve um método de ensaio que utiliza um catalisador de transferência de elétrons como um marcador. O catalisador (marcador) é desativado mediante ligação ao anticorpo.

[005] Campbell et al., (Biochem. J., 216, 185-194 (1983)), des creve um método de detecção que utiliza transferência de energia entre um doador de quimioluminescência acoplado a um antígeno (Ag-L) e um receptor de fluorescência acoplado a um anticorpo (Ab-F) em uma forma de ensaio competitivo. O antígeno complexado se expressa essencialmente no comprimento de onda do fluorescedor, enquanto o antígeno livre se expressa no comprimento de onda característico do marcador de quimioluminescência. Subsequentemente, a intensidade da luz é medida em dois comprimentos de onda e a razão dos sinais está relacionada à quantidade de analito na amostra.

[006] Vários outros imunoensaios homogêneos são conhecidos: Rubenstein, et al, Patente U.S. N° 3.817.837 (Homogeneous Enzyme Immunoassay), Ullman, Patente U.S. N° 3.996.345 (Fluorescence Quenching Homogenous Immunoassay), Maggio, Patente U.S. N° 4.233.402 (Enzyme Channeling Homogeneous Enzyme Immunoas say), e Boguslaski, et al, Patente canadense 1.082.577 (Hapten- Cofactor Homogeneous Enzyme Immunoassay).

[007] A Patente U.S. 6.406.913 de Ullman descreve métodos de ensaio que compreendem tratar um meio suspeito de conter um anali- to sob condições de modo que o analito faça com que um fotossensibi- lizador e um composto quimioluminescente entrem em estreita proximidade. O fotossensibilizador gera um oxigênio singleto, que se difunde através da solução e ativa o composto quimioluminescente quando este estiver em estreita proximidade. O composto quimioluminescente ativado produz, subsequentemente, luz. A quantidade de luz produzida está relacionada à quantidade de analito no meio. Em uma modalidade, pelo menos um entre o composto fotossensibilizador e quimiolumi- nescente está associado a uma partícula passível de suspensão e um elemento de par de ligação específico está ligado a essa.

[008] A Patente U.S. 5.516.636 de McCapra descreve métodos de ensaio que compreendem ensaios de ligação específicos que utilizam um sensibilizador como um marcador. O sensibilizador, quando estimulado por radiação, transferência de elétrons, eletrólise, eletrolu- minescência ou transferência de energia, atinge um estado excitado, que (a) mediante a interação com oxigênio molecular produz oxigênio singleto, ou (b) mediante a interação com um corante leuco é reduzido por oxigênio para produzir peróxido de hidrogênio. Cada interação com o sensibilizador excitado, com a adição de outros reagentes, produz um sinal detectável.

[009] Apesar dos esforços consideráveis feitos para desenvolver formas de ensaio homogêneo ou de não-separação, essas ainda não experimentaram a ampla adoção comercial. Os ensaios heterogêneos são considerados mais simples de se desenvolver e produzir em massa, embora sejam operacionalmente mais complexos. Em particular, o campo de imunodiagnóstico clínico de alto volume e o menor campo de diagnóstico clínico de ácido nucleico são dominados por formas de ensaio heterogêneo. Dentro dessa área, as formas de teste poderiam ser benéficas ao campo que poderia simplificar os protocolos, reduzir a complexidade e aprimorar a compatibilidade com a automação ao remover etapas desnecessárias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Em um aspecto, a presente invenção proporciona novos métodos de ensaio que envolvem reações de ligação específicas, especialmente imunoensaios, que são simplificados comparados com métodos conhecidos. Os ensaios são simplificados ao eliminar uma etapa de separação e lavagem antes da etapa de detecção e, assim, são considerados ensaios de não-separação. Os métodos descrevem o uso de um composto quimioluminescente imobilizado e um conjugado de composto ativador com um parceiro de ligação específico para induzir uma reação quimioluminescente. A co-localização mediada por analito do composto marcador quimioluminescente e do conjugado ativador faz com que a reação quimioluminescente subsequente ocorra apenas no sítio das moléculas de analito ligadas. A presença de excesso de conjugado ativador não-ligado não contribui nem interfere na reação quimioluminescente. Como resultado, a intensidade de qui- mioluminescência emitida é proporcional à quantidade de analito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A Figura 1 é um diagrama esquemático da etapa de detec ção de um imunoensaio conduzido de acordo com a invenção que utiliza um anticorpo de captura marcado.

[0012] A Figura 2 é um diagrama esquemático da etapa de detec ção de outro imunoensaio conduzido de acordo com a invenção que utiliza a proteína de bloqueio marcada e um anticorpo de captura não- marcado.

[0013] A Figura 3 é um diagrama esquemático da etapa de detec ção de outro imunoensaio conduzido de acordo com a invenção que utiliza uma superfície sólida marcada e um anticorpo de captura não- marcado.

[0014] A Figura 4 é um gráfico que mostra a detecção de antígeno IgG em um imunoensaio de não-separação que utiliza um anticorpo de captura marcado imobilizado nos poços de uma microplaca e excesso de conjugado anti-IgG-HRP para detecção.

[0015] A Figura 5 é um gráfico que mostra a detecção de antígeno IgG em um imunoensaio de não-separação que utiliza uma proteína de bloqueio marcada e um anticorpo de captura não-marcado imobilizado nos poços de uma microplaca e excesso de conjugado anti-IgG-HRP para detecção.

[0016] A Figura 6 é um diagrama esquemático da etapa de detec ção de um ensaio de hibridização de ácido nucleico conduzido de acordo com a invenção que utiliza um ácido nucleico de captura marcado.

[0017] A Figura 7 é um diagrama esquemático da etapa de detec ção de um imunoensaio competitivo conduzido de acordo com a invenção que utiliza uma fase sólida marcada, um anticorpo de captura imobilizado e um análogo de analito marcado. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES Alquila - Um grupo hidrocarboneto cíclico ou de cadeia linear, ramificada que contém de 1 a 20 carbonos que podem ser substituídos por 1 ou mais substituintes, exceto H. Alquila inferior como usada aqui se refere àqueles grupos alquila que contêm até 8 carbonos. Analito - Uma substância em uma amostra que será detectada em um ensaio. Uma ou mais substâncias que possuem uma afinidade de ligação específica ao analito serão usadas para detectar o analito. O analito pode ser uma proteína, um anticorpo, ou um hapteno ao qual um anticorpo se liga. O analito pode ser um ácido nucleico que é ligado por um ácido nucleico complementar. O analito pode ser qualquer outra substância que forma um elemento de um par de ligação específico. Aralquila - Um grupo alquila substituído por um grupo arila. Arila - Um grupo contendo anel aromático que contém 1 a 5 anéis aromáticos carbocíclicos, que podem ser substituídos por 1 ou mais substituintes, exceto H. Material biológico - inclui o sangue total, sangue total anti- coagulado, plasma, soro, tecido, células, conteúdo celular e vírus. Composto quimioluminescente - Um composto que se submete a uma reação que resulta em sua conversão em outro composto formado em um estado eletronicamente excitado. O estado excitado pode ser tanto um estado excitado singleto como tripleto. O estado excitado pode emitir luz diretamente mediante relaxamento até o estado normal ou pode transferir energia de excitação para um receptor de energia emissiva retornando, assim, ao estado normal. O receptor de energia é elevado para um estado excitado no processo e emite luz. Amostra - Um fluido que contém ou suspeita-se que contenha ácidos nucleicos. As amostras típicas que podem ser usadas nos métodos da invenção incluem fluidos corporais, tais como, sangue, que pode ser sangue anticoagulado conforme comumente encontrado em amostras de sangue coletadas, plasma, soro, urina, sêmen, saliva, culturas celulares, extratos de tecido, e similares. Outros tipos de amostras incluem solventes, água do mar, amostras de água industrial, amostras de alimentos e amostras ambientais, tais como, solo ou água, materiais de plantas, eucariotos, bactérias, plasmídeos e vírus, fungos e células originadas de procariotos. Material de fase sólida - um material que possui uma super- fície mediante a qual os componentes de ensaio são imobilizados. Os materiais podem estar sob a forma de partículas, micropartículas, na- nopartículas, fibras, microesferas, membranas, filtros e outros suportes, tais como, tubos de teste e micropoços. Par de ligação específica, parceiro de ligação específica - Uma molécula, inclusive moléculas biológicas que possuem uma afinidade de ligação específica com outra substância inclusive DNA, RNA, oligonucleotídeos, anticorpos, fragmentos de anticorpo, quimeras de anticorpo-DNA, antígenos, haptenos, proteínas, lectinas, avidina, es- treptavidina e biotina. Os parceiros de ligação específica podem ser conjugados com uma ou mais moléculas tanto de um ativador como de um composto quimioluminescente. Substituído - Refere-se à substituição de pelo menos um átomo de hidrogênio em um grupo por um grupo não-hidrogênio. Deve ser observado que em referências aos grupos substituídos, pretende- se que múltiplos pontos de substituição possam estar presentes, salvo claramente indicado em contrário.

[0018] A presente invenção se refere a métodos de ensaio rápidos e simples para detectar substâncias por meio de reações de pares de ligação específica. Os métodos requerem o uso de um composto qui- mioluminescente imobilizado, um conjugado de composto ativador a um parceiro de ligação específica para induzir uma reação quimiolumi- nescente, e uma solução ativadora. Os métodos envolvem uma ou mais reações de par de ligação específica para detectar o analito. Como resultado de um parceiro de ligação específica marcado que se liga ao analito, um ativador entra em proximidade com um composto quimioluminescente imobilizado de modo que esse seja eficaz para ativar uma reação que gera quimioluminescência mediante a adição de uma solução ativadora. O parceiro de ligação específica marcado por ativador é proporcionado ao sistema em excesso à quantidade ne- cessária para ligar todo o analito. O excesso de conjugado ativador não-ligado não é removido antes da adição de soluções ativadoras e detecção uma vez que esse não pode participar da reação.

[0019] Os presentes métodos se diferem, dessa maneira, de mé todos de teste convencionais que requerem a remoção do conjugado ativador não-ligado presente em grande excesso à quantidade* especificamente associada com o analito. A amostra que contém analito, conjugado ativador, e solução ativadora pode ser adicionada de forma sequencial a um recipiente de teste, sem lavagem ou separações, e a luminescência lida*. Alternativamente, a amostra e conjugado ativador podem ser pré-misturados e adicionados ao recipiente de teste que contém um parceiro de ligação específica para capturar o analito e conter o marcador quimioluminescente imobilizado antes de introduzir a solução ativadora. Nenhuma lavagem ou separação de excesso de conjugado ativador não-ligado é requerida. Outro ponto de diferença com ensaios quimilouminescentes convencionais na técnica é o fato de que nem o composto quimioluminescente nem o ativador (por exemplo, peroxidase) que participa da produção de luz está livre de se difundir na solução. Ambos estão espacialmente constritos. Parcialmente, como uma consequência disso, a geração de sinal tende a ser de curta duração.

[0020] Os ensaios convencionais que utilizam substratos quimio- luminescente e conjugados marcados por enzima proporcionam o substrato em grande excesso à quantidade de enzima marcadora. Frequentemente, a razão molar de substrato/enzima pode exceder nove potências de dez, ou seja, um excesso de um bilhão de vezes. Acredita-se que seja necessário fornecer tal excesso significativo de composto quimioluminescente para assegurar um fornecimento adequado de substrato para turnover enzimático contínuo e que esse processo garanta a sensibilidade de detecção adequada em métodos de ensaio. As requerentes descobriram que é possível desenvolver métodos de ensaio altamente sensíveis que reduzem essa razão em diversas ordens de magnitude. Nesse aspecto, esses métodos diferem fundamentalmente dos métodos conhecidos.

[0021] A eliminação das etapas de lavagem e separação, como descrito acima e como mostrado em ensaios exemplificativos descritos abaixo, proporciona oportunidades para simplificar o desenho de protocolos de ensaio. O número reduzido de etapas operacionais reduz o tempo de ensaio, variabilidade entre ensaios de lavagem incompleta e o custo. Ao mesmo tempo isso aumenta a capacidade de automatizar e miniaturizar a performance de ensaio com todas as vantagens inerentes presentes sobre a automação e miniaturização.

[0022] Os ensaios realizados de acordo com os presentes méto dos envolvem quatro etapas. Em uma primeira etapa, uma fase sólida é proporcionada em um dispositivo de teste para capturar especificamente um analito de interesse. A fase sólida é proporcionada com um parceiro de ligação específico imobilizado para que um analito seja detectado. A fase sólida é adicionalmente proporcionada com composto de marcação quimioluminescente imobilizado sobre esse. O marcador quimioluminescente pode ser proporcionado de inúmeras maneiras diferentes, como descrito abaixo em mais detalhes. Em cada variante, o marcador quimioluminescente é irreversivelmente ligado a uma substância ou material de modo que torne o mesmo imóvel. Em uma segunda etapa, a amostra contendo analito e o conjugado ativador são introduzidos no dispositivo de teste que possui o parceiro de ligação específica imobilizado de fase sólida do analito e permitem a formação de complexos de ligação específica. A amostra e conjugado ativador podem ser adicionados separadamente em cada ordem, ou simultane-amente, ou podem ser pré-misturados e adicionados como uma combinação. Um tempo de retardo opcional para permitir que ocorram as reações de ligação pode ser inserido nesse ponto. Na terceira etapa, uma solução ativadora é adicionada para produzir a quimiolumines- cência de modo a detectar o analito. Finalmente, a quimioluminescên- cia é detectada. De preferência, tanto o nível de pico de intensidade de luz como de intensidade de luz integrada total são medidos. A quantidade de luz pode estar relacionada à quantidade do analito ao construir uma curva de calibração de acordo com os métodos geralmente co-nhecidos. Quando a emissão de luz ocorrer rapidamente após a adição de solução ativadora é desejável tanto determinar mecanicamente o tempo do início de medida com a adição por meio de um injetor adequado como realizar a adição com o dispositivo de teste já exposto ao detector. FORMAS DE ENSAIO E SUPORTES SÓLIDOS

[0023] Nos métodos da presente invenção, o composto de marca ção quimioluminescente é imobilizado em um componente do sistema de teste. Isso pode ser realizado de qualquer uma entre as diversas maneiras. Em uma modalidade, o marcador quimioluminescente é co- valentemente ligado a um parceiro de ligação específica imobilizado do analito. Um exemplo poderia ser um anticorpo de captura imobilizado sobre os poços de uma microplaca. A imobilização do parceiro de ligação específica pode ocorrer por meio de ligação covalente ou por um processo de adsorção. Nessa forma, mostrada na Figura 1, o marcador quimioluminescente se associa ao ativador em virtude de dois parceiros de ligação específica, ambos se ligam a um analito em um formato de "sanduíche". Em outra modalidade, mostrada na Figura 2, o marcador quimioluminescente é covalentemente ligado a uma substância auxiliar que é imobilizada sobre o suporte sólido de maneira aleatória. A imobilização da substância auxiliar pode ocorrer por meio de ligação covalente ou por um processo de adsorção. O marcador é, desse modo, distribuído mais ou menos de maneira uniforme sobre a superfície do suporte sólido. Um meio é proporcionado para atrair o analito para a superfície, por exemplo, por meio de um parceiro de ligação específica não-marcado do analito. O marcador quimiolumines- cente se associa ao ativador em virtude de uma reação de ligação específica que se liga ao ativador próximo ao marcador quimiolumines- cente ligado à substância auxiliar coberta de forma passiva sobre a superfície do suporte. Em outra modalidade, o marcador quimiolumi- nescente é covalentemente ligado à superfície do suporte sólido. Como mostrado na Figura 3, o marcador é, dessa forma, distribuído mais ou menos de maneira uniforme sobre a superfície do suporte sólido. Um meio é proporcionado para atrair o analito para a superfície, por exemplo, por meio de um parceiro de ligação específica não-marcado do analito. O marcador quimioluminescente se associa ao ativador em virtude de uma reação de ligação específica que se liga ao ativador próximo ao marcador quimioluminescente diretamente ligado à superfície do suporte. Então, sem lavagem ou separação, a solução ativado- ra é adicionada e a quimioluminescência medida.

[0024] Outra modalidade compreende uma variação em que um análogo do analito é usado compreendendo um conjugado de ativa- dor-analito. O análogo de analito e analito irão se ligar de maneira competitiva ao parceiro de ligação específica do analito. Tornar-se-á claro que nesse tipo de método de ensaio, resultará uma correlação negativa entre a quantidade de analito na amostra e a intensidade de quimioluminescência. (Figura 7)

[0025] Além da ligação de marcador quimioluminescente através de anticorpos para ligação de antígenos ou outras proteínas ou outros anticorpos através de um imunoensaio, os presentes métodos podem usar ácidos nucleicos marcados quimilouminescentes para detectar os ácidos nucleicos através da ligação de ácidos nucleicos complementares. O uso, nesse aspecto, não é particularmente limitado com relação ao tamanho do ácido nucleico, o único critério sendo que os parceiros complementares possuam comprimento suficiente para permitir uma hibridização estável. Os ácidos nucleicos, como usado aqui, incluem ácidos nucleicos com comprimento de gene, fragmentos mais curtos de ácidos nucleicos, polinucleotídeos e oligonucleotídeos, sendo que qualquer um desses pode possuir cadeia simples ou dupla. Na prática da invenção são utilizados ácidos nucleicos como parceiros de ligação específica, um ácido nucleico é covalentemente ligado ou fisicamente imobilizado sobre uma superfície de um suporte sólido para capturar um ácido nucleico de analito. O marcador quimioluminescente pode ser ligado ao ácido nucleico de captura, como esquematicamente mostrado na figura 6, ou o marcador pode estar diretamente associado à fase sólida, como explicado acima. O ácido nucleico de captura possuirá complementaridade de sequência total ou substancialmente total a uma região de sequência do ácido nucleico de analito. Quando substancialmente complementar, o ácido nucleico de captura pode possuir uma parte ressaltante terminal, uma parte de alça terminal ou uma parte de alça interna que não é complementar ao analito desde que essa não interfira ou impeça a hibridização com o analito. A situação inversa também pode ocorrer quando o ressalto ou alça se encontrar dentro do ácido nucleico de analito. Permite-se que o ácido nucleico de captura, ácido nucleico de analito e um conjugado de um ativador e um terceiro ácido nucleico se hibridizem. O terceiro ácido nucleico é subs-tancialmente complementar a uma região de sequência do ácido nu- cleico de analito diferente da região complementar ao ácido nucleico de captura. A hibridização do ácido nucleico de captura e o ácido nu- cleico conjugado ativador com o analito pode ser realizada de maneira consecutiva tanto em ordem como simultaneamente. Como resultado desse processo, o marcador quimioluminescente se associa ao ativa- dor em virtude de reações de hibridização específicas que se liga pró- ximo ao marcador quimioluminescente diretamente ligado à superfície do suporte. Solução ativadora é proporcionada e a quimioluminescên- cia detectada como descrito acima.

[0026] Outra modalidade compreende uma variação em que se utiliza um conjugado do analito com o ativador. O conjugado ativador de ácido nucleico de analito e ácido nucleico de analito irão se ligar de maneira competitiva ao parceiro de ligação específica do ácido nuclei- co de analito. Tornar-se-á claro que nesse tipo de método de ensaio resultará uma correlação negativa entre a quantidade de analito na amostra e a intensidade de quimioluminescência.

[0027] Além dos sistemas à base de anticorpo e à base de ácido nucleico, outros pares de ligação específica como geralmente conhecidos pelo elemento versado na técnica de ensaios de ligação podem servir como a base de métodos de teste de acordo com a presente invenção. Os pares fluoresceína/anti-fluoresceína, digoxigeni- na/antidigoxigenina e nitrofenila/antinitrofenila são exemplificativos. Como um exemplo adicional, o par de ligação (estrept)avidina/biotina bem-conhecido pode ser utilizado. Para ilustrar uma maneira na qual esse par de ligação poderia ser usado, um conjugado quimiolumines- cente marcador de estreptavidina pode ser covalentemente ligado ou adsorvido sobre um suporte sólido. Um analito marcado por biotina e um conjugado ativador são então adicionados, sendo que o conjugado é ligado a um anticorpo antibiotina ou anticorpo antianalito. Após permitir que os complexos se formem solução ativadora é adicionada e a detecção realizada como descrito acima. Esses e outros exemplos que irão ocorrer para um versado na técnica são considerados dentro escopo dos presentes métodos inventivos.

[0028] Os suportes sólidos úteis na prática da presente invenção podem ser de vários materiais, formatos e tamanhos. Os materiais já em uso em ensaios de ligação incluem placas de micropoços de 96 poços, 384 poços ou variedades de números maiores, tubos de teste, frascos de amostra, esferas de plástico, celulose, papel ou tiras de teste de plástico, partículas de látex, partículas poliméricas, partículas de sílica, partículas magnéticas, especialmente aquelas que possuem diâmetros médios de 0,1 a 10 μm, e nanopartículas de vários materiais podem proporcionar um suporte sólido útil para a ligação de marcadores quimilouminescentes e para imobilizar os parceiros de ligação específica. A presente descrição ensina métodos para funcionalizar tais materiais para uso nos presentes métodos de ensaio. Em particular, os métodos são descritos para ligar tanto compostos de marcação qui- mioluminescente como um parceiro de ligação específica, tal como, um anticorpo, à mesma superfície, especialmente a uma micropartícu- la. COMPOSTOS DE MARCADOR QUIMILUMINESCENTE

[0029] Os compostos usados como marcadores quimiloumines- centes na prática da presente invenção possuem a fórmula geral CL - L - RG em que CL denota uma porção quimioluminescente, L denota uma porção de ligação para ligar a porção quimioluminescente e um grupo reativo, e RG denota uma porção de grupo reativo para acoplamento a outro material. A porção quimioluminescente CL compreende. É desejado, porém não necessário, que a reação quimioluminescente do grupo CL, do ativador e da solução ativadora seja rápida e que ocorra, de maneira desejável, durante um espaço de tempo muito cur-to.

[0030] Os compostos quimilouminescentes preferidos são capazes de ser oxidados para produzir quimioluminescência na presença do ativador e uma solução ativadora. Uma classe exemplificativa de compostos que mediante incorporação de um ligante poderiam servir como o marcador quimioluminescente incluem luminol, e hidrazidas cíclicas estruturalmente relacionadas inclusive isoluminol, aminobutil- etilisoluminol (ABEI), amino-hexiletilisoluminol (AHEI), hidrazida do ácido 7-dimetilaminonaftaleno-1,2-dicarboxílico, aminoftalidrazidas substituídas por anel, hidrazidas do ácido antraceno-2,3-dicarboxílico, hidrazidas do ácido fenatreno-1,2-dicarboxílico, hidrazidas do ácido pirenodicarboxílico, 5-hidróxi-ftalidrazida, 6-hidroxiftalidrazida, bem como outros análogos de ftalazinadiona descritos na Patente U.S. N° 5.420.275 de Masuya et al. e na Patente U.S. N° 5.324.835 de Yamaguchi.

[0031] Outra classe de porções quimilouminescentes inclui ésteres de acridan, tioésteres e sulfonamidas descritos nas Patente Nos U.S. 5.491.072, 5.523.212, 5.593. 845, e 6.030. 803. Outra classe de porções quimilouminescentes inclui os compostos heterocíclicos descritos nas Patentes U.S. Nos 5.922.558; 6.696.569; e 6.891.057. Esses compostos compreendem, de preferência, um anel heterocíclico, de preferência, que compreende um grupo de anel de cinco ou seis elementos ou múltiplos anéis contendo nitrogênio, oxigênio ou enxofre ao qual está ligada uma ligação dupla exocíclica, cujo carbono terminal é substituído por dois átomos selecionados entre átomos de oxigênio e enxofre.

[0032] É considerado que qualquer composto conhecido produz quimioluminescência por meio da ação de peróxido de hidrogênio e uma peroxidase irá funcionar como a porção quimioluminescente do composto marcador quimioluminescente usado na presente invenção. Inúmeros tais compostos de várias classes estruturais, inclusive corantes xanteno, aminas aromáticas e aminas heterocíclicas são conhecidos na técnica para produzir quimioluminescência sob essas condições.

[0033] Um grupo preferido de compostos marcadores quimiloumi- nescentes útil nos métodos da invenção compreende compostos acri- dan que possuem a fórmula I

[0034] em que pelo menos um dos grupos R1 - R11 é um substi- tuinte de marcação da fórmula L - RG

[0035] onde L é um grupo de ligação que pode ser uma ligação ou outro grupo divalente ou polivalente, RG é um grupo reativo que permite que o composto de marcação quimioluminescente seja ligado a outro composto, R1, R2 e R3 são grupos orgânicos que contêm de 1 a 50 átomos de não-hidrogênio, e cada R4 - R11 é hidrogênio ou um substi- tuinte não-interferente. O substituinte de marcação -L-RG está presente, de preferência, sobre um entre R1 ou R2, embora esse também possa estar presente como um substituinte sobre R3 ou um R4 - R11.

[0036] Os grupos R1 e R2 no composto da fórmula I podem consis tir em qualquer grupo orgânico contendo de 1 a cerca de 50 átomos de não-hidrogênio selecionados entre átomos de C, N, O, S, P, Si e halo- gênio que permitem a produção de luz. Pelo último entende-se que quando um composto da fórmula I se submete a uma reação da presente invenção, um composto do produto do estado excitado é produzido e pode envolver a produção de um ou mais intermediários quimi- louminescentes. O produto no estado excitado pode emitir luz diretamente ou pode transferir a energia de excitação para um receptor fluo-rescente através da transferência de energia fazendo com que a luz seja emitida do receptor fluorescente. R1 e R2 são, de preferência, selecionados entre grupos alquila substituídos ou não-substituídos, al- quenila substituídos ou não-substituídos, alquinila substituídos ou não- substituídos, arila substituídos ou não-substituídos, aralquila substituídos ou não-substituídos de 1 a 20 átomos de carbono. Quando R1 ou R2 for um grupo substituído, esse é substituído por 1 a 3 átomos ou grupos selecionados entre grupos carbonila, grupos carboxila, grupos tri(C1-C8 alquil)silila, um grupo SO3, um grupo OSO3-2, grupos glico- sila, um grupo PO3, um grupo OPO3-2, átomos de halogênio, um grupo hidroxila, um grupo tiol, grupos amino, grupos amônio quaternário, grupos fosfônio quaternário. Em uma modalidade preferida, R1 ou R2 é, de preferência, substituído pelo substituinte de marcação da fórmula - L-RG onde L é um grupo de ligação e RG é um grupo reativo.

[0037] O grupo R3 é um grupo orgânico que contém de 1 a 50 átomos de não-hidrogênio selecionados entre átomos de C, N, O, S, P, Si e halogênio além do número necessário de átomos de H requerido satisfazem as valências dos átomos no grupo. Mais preferivelmente, R3 contém de 1 a 20 átomos de não-hidrogênio. O grupo orgânico é, de preferência, selecionado do grupo que consiste em grupos alquila, alquila substituídos, alquenila substituídos ou não-substituídos, alquini- la substituídos ou não-substituídos, arila substituídos ou não- substituídos, aralquila substituídos ou não-substituídos de 1 a 20 átomos de carbono. Os grupos mais preferidos de R3 incluem grupos C1C4 alquila substituídos ou não-substituídos, fenila, grupos benzila substituídos ou não-substituídos, grupos alcoxialquila, carboxialquila e ácido alquilsulfônico. O grupo R3 pode ser ligado tanto a R7 como R8 para completar um anel de 5 ou 6 membros. Em uma modalidade, R3 é substituído pelo substituinte de marcação da fórmula -L RG.

[0038] Nos compostos da fórmula I, cada grupo R4 - R11 é inde pendentemente H ou um grupo substituinte que permite que o produto em estado excitado seja produzido e geralmente contém de 1 a 50 átomos selecionados dentre átomos de C, N, O, S, P, Si e halogênio. Os grupos substituintes representativos que podem estar presentes incluem, sem caráter limitativo, grupos alquila, alquila substituído, arila, arila substituídos, aralquila, alquenila, alquinila, alcóxi, arilóxi, halogê- nio, amino, amino substituídos, carboxila, carboalcóxi, carboxamida, ciano e sulfonato. Os pares de grupos adjacentes, por exemplo, R4 - R5 ou R5 - R6, podem ser ligados uns aos outros para formar um sistema de anel carbocíclico ou heterocíclico que compreende pelo menos um anel de 5 ou 6 membros que é fundido com o anel ao qual os dois grupos estão ligados. Tais anéis heterocíclicos fundidos podem conter átomos de N, O ou S e podem conter substituintes de anel, exceto H, tais como aqueles mencionados acima. Um ou mais grupos R4 - R11 podem ser um substituinte de marcação da fórmula -L-RG. Prefere-se que R4 - R11 sejam selecionados dentre grupos hidrogênio, halo- gênio e alcóxi, tais como, metóxi, etóxi, t-butóxi e similares. Um grupo de compostos preferido possui um entre R5, R6, R9 ou R10 como um halogênio e os outros entre R4 - R11 são átomos de hidrogênio.

[0039] Os grupos substituintes podem ser incorporados em várias quantidades e em posições de anel ou cadeia selecionadas no anel acridan para modificar as propriedades do composto ou para proporcionar conveniência de síntese. Tais propriedades incluem, por exemplo, rendimento quântico de quimioluminescência, taxa de reação com a enzima, intensidade de luz máxima, duração de emissão de luz, comprimento de onda de emissão de luz e solubilidade no meio de reação. Os substituintes específicos e seus efeitos são ilustrados nos exemplos específicos abaixo, que, entretanto, não devem ser considerados, de maneira nenhuma, limitadores do escopo da invenção. Os compostos de utilidade sintética da fórmula I possuem desejavelmente cada R4 a R11 como um átomo de hidrogênio.

[0040] Grupo de ligação (L): O grupo de ligação pode ser uma li gação, um átomo, grupos divalentes e grupos polivalentes, ou uma cadeia linear ou ramificada de átomos, sendo que alguns desses podem fazer parte de uma estrutura de anel. O substituinte geralmente contém de 1 a cerca de 50 átomos de não-hidrogênio, mais geralmen- te de 1 a cerca de 30 átomos de não-hidrogênio. Os átomos que compreendem a cadeia são selecionados entre átomos de C, O, N, S, P, Si, B, e Se, de preferência, de C, O, N, P e S. Os átomos de halogênio podem estar presentes como substituintes sobre a cadeia ou anel. Os grupos funcionais típicos que compreendem o substituinte de ligação incluem grupo alquileno, arileno, alquenileno, éter, peróxido, carbonila, como cetona, éster, éster carbonato, tioéster, ou amida, grupos amina, amidina, carbamato, ureia, imina, imida, imidato, carbodi-imida, hidra- zina, diazo, fosfodiéster, fosfotriéster, éster fosfonato, tioéter, dissulfe- to, sulfóxido, sulfona, éster sulfonato, éster sulfato e tioureia.

[0041] Grupo reativo: O grupo reativo RG é um átomo ou grupo cuja presença facilita a ligação à outra molécula por ligação covalente ou forças físicas. Em algumas modalidades, a ligação de um composto de marcação quimioluminescente da presente invenção a outro composto irá envolver a perda de um ou mais átomos do grupo reativo, por exemplo, quando o grupo reativo for um grupo de saída, tal como, um átomo de halogênio ou um grupo tosilato e o composto de marcação quimioluminescente for covalentemente ligado a outro composto por uma reação de deslocamento nucleofílico. Em outras modalidades, a ligação de um composto de marcação quimioluminescente a outro composto por formação de ligação covalente irá envolver a reorganização de ligações dentro do grupo reativo visto que ocorre em uma reação de adição, tal como, uma adição de Michael ou quando o grupo reativo for um grupo isocianato ou isotiocianato. Ainda em outras modalidades, a ligação não irá envolver a formação de ligação covalente, porém em vez disso, as forças físicas em cujo caso o grupo reativo permanece inalterado. Por forças físicas entende-se forças atrativas, tais como, ligação de hidrogênio, atração eletrostática ou iônica, atração hidrofóbica, tal como, empilhamento de bases, e interações de afinidade específicas, tais como, interações biotina-estreptavidina, an- tígeno-anticorpo e nucleotídeo-nucleotídeo. Tabela 1. Grupos Reativos para Ligação Química de Marcadores a Moléculas Orgânicas e Biológicas a.) Grupos reativos amina

b.) Grupos reativos tiol.

[0042] Os grupos reativos preferidos incluem grupos OH, NH2, ONH2, NHNH2, COOH, SO2CH2CF3, éster N-hidroxissuccinimida, éter N-hidroxissuccinimida e maleimida.

[0043] Os reagentes de acoplamento bifuncionais também podem ser usados para acoplar marcadores a moléculas orgânicas e biológicas com grupos moderadamente reativos (veja, L. J. Kricka, LigandBinder Assays, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985, pp. 18-20, Tabela 2.2 e T. H Ji, "Bifunctional Reagents", Methods in Enzymology, 91, 580-609 (1983)). Há dois tipos de reagentes bifuncionais: aqueles que se incorporam na estrutura final, e aqueles que não servem apenas para acoplar os dois reagentes.

[0044] Um grupo preferido de compostos possui a fórmula II onde cada R4 a R11 é hidrogênio. Os grupos R1, R2 e R3 são conforme definidos acima.

[0045] Os compostos de marcação preferidos possuem a fórmula I e possuem os grupos -L-RG como um substituinte sobre o grupo R1 ou R2. Um composto de marcação preferido possui a fórmula III.

[0046] Os compostos de marcação preferidos representativos e seu uso na ligação a outras moléculas e superfícies sólidas são descritos nos exemplos específicos abaixo.

CONJUGADO ATIVADOR

[0047] O composto ativador forma parte de um conjugado ativa- dor-parceiro de ligação específica. O conjugado apresenta uma função dupla; 1) se ligar de maneira específica ao analito no ensaio através da parte de parceiro de ligação específica, tanto diretamente como através de um parceiro de ligação específica intermediário, e 2) ativar o composto quimioluminescente através da parte ativadora. A parte ativadora do conjugado é um composto que realiza a ativação do composto quimioluminescente de modo que, na presença da solução ativadora, a quimioluminescência seja produzida. Os compostos capazes de servir como ativador incluem sais de metal de transição e complexos e enzimas, especialmente enzimas contendo metal de transição, mais especialmente enzimas peroxidase. Os metais de transição úteis nos compostos ativadores incluem aqueles dos grupos 3 a 12 da tabela periódica, especialmente, ferro, cobre, cobalto, zinco, manganês e cromo. Deve ser observado que as moléculas ativadoras responsáveis pela geração de sinal podem operar dentro de um raio fisicamente confinado e entrar em contato apenas com um suprimento limitado de composto quimioluminescente. Isso parece eliminar o grande turnover catalítico em casos onde o ativador possui esse potencial.

[0048] A peroxidase que pode se submeter à reação quimiolumi- nescente inclui lactoperoxidase, microperoxidase, mieloperoxidase, haloperoxidase, por exemplo, vanádio bromoperoxidase, peroxidase de raiz-forte, peroxidases por fungos, tais como, lignina peroxidase e peroxidase de Arthromyces ramosus e peroxidase dependente de Mn produzida em fungos de decomposição branca e peroxidase de soja. Outros compostos miméticos de peroxidase que não são enzimas, porém possuem atividade similar à peroxidase inclusive complexos de ferro, tais como, heme e Mn-TPPS4 (Y.-X. Ci, et al., Mikrochem. J., 52, 257-62 (1995)), os quais são conhecidos por catalisarem a oxidação quimioluminescente de substratos são explicitamente considerados dentro do escopo do significado de peroxidase como usado aqui.

[0049] Os conjugados ou complexos de uma peroxidase e uma molécula biológica também podem ser usados no método para produ- zir quimioluminescência, sendo que a única ressalva é que o conjugado apresenta atividade de peroxidase. As moléculas biológicas que podem ser conjugadas com uma ou mais moléculas de uma peroxidase incluem DNA, RNA, oligonucleotídeos, anticorpos, fragmentos de anticorpo, quimeras de anticorpo-DNA, antígenos, haptenos, proteínas, lectinas, avidina, estreptavidina e biotina. Os complexos que in-cluem ou incorporam uma peroxidase, tais como, lipossomas, micelas, vesículas e polímeros que são funcionalizados para ligação a moléculas biológicas, também podem ser usados nos métodos da presente invenção.

SOLUÇÃO ATIVADORA

[0050] A solução ativadora proporciona um reagente necessário para gerar o composto em estado excitado necessário para quimiolu- minescência. O reagente pode ser um necessário para realizar a reação quimioluminescente ao reagir diretamente com o marcador quimio- luminescente. Esse pode servir em vez de ou além dessa função para facilitar a ação do composto ativador. Esse será o caso, por exemplo, quando o ativador for uma enzima peroxidase. Em uma modalidade preferida, a solução ativadora compreende um composto peróxido. O composto peróxido é qualquer peróxido ou hidroperóxido de alquila capaz de reagir com a peroxidase. Os peróxidos preferidos incluem peróxido de hidrogênio, peróxido de ureia e sais perborato. Uma modalidade representativa usa um conjugado de peroxidase como o ati- vador, um marcador de acridan de um analito sendo que o marcador de acridan é proporcionado ao reagir o parceiro de ligação específica com um composto da fórmula III acima, e uma solução ativadora que compreende peróxido de hidrogênio. O peróxido reage com a peroxidase, presumidamente para alterar o estado de oxidação do ferro no sítio ativo da enzima para um estado de oxidação diferente. Esse estado alterado da enzima reage com o marcador de acridan mantido em proximidade com a enzima. A reação quimioluminescente compreende uma reação adicional de um intermediário formado a partir do composto quimioluminescente com peróxido para produzir o produto de reação e luz final.

[0051] A incorporação de certos compostos intensificadores na solução ativadora promove a reatividade da enzima. Incluído entre esses intensificadores estão os compostos fenólicos e aminas aromáticas conhecidos por aumentar outras reações de peroxidase, como descrito na Patente Nos. U.S. 5.171.668 e 5.206.149, que estão incorporados aqui a título de referência. Os compostos de ácido arilborôni- co substituídos e não-substituídos e seus derivados de éster e anidri- do, como descrito na Patente U.S. 5.512.451 e incorporados a título de referência também são considerados dentro do escopo de intensifica- dores úteis na presente invenção. Os intensificadores preferidos incluem, porém sem caráter limitativo: p-fenilfenol, p-iodofenol, p- bromofenol, ácido p-hidroxicinâmico, p-imidazolilfenol, acetaminofeno, 2,4-diclorofenol, 2-naftol e 6-bromo-2-naftol. As misturas de mais de um intensificador daquelas classes mencionadas acima também podem ser empregadas.

[0052] Os intensificadores adicionais identificados como eficazes no aumento da produção de quimioluminescência de compostos da presente invenção são derivados de fenoxazina e fenotiazina que possuem as fórmulas abaixo.

[0053] Os grupos R substituídos sobre o átomo de nitrogênio de intensificadores de fenoxazina e fenotiazina incluem alquila de 1 a 8 átomos de carbono, e alquila de 1 a 8 átomos de carbono substituídos por um grupo sal sulfonato ou sal carboxilato. Os intensificadores pre- feridos incluem sais do ácido 3-(N-fenotiazinil)-propanossulfônico, sais do ácido 3-(N-fenoxazinil)propanossulfônico, sais do ácido 4-(N- fenoxazinil)butanossulfônico, sais do ácido 5-(N-fenoxazinil)- pentanoico e N-metilfenoxazina e homólogos relacionados.

[0054] A reação de detecção da presente invenção é realizada com uma solução ativadora que está tipicamente em um tampão aquoso. Os tampões adequados incluem qualquer tampão comumente usado capaz de manter um ambiente que permite que a reação quimi- oluminescente seja realizada. Tipicamente, a solução ativadora terá um pH na faixa de cerca de 5 a cerca de 10,5. Os tampões exemplifi- cativos incluem fosfato, borato, acetato, carbonato, tris(hidróxi- metilamino)metano [tris], glicina, tricina, 2-amino-2-metil-1-propanol, dietanolamina MOPS, HEPES, MES e similares.

[0055] A solução ativadora também pode conter um ou mais de tergentes ou tensoativos poliméricos para aumentar a eficiência de luminescência da reação produtora de luz ou aperfeiçoar a razão si- nal/ruído do ensaio. Os tensoativos não-iônicos úteis na prática da presente invenção incluem a título de exemplo alquilfenóis polioxietile- nados, álcoois polioxietilenados, éteres polioxietilenados e ésteres de sorbitol polioxietilenados. Os tensoativos catiônicos monoméricos, inclusive compostos sal de amônio quaternário, tais como, CTAB e compostos sal de fosfônio quaternário podem ser usados. Os tensoati- vos catiônicos poliméricos que incluem aqueles que compreendem grupos sal de amônio e fosfônio quaternário também podem ser usados para esse propósito.

[0056] A luz emitida pelo presente método pode ser detectada por qualquer meio conhecido adequado, tal como, um luminômetro, filme de raios-x, filme fotográfico de alta velocidade, uma câmera CCD, um contador de cintilação, um actinômetro químico ou visualmente. Cada meio de detecção possui uma sensibilidade espectral diferente. O olho humano é otimamente sensível à luz verde, as câmeras CCD apresentam sensibilidade máxima à luz vermelha, os filmes de raios-X com resposta máxima tanto à luz UV, luz azul como à luz verde estão disponíveis. A seleção do dispositivo de detecção será dirigida pela aplicação e considerações de custo, conveniência, e se a criação de um registro permanente for requerido. Naquelas modalidades onde o curso de tempo de emissão de luz é rápido, é vantajoso realizar a reação de ativação para produzir a quimioluminescência na presença do dispositivo de detecção. Como um exemplo, a reação de detecção pode ser realizada em um tubo de teste ou placa de micropoço alojado em um luminômetro ou colocado na frente de uma câmera CCD em um alojamento adaptado para receber os tubos de teste ou placas de mi- cropoço. USOS

[0057] Os presentes métodos de ensaio encontram aplicabilidade em muitos tipos de ensaios de pares de ligação específica. Primeiramente, entre esses estão os imunoensaios ligados à enzima quimio- luminescente, tal como, ELISA. Várias formas de ensaio e os protocolos para realizar as etapas imunoquímicas são bem-conhecidos na técnica e incluem tanto ensaios competitivos como ensaios sanduíche. Os tipos de substâncias que podem ser analisados por imunoensaio de acordo com a presente invenção incluem proteínas, anticorpos, ha- ptenos, fármacos, esteróides e outras substâncias que são geralmente conhecidas na técnica de imunoensaio.

[0058] Os métodos da presente invenção também são úteis para a detecção de ácidos nucleicos pelo uso de sondas de ácidos nucleico marcado por enzima. Os métodos exemplificativos incluem ensaios de hibridização de solução, detecção de DNA em Southern blotting, RNA por Northern blotting, sequenciamento de DNA, impressões digitais do DNA, hibridizações de colônia e plaque lifts, cujo comportamento é bem-conhecido pelo versado na técnica.

[0059] Além dos pares antígeno-anticorpo, hapteno-anticorpo ou anticorpo-anticorpo, pares de ligação específica também podem incluir oligonucleotídeos ou polinucleotídeos complementares, avidina- biotina, estreptavidina-biotina, hormônio-receptor, lectina-carboidrato, proteína A de IgG, proteína de ligação de ácido nucleico-ácido nuclei- co e anticorpo de ácido nucleico-anti-ácido nucleico. Os ensaios de receptor usados na classificação de candidatos a fármaco consistem em outra área de uso dos presentes métodos. Qualquer um desses pares de ligação pode ser adaptado para uso nos presentes métodos por meio da técnica sanduíche de três componentes ou a técnica competitiva de dois componentes descrita acima.

[0060] A presente invenção também contempla o fornecimento de kits para realizar ensaios de acordo com os métodos da presente invenção. Os kits podem compreender, em combinação embalada, marcadores quimilouminescentes tanto como os compostos de marcação livre, parceiros de ligação específica marcados quimilouminescentes, suportes sólidos derivatizados quimilouminescentes, tais como, partículas ou microplacas, quanto como substâncias auxiliares marcadas quimilouminescentes, tais como, proteínas de bloqueio, juntamente com uma solução ativadora e instruções para uso. Os kits também podem conter opcionalmente conjugados ativadores, calibradores de analito, diluentes e tampões de reação se a marcação quimiolumines- cente for realizada pelo usuário. EXEMPLOS Exemplo 1: Síntese de Composto 1

[0061] O éster NHS iodocarboxilato foi sintetizado ao reagir os ácidos iodocarboxílicos com N-hidróxi succinimida utilizando DCC como o reagente de acoplamento.

[0062] A uma solução de ditioéster B (1,808 g, 5,00 mmols) em DMF anidra (50 mL) foi adicionado NaH (60% em óleo mineral, 0,200 g, 5,00 mmols) sob argônio. Após 4 h em temperatura ambiente NHS 3-iodopropionato A (1,485 g, 5,00 mmols) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada durante a noite. DMF foi removida a vácuo. A cromatografia em coluna com CH2Cl2/EtOAc (40:1) produziu 1,770 g de 1 como um sólido amarelo (rendimento 67%). 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 2,30 (s, 3H), 2,74 (t, 2H), 2,83 (s, 4H), 3,01 (t, 2H), 5,31 (s, 2H), 6,88 (t, 2H), 7,07 (m, 2H), 7,11-7,18 (m, 3H), 7,27 (m, 4H), 7,82 (dd, 1H), 7,89 (dd, 1H) ppm. Exemplo 2: Síntese de Composto 2.

[0063] Uma mistura de ditioéster C (0,692 g, 1,50 mmol) e NaH (60% em óleo mineral, 0,060 g, 1,50 mmol) em DMF anidra (20 mL) foi agitada sob argônio em temperatura ambiente durante 4 horas, resultando em uma solução levemente turva. NHS 6 iodo-hexanoato A (0,661 g, 1,95 mmol) foi então adicionado em DMF (5 mL). Após 16 h, a DMF foi removida a vácuo. Ao resíduo foram adicionados 10 mL de acetona seguido por 20 mL de éter. O sobrenadante foi decantado. O precipitado foi lavado três vezes após os mesmos procedimentos. Após a secagem sob vácuo, 1,200 g de 2 foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 1,15 (m, 2H), 1,33-1,47 (m, 4H), 2,01 (p, 2H), 2,38 (t, 2H), 2,67 (t, 2H), 2,75 (t, 2H), 2,82 (s, 4H), 2,88 (t, 2H), 5,32 (s, 2H), 6,88 6,93 (m, 2H), 7,00 (t, 2H), 7,08-7,28 (m, 7H), 7,83 (d, 1H), 7,92 (d, 1H) ppm. Exemplo 3: Síntese de Compostos 3 e 4

[0064] Uma mistura de ditioéster C (1,00 g, 2,10 mmols) e NaH (60% em óleo mineral, 0,087 g, 2,16 mmols) em DMF anidra (20 mL) foi agitada sob argônio em temperatura ambiente durante 4 horas, resultando em uma solução levemente turva. N-6 iodo- hexoxissuccinimida D (0,82 g, 2,52 mmols) quando então adicionada em DMF (5 mL). A mistura foi agitada durante a noite, após o que DMF foi removida a vácuo. O resíduo foi lavado quatro vezes com 30 mL de éter obtendo 1,35 g de 3.

[0065] O composto 3 (0,25 g) foi dissolvido em 5 mL de metanol ao qual foram adicionados 5,0 mL de 50% de NH2OH aquoso. Após a agitação da solução durante 2 dias, os solventes foram evaporados sob vácuo. O resíduo foi lavado com 6 x 20 mL de éter obtendo 0,21 g de 4. 1H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 1,14 (m, 4H), 1,40 (m, 4H), 1,94 (p, 2H), 2,65-2,71 (m, 4H), 2,84 (t, 2H), 3,55 (t, 2H), 5,31 (s, 2H), 6,88 (d, 2H), 6,98 (q, 2H), 7,10 (m, 4H), 7,12-7,27 (m, 3H), 7,85 (t, 2H) ppm. Exemplo 4: Síntese de Compostos 5 e 6

[0066] Uma mistura de ditioéster C (1,32 g, 2,78 mmols) e NaH (60% em óleo mineral, 0,114 g, 2,86 mmols) em 30 mL de DMF anidra foi agitada sob argônio em temperatura ambiente durante 4 horas. O composto E (1,014 g, 3,61 mmols) foi então adicionado a 10 mL de DMF. A mistura foi agitada durante a noite, após o que DMF foi removida a vácuo. O resíduo foi lavado três vezes com 20 mL de éter obtendo 2,10 g de F.

[0067] O composto F (2,25 g) foi dissolvido em uma mistura de 15 mL de NH3 a 7 N em MeOH e 10 mL de 28% de solução de amônia aquosa. Após 3 dias de agitação, os solventes foram removidos sob vácuo. O resíduo foi lavado com éter (3 x 50 mL) e recristalizado com H2O/2-propanol, obtendo 1,20 g de 5.

[0068] A uma suspensão de 5 (0,300 g, 0,563 mmol) em 9,0 mL de DMF seca foi adicionado 1,20 mL de trietilamina. A mistura foi agitada durante 5 min, obtendo uma solução levemente turva. A essa foi adicionado éster NHS 6-maleimido-hexanoico (G 0,260 g, 0,843 mmol). Uma solução transparente foi originada em 5 min. Após 16 h, a DMF foi removida sob vácuo. O resíduo foi lavado com éter (4 x 30 mL), então dissolvido em MeOH (2 mL) e precipitado com éter (50 mL). Um rendimento de 0,400 g de 6 foi obtido como um sólido tipo espuma amarelado. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ 1,26 (t, 11H), 1,49-1,58 (m, 6H), 1,90 (p, 2H), 2,08 (t, 2H), 2,68 (m, 4H), 2,80 (t, 2H), 3,00 (t, 2H), 3,15 (q, 6H), 3,42 (t, 2H), 5,28 (s, 2H), 6,73 (s, 2H), 6,85 (d, 2H), 6,96 (m, 2H), 7,07 (m, 4H), 7,18-7,25 (m, 3H), 7,83 (m, 2H) ppm. Exemplo 5: Compostos de Marcação Adicionais 7 a 12

[0069] A preparação de outros compostos de marcação exemplifi- cativos listados abaixo foi descrita na Patente U.S. 6.858.733.

Exemplo 6: Preparação de Anticorpo marcado por Acridan

[0070] O composto de marcação acridan 3 do exemplo 3 foi usado para marcar IgG de ovelha anticamundongo (H + L) (Jackson Immunoresearch). Uma solução de 0,24 mg do anticorpo em e tampão borato a 0,1 M, pH 8,25 e composto 3 em DMF (10:1 razão molar 3:anticorpo) em um volume de 500 μL foi reagida durante 15 min em temperatura ambiente e então a 4oC durante a noite. A solução foi passada através de uma coluna de dessalinização (BioRad) eluída com tampão PBS para remover o marcador não-ligado. O anticorpo marcado juntamente com qualquer anticorpo não-reagido foi obtido ao coletar frações de 500 μL.

[0071] As frações foram testadas em termos de quantidade de an ticorpo marcado por um ensaio quimioluminescente. Uma alíquota de 1 ou 10 μL foi misturada com 50 μL de HCL a 0,4 M +3,6% de peróxi- do de ureia, seguida por injeção de 50 μL NaOH a 0,5 M em um tubo em um luminômetro Turner Designs TD-20e. A intensidade integrada total da explosão de luminescência foi medida a partir do tempo de injeção. Aquelas frações que mostram quimioluminescência foram mantidas. A fração 8 continha a quantidade máxima de produto. Exemplo 7: Preparação de BSA marcada por Acridan

[0072] O composto de marcação acridan 3 do exemplo 3 foi usado para marcar a albumina de soro bovino (BSA). Uma solução de 0,1 g de BSA em 500 μL de tampão borato a 0,1 M, pH 8,25 e 42 μL de 23,4 mg de composto 3/100 μL de DMF (10:1 razão molar 3:BSA) foi reagi- da durante 15 min em temperatura ambiente e então a 4oC durante a noite. A solução foi passada através de uma coluna de dessalinização (BioRad) eluída com tampão PBS para remover marcador não-ligado. A BSA marcada juntamente com qualquer BSA não-reagida foi obtida ao coletar frações de 500 μL.

[0073] As frações foram testadas em termos de quantidade de BSA marcada pelo ensaio quimioluminescente no exemplo 6. Aquelas frações que mostram quimioluminescência foram mantidas. A fração 7 continha a quantidade máxima de produto. Exemplo 8: Preparação de Micropoços Funcionalizados por Acridan

[0074] As microplacas brancas de poliestireno de 96 poços funcio- nalizadas com grupos ácido carboxílico (Biosystems) são acopladas com o Composto 5 utilizando EDC como agente de acoplamento. Uma solução de estoque do Composto 5 em uma solução 70:30 (v/v) de DMF e tampão MÊS 0,1 M, pH 4 é preparada. Uma alíquota de 0,2 mL foi adicionada a cada poço da placa que foi anteriormente lavado em tampão MES. EDC em tampão MES é adicionado e a mistura reagida durante a noite. O sobrenadante é removido e os poços lavados de maneira sequencial 2 x com água e 6 x com metanol. Exemplo 9: Preparação de Micropartículas de Poli(metacrilato) marcadas com Acridan.

[0075] A resina Amberlite (IRP-64, 100-400 malha, 2,50 g) foi rea gida com SOCl2 em refluxo durante quatro horas. A reação foi resfriada e os voláteis removidos sob vácuo. As microesferas foram então suspensas em 50 mL de CH2Cl2 as quais foram adicionados 17,0 mL de trietilamina seguido por 15,0 mL de etilenodiamina. A mistura foi agitada sob Ar durante a noite. As partículas foram dispersas pela adição de 100 mL de MeOH e então filtradas. As partículas filtradas foram lavadas com MeOH e CH2Cl2, e então secas ao ar. As partículas resultantes pesam 2,80 g para um teor de NH2 calculado de 2,86 mmol/g.

[0076] As partículas modificadas por etilenodiamina, (100 mg) em 10 mL de DMF anidra, foram agitadas sob Ar com 10 mg do Composto 2 em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi filtrada e as partículas lavadas com MeOH. Após a secagem ao ar, as partículas funcionalizadas recuperadas passaram a pesar 102 mg.

[0077] Em um método alternativo, 2,50 g de resina Amberlite fo ram convertidos na forma de cloreto ácido pela reação com SOCl2 como mostrado acima, e então reagidos com 4,32 g de N- hidroxissuccinimida em 50 mL de THF e 6,8 mL de trietilamina para preparar as partículas funcionalizadas de éster NHS. Essas foram reagidas com o Composto 5 que contém um grupo NH2 terminal livre para realizar o acoplamento. Exemplo 10: Conjugação de Micropartículas Marcadas por Acridan com Anticorpo

[0078] Uma quantidade de 20 mg das partículas Amberlite marca das por Acridan, contendo grupos NH2 terminais não-reagidos, foi adicionalmente reagida com 102 mg de octanodioato de dissuccinimidila, (~ 5 eq.) em 100 mL de DMF anidra durante 15 min em temperatura ambiente. As partículas foram separadas por centrifugação e lavadas com 10 x 1 mL de DMF. O éster NHS livre resultante foi acoplado ao IgG de ovelha anticamundongo (0,5 mL de uma solução de estoque de 1,8 mg/mL) em tampão borato a 0,1 M, pH 8,5, EDTA a 2 mM durante a noite a 4oC. A mistura de reação foi centrifugada em 13k rpm e o so- brenadante removido. As partículas foram lavadas diversas vezes sobre uma coluna de centrifugação com PBS + 0,05% de Tween-20.

[0079] As partículas marcadas por anticorpo resultantes foram bloqueadas com BSA por incubação em 1,0 mL de tampão de bloqueio (1 % de BSA, 1 % de sacarose em 1X PBS) a 37oC durante 1 hora. As partículas foram lavadas com tampão de lavagem Tween- PBS e armazenadas em 1,0 mL de 1X PBS. Exemplo 11: Preparação de Micropartículas Magnéticas Marcadas por Acridan

[0080] Uma solução de estoque de 4 mg do Composto 5 em uma solução de 0,7 mL de DMF e 0,3 mL de tampão MES a 0,1 M, pH 4 foi preparada. Uma alíquota de 0,1 mL foi adicionada a 50 mg de partículas de poliestireno carboxiladas (ácido carboxílico Dynal Dynabeads M-270), que foram lavadas em tampão MES. A mistura foi diluída com 0,67 mL de tampão MES e 0,23 mL de DMF. EDC (23 mg) foi adicionado e a mistura agitada durante a noite. O sobrenadante foi removido e as partículas lavadas de maneira sequencial com 2 x 1 mL de água e 6 x 1 mL de MeOH e ressuspenso em 1 mL de MeOH.

[0081] As partículas foram testadas para incorporação de marca dor. Uma alíquota de 10 μL (contendo cerca de 0,5 mg) foi adicionada a 0,5 mL de água para preparar um estoque de 1 mg/mL. Uma alíquota de 100 μL foi reagida com um excesso de HRP durante 5 min. As partículas foram lavadas com 4 x 1 mL de água e então suspensas em 1 mL de água. A solução ativadora (10 μL) contendo de tris a 25 mM, pH 8,0, ácido p-hidroxicinâmico a 8 mM, EDTA a 1 mM, 0,2% de Tween-20 e peróxido de ureia a 0,1 M foi injetado e o flash de quimio- luminescência registrado em um luminômetro. Um sinal de 6040 RLU foi observado comparado com um ensaio em branco de 18 RLU.

[0082] Uma parte de 5 mg de partículas foi lavada com 2 x 200 μL de tampão MES a 0,1 M, pH 4 e então ressuspensa em 117 μL de tampão MES. IgG de ovelha anticamundongo (0,15 mg de uma solução de estoque 1,8 mg/mL) foi adicionada às partículas e a mistura foi agitada durante 30 minutos. EDC, 5 mg, foi adicionado e a mistura agitada durante 4 horas. O sobrenadante foi removido e as microesferas foram lavadas com 3 x 500 μL de tampão de lavagem (PBS + 0,05% de Tween-20). As partículas foram ressuspensas em 500 μL de tampão de bloqueio (PBS + 1% de BSA + 1% de sacarose) e 5 mg de EDC, agitadas durante 15 min em temperatura ambiente e agitadas a 4oC durante a noite. O sobrenadante foi removido e as partículas lavadas com 2 x 500 μL de tampão de lavagem e ressuspensas em 1 mL de PBS. Exemplo 12: Imunoensaio de Microplaca Utilizando Anticorpo de Captura Marcado

[0083] A fração contendo produto da preparação de anticorpo marcado no exemplo 6 foi diluída 1:100 em tampão PBS. Uma alíquota de 50 μL foi adicionada a cada um dos 26 poços de uma placa branca de poliestireno de 96 poços. A placa foi agitada durante 5 minutos em temperatura ambiente sobre um agitador orbital. A solução foi removida e os poços lavados três vezes com 1X PBS+0,05% de Tween-20, removendo todo o tampão de lavagem após cada etapa.

[0084] Um conjugado F(ab1)2-HRP de IgG de ovelha anticamun- dongo (Jackson Immunoresearch) foi diluído 1:1,2 x 106 em um tampão conjugado que compreende 2,5% de BSA e 1% de sacarose em 1X PBS. Alternativamente, o conjugado também pode ser diluído em outras matrizes, tal como, FBS. As alíquotas de conjugado diluído foram dispensadas nos 26 poços. Os padrões de IgG que contêm de 100 ng/mL a 0,048 ng/mL foram preparados por diluição 2 vezes juntamente com uma solução de 0 ng/mL em solução de conjugado F(ab1)2-HRP anti-IgG. Os padrões e zero foram dispensados em poços atingindo um volume final de 50 μL/poço. A placa foi incubada 1 h em temperatura ambiente sobre o agitador de placa.

[0085] Uma solução ativadora foi preparada contendo de tris a 25 mM, pH 8,0, ácido p-hidróxi-cinâmico a 8 mM, EDTA a 1 mM, 0,2% de Tween-20 e peróxido de ureia a 0,1 M.

[0086] A placa foi transferida para um luminômetro de placa Lumi- noskan. Sem a remoção da solução de conjugado, a luminescência foi gerada ao injetar de maneira sequencial 100 μL de solução ativadora, e através da leitura da intensidade integrada em cada poço durante 5 segundos. Um gráfico do ensaio resultante é mostrado na figura 1. O ensaio permitiu a quantificação ao longo de toda a faixa testada com o calibrador mais baixo excedendo o sinal dos desvios de padrão zero + 2 do zero. Exemplo 13: Imunoensaio de Microplaca Utilizando Anticorpo de Captura Não-marcado e BSA Marcado.

[0087] Uma alíquota de 50 μL de IgG de ovelha anticamundongo não-marcado (H + L) 40 μg/mL de 1X PBS foi adicionada para cobrir cada um dos 26 poços de uma placa branca de poliestireno de 96 poços. A placa foi agitada durante 5 minutos em temperatura ambiente sobre um agitador orbital. A solução foi removida e os poços lavados três vezes com 1X PBS+0,05% de Tween-20, removendo todo o tampão de lavagem após cada etapa.

[0088] A fração contendo produto da preparação de BSA marcada no exemplo 7 foi diluída em 50 μL/mL em tampão PBS + 1% de sacarose. Uma alíquota de 100 μL foi adicionada a cada um dos 26 poços de uma placa branca de poliestireno de 96 poços. A placa foi mantida durante 1 h a 37oC. A solução foi removida e os poços lavados três vezes com PBS+0,05% de Tween-20, removendo todo o tampão de lavagem após cada etapa.

[0089] O conjugado F(ab1)2-HRP de IgG de ovelha anticamundon- go foi diluído 1:1,2 x 106 em um tampão conjugado que compreende 1% de BSA e 1% de sacarose em 1X PBS. As alíquotas de conjugado diluído foram dispensadas nos 26 poços. Os padrões de IgG contendo de 100 ng/mL - 0,048 ng/mL foram preparados por diluição, 2 vezes, juntamente com uma solução de 0 ng/mL em solução de conjugado F(ab1)2-HRP anti-IgG. Os padrões e zero foram dispensados em poços atingindo um volume final de 50 μL/poço. A placa foi incubada 1 h em temperatura ambiente sobre o agitador de placa.

[0090] A placa foi transferida para um luminômetro de placa Lumi- noskan. Sem a remoção da solução de conjugado, a luminescência foi gerada ao injetar de maneira sequencial 100 μL de solução ativadora, e através da leitura da intensidade integrada em cada poço durante 5 segundos. Um gráfico do ensaio resultante é mostrado na figura 2. O ensaio permitiu a quantificação ao longo de toda a faixa testada com o calibrador mais baixo excedendo o sinal dos desvios de padrão zero + 2 do zero. Exemplo 14: Imunoensaio de Micropartícula utilizando Micropartículas Magnéticas Marcadas

[0091] Obter 50 μg/reação de micropartículas magnéticas comar- cadas por anticorpo e acridan do exemplo 11. As partículas foram lavadas três vezes com 1X PBS+0,05% de Tween-20 e ressuspensas em conjugado F(ab1)2-HRP de IgG de ovelha anticamundongo diluído 1:1,2 x 106 em tampão 1X PBS contendo 1% de BSA e 1% de sacarose. A suspensão de partícula foi dispensada em 26 poços de uma placa branca de poliestireno de 96 poços. Os padrões de IgG em solução de conjugado F(ab1)2-HRP de IgG de ovelha anticamundongo foram preparados por diluição em série, 2 vezes, para resultar em concentrações finais de 100 ng/mL - 0,048 ng/mL ou 0 ng/mL nos poços. Os respectivos padrões e zero foram dispensados em poços para formar um volume de reação final de 50 μL/poço. A placa foi inc ubada durante 1 h em temperatura ambiente sobre um agitador de placa.

[0092] A placa foi transferida para um luminômetro de placa Lumi- noskan. Sem a remoção da solução de conjugado, a luminescência foi gerada ao injetar de maneira sequencial 100 μL de solução ativadora, e através da leitura da intensidade integrada em cada poço durante 5 segundos. Um gráfico do ensaio resultante permitiu a quantificação de IgG. Exemplo 15: Imunoensaio de Micropartícula utilizando Micropartículas Amberlite Marcadas

[0093] Obter 100 μg/reação de micropartículas Amberlite comar- cadas por anticorpo e acridan do exemplo 10. As partículas foram lavadas três vezes com 1X PBS+0,05% de Tween-20 e ressuspensas em conjugado F(ab1)2-HRP de IgG de ovelha anticamundongo diluído 1:1,2 x 106 em tampão 1X PBS contendo 1% de BSA e 1% de sacarose. A suspensão de partícula foi dispensada em 26 poços de uma placa branca de poliestireno de 96 poços. Os padrões de IgG em solução de conjugado F(ab1)2-HRP de IgG de ovelha anticamundongo foram preparados por diluição em série, 2 vezes, para resultar em concentrações finais de 100 ng/mL - 0,048 ng/mL ou 0 ng/mL nos poços. Os respectivos padrões e zero foram dispensados em poços para formar um volume de reação final de 50 μL/poço. A placa foi incubada durante 1 h em temperatura ambiente sobre um agitador de placa.

[0094] A placa foi transferida para um luminômetro de placa Lumi- noskan. Sem a remoção da solução de conjugado, a luminescência foi gerada ao injetar de maneira sequencial 100 μL de solução ativadora, e através da leitura da intensidade integrada em cada poço durante 5 segundos. Um gráfico do ensaio resultante permitiu a quantificação de IgG. Exemplo 16: Preparação de Micropartículas Modificadas por Carboxila Marcadas por Acridan.

[0095] As micropartículas de poliestireno modificadas por ácido carboxílico de 1 μm (Seradyn) que possuem um carregamento de car- boxila de 0,0282 meq/g foram conjugadas com o Composto 5 por acoplamento de EDC de acordo com o procedimento descrito no exemplo 11. Uma porção de partículas de 52,5 mg (1,48 μmol de COOH) foi tratada com 0,39 mg de 5 (0,74 μmol) para garantir a permanência dos grupos COOH não-reagidos. Os grupos COOH livres foram acoplados a IgG de ovelha anticamundongo (1,48 μmol) por acoplamento de EDC em tampão MES pH 4. O anticorpo não-reagido foi removido por lavagem com tampão Tween-PBS utilizando uma coluna de centrifugação.

Claims

1. Método para detectar um analito em uma amostra em um procedimento de ensaio, caracterizado pelo fato de que compreende: a) proporcionar uma amostra que contém ou suspeita-se que contenha o analito e um suporte sólido que foi imobilizado em: 1) um composto quimioluminescente, e 2) um primeiro parceiro de ligação específica para o analito; b) contatar a amostra e o suporte sólido para permitir que o analito se ligue ao parceiro de ligação específica imobilizado do anali- to; c) proporcionar um excesso de um conjugado de composto ativador que compreende um conjugado de composto ativador com um segundo parceiro de ligação específica do analito ou com o analito; d) permitir que o conjugado de composto ativador seja submetido a uma reação de pares de ligação específica, desse modo, permitindo que uma primeira parte do conjugado de composto ativador entre em proximidade com o composto quimioluminescente imobilizado, em que uma segunda parte do conjugado de composto ativador não seja submetida a uma reação de pares de ligação específica e não entre em proximidade com o composto quimioluminescente imobilizado, e em que a parte do conjugado de composto ativador em proximidade ao composto quimioluminescente imobilizado ativa uma parte do composto quimioluminescente imobilizado; e) proporcionar, como uma solução ativadora, uma solução aquosa compreendendo um composto de peróxido para provocar um estado alterado da enzima peroxidase, em que o estado alterado da enzima peroxidase reage com o composto quimioluminescente imobilizado, e produz quimioluminescência da parte ativada do composto quimioluminescente; f) detectar a quimioluminescência produzida; e g) relacionar a quimioluminescência produzida com a presença, local, ou quantidade do analito na amostra.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto ativador é selecionado a partir de pelo menos sais de metal de transição e complexos, enzimas peroxidase, e enzimas que contêm metal de transição, em que o metal de transição é selecionado a partir de pelo menos ferro, cobre, cobalto, zinco, manganês e cromo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é selecionado a partir de placas de micropoços, tubos de teste, frascos de amostra, esferas de plástico, tiras de teste de celulose, tiras de teste de papel, tiras de teste de plástico, partículas de látex, partículas poliméricas, partículas de sílica, partículas magnéticas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é capaz de ser oxidado para produzir quimioluminescência na presença do ativador e uma solução ativadora, e compreende uma porção quimioluminescen- te e uma porção de ligação que liga a porção quimioluminescente ao suporte sólido, em que a porção quimioluminescente é selecionada a partir de luminol, isoluminol, aminobutil-etilisoluminol, amino- hexiletilisoluminol, hidrazida do ácido 7-dimetilaminonaftaleno-1,2- dicarboxílico, hidrazida do ácido antraceno-2,3-dicarboxílico, hidrazida do ácido fenatreno-1,2-dicarboxílico, hidrazida do ácido pirenodicarbo- xílico, 5-hidroxiftalidrazida, 6-hidroxiftalidrazida, ésteres de acridan, tioésteres de acridan, sulfonamidas de acridan, e grupos da fórmula I:

em que R1, R2 e R3 são grupos orgânicos que contêm de 1 a 50 átomos de não-hidrogênio, e cada R4 - R11 é hidrogênio ou um substituinte não-interferente, em que pelo menos um dos grupos R1 - R11 compreende a porção de ligação.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é covalentemente ligado ao suporte sólido.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é covalentemente ligado a uma substância auxiliar que está imobilizada sobre o suporte sólido.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é covalentemente ligado a um elemento do par de ligação específica que está imobilizado sobre o suporte sólido.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um imunoensaio.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio é um imunoensaio "sanduíche".

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio de hibridização de ácido nuclei- co, em que o analito é um ácido nucleico alvo e em que o primeiro parceiro de ligação específica é um ácido nucleico complementar a uma primeira região do alvo, e em que o conjugado de composto ati- vador é um conjugado de composto ativador a um ácido nucleico que é complementar a uma segunda região do alvo.

11. Método para detectar um analito em uma amostra em um procedimento de ensaio, caracterizado pelo fato de que compreende: a) proporcionar uma amostra que contém ou suspeita-se que contenha o analito e um suporte sólido que foi imobilizado em: 1) um composto quimioluminescente que compreende uma porção quimioluminescente e uma porção de ligação que liga a porção quimioluminescente ao suporte sólido, em que a porção quimiolumi- nescente é de fórmula I:

em que R1, R2 e R3 são grupos orgânicos que contêm de 1 a 50 átomos de não-hidrogênio, e cada R4 - R11 é hidrogênio ou um substituinte não-interferente, em que pelo menos um dos grupos R1 - R11 compreende a porção de ligação, e 2) um primeiro parceiro de ligação específica para o analito; b) contatar a amostra e o suporte sólido para permitir que o analito se ligue ao parceiro de ligação específica imobilizado para o analito; c) proporcionar um excesso de um conjugado de composto ativador que compreende um conjugado de composto ativador tanto a um segundo parceiro de ligação específica do analito como ao analito; d) permitir que o conjugado de composto ativador seja submetido a uma reação de pares de ligação específica, desse modo, permitir que uma primeira parte do conjugado de composto ativador entre em proximidade com o composto quimioluminescente imobilizado, em que uma segunda parte do conjugado de composto ativador não seja submetida a uma reação de pares de ligação específica e não entre em proximidade com o composto quimioluminescente imobilizado, e em que a parte do conjugado de composto ativador em proximidade ao composto quimioluminescente imobilizado ativa uma parte do composto quimioluminescente imobilizado; e) sem remover a segunda parte do composto ativador conjugado, proporcionar uma solução ativadora para produzir quimiolumi- nescência a partir da parte ativada do composto quimioluminescente, em que a solução ativadora é uma solução aquosa que compreende um composto peróxido para provocar um estado alterado da enzima peroxidase, em que o estado alterado da enzima peroxidase reage com o composto quimioluminescente imobilizado, e produz quimiolu- minescência da parte ativada do composto quimioluminescente; f) detectar a quimioluminescência produzida; e g) relacionar a quimioluminescência produzida com a presença, local, ou quantidade do analito na amostra.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o composto ativador é selecionado a partir de pelo menos sais de metal de transição e complexos, enzimas peroxidase, e enzimas que contêm metal de transição, em que o metal de transição é selecionado a partir de pelo menos ferro, cobre, cobalto, zinco, manganês e cromo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é selecionado a partir de placas de micropoços, tubos de teste, frascos de amostra, esferas de plástico, tiras de teste de celulose, tiras de teste de papel, tiras de teste de plástico, partículas de látex, partículas poliméricas, partículas de sílica, partículas magnéticas.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é capaz de ser oxidado para produzir quimioluminescência na presença do ativador e uma solução ativadora, e compreende uma porção quimioluminescen- te e uma porção de ligação que liga a porção quimioluminescente ao suporte sólido, em que a porção quimioluminescente é selecionada a partir de luminol, isoluminol, aminobutil-etilisoluminol, amino- hexiletilisoluminol, hidrazida do ácido 7-dimetilaminonaftaleno-1,2- dicarboxílico, hidrazida do ácido antraceno-2,3-dicarboxílico, hidrazida do ácido fenatreno-1,2-dicarboxílico, hidrazida do ácido pirenodicarbo- xílico, 5-hidroxiftalidrazida, 6-hidroxiftalidrazida, ésteres de acridan, tioésteres de acridan, sulfonamidas de acridan, e grupos da fórmula I:

15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é covalentemente ligado ao suporte sólido.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é covalentemente ligado a uma substância auxiliar que está imobilizada sobre o suporte sólido.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é covalentemente ligado a um elemento do par de ligação específica que está imobilizado sobre o suporte sólido.

18. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um imunoensaio.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio é um imunoensaio "sanduíche".

20. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que o ensaio é um ensaio de hibridização de ácido nu- cleico, em que o analito é um ácido nucleico alvo, e em que o primeiro parceiro de ligação específica é um ácido nucleico complementar a uma primeira região do alvo, e em que o conjugado de composto ati- vador é um conjugado de composto ativador a um ácido nucleico que é complementar a uma segunda região do alvo.

21. Método para detectar um analito em uma amostra em um procedimento de ensaio, caracterizado pelo fato de que compreende: a) proporcionar uma amostra que contém ou suspeita-se que contenha o analito e um suporte sólido quimioluminescente marcado que foi imobilizado em: 1) um composto quimioluminescente, e 2) um primeiro parceiro de ligação específica do analito, em que o suporte sólido quimioluminescente marcado é preparado ao reagir um suporte sólido com um composto da formula II:

em que M é um íon de metal alcalino; b) contatar a amostra e o suporte sólido quimioluminescen- te marcado para permitir que o analito se ligue ao parceiro de ligação específica imobilizado do analito; c) proporcionar um excesso de conjugado de composto ati- vador que compreende uma peroxidase conjugada a um segundo parceiro de ligação específica do analito ou ao analito; d) permitir que o conjugado de composto ativador seja submetido a uma reação de pares de ligação específica, desse modo, permitir que uma primeira parte do conjugado de composto ativador entre em proximidade com o composto quimioluminescente imobilizado, em que uma segunda parte do conjugado de composto ativador não seja submetida a uma reação de pares de ligação específica e não entre em proximidade com o composto quimioluminescente imobilizado, e em que a parte do conjugado de composto ativador em proximidade ao composto quimioluminescente imobilizado ativa uma parte do composto quimioluminescente imobilizado; e) sem remover a segunda parte do composto ativador conjugado, proporcionar uma solução ativadora para produzir quimiolumi- nescência a partir da parte ativada do composto quimioluminescente, em que a solução ativadora é uma solução aquosa que compreende um composto peróxido para provocar um estado alterado da enzima peroxidase, em que o estado alterado da enzima peroxidase reage com o composto quimioluminescente imobilizado, e produz quimiolu- minescência da parte ativada do composto quimioluminescente, e em que o composto quimioluminescente é covalentemente ligado ao suporte sólido ou covalentemente ligado a uma substância auxiliar que está imobilizada sobre o suporte sólido; f) detectar a quimioluminescência produzida; e g) relacionar a quimioluminescência produzida com a presença, local, ou quantidade do analito na amostra.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto ativador é selecionado a partir de pelo menos sais de metal de transição e complexos, enzimas peroxidase, e enzimas que contêm metal de transição, em que o metal de transição é selecionado a partir de pelo menos ferro, cobre, cobalto, zinco, manganês e cromo.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do pelo fato de que o suporte sólido é selecionado a partir de placas de micropoços, tubos de teste, frascos de amostra, esferas de plástico, tiras de teste de celulose, tiras de teste de papel, tiras de teste de plás-tico, partículas de látex, partículas poliméricas, partículas de sílica, partículas magnéticas.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é capaz de ser oxidado para produzir quimioluminescência na presença do ativador e uma solução ativadora, e compreende uma porção quimioluminescen- te e uma porção de ligação que liga a porção quimioluminescente ao suporte sólido, em que a porção quimioluminescente é selecionada entre luminol, isoluminol, aminobutil-etilisoluminol, amino- hexiletilisoluminol, hidrazida do ácido 7-dimetilaminonaftaleno-1,2- dicarboxílico, hidrazida do ácido antraceno-2,3-dicarboxílico, hidrazida do ácido fenatreno-1,2-dicarboxílico, hidrazida do ácido pirenodicarbo- xílico, 5-hidroxiftalidrazida, 6-hidroxiftalidrazida, ésteres de acridan, tioésteres de acridan, sulfonamidas de acridan, e grupos da fórmula I:

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto quimioluminescente é covalentemente ligado a um elemento do par de ligação específica que está imobilizado sobre o suporte sólido.

26. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um imunoensaio.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio é um imunoensaio "sanduíche".

28. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o ensaio é um ensaio de hibridização de ácido nu- cleico em que o analito é um ácido nucleico alvo, e em que o primeiro parceiro de ligação específica é um ácido nucleico complementar a uma primeira região do alvo e em que o conjugado de composto ativa- dor é um conjugado de composto ativador com um ácido nucleico que é complementar a uma segunda região do alvo.