JP5408905B2 - 抗体又は抗原の定量方法 - Google Patents
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Description
測定対象となる試料は、血液(特に血清)、尿、唾液、髄液などの体液である。
また、鉄錯体を高分子で被覆した従来の磁気ビーズと比較して、構造が簡単でありコストも安い。
ビオチン−アビジン反応による生体分子の固定化の例としては、例えば、鉄サレン錯体のAの部位にアビジンを固定化し、ビオチン化した抗体を、ビオチン−アビジン反応によりアビジンを介して鉄サレン錯体に固定することができる。
このように、抗体抗原反応によって磁性粒子固相に結合した抗原(または抗体)と未結合の遊離した抗原(または抗体)とを分離し、また、抗原抗体複合体に結合した標識抗体(または標識抗原)と未結合の遊離した標識抗体(または標識抗原)とを分離することにより、測定の精度をさらに高めることができる。
図1(a)に示すように、磁性粒子固相1の表面には、抗体がビオチン−アビジン反応により固定され、固相抗体2を形成している。
磁性粒子固相1としては、例えば、酸化鉄の一種であるマグネタイト微粒子で作られた磁性粒子が用いられる。
B/F分離後は、図1(c)に示すように、結合型抗原5のみが反応容器中に残ることになる。
標識酵素としては、例えば、HRP、すなわち、西洋ワサビペルオキシターゼが好ましい。
標識酵素7で標識された標識抗体6を反応容器に添加し、磁性粒子固相1と一定時間反応させると、標識抗体6は、結合型抗原5を固相抗体2との間でサンドイッチ状にはさんで、標識抗体−抗原−抗体複合体8を形成する。
このとき、固相抗体2に結合した結合型抗原5を十分に標識化するために、過剰量の標識抗体6を添加する。したがって、結合型抗原5と標識抗体6の抗体抗原反応によって結合型抗原5の標識化を行った後には、抗原に結合した標識抗体9と抗原に結合しなかった余分の遊離型の標識抗体6とを分ける操作、すなわちB/F分離を再び行う必要がある。
図2(a)に正面図を、図2(b)に側面図を示すように、B/F分離装置は、分離容器13の側壁外側のA位置に磁石14を配置し、分離容器13内の磁性粒子固相12に磁界を与えて磁化し、磁性粒子固相12を磁気的に吸引して、分離容器13の内壁側面に集合保持させる。
そこへ給排水ノズル15を分離容器13内に挿入して、遊離した抗原(または抗体)を含んだ溶液を吸引除去する。
次に、磁石14をB位置に遠ざけ、新たな洗浄液を注入して、磁性粒子固相12を再懸濁して洗浄する。その後、再び、磁石14をA位置に戻して磁性粒子固相12を分離容器13の内壁側面に集合保持させ、洗浄液を吸引除去する。これを複数回繰り返しB/F分離を行う。
鉄サレン錯体の合成を、次のように行った。
得られた化合物は、シリカジェルを使ったフラッシュクロマトグラフィーを2回行うことで、10gのcompound 6(収率58%)が得られた。
得られた化合物はジエチルエーテルとパラフィンの溶液中で再結晶させ高速液化クロマトグラフィーで測定したところ純度95%以上のcomplex A(鉄サレン錯体)5.7g(収率62%)を得た。
得られたアビジンの化学式は以下の通りである。
その後 Biotin-X-ester試薬(Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany社製 D-Biotin-N-hydroxysuccinimide Product #732 494, または Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA社製 Biotin-X-NHS Ester, Cat.No. 5002-1/2)を使用してoligoのアミノ基に上記化学式で示されるアビジンをつけ、取り込まれないBiontin-X-esterを、NAP-10 Column (Pharmacia Biotech Europe, Brussels, Belgium, Product #170854-01/02)で除去した後、室温で一晩インキュベートした。
アビジンは、卵白中に存在する分子量約 68 kDa の塩基性糖タンパク質であり、低分子ビタミンであるビオチンに対してきわめて強い親和性(Affinity constant > 10 15 M -1 )を有する。
また、タンパク質には多数のビオチン分子が共有結合できるため、ビオチン標識タンパク質は複数のアビジンと結合することができる。また、ビオチン標識を温和な条件で行えば、タンパク質の生理活性が損なわれることを防止することができる。ビオチン標識抗体、レクチン、核酸プローブを用いれば、抗原、糖複合体、核酸の検出に極めて有用である。
2 固相抗体
3 抗原
4 抗体抗原複合体
5 結合型抗原
6 標識抗体
7 標識酵素
8 標識抗体−抗原−抗体複合体
9 標識抗体
10 発色色素
11 発色試薬
13 分離容器
14 磁石
15 給排水ノズル
Claims (1)
- 下記式(I)で示される鉄サレン錯体化合物を用いた抗体又は抗原の定量方法であって、
前記鉄サレン錯体化合物のAの部位にアビジン又はビオチンを結合させ得る工程と、
ビオチン化又はアビジン化させた抗原を、ビオチン−アビジン反応により前記鉄サレン錯体化合物に結合させたアビジン又はビオチンと反応させ、鉄サレン錯体化合物と一体化させた固相抗原とする工程と、
前記固相抗原を磁性粒子固相の表面に固定させ、磁性粒子固相に固定させた前記固相抗原に、抗体を含む試料を添加して抗体抗原反応により第1の抗体抗原複合体を得る工程と、
前記第1の抗体抗原複合体を磁場誘導により分離する工程と、
前記第1の抗体抗原複合体に標識抗原を添加して抗体抗原反応により第2の抗体抗原複合体を得る工程と、
前記第2の抗体抗原複合体を磁場誘導により分離し、前記第2の抗体抗原複合体における標識を検出する工程と、を含む抗体又は抗原の定量方法。
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