JPH10505169A

JPH10505169A - 磁気的手段による試料内の分析物、特に細菌の、質的および／または量的な測定プロセスおよび装置

Info

Publication number: JPH10505169A
Application number: JP8528230A
Authority: JP
Inventors: ブルーノコリン，; アランテレツ，
Original assignee: ベーイーオーメリュー
Priority date: 1995-03-21
Filing date: 1996-03-20
Publication date: 1998-05-19
Also published as: DE69614205D1; ATE203826T1; WO1996029601A1; FR2732116A1; DE69614205T2; EP0760952A1; AU4888796A; US5925573A; CA2190981A1; FR2732116B1; EP0760952B1

Abstract

(57)【要約】分析物の測定のためのプロセスであって、それによって、i)試料を液相で提供し、ii)液相内に浮遊する磁性もしくは磁化可能な反応性金属粒子よりなり、各粒子がアンチリガンドを直接または間接に結合した金属コアを具備する少なくとも１つの試薬を提供し、iii)液相内に分析物と反応した反応性粒子の金属錯体の中間混合物を得るために試料と試薬とを接触させ、iv)その金属錯体を磁場を用いて分離し、v)錯体の金属塊を表す検知信号を得るために分離された磁性錯体を検知し、組み合わせにより、a)ステップ(iv)に従って、分離された金属錯体を電磁式センサの前方に配置することにより、該分離された金属錯体を検知し、b)ステップ(v)に従って、電磁式センサの前方に該電磁式センサにより検出され得る測定集塊を得るために、分離された金属錯体をさらに拘束することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】磁気的手段による試料内の分析物、特に細菌の、質的および／または量的な測定プロセスおよび装置この発明は、試料内に存在しがちな分析物の質的および／または量的な測定に関するものである。この発明によれば、「分析物の測定」という語句は、何らかの生化学的若しくは生物学的な物質、特に、例えば、細菌の細胞のような生きている物質の検知および／または分析を意味することを意図している。細菌の細胞の場合、量的な測定は、その細菌の細胞を数えることである。しかしながら、この発明によれば、測定されるべき分析物は、当該分析物が、一般に、測定されたアンチリガンド（anti-ligand）に明確に結びつく少なくとも１つの識別部位を有するリガンドよりなるという条件で、限定されることなく、抗原、ハプテン、抗体、ペプチド、核酸（ＤＮＡ）または（ＲＮＡ）の断片、酵素若しくは基質であってもよい。この発明において使用されているように、リガンドおよびアンチリガンドの語句は、以下の錯体、すなわち、抗原／抗体、抗体／ハプテン、ホルモン／受容体、蛋白質／抗体、ビオチン／ストレプタビジン、レクチン／糖、キレート剤／キレート分子、オリゴヌクレチド／オリゴヌクレチド混成物、オリゴヌクレチド／核酸混成物、または酵素／基質のようなリガンド／アンチリガンド錯体を形成することのできる生物学的若しくは生化学的分子をいう。リガンドが核酸断片であるときは、おそらくＲＮＡ断片もしくはＤＮＡ断片と同等であることは理解される。この発明によれば、「抗体」の語句は、単クローン抗体、多クローン抗体、抗体断片および遺伝子組み替えにより得られた抗体を意味することを意図している。特許出願ＥＰ−０３３９６２３号は、試料内の分析物の測定のためのプロセスを開示しかつ提案している。これによれば、 i) 前記分析物がアンチリガンドの明確な識別のための少なくとも１つの部位を有するリガンドよりなる前記試料が液相で提供され、 ii) 少なくとも１つのアンチリガンドが直接的または間接的に結びついた金属コアをそれぞれ有し、前記液相内に浮遊する超常磁性の反応性金属粒子を具備する少なくとも１つの試薬が与えられ、 iii) 前記試料および試薬が、液相内において、分析物と反応した反応性粒子の金属錯体と未反応の残留反応性粒子との中間混合物を得るために、特に定温放置によって接触させられ、 iv) 前記中間混合物内の金属錯体の識別された移動を、前記液相内において、かつ、前記未反応の残留反応性粒子からのそれらの物理的な分離を伴うことなく生じさせる磁気伝達(magnetophoresis)に、前記中間混合物をさらすために、前記中間混合物に磁場が供給され、 v) 前記錯体の存在および量を表し、初めから試料内に存在していた分析物の存在および／または量に関連する検知信号を得るために、前記磁場の方向に配置された前記中間混合物内の基準点において、光の回折により、金属錯体の存在が検知される。この刊行物ＥＰ−Ａ−０３３９６２３号に係るプロセスは、実際には、可干渉性の単色光源（レーザ）、回折光検知装置およびそれによって収集された光信号の処理が必要であるために特に複雑な金属錯体検出手段によらざるを得ないという欠点がある。この発明の課題は、より簡易に金属錯体を検知することができるプロセスにある。この発明によれば、組み合わせにより、 a) ステップ(iv)によって、磁性混合物に磁場を与え、一方では、分析物と反応した反応性粒子の金属錯体が、測定集塊の形態で拘束されまたは集められ、他方では、前記測定集塊が未反応の残留粒子から分離され（物理的分離という。）、残留粒子から拘束されかつ分離された金属錯体を同時に運び出すことを可能とし、 b) ステップ(v)によって、分離された測定集塊が、前記超常磁性の反応性金属粒子をアンチリガンドと反応させることにより、そして、あるいはそれらの膠着により生じ、前記金属錯体の存在および総量を表す強磁性体質量を測定することによって検知される。この発明によれば、それ自体公知でかつ刊行物ＥＰ−Ａ−０３３９６２３号に示されるような方法で、特に鉄流体（ferro-fluid）と呼ばれる試薬、すなわち、液相内に浮遊する超常磁性の反応性金属粒子よりなる試薬が用いられる。そのような試薬内の各反応性粒子は、少なくとも１つの前記アンチリガンドが直接若しくは間接に結びつけられた金属コアを具備している。そのような試薬の本質的な特性は、それらが前記リガンドと反応しなかった場合には、磁石手段によって磁性および／または磁化可能な反応性金属粒子が液相から個別に分離され得ず、リガンドと反応した場合には、それらは強磁性体であり、集合した強磁性体の塊として挙動するというものである。そのようなそれ自体公知の試薬の十分な開示は、それらを得る方法をも含めて、刊行物ＥＰ−Ａ−０３３９８２３号に与えられており、さらに詳細には、この公開された特許出願の次の節、 − ５頁第９〜２３行、 − ６頁第１４行〜７頁第１３行に、この記載における他の発展若しくは説明を何ら必要とすることなく開示されている。測定集塊を、未反応の残留粒子が内部に保持されている中間混合物から分離する多くの方法が考えられている。 − 第１に、金属錯体を中間媒体から外部に移動させるために、金属錯体を拘束するために使用される実際の磁場を設定、特に、移動させることが可能であり、 − 第２に、金属錯体を拘束するために使用される磁場を固定若しくは動かなくし、かつ、残留粒子を含有する中間媒体を測定集塊から移動させることが可能である。これを実施するために、金属錯体を拘束するために使用される固定された磁場に対して中間媒体を循環させるか、中間媒体を、特にポンピング若しくは吸収剤への吸収により、金属錯体を拘束するための磁場（磁場は上述したように固定状態に維持されている。）により保持されている測定集塊から引き出すことのいずれかが可能である。この発明によれば、測定集塊の強磁性体質量を測定するだけで足りるので、金属錯体の検知がきわめて簡易になる。この目的のために、当業者に周知の種々の手段が使用されている。好ましくは、測定集塊は、強磁性体質量を表し、結果として、前記試薬と前記分析物との間に形成された金属錯体の存在および／または量を表す電気測定信号を発生する電磁式センサの前方に配置される。分析物の量的な測定は、種々の直接的なもしくは間接的な解析方法を用いて行われる。例えば、競合として言及される技術において、いわゆる競合試薬が提供される他のものは、液相内に浮遊状態の超常磁性の反応性磁性粒子を具備し、各個々の粒子は、前記試薬のアンチリガンドによって明確に識別される他のリガンドをその上に直接若しくは間接に結びつけた金属コアを有している。この発明の他の対象は、試料内の分析物の質的若しくは量的な測定装置であって、 i) 前記分析物が、アンチリガンドの明確な識別のための少なくとも１つの部位を有するリガンドよりなる前記液相内の前記試料を受け入れるためのサポート、特に容器と、 ii) 上記において定義されたような少なくとも１つの生物学的に反応性のある試薬の供給源と、 iii) 前記液相内に、前記分析物と反応した反応性粒子の金属錯体および未反応残留粒子の中間混合物を得るために、前記試料と前記試薬とを、特に、定温放置によって接触させる手段と、 iv) 前記中間混合物に磁場を与える手段と、 v) 前記錯体の存在および量を表す検知信号であって、前記試料内に初めから存在する分析物の存在および量と相関関係を有する信号を得るために、分離された金属錯体を検知する手段とを具備している。この発明によれば、組み合わせにより、 a) (iv)により磁場を与える手段が、前記金属粒子と前記分析物との間に形成された金属錯体を、測定集塊の形態で、拘束若しくは収集するための手段、および、前記サポート上に残された前記集塊を未反応の残留粒子から分離（物理的に分離することを意味する意図である。）する手段の両方を具備し若しくはその両方の手段として使用され、 b) (v)による検知手段が、一方では、前記金属錯体の存在および／または総量を表す測定信号を発生する、分離された測定集塊の前記強磁性体質量もしくは磁性体質量を測定する手段よりなり、他方では、前記サポートを前記測定集塊とともに、前記測定手段の前方に配置する手段よりなる。上述したように、前記液相内に浮遊する前記反応性金属粒子は、その上に、前記アンチリガンド、例えば、抗体が、直接若しくは間接に結びつけられ若しくは合体させられた試薬、特に鉄流体からなっている。例として、試薬内の粒子の金属コアは、錯塩と酸化物、ホウ化物と鉄またはコバルトまたはニッケルの硫化物のような本質的に磁性のあるおよび／または磁化可能な磁性材料および赤鉄鉱およびフェライトのような高い帯磁率を有する希土類酸化物部材から選択されている。前記粒子の金属コアは、純粋金属若しくはこれらの部材の１以上よりなる合金からなっている。この金属コアは、残留磁気を全く有しておらずかつその平均サイズが５〜３０ｎｍ、特に、１０〜２０ｎｍの間にあるように設計されていることが好ましい。この金属コアは、前記反応粒子の５〜１００重量％、特に、２５〜６５重量％を占めている。前記反応性金属粒子は、金属コアに加えてシェルを有していてもよい。このシェルの構成は、それがアンチリガンドの結合を可能とし、かつ、前記金属コアと相互作用し得る限り重大なものではない。例として、シェルは、選択的に化学的に調整された天然ポリマー、例えば、アガロース、デキストランのような多糖類およびカルボキシメチルセルロースのようなセルロース誘導体、ゼラチンおよびアルブミンポリマーのような蛋白質、アクリル酸もしくはメタアクリル酸のような選択的に化学的に調整された人工ポリマーであってもよい。反応性粒子の平均サイズは、２０〜１００ｎｍ、特に、５０〜７０ｎｍの間である。この発明に係るプロセスおよび装置は、試料内における低濃度の細菌の細胞のような分析物の測定において、より一層効果的である。実際には、試料内に少ししかない細菌の細胞を直接検知するための十分に感度の高い方法はまだなく、そのため、事前に濃縮するステップを用いることが必要である。この試薬もしくはこれらの試薬は、分析物およびそれ故にリガンドを含むと仮定される液状試料と混合され、その後、その混合物は、例えば、定温放置に付される。その試料および試薬は、検知されるべきリガンドの性質によって定められたｐＨにおいて接触させられる。その接触は、きわめて広い温度範囲、２〜９５ ℃において実施されるけれども、都合よく選択される温度は、室温若しくは３７ ℃〜４０℃の間の温度である。接触時間は、それ自体公知の従来の動作条件を用いて、質的および／よたは量的な測定時間の関数として決定される。所望のｐＨを維持するために、通常は、緩衝剤が使用される。使用され得る緩衝液は、燐酸緩衝液、トリス（Tris）緩衝液その他から選択される。一定の場合には、塩、蛋白質若しくは洗浄剤が、無指定反応(non-specific reaction)を防止するために、試料の試薬の混合物に加えられる。この発明の基底にある原理は、以下に記載された実験プロトコルに基づいて、最初に説明される。 1)Ｆｅ₃Ｏ₄／デキストランＴ４０（５０％）粒子の合成１４ｇのデキストランＴ４０（Ｍｗ＝４００００、ファーマシア(Pharmacia) ）が１５ｍｌの水に加えられ、デキストランが、第１の溶液を形成するために室温において溶解するように放置される。第２の溶液は、２０ｍｌの水内における３ｇのＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ（Ｍｗ＝２７０．３０）と、１．３ｇのＦｅＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ（Ｍｗ＝１９８．８１）とにより準備される。２つの溶液は、約２００〜２５０ｒｐｍに設定された攪拌モータと、ガラス攪拌器と、７．５％（ｖ／ｖ）ＮＨ₄ＯＨ溶液を含んだ滴下漏斗を備えた２５０ｍｌの二重壁反応器内に導入される。室温において、前記７．５％（ｖ／ｖ）ＮＨ₄ＯＨ溶液が、１０〜１１の最終ｐＨとなるまで滴下により加えられる。反応器は、約６０分間、７０℃に加熱される。反応の終わりに、溶液は回収されて、５リットルの蒸留水に対して大量に透析され、その後、石英ウールによって濾過される。この溶液は、その後、６００ｒｐｍで５分間の遠心分離に３回かけられる。未反応のデキストランを取り除くために、０．１Ｍのアセテート、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＮａＮ₃よりなるｐＨ６．５の緩衝液を用いて予め平衡させられたセファクリルＳ３００ＨＲジェル（ファーマシア）の３３２．５ｃｍのコラム上に配置される。得られた鉄流体内の金属粒子は、デキストランシェルを有する、２０〜９００ｎｍ、好ましくは５０〜７０ｎｍの外径寸法を有している。それらは、＋４℃で保管される。以下にアンチ−エル（anti-L）Ａｂとして言及されるリステリア属に対し割り当てられる少なくとも１つの抗体を搬送する反応性粒子の準備例１によって合成される粒子は、過ヨウ素酸ナトリウム（０．１Ｍ）を加えることにより酸化される。光のない状態で４５分間攪拌した後に、粒子は、０．１５ＮａＣｌに対して４時間にわたって透析にかけられる。１０ｇ／ｍｌのアンチ−エルＡｂは、１ｍｇの試薬当たり１ｍｇの粒子の濃度を有する前記金属粒子を含んだ溶液に加えられる。そのｐＨは、ＮａＨＣＯ₃を加えることにより約８に調節されている。混合物は、静かに攪拌されながら２０時間、定温放置される。これにより形成される混合物は、４５分間静かに攪拌しながら、粒子の１ｍｇ当たり１２・１０^-3 モルのＮａＢＨ₄の濃度のホウ素水和（borohydrate）ナトリウム溶液を加えることによって、減じられる。混合物は、燐酸ナトリウム（０．１Ｍ）およびＮａＣｌ（０．１５Ｍ）よりなるｐＨ７．５の緩衝液に対して一晩透析される。最終的な溶液は、１ｍｌの試薬当たりに０．４１５ｍｇの金属粒子および１ｍｇの粒子当たりに１５．４ｇのアンチ−エルＡｂ、すなわち、１ｍｌの試薬当たりに６．４ｇのアンチ−エルＡｂを含有している。特に、電磁式センサを用いたリステリア属細菌の検知における質的および／または量的な測定使用される実験的な設定は、以下のものよりなる。 − 一般のオーディオまたはビデオ記録テープ、例えば、厚さ５・１０^-2ｍｍのポリエステルフィルムと同一のサポート２。このサポートは、一方では、相対的に自由で、特に、以下に定義される接線方向気流の作用下において、特に、任意の好適な手段を用いたバイブレーションにより、特に、振動（オシレート :osci llate）させられ得る固定ベース２ｂと舌部２ａとからなっている。この不浸透性のサポートは、液相内に、評価されるべき細菌を含む処理されるべき試料および／または上記のように準備された試薬および／または分析物として考慮される細菌と反応した反応性粒子よりなる金属錯体を具備する中間混合物を受け入れようとするものである。 − 上記サポートを、例えば、２つのフック２３を用いて固定することを可能とする固定手段２１。 − 上記に定義されかつサポート２により支持された拘束されかつ分離された測定集塊の形態で、金属錯体を検知するための手段４。この発明によれば、この検知手段４は、分離された測定集塊の強磁性体質量を測定するための手段であって、電気的な測定信号、例えば、分離された測定集塊の強磁性体質量を表し、結果として金属錯体の存在および総量を表す検知起電力を発生する電磁式センサ６よりなっている。このセンサは、一般的な様式では、記録されたオーディオ若しくはビデオテープの読取りヘッドの場合のように、前記サポートの前記舌部２ａがそこから一定距離を開けてその前方に配置された磁気的な間隙１２を画定する磁気回路２４により形成されている。コイル２０は、Ｕ字状断面を有する磁気回路２４の２つのリムの間に配置されている。 − ゲインを調節し得るアンプ１８と、該アンプ１８の出力側に接続されたディスプレイ１９とからなり、前記コイル２０の出力側において電気的な測定信号を処理するためのシステム。 − センサ６、そして、さらに詳細には、コイル２０の出力において、測定信号を増大させるために、電気磁気的なセンサ６上に配置された永久磁石１１若しくは補助の磁気発生器。 − 前記舌部２ａのエッジ若しくは側部に集中させられる不活性ガス流を噴射するノズル２よりなり、舌部２ａを垂直方向に振動させるための手段１０。ガス流の強さは、マノメータ２２を用いてノズル２０内のガスの圧力を監視することにより調節される。この振動（バイブレーション:vibration）手段は、電磁気的手段であってもよい。ノズル１０より噴射され、任意のユニット、例えば、マノメータ２２の目盛により測定される気流の強さに応じて、出力電圧１９は、種々の形態で測定される。すなわち、 − 磁気空気間隙１２の前方に一定間隔を空けた舌部２ａがない場合には、Ｖ_o − 舌部若しくはサポート２ａは存在するが、空気間隙１２の前方の一定間隔位置においても試薬がない場合には、Ｖ_b − そして、最後に、空気間隙の前方に一定間隔を開けた位置に予め設定された量の試薬がある場合には、Ｖ。この最初の試行のために、アンプ１８のゲインは、４．２に固定されている。空気間隙１２に関して接線方向に当てられる気流の強さにかかわらず、ディスプレイ１９に現れる電圧は、空気間隙１２の前方にサポート２ａが存在してもしなくても、実質的に同一に保持される。５２（約１５０ミリバールの圧力に対応する任意値）を超える気流において、磁気サポートで表示される電圧、すなわち「Ｖ」は、１１〜５１間の気流で１８ｍＶから５０ｍＶまで、５２において５０から１９０ｍＶまで変化し、６２において最大値に達するので、猛烈に増大する。したがって、以下の試行に採用される気流の値は、６２に近いものである。次に、値６２に固定された同一の気流で、表示された最大および最小電圧Ｖ_o ，Ｖ_bは、前記アンプ１８のゲインの関数として決定される。したがって、重要な信号を検知するために、アンプ１８のゲインは４より大きくなければならないことがわかる。したがって、このように決定された２つの値、気流の値６２、およびアンプのゲインの値４によって、信号／雑音比（ＳＮ比）は最適化され、以下の式で表される。（Ｖ_m−Ｖ_o）／（Ｖ_b−Ｖ_o）ここで、Ｖ_mは、測定のために、ディスプレイ１９に表示される電圧である。第１に、サポート２ａを用いることにより、上述したと同様の金属粒子であるが、アンチリガンド若しくは抗体と結合する前の１リットルの鉄流体が、このサポート２ａ上において、Ｅ大腸菌と一緒に配される。定温放置の間に、測定された電圧Ｖｍが、実質的に一定であり、１．１％の範囲内で、平均して１１．９５に等しく、標準偏差が０．１３に保持されることがわかる。この電圧は、同様の実験条件下で得られた電圧Ｖ_o、Ｖ_bと大きく相違しておらず、そのために、ＳＮ比は大きくならない。アンプ１８のゲインをもう一度変更することにより、ゲイン６に対してＳＮ比が最適に決定されると同時に、サポート２ａを振動させる気流の強さが同等に保持される。これらの条件下において、上記において準備され、１ｍｌ当たりに０．５リットルのアンチリステリア属抗体と、１ｍｌ当たりに０．５ｍｇの鉄流体を具備する１ｍｌの試薬が加えられたオーディオ／ビデオ磁気テープ形式のサポートを用いることにより、得られるＳＮ比は１４０となる。オーディオ／ビデオ磁気テープ形式のサポート２ａで、同様の気流と同様のゲインを維持しながら、１リットルの水、１．４６ｎｇの抗体に被覆されておらず（not coated）かつ縛られていない鉄流体、１４．６ｎｇ、１４６ｎｇおよび１．４６ｇの同様の鉄流体のそれぞれにおいて、測定された電圧Ｖｍと電圧Ｖ_bとの相違が測定される。以下の表にまとめられた値はこのようにして得られたものである。この表は、検知し得る試薬の最小量は１４．６ｎｇであることを示し、表示された信号は試薬の量に比例して増加していないことがわかる。気流および増幅ゲインに関する条件および磁気テープ形式のサポート２が同一であっても、電圧Ｖ_o，Ｖ_b，Ｖ_mおよびＳＮ比は、サポートが上記において準備された試薬と１ｍｌ当たりに１０Ｅ９のリステリア属細菌を含む液相内の試料との間で形成された錯体よりなる中間混合物を具備するときに、連続的に決定される。これらの条件下では、得られる電圧Ｖ_mは５３０ｍＶであり、ＳＮ比は１１３である。この比率は、Ｖ_bを低減することにより、例えば、ノズル１０を通して噴射される気流の強さを低減することにより増大され得る。例えば、リステリア属細菌の場合には、上述した細菌において検出可能な最小の信号を得るために、気流の値は（上記において定義した任意のユニットを用いて）４４に設定され得る。これらの新たな条件下では、液相試料内における同一の濃度の細菌に対して、試薬を前記試料と接触させてサポート上に存在させた状態で、５ｇ／ｍｌの抗体と１ｍｇ／ｍｌの鉄流体の割合で、ＳＮ比１７１４、７００ｍＶの出力信号が得られる。したがって、この実験プロトコルは、この発明によれば、評価されあるいは検知されるべき試料内に存在する細菌の存在および／または量若しくは数に相関関係を有し得る出力信号、すなわち、測定信号を得ることが可能であることを論証するものである。概要図２〜図５からなる添付図面によれば、この発明に係る質的および／または量的な測定のための種々の装置が図示されている。図２によれば、この発明に係る装置１は、 i) 検知方向７４に並進移動し、液相内の試料、例えばサポート２上の受入領域８に配置される接種物を受け入れることを可能とする不浸透性のサポート２と、 ii) 前記試薬を、例えば、前記領域８内の前記試料と接触させるために提供される上記に定義した試薬の供給源と、 iii) 特に、定温放置によるこの試料と試薬との接触が液相内、例えば、領域８内に、上記に定義した中間混合物を得ることを可能とし、 iv) 上記に定義した前記金属錯体を測定集塊の形態で拘束するための手段および前記集塊を未反応粒子からサポート上において分離するための手段の両方に用いられる磁場を提供するための手段３であって、テープの形態をしたサポート２に対して横方向に配置された永久磁石よりなる手段３と、 v) このように拘束されかつ分離された金属錯体を検知するための手段４であって、１３において示され、かつ、集塊の磁性塊、および、それによって、試料内に初めから存在する分析物の量と相関し得る金属錯体の存在および／または量を表す測定信号５を得るために、測定集塊の強磁性体質量を検出するための電磁式センサ６を具備する手段とからなっている。この発明によれば、組み合わせにより、 a) (v)に係る検知手段が、一方では、本来電気的で、初めから上述した中間混合物内に存在する金属錯体の存在および／または総量を表す測定信号を発生する強磁性体質量の測定手段６と、テープの形態をしたサポート２であってこれらの拘束されかつ分離された金属錯体を、テープ２の下方に配置された電磁式センサ６の前方の一定間隔を空けた位置に通過させることによって提供するための手段を構成するサポートとを具備し、 b) (iv)に係る磁場を提供するための手段３が、この場合には、横方向永久磁石が、金属錯体を拘束し、測定集塊の形態で収集するための手段、および、分離領域９において電磁式センサ６により検知され得る分離された状態の前記集塊をこのセンサの前方の一定間隔を空けた位置に提供し若しくは通過させることによって得るために、前記集塊を受入量域８から分離領域９に搬送することによって分離するための手段の両方の手段として用いられる。上述したように、サポート２は平坦で、例えば、試料、試薬および前記液相の中間混合物に対して不浸透性のテープを構成している。その上面は、前記液相の反応相手を、一の領域から他の領域に、例えば、少なくとも中間混合物を受け入れる第１の領域８から測定集塊を分離するための第２の領域９に、特に、前記測定集塊を前記第１の領域から第２の領域に移動させることを可能とする磁場を発生する磁石３の作用下において、スライド若しくは流すことができるようなものである。図１を参照して説明した実験的設定におけるように、サポートの水平面に対して垂直な方向に該サポート２のバイブレーションが発生され、そのバイブレーションは、電磁式センサ６の前方でかつ一定の間隔を空けた位置を通過するときに測定集塊に伝達される。上述したように、この発生器は前記サポート２のエッジ若しくは側面に対して接線方向のガス流を噴射する手段１０よりなっている。前記電磁式センサ６によって発生された検知信号を増大するために、補助の磁気発生器１１が電磁式センサ６に設けられている。試料内の分析物、例えば、細菌の質的および／または量的な測定のためのプロセスは、上記説明から提供され、かつ、以下のステップを具備している。 i) 液相の試料を第１の領域８に配置し、 ii) 上記に定義した試薬をこの領域８に導入し、 iii) 液相内において金属錯体と未反応の残留反応性粒子とからなる中間混合物を得るために、定温放置により、領域８における試料と試薬との間の接触が達成されることを可能とし、 iv) 第２の領域９内に、電磁式センサ６の前方を一定間隔を開けて通過させることによって該電磁式センサ６により検知され得る分離された測定集塊７を得るために、磁石３によって発生しかつ前記中間混合物に適用される磁場を用いて、前記金属錯体が測定集塊の形態で拘束され、かつ、前記集塊７が前記第１の領域８から第２の領域９に移動されることにより未反応粒子から分離され、 v) このように分離された測定集塊７が、上述した金属錯体の存在および／または量若しくは総数を表す電気的測定信号５を発生する前記電磁式センサ６の前方に前記集塊を配置することにより、その強磁性体質量を測定することにより検知される。矢印７４に沿って移動するサポート２には、したがって、いわば、２つのトラックがある。すなわち、第１の反応トラック２６および第２の測定トラック２７であって、これに関連して、前記電磁式センサ６がテープ若しくはサポート２の下に配置されている。上述したように、磁石３により金属錯体は拘束されかつ分離されもしくは第１の領域８から選択的に引出され、かつ第２の分離領域９に移動され、その結果、いわば、第１のトラック２６から第２のトラック２７に移動され、このことは磁力線を前記第２の領域９に集める前記磁石３により発生された磁場の作用によって行われる。この移動は、サポート若しくはテープ２上の平坦なステージにおいて行われる。平坦なサポート２は、ノズル１０により出射されサポート２のエッジに当てられるガスジェットの作用下で垂直方向に周期的なオシレーションを課され、前記測定集塊７は、それ自体が電磁式センサ６の前方において振動させられる。さらに、前記検知信号５を増大させるために、補助の磁場が磁石１１によってセンサ６に適用される。そのような磁石は、例えば、ネオジム−鉄−ホウ素磁石（直径６ｍｍ，高さ５ｍｍ）であり、その共鳴は３０％以上、そのエネルギ効率は７０％である。図３に示された装置は、単一の生物学的試料に、複数の生物学的若しくは生化学的測定を実施するために用いることを可能とするカードを具備する点において、図２に示されたものと相違している。この目的のために、サポート２は、成形されたカードを具備している。カードは、 − 各々が前記試料、試薬および一旦形成された中間混合物の一部を受け入れるための第１の領域２を形成する複数の定温放置皿１６ａ〜１６ｊが並列に接続された、液相の試料を受け入れるための受け皿１５と、 − 各々が測定集塊の分離のための第２の領域を形成する、種々の定温放置皿１６ａ〜１６ｊにそれぞれ接続された複数の読取り皿１７ａ〜１７ｊと、 − 前記中間錯体を移動するために、前記受け皿と前記読取り皿とを個々に連結する複数の溝に対応して配置された複数の磁石３ａ〜３ｊと、 −前記種々の読取り皿１７ａ〜１７ｊの前方においてそれぞれ移動され得る単一の電磁式センサ６とからなっている。図４に示された装置は、図２および図３にそれぞれ示されたものと以下の点において相違している。すなわち、 − サポート２を形成するカード若しくはスリーブ上に配され、予め包装された液相の試薬を収容する単一の定温放置皿１６があり、 − 前記サポート２が方向２８に全く振動しないときに、前記受け皿１５が、液相の試料および液相の試薬に対して液密で、かつ、該サポート２にが同一方向に振動されたときに同試料が通過することを許容する溝により、前記定温放置皿１６に接続され、 − 前記皿１５，１６を連結する溝が平坦なジグザグ形状を有しているのに対して、前記定温放置皿１６に直線溝によって接続される単一の読取り皿１７があることである。図５によれば、そして、この発明の他の実施形態によれば、金属錯体を拘束かつ分離するための手段は、電磁式センサ６若しくは測定集塊の強磁性体質量の測定手段の前方に配置され、前記センサによって前記塊を検知するように調整された断面を有する、前記中間混合物を循環させるための管路、例えば、キャピラリー管である。この実施形態によれば、金属錯体は、したがって、センサ６によって測定集塊の強磁性体質量を検知するように調整された断面を有する液体の流れ内の中間混合物を、前記電磁式センサ６の前方を通過するように循環させることによって、拘束されかつ分離される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．試料内の分析物の質的および／または量的な測定のためのプロセスであって、それによって、 i) 内部の前記分析物がアンチリガンド(anti-ligand)を明確に識別するための少なくとも１つの部位を有するリガンドを具備する前記試料を、液相で提供し、 ii) 前記液相内に浮遊する超常磁性の反応性を有する金属粒子を具備し、各反応性粒子がその上に少なくとも１つの前記アンチリガンドを直接または間接に結合した金属コアを具備する少なくとも１つの試薬を提供し、 iii) 前記分析物と反応した反応性粒子の金属錯体と未反応の残留反応性粒子との中間混合物を液相内に得るために、前記試料と前記試薬とを、特に、定温放置によって接触させ、 iv) 該中間混合物に、磁場を作用させ、 v) 前記試料内に初めから存在する分析物の存在および／または量と相関関係を有し、前記錯体の存在および／または量を表す検知信号を得るために、前記金属錯体が検知されるプロセスにおいて、組み合わせにより、 a) 前記ステップ(iv)に従い、前記中間混合物に磁場が作用させられた状態で、前記分析物と反応した反応性粒子の金属錯体を、測定集塊の形態で拘束し、かつ、同時に選択的に、該集塊を前記未反応の残留粒子から分離し、 b) 前記ステップ(v)に従い、前記金属錯体の存在および／または総量を表すその強磁性体質量を測定することにより、前記分離された測定集塊を検知することを特徴とするプロセス。２．前記測定集塊が、前記金属錯体を拘束するために使用される磁場を、前記中間媒体からかつその外部で設定、特に、移動することによって、前記未反応の残留粒子を残された中間媒体から分離することを特徴とする請求項１記載のプロセス。３．前記金属錯体が、前記測定集塊を前記中間混合物を、それを収容する第１の領域から引き出して第２の領域に移動することにより、拘束しかつ分離することを特徴とする請求項２記載のプロセス。４．前記測定集塊の第１の領域から第２の領域への引き出しおよび移動を、前記集塊に磁力線を集めかつ選択的に前記移動方向に沿って移動可能な磁場の作用下において実施することを特徴とする請求項３記載のプロセス。５．前記測定集塊の第１の領域から第２の領域への移動を、少なくとも中間混合物に対して不浸透性のサポート上において平坦な状態で実施することを特徴とする請求項１記載のプロセス。６．前記金属錯体を拘束するために用いられる磁場を固定し、かつ、前記測定集塊からはなれた残留粒子を含む前記中間媒体を移動することによって、前記未反応の残留粒子が残された中間媒体から、前記測定集塊を分離することを特徴とする請求項１記載のプロセス。７．前記中間媒体が、前記金属錯体を拘束するために用いられ、固定状態に保持された磁場に対して循環させられることを特徴とする請求項６記載のプロセス。８．前記測定手段による前記強磁性体質量の検知のために調整された断面を有する液体の流れの形態で、前記中間混合物が、測定集塊の強磁性体質量を測定するための手段の前面を通過させられて、循環されることを特徴とする請求項７記載のプロセス。９．前記中間媒体が、特にポンピング若しくは吸収剤への吸収によって、前記金属錯体を拘束するための固定された磁場により保持された集塊から引かれることを特徴とする請求項６記載のプロセス。１０．前記強磁性体質量を表す電気測定信号を発生する電磁式センサの前方に、前記測定集塊を配置することにより、前記強磁性体質量を測定することを特徴とする請求項１記載のプロセス。１１．前記周期的なオシレーション、特に、バイブレーションが、測定手段の前方の測定集塊に伝達されることを特徴とする請求項１０記載のプロセス。１２．前記電磁式センサの前方において、前記平坦なサポートが、例えば、該平坦なサポートのエッジに当てられるガスジェットの作用下において、周期的なオシレーション、特に、バイブレーションを付与されることを特徴とする請求項５から請求項１１のいずれかに記載のプロセス。１３．前記測定集塊の前記磁性塊を増大させる補助の磁場を、電磁式センサに用いていることを特徴とする請求項１０記載のプロセス。１４．試料内の分析物を質的および／または量的に測定するための装置（１）であって、 i) アンチリガンドの明確な識別のための少なくとも１つの部位を有するリガンドよりなる分析物を含む液相の前記試料を受け入れるためのサポート（２）と、 ii) 前記液相内に浮遊する超常磁性の反応性のある金属粒子よりなり、各反応性粒子が、少なくとも１つの前記アンチリガンドを直接若しくは間接に結合した金属コアを具備する少なくとも１つの試薬の供給源と、 iii) 液相内に、前記分析物と反応した反応性粒子の金属錯体と未反応の残留粒子との中間混合物を得るために、特に、定温放置によって、前記試料と前記試薬とを接触させる手段と、 iv) 前記中間混合物に磁場を与える手段（３）と、 v) 前記試料内に初めから存在する分析物の存在および／または量と相関関係を有し、前記錯体の存在および／または量を表す検知信号を得るために、前記分離された金属錯体を検知する手段（４）とを具備する装置（１）において、組み合わせにより、 a) 前記(iv)に係る磁場を与える手段（３）が、前記分析物と反応した金属粒子の前記金属錯体を測定集塊の形態で拘束するための手段、および、前記サポート（２）上に残された前記集塊を未反応の残留粒子から分離するための手段の両方を具備し若しくはその両方として使用され、 b) 前記(v)に係る検知手段（４）が、一方では、前記金属錯体の存在および／または総量を表す測定信号を発生して前記分離された測定集塊の強磁性体質量を測定するための手段（６）を、他方では、前記サポート（２）を前記測定集塊とともに前記測定手段の前方に配置するための手段を具備することを特徴とする装置。１５．前記測定手段が、分離された測定集塊の強磁性体質量を表す電気的測定信号を発生する電磁式センサ（６）よりなることを特徴とする請求項１４記載の装置。１６．前記同一サポート（２）上に、前記中間混合物を受け入れるための第１の領域（８）および前記測定集塊を分離するための第２の領域（９）と、前記測定集塊を前記第１の領域から前記第２の領域に移動するための手段（３）とを具備することを特徴とする請求項１４記載の装置。１７．前記サポート（２）が、平坦で、かつ、少なくとも前記中間混合物に対して不浸透性を有することを特徴とする請求項１６記載の装置。１８．前記サポート（２）が、液相の試料を受け入れるための受け皿（１５）と、該受け皿に接続されかつ前記中間混合物を受け入れる少なくとも１つの定温放置皿（１６，１６ａ〜１６ｊ）と、該定温放置皿に接続されかつ前記測定集塊を分離するための第２の領域を形成する少なくとも１つの読取り皿（１７，１７ａ〜１７ｊ）とを具備することを特徴とする請求項１４記載の装置。１９．前記サポート（２）が、一側に単一の受け皿（１５）が接続された複数の定温放置皿（１６ａ〜１６ｊ）と、該種々の定温放置皿に個別に接続された複数の読取り皿（１７ａ〜１７ｊ）とを具備することを特徴とする請求項１８記載の装置。２０．前記定温放置皿（１６）が液相の試薬を収容し、前記受け皿（１５）は、前記サポート（２）が、振動しないときに、液相の試料及び液相の試薬に対して液密となり、前記サポート（２）が振動するときには前記サンプルの通過を許容する溝によって、前記定温放置皿に連結されていることを特徴とする請求項１８記載の装置。２１．前記測定集塊の強磁性体質量を測定するための手段（６）の前方に配置され、かつ、その断面が、前記測定手段による前記強磁性体質量の検知のために調整された中間混合物の循環管路を具備することを特徴とする請求項１４記載の装置。２２．前記測定集塊に当てられる周期的なオシレーション、特に、バイブレーションの発生器（１０）が、前記測定手段（６）に連結され、かつ、例えば、前記サポート（２）のエッジに対して接線方向のガス流を噴射するための手段を具備することを特徴とする請求項１４記載の装置。２３．補助の磁気発生器（１１）が、前記測定集塊の磁性塊を増大させるために、前記電磁式センサ（６）に設けられていることを特徴とする請求項１４記載の装置。