JP5408905B2

JP5408905B2 - 抗体又は抗原の定量方法

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Publication number: JP5408905B2
Application number: JP2008137888A
Authority: JP
Inventors: 義弘石川; 晴樹江口
Original assignee: IHI Corp
Current assignee: IHI Corp
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2028-05-27
Also published as: JP2009287949A

Description

本発明は、所定の鉄サレン錯体化合物を用いた抗体又は抗原の定量方法に関する。

酵素免疫測定法（Enzyme immunoassay法、EIA法）は、鍵と鍵穴に例えられる特異的な抗体抗原反応を利用して、生体内の特定の抗原又は抗体を定量する免疫測定法の一つである。EIA法は、検出感度が極めて高いため、癌マーカー、各種感染症の抗原、ホルモン等、生体内に微量に存在する物質の定量に幅広く利用されている。
測定対象となる試料は、血液（特に血清）、尿、唾液、髄液などの体液である。

従来の抗体抗原反応を利用した抗体又は抗原の定量方法には、マグナビート社製 Therma-MaxやＪＳＲ社製IMMUTEX-MAG等の磁気ビーズ（磁性固相）を用いたものが知られているが、これらは、マグネタイトを高分子で被覆した微粒子を形成しているため、マグネタイトと高分子の親和性が悪くなった場合、磁気ビーズに結合した抗原が脱落してしまうという問題がある。
特開平７−１８１１８８号公報特開平８−６２２２４号公報特開平８−１７８９３１号公報特開平９−２１８２０１号公報特開平９−３２５１４８号公報特開平１０−９６７３２号公報特開平１０−１２３１３６号公報特開平１１−２６２６７８号公報特開平１１−３２６３３８号公報特開２００１−９１５２１号公報特表平１１−５０２６２５号公報特表２００１−５１０８９３号公報特表２００２−５２８７０５号公報特開２００２−５３１８１１号公報

そこで、本発明は、結合した抗体や抗原が脱落することなく、精度よく抗体抗原反応を確認できる、抗体又は抗原の定量方法を提供することを目的とする。

本発明は、（１）下記式（Ｉ）で示される鉄サレン錯体化合物を用いた抗体又は抗原の定量方法であって、Ａの部位にビオチン−アビジン反応により抗体又は抗原を結合させて固相抗体又は固相抗原とする工程と、抗原又は抗体を含む試料を添加して抗体抗原反応により第１の抗体抗原複合体を得る工程と、前記第１の抗体抗原複合体に標識抗体又は標識抗原を添加して抗体抗原反応により第２の抗体抗原複合体を得る工程と、前記第２の抗体抗原複合体における標識を検出する工程と、を含む抗体又は抗原の定量方法；
（２）下記式（Ｉ）で示される鉄サレン錯体化合物を用いた抗体又は抗原の定量方法であって、Ａの部位にビオチン−アビジン反応により抗体又は抗原を結合させて固相抗体又は固相抗原とする工程と、抗原又は抗体を含む試料を添加して抗体抗原反応により第１の抗体抗原複合体を得る工程と、前記第１の抗体抗原複合体を磁場誘導により分離する工程と、前記第１の抗体抗原複合体に標識抗体又は標識抗原を添加して抗体抗原反応により第２の抗体抗原複合体を得る工程と、前記第２の抗体抗原複合体を磁場誘導により分離し、前記第２の抗体抗原複合体における標識を検出する工程と、を含む抗体又は抗原の定量方法；
（３）下記式（Ｉ）で示される鉄サレン錯体化合物を用いたたんぱく質、核酸、又は糖複合体の定量方法であって、Ａの部位にビオチン−アビジン反応によりたんぱく質、核酸、又は糖複合体を結合させ第１の複合体を得る工程と、前記第１の複合体にアビジン、核酸プローブ、又はレクチンを添加して第２の複合体を得る工程と、前記第２の複合体における標識を検出する工程と、を含む定量方法；
を提供する。

本発明によれば、鉄サレン錯体化合物と抗体又は抗原とが一体となるため、抗体（抗原）に抗原（抗体）が結合した際に脱落なく精度よく抗体抗原反応を確認することができる。
また、鉄錯体を高分子で被覆した従来の磁気ビーズと比較して、構造が簡単でありコストも安い。

次に、本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。

本発明の抗体又は抗原の定量方法は、下記式（Ｉ）で示される鉄サレン錯体化合物を用いた抗体又は抗原の定量方法であって、Ａの部位にビオチン−アビジン反応により抗体又は抗原を結合させて固相抗体又は固相抗原とする工程と、抗原又は抗体を含む試料を添加して抗体抗原反応により第１の抗体抗原複合体を得る工程と、前記第１の抗体抗原複合体に標識抗体又は標識抗原を添加して抗体抗原反応により第２の抗体抗原複合体を得る工程と、前記第２の抗体抗原複合体における標識を検出する工程と、を含む。
このような定量方法とすることにより、抗体（抗原）に抗原（抗体）が結合した際に脱落なく精度よく抗体抗原反応を確認することができる。

前記Ａの部位に抗原又は抗体を結合させて固相抗原又は固相抗体とする工程は、ビオチン−アビジン反応による。
ビオチン−アビジン反応による生体分子の固定化の例としては、例えば、鉄サレン錯体のＡの部位にアビジンを固定化し、ビオチン化した抗体を、ビオチン−アビジン反応によりアビジンを介して鉄サレン錯体に固定することができる。

また、本発明の抗体又は抗原の定量方法は、下記式（Ｉ）で示される鉄サレン錯体化合物を用いた抗体又は抗原の定量方法であって、Ａの部位にビオチン−アビジン反応により抗体又は抗原を結合させて固相抗体又は固相抗原とする工程と、抗原又は抗体を含む試料を添加して抗体抗原反応により第１の抗体抗原複合体を得る工程と、前記第１の抗体抗原複合体を磁場誘導により分離する工程と、前記第１の抗体抗原複合体に標識抗体又は標識抗原を添加して抗体抗原反応により第２の抗体抗原複合体を得る工程と、前記第２の抗体抗原複合体を磁場誘導により分離し、前記第２の抗体抗原複合体における標識を検出する工程と、を含むことが好ましい。
このように、抗体抗原反応によって磁性粒子固相に結合した抗原（または抗体）と未結合の遊離した抗原（または抗体）とを分離し、また、抗原抗体複合体に結合した標識抗体（または標識抗原）と未結合の遊離した標識抗体（または標識抗原）とを分離することにより、測定の精度をさらに高めることができる。

次に、図１を参照して、本発明の定量方法の一例を説明する。
図1（ａ）に示すように、磁性粒子固相１の表面には、抗体がビオチン−アビジン反応により固定され、固相抗体２を形成している。
磁性粒子固相１としては、例えば、酸化鉄の一種であるマグネタイト微粒子で作られた磁性粒子が用いられる。

図１（ｂ）に示すように、測定対象である抗原３を含んだ試料を添加して、一定時間反応させると、抗原３は固相抗体２と抗体抗原反応を起こして、磁性粒子固相１の表面に結合し、抗体抗原複合体４を形成する。この状態の抗原を、結合型抗原５（Bound form、Bと略す）と呼び、磁性粒子固相１の洗浄によっても結合が切られることはない。一方、固相抗体２に対して未結合の抗原３は遊離型抗原（Free form、Fと略す）と呼ばれ、磁性粒子固相１を洗浄することによって容易に反応容器の中から取り除くことが出来る。この結合型抗原５と遊離型抗原３を洗浄によって分ける操作をB／F分離と呼ぶ。
B／F分離後は、図１（ｃ）に示すように、結合型抗原５のみが反応容器中に残ることになる。

次に、図１（ｄ）に示すように、抗体抗原複合体４を形成している結合型抗原５に対して、標識酵素７によって標識された標識抗体６を、抗体抗原反応で結合させ、結合型抗原５を酵素で標識する操作を行う。
標識酵素としては、例えば、HRP、すなわち、西洋ワサビペルオキシターゼが好ましい。
標識酵素７で標識された標識抗体６を反応容器に添加し、磁性粒子固相１と一定時間反応させると、標識抗体６は、結合型抗原５を固相抗体２との間でサンドイッチ状にはさんで、標識抗体−抗原−抗体複合体８を形成する。
このとき、固相抗体２に結合した結合型抗原５を十分に標識化するために、過剰量の標識抗体６を添加する。したがって、結合型抗原５と標識抗体６の抗体抗原反応によって結合型抗原５の標識化を行った後には、抗原に結合した標識抗体９と抗原に結合しなかった余分の遊離型の標識抗体６とを分ける操作、すなわちB／F分離を再び行う必要がある。

このB／F分離後は、図１（ｅ）に示すように、酵素によって標識化された標識抗体−抗原−抗体複合体８のみが磁性粒子固相１の表面に残ることになる。これは、磁性粒子固相１の表面に残った結合型抗原５の数だけ標識酵素７が残っていることを意味する。

磁性粒子固相１の表面に結合された標識酵素７の量は、図１（ｆ）に示すように、該酵素の基質となりえる発色色素（例えば、OPDA、すなわち、オルトフェニルレンジアミン）１０を加えて標識酵素７と反応させ、生成する発色後の発色試薬１１の量を測定することにより定量することができる。

なお、上記の例では、固相抗体２と標識抗体６を用いて抗原を定量する方法について説明をしたが、固相抗体２と標識抗体６の代わりに、固相抗原と標識抗原を用いて同様の操作を行えば、試料中の抗体を定量化することもできる。

以上に説明したように、抗体抗原反応によって磁性粒子固相に結合した抗原（または抗体）と未結合の遊離した抗原（または抗体）とを分離するB／F分離、および、抗原抗体複合体に結合した標識抗体（または標識抗原）と未結合の遊離した標識抗体（または標識抗原）とを分離するB／F分離、が測定の精度を決める重要な鍵となっている。

次に、図２を参照して、磁気分離固相法のＢ／Ｆ分離装置の構成を説明する。
図２（ａ）に正面図を、図２（ｂ）に側面図を示すように、Ｂ／Ｆ分離装置は、分離容器１３の側壁外側のＡ位置に磁石１４を配置し、分離容器１３内の磁性粒子固相１２に磁界を与えて磁化し、磁性粒子固相１２を磁気的に吸引して、分離容器１３の内壁側面に集合保持させる。
そこへ給排水ノズル１５を分離容器１３内に挿入して、遊離した抗原（または抗体）を含んだ溶液を吸引除去する。
次に、磁石１４をＢ位置に遠ざけ、新たな洗浄液を注入して、磁性粒子固相１２を再懸濁して洗浄する。その後、再び、磁石１４をＡ位置に戻して磁性粒子固相１２を分離容器１３の内壁側面に集合保持させ、洗浄液を吸引除去する。これを複数回繰り返しＢ／Ｆ分離を行う。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
鉄サレン錯体の合成を、次のように行った。

4-nitrophenol (25g, 0.18mol)、hexamethylene tetramine (25g, 0.18mol)、 polyphosphoric acid (200ml)の混合物を１時間１００℃で攪拌した。その後、その混合物を500mlの酢酸エチルと１Lの水の中に入れ、完全に溶解するまで攪拌した。さらにその溶液に400mlの酢酸エチルを追加で加えたところその溶液は２つの相に分離し、水の相を取り除き、残りの化合物を塩性溶剤で２回洗浄し、無水MgSO₄で乾燥させた結果、compound 2が１７ｇ（収率57%）合成できた。

compound 2 (17g, 0.10mol), acetic anhydride (200ml), H₂SO₄(少々)を室温で１時間攪拌させた。得られた溶液は、氷水（２L）の中に0.5時間混ぜ、加水分解を行った。得られた溶液をフィルターにかけ、大気中で乾燥させたところ白い粉末状のものが得られた。酢酸エチルを含む溶液を使ってその粉末を再結晶化させたところ、２４ｇのCompound 3（収率76%）の白い結晶を得ることができた。

compound 3 (24g, 77mmol)とメタノール(500ml)に10%のパラジウムを担持したカーボン(2.4g)の混合物を一晩 1.5気圧の水素還元雰囲気で還元した。終了後、フィルターでろ過したところ茶色油状のcompound 4 (21g)が合成できた。

無水ジクロメタン(DCM) (200ml)にcompound 4 (21g, 75mmol), di(tert-butyl) dicarbonate (18g, 82mmol)を窒素雰囲気で一晩攪拌した。得られた溶液を真空中で蒸発させた後、メタノール(100ml)で溶解させた。その後、水酸化ナトリウム(15g, 374mmol)と水(50ml)を加え、5時間還流させた。その後冷却し、フィルターでろ過し、水で洗浄後、真空中て乾燥させたところ茶色化合物がえられた。
得られた化合物は、シリカジェルを使ったフラッシュクロマトグラフィーを２回行うことで、10gのcompound 6（収率58%）が得られた。

無水エタノール400mlの中にcompound 6 (10g, 42mmol)を入れ、加熱しながら還流させ、無水エタノール20mlにエチレンジアミン(1.3g, 21mmol)を0.5時間攪拌しながら数滴加えた。そして、その混合溶液を氷の容器に入れて冷却し15分間かき混ぜた。その後、200mlのエタノールで洗浄しフィルターをかけ、真空で乾燥させたところcompound 7が8.5g （収率82%）で合成できた。

無水メタノール(50ml)の中にcompound 7 (8.2g, 16mmol)、triethylamine (22ml, 160mmol)をいれ、10mlメタノールの中にFeCl₃(2.7g, 16mmol)を加えた溶液を窒素雰囲気下で混合した。室温窒素雰囲気で１時間混合したところ茶色の化合物が得られた。その後、真空中で乾燥させた。得られた化合物はジクロロメタン400mlで希釈し、塩性溶液で２回洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空中で乾燥させたところcomplex Aが得られた。
得られた化合物はジエチルエーテルとパラフィンの溶液中で再結晶させ高速液化クロマトグラフィーで測定したところ純度95%以上のcomplex A(鉄サレン錯体)5.7g（収率62%）を得た。

得られた化合物は、Quantum Design社製 MPMSによるＳＱＵＩＤによる「磁場−磁化曲線」の測定により室温で強磁性であることを確認した。

その後、鉄サレン錯体化合物をアシル化、Et3N等の反応ステップを経ることにより、アビジンと連結させた。
得られたアビジンの化学式は以下の通りである。

上記に核酸を付ける場合は、最初にAminolink 2試薬（Applied Biosystems Division of the Perkin-Elmer Corp, CA, USA）を使用して5' amino-modified oligoを合成し、逆相HPLCで精製した。
その後 Biotin-X-ester試薬（Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany社製 D-Biotin-N-hydroxysuccinimide Product #732 494, または Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA社製 Biotin-X-NHS Ester, Cat.No. 5002-1/2）を使用してoligoのアミノ基に上記化学式で示されるアビジンをつけ、取り込まれないBiontin-X-esterを、NAP-10 Column （Pharmacia Biotech Europe, Brussels, Belgium, Product #170854-01/02）で除去した後、室温で一晩インキュベートした。

上記化学式で示されるアビジンは、biotin-X-NHS エステル（Clonetech Corp, Palo Alto, CA, USA）を用いて、たんぱく質（たとえば、卵白に含まれるたんぱく質であるアビジンなど）に含まれるアミノ酸（リジン基）などに結合させることが可能なため、たんぱく質の検出および精製が可能となる。
アビジンは、卵白中に存在する分子量約 68 kDa の塩基性糖タンパク質であり、低分子ビタミンであるビオチンに対してきわめて強い親和性（Affinity constant ＞ 10 15 M -1 ）を有する。
また、タンパク質には多数のビオチン分子が共有結合できるため、ビオチン標識タンパク質は複数のアビジンと結合することができる。また、ビオチン標識を温和な条件で行えば、タンパク質の生理活性が損なわれることを防止することができる。ビオチン標識抗体、レクチン、核酸プローブを用いれば、抗原、糖複合体、核酸の検出に極めて有用である。

酵素免疫測定の原理説明図である。磁気分離固相法のＢ／Ｆ分離装置の構成を示す（ａ）正面図及び（ｂ）側面図である。

符号の説明

１、１２磁性粒子固相
２固相抗体
３抗原
４抗体抗原複合体
５結合型抗原
６標識抗体
７標識酵素
８標識抗体−抗原−抗体複合体
９標識抗体
１０発色色素
１１発色試薬
１３分離容器
１４磁石
１５給排水ノズル

Claims

下記式（Ｉ）で示される鉄サレン錯体化合物を用いた抗体又は抗原の定量方法であって、
前記鉄サレン錯体化合物のＡの部位にアビジン又はビオチンを結合させ得る工程と、
ビオチン化又はアビジン化させた抗原を、ビオチン−アビジン反応により前記鉄サレン錯体化合物に結合させたアビジン又はビオチンと反応させ、鉄サレン錯体化合物と一体化させた固相抗原とする工程と、
前記固相抗原を磁性粒子固相の表面に固定させ、磁性粒子固相に固定させた前記固相抗原に、抗体を含む試料を添加して抗体抗原反応により第１の抗体抗原複合体を得る工程と、
前記第１の抗体抗原複合体を磁場誘導により分離する工程と、
前記第１の抗体抗原複合体に標識抗原を添加して抗体抗原反応により第２の抗体抗原複合体を得る工程と、
前記第２の抗体抗原複合体を磁場誘導により分離し、前記第２の抗体抗原複合体における標識を検出する工程と、を含む抗体又は抗原の定量方法。