JP2010117140A - アナライト分析方法 - Google Patents
アナライト分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010117140A JP2010117140A JP2008288443A JP2008288443A JP2010117140A JP 2010117140 A JP2010117140 A JP 2010117140A JP 2008288443 A JP2008288443 A JP 2008288443A JP 2008288443 A JP2008288443 A JP 2008288443A JP 2010117140 A JP2010117140 A JP 2010117140A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- analyte
- avidin
- biotin
- modified
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
【課題】アビジン−ビオチン結合の際に発光シグナルを増加させてアナライトを高感度に検出できるアナライト分析方法を提供する。
【解決手段】アナライトとビオチン修飾リガンドとを反応させ結合体を形成させる結合体形成ステップと、前記結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体とを添加しアビジン−ビオチン反応を行い結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体を形成させる複合体形成ステップと、前記複合体中の標識物質修飾アビジンの標識物質から信号を生成させ前記信号を検出することでアナライトの分析を行う分析ステップと、からなる、アナライト分析方法。
【選択図】図1
【解決手段】アナライトとビオチン修飾リガンドとを反応させ結合体を形成させる結合体形成ステップと、前記結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体とを添加しアビジン−ビオチン反応を行い結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体を形成させる複合体形成ステップと、前記複合体中の標識物質修飾アビジンの標識物質から信号を生成させ前記信号を検出することでアナライトの分析を行う分析ステップと、からなる、アナライト分析方法。
【選択図】図1
Description
本発明は、試料中に存在する特定のアナライトを、高感度に検出するためのアナライト分析方法に関する。
酵素免疫測定法は、酵素を標識した抗体をアナライトと抗原抗体反応させ、アナライトの濃度に応じて、酵素から生成されるシグナルを検出する高感度免疫測定法である。この方法は、酵素が有する触媒活性の高さから容易に高いシグナルを得ることができるため、アナライトを高感度に測定できる。
一般的に、酵素免疫測定法は、固相に固定化された固相固定化抗体に対し、アナライトを含む試料を加え、抗原抗体反応させる。次に、酵素標識抗体とアナライトとを抗原抗体反応により、固相固定化抗体・アナライト・酵素標識抗体との複合体を形成させる。この複合体に対し、酵素基質溶液を加えて、酵素反応を行わせることにより、発色・発光等のシグナルを生成させる。このシグナルを検出することで、目的とするアナライトの存在量を知る方法である。
しかしながら、上記方法は、酵素のような巨大分子の標識物質を抗体に直接結合させているため、抗原抗体反応の際に立体障害となり反応が阻害される。そのため、抗体にビオチン、酵素にアビジンを修飾し、抗原抗体反応後に、アビジン−ビオチン反応によって酵素を結合させる方法が知られている(例えば、特許文献1参照。)。
これは、固相に接続された固相固定化抗体に対し、アナライトを含む試料を加え、抗原抗体反応させる。次に、ビオチン標識抗体とアナライトとを抗原抗体反応させ、更に、アビジン標識酵素を加えることにより、固相固定化抗体・アナライト・ビオチン標識抗体・アビジン標識酵素とで複合体を形成させる。この複合体に対し、酵素基質溶液を加えて、酵素反応を行わせることにより、発色・発光等のシグナルを生成させる。このシグナルを検出することで、目的とするアナライトの存在量を検出する。
しかしながら、上記の方法では、安定した酵素が必要となる。そのため、近年では、イソルミノールやアクリジニウムエステル等の化学発光物質を標識した化学発光免疫分析法や、トリス(2,2’−ビピリジン)ルテニウム錯体のような電気化学発光物質を抗体に標識した電気化学発光免疫分析法が広く用いられている。
化学発光免疫分析方法や電気化学発光免疫分析方法は、優れた方法であるが、抗体への標識率が低いと、得られる発光量が微弱なので、複雑な光学系を有した装置が必要となる。そのため、高分子化合物にビオチン及び発光物質を修飾した、ビオチン標識−発光性高分子化合物を使用する(例えば、特許文献2参照。)。
この方法は、上述した酵素を用いた免疫測定法と同様に、固相に固定化された固相固定化抗体に対し、アナライトを含む試料を加え、抗原抗体反応させる。次に、ビオチン標識抗体とアナライトとを抗原抗体反応により、固相固定化抗体・アナライト・ビオチン標識抗体との複合体を形成させる。その後、アビジン及び前記ビオチン標識−発光性高分子化合物を添加させて、固相固定化抗体・アナライト・ビオチン標識抗体・アビジン・ビオチン標識−発光性高分子化合物との複合体を形成させる。この複合体から発する発光量を検出することで、目的とするアナライトの存在量を知る方法である。
このビオチン標識−発光性高分子化合物は、高分子化合物に発光物質を複数個結合させているだけでなく、アビジンとビオチン標識−発光性高分子化合物との結合により、連鎖的にまた多岐にアビジン・ビオチン標識−発光性高分子化合物の複合体を形成させている。そのため、発光シグナルが増加されるので、簡易な装置を用いても感度良く分析が出来る。
特開昭58−30667号公報
国際公開第2003/031974号パンフレット
しかしながら、前記従来の構成では、ルミノールを300個結合させたビオチン標識−発光性高分子化合物を用いて免疫測定を行うと、ルミノール単体を標識させた場合に比べて発光シグナルは4倍程度の増加に留まる。これは、ビオチン標識−発光性高分子化合物がアビジン−ビオチン結合の際に、立体障害が生じるためである。すなわち、前記従来の構成では、アビジン−ビオチン結合の際に発光シグナルが増加しないという課題を有していた。
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、アビジン−ビオチン結合の際に発光シグナルを増加させてアナライトを高感度に検出できるアナライト分析方法を提供することを目的とする。
前記従来の課題を解決するために、本発明のアナライト分析方法は、アナライトとビオチン修飾リガンドとを反応させ結合体を形成させる結合体形成ステップと、前記結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体とを添加しアビジン−ビオチン反応を行い結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体を形成させる複合体形成ステップと、前記複合体中の標識物質修飾アビジンの標識物質から信号を生成させ前記信号を検出することでアナライトの分析を行う分析ステップと、からなることを特徴としたものである。
本発明のアナライト分析方法によれば、低分子であるビオチンビス体が、標識物質修飾アビジン間のリンカーとして作用するため、アビジン−ビオチン結合の際に発光シグナルを増加させてアナライトを高感度に検出できる。
以下に本発明のアナライト分析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
(実施の形態1)
図1は、本手法におけるアナライト分析方法を示した図である。この図とともに詳細に説明する。本実施例では、抗原をアナライトとして説明するが、抗体もしくは核酸をアナライトとしても良い。
図1は、本手法におけるアナライト分析方法を示した図である。この図とともに詳細に説明する。本実施例では、抗原をアナライトとして説明するが、抗体もしくは核酸をアナライトとしても良い。
(結合体形成ステップ)
図1aは、固相上に固定した固相固定化抗体、抗原、ビオチン修飾抗体が結合した形態を示す図である。1は固相として用いた磁気ビーズであり、2は固相固定化抗体である。3は抗原であり、4のビオチン修飾リガンドと結合している。5はビオチン修飾リガンドに修飾されているビオチンである。本発明では、図1aに示す形態を結合体と称する。この結合体は、公知の抗原抗体反応を使えば、容易に形成することが出来る。
図1aは、固相上に固定した固相固定化抗体、抗原、ビオチン修飾抗体が結合した形態を示す図である。1は固相として用いた磁気ビーズであり、2は固相固定化抗体である。3は抗原であり、4のビオチン修飾リガンドと結合している。5はビオチン修飾リガンドに修飾されているビオチンである。本発明では、図1aに示す形態を結合体と称する。この結合体は、公知の抗原抗体反応を使えば、容易に形成することが出来る。
本実施例では、固相に磁気ビーズを用いたが、これ以外のビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリエチレンビーズなどを用いても良い。また、 本発明で用いる固相はビーズに限定されるものではなく、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Si、Ge、 ZnO、 CdS、TiO、GaAsのような半導体で作製されたプレートでも良い。なお、以上の物質は電気化学発光を行う場合、電極として利用する利点がある。
次に、固相に固相固定化抗体を固定させる。一般的な手法としては、物理的に吸着させる手法が挙げられる。また、抗体のシステイン残基やアミノ基、カルボキシル基を用いて、これらと結合できる官能基を化学処理した固相と共有結合させる手法も挙げられる。これらの手法は公知であるので、ここでは説明を省略する。
本発明で用いるリガンドは、抗原、抗体、核酸のいずれかから選択される。本実施例では、アナライトに抗原を用いたため、リガンドには抗体を用いた。
本発明で用いるビオチン修飾リガンドの修飾は、共有結合により行う。共有結合には、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、マレイミド−チオール結合がある。抗体の場合、アミノ残基とビオチンに含まれるカルボン酸との間でアミド結合させるが、チオールやマレイミドを修飾させたビオチンが市販されているので、これを用いてシステイン残基などに修飾させても良い。
なお、リガンドが核酸の場合は、5´末端若しくは3´末端にビオチンと共有結合できる官能基を修飾した核酸を合成する手法が一般的である。また、グアニンやウラシルなどの基質にビオチンを修飾させ、核酸増幅やニックトランスレーションなどによりビオチンを導入させる手法もある。
(複合体形成ステップ)
次に、以上に説明した図1aの結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体を添加して、複合体を形成する方法を説明する。
次に、以上に説明した図1aの結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体を添加して、複合体を形成する方法を説明する。
図1bは、標識物質修飾アビジンを示す図である。6は標識物質であり、7のアビジンに修飾されている。アビジン7への標識物質6の修飾は、共有結合により行えば良い。共有結合の例としては、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、マレイミド−チオール結合が挙げられる。
標識物質6は、電気化学発光性、化学発光性を有する物質であれば特に限定されず、電気化学発光であれば、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエン、トリスビピリジンルテニウム錯体、トリスビピリジンオスミウム錯体などを挙げることができ、化学発光では、イソルミノール、ルシゲニン、ロフィン、アクリジニウムエステル、ジフェノイルペルオキシド、イミダゾピラジノン系化合物が利用できる。
この標識物質をアビジン7に修飾させる。アビジンには、卵白アビジン、ストレプトアビジン、リコンビナントアビジンがある。修飾方法は、上述した共有結合により行う。
図1cは、ビオチンビス体9を示す図である。ビオチンビス体9とは、ビオチン5を2つ有する化合物であり、リンカー8を介してビオチン5を共有結合させた化合物である。リンカー8の種類は、アルキル、アルコール、カルボン酸、スルホン酸、エステル、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、糖、リン酸、アミノ酸、メタクリル酸、アミド、イミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エチレン、カーボネート、ビニル、ヒドラゾン、環式化合物、ヘテロ環式化合物またはこれらの組み合わせからなる。
リンカーの剛直性は、本発明においては大変重要である。剛直性が低いと、リンカーが屈曲し、アビジン−ビオチン結合の反応効率を低下させてしまう。そのため、エチレンなどの不飽和炭化水素やシクロアルカンなどの環式化合物を持たせると良い。
また、リンカー長さも本発明においては重要である。リンカー長さは、0.14nmから6nmが望ましい。これは、アビジンのビオチン結合部位が、アビジン分子表面から約0.9nmの深さにあるためである。ビオチン部位のC4の位置にある側鎖の鎖長は約0.43nmであり、そのままビス体を形成させても約0.86nm程度である。そのため、ビオチン間の距離が0.14nm以下だと、ビオチンの一方はアビジンと反応出来るが、もう一方のビオチンは、前記アビジンに埋もれてしまう。また、埋もれなかった場合でも、アビジン間の立体障害により、アビジン−ビオチン結合が阻害されてしまう。一方、6nm以上では、リンカー自体が立体障害の要因となるため、6nm以下に設計する。さらに水溶液への溶解度を上げるため、アルコールやカルボン酸などの親水基を修飾させると良い。
図1aで作製した結合体に、上述した標識物質修飾アビジン及びビオチンビス体を添加することで、図1dに示す結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体が形成される。これは、図1cで示したビオチンビス体9が標識物質修飾アビジン間のリンカーとして機能するので、連鎖的に標識物質修飾アビジンの複合体が形成される。形成後、緩衝液で未反応のビオチンビス体及び、標識物質結合アビジンを除去する。
(分析ステップ)
図1eは、図1dで形成した複合体を電極10に配置した図である。このように電極に複合体を配置した後、還元剤を含む電解液を添加して電圧を印加する。この工程で生成した発光を光電子増倍管やCCD(Charge Coupled Device)で計測する。
図1eは、図1dで形成した複合体を電極10に配置した図である。このように電極に複合体を配置した後、還元剤を含む電解液を添加して電圧を印加する。この工程で生成した発光を光電子増倍管やCCD(Charge Coupled Device)で計測する。
電極10は、導電物質であれば特に限定されない。例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Si、Ge、 ZnO、 CdS、TiO、GaAsのような半導体等が利用できる。
上述の検出ステップは、電気化学発光する標識物質を用いた場合で説明したが、標識物質が化学発光の場合では、電極10を設ける必要は無い。
以上のことから、目的の抗原が存在する場合は、固相上に、結合体・標識物質結合アビジン複合体が形成される。標識物質結合アビジンは、ビオチンビス体を介して連鎖的に複合体を形成しているので、標識物質結合アビジン同士が立体障害を起こすことがなく、アナライトを高感度に検出することができる。
以下に、本発明のアナライト分析方法を用いたTNF−αの測定手順を詳細に説明する。ここで用いる固相固定化抗体及び、ビオチン修飾抗体は、R&D Systems社製のDuOSET ELISA Development Systemのhuman TNF−α/TNFSF1Aキットを使用した。
(1)抗体(TNF−α抗体)固定化磁気ビーズの調製
invitrogen社製の直径1.5μmのシリカコーティング磁気ビーズ(1mg/mL)50μLを採取し、磁石で磁気ビーズを引き寄せて、上澄みを廃棄した。その後、pH7.4に調整した10mMのリン酸緩衝液1mL添加し、攪拌させて、再度磁気ビーズを引き寄せて上澄みを廃棄した(以降、緩衝液添加から上澄みの廃棄までの工程を洗浄操作と略す)。
invitrogen社製の直径1.5μmのシリカコーティング磁気ビーズ(1mg/mL)50μLを採取し、磁石で磁気ビーズを引き寄せて、上澄みを廃棄した。その後、pH7.4に調整した10mMのリン酸緩衝液1mL添加し、攪拌させて、再度磁気ビーズを引き寄せて上澄みを廃棄した(以降、緩衝液添加から上澄みの廃棄までの工程を洗浄操作と略す)。
この磁気ビーズに、10mMのリン酸緩衝液300μLと、上述したキットに含まれる固相固定化抗体(Capture antibody)を200μL添加した。そして、さらにウシ血清アルブミン(以降、BSAと略す)を1%含んだ10mMのリン酸緩衝液を100μL添加した後、37℃で18時間穏やかに攪拌させることにより、磁気ビーズに固相固定化抗体を結合させた。
次に、洗浄操作を行った後、磁気ビーズのコーティング剤としてBSAを3%含んだ10mMのリン酸緩衝液を1mL添加し、37℃で2時間反応させた。このようにして、TNF−α抗体固定化磁気ビーズを得た。
(2)抗原(TNF−α)と磁気ビーズ固定化抗体の結合
まず、サンプルであるTNF−αを1%BSA含有10mMリン酸緩衝液で100pg/mLに濃度調整した。次に、(1)で調製したTNF−α抗体固定化磁気ビーズを25μL採取し、磁石で磁気ビーズを引き寄せて、上澄みを廃棄した。その後、上述したTNF−αを500μL添加して、30℃で1時間反応させた。
まず、サンプルであるTNF−αを1%BSA含有10mMリン酸緩衝液で100pg/mLに濃度調整した。次に、(1)で調製したTNF−α抗体固定化磁気ビーズを25μL採取し、磁石で磁気ビーズを引き寄せて、上澄みを廃棄した。その後、上述したTNF−αを500μL添加して、30℃で1時間反応させた。
(3)TNF−αとビオチン修飾抗体の反応
キットのビオチン修飾抗体(Detection antibody)を10μL採取し、1%BSA含有10mMリン酸緩衝液440μLで希釈した。(2)の反応後、0.1%polyoxyethylene(10)isooctylphenylether(以降、TritonX−100と略す)含有10mMリン酸緩衝液で洗浄操作を3回行い、未反応物などを除去した。この磁気ビーズに、前記ビオチン修飾抗体450μLを添加し、30℃で1時間反応させることにより、TNF−αとの抗原抗体反応を行った。
キットのビオチン修飾抗体(Detection antibody)を10μL採取し、1%BSA含有10mMリン酸緩衝液440μLで希釈した。(2)の反応後、0.1%polyoxyethylene(10)isooctylphenylether(以降、TritonX−100と略す)含有10mMリン酸緩衝液で洗浄操作を3回行い、未反応物などを除去した。この磁気ビーズに、前記ビオチン修飾抗体450μLを添加し、30℃で1時間反応させることにより、TNF−αとの抗原抗体反応を行った。
(4)ルテニウム錯体修飾アビジンの合成
標識物質には、電気化学発光物質である、ルテニウム錯体を使用し、以下のようにしてアビジンへ修飾した。
標識物質には、電気化学発光物質である、ルテニウム錯体を使用し、以下のようにしてアビジンへ修飾した。
(4−1)ルテニウム錯体の合成
まず、テトラヒドロフラン(以降、THFと略す)60.0mLに溶解させた4,4´−ジメチル−2,2´ビピリジン2.50g(13.5mmol)溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド2M溶液16.9mL(27.0mmol)を滴下し、氷冷しながら30分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、1,3−ジブロモプロパン4.2mL(41.1mmol)とTHF10mLとを加え、氷冷しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて2.5時間反応させた。反応溶液は2Nの塩酸で中和し、THFを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Aを得た(収率47.2%)。
まず、テトラヒドロフラン(以降、THFと略す)60.0mLに溶解させた4,4´−ジメチル−2,2´ビピリジン2.50g(13.5mmol)溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド2M溶液16.9mL(27.0mmol)を滴下し、氷冷しながら30分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、1,3−ジブロモプロパン4.2mL(41.1mmol)とTHF10mLとを加え、氷冷しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて2.5時間反応させた。反応溶液は2Nの塩酸で中和し、THFを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Aを得た(収率47.2%)。
次に窒素雰囲気の容器に、前記生成物A1.0g(3.28mmol)、フタルイミドカリウム0.67g(3.61mmol)、及び脱水したジメチルホルムアミド(以降、DMFと略す)30.0mLを加え、オイルバスで18時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、0.2N水酸化ナトリウム50mL及び蒸留水200mLで洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Bを得た(収率61.5%)。
三塩化ルテニウム(2.98g、0.01mol)、及び2,2´−ビピリジン(3.44g、0.022mol)をDMF(80.0mL)中で6時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、18時間4℃に冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液170mL(エタノール:水=1:1)を加え1時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを20g加え、エタノールを留去し、さらに16時間4℃で静置した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Cを得た(収率68.2%)。
窒素置換した容器に、前記生成物B0.50g(1.35mmol)、前記生成物C0.78g(1.61mmol)、及びエタノール50mLを加えた。9時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、1.0Mの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Dを得た(収率81.6%)。
さらに、前記生成物D1.0g(1.02mmol)、及びメタノール70.0mLを
1時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物0.21mL(4.21mm
ol)を加え再び13時間還流した。反応後、蒸留水を15mL加え、メタノールを留去
した。
1時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物0.21mL(4.21mm
ol)を加え再び13時間還流した。反応後、蒸留水を15mL加え、メタノールを留去
した。
次に、濃塩酸を5.0mL加え、2時間還流して得られた反応液を4℃で16時間静置し、析出した不純物を自然ろ過で除去した。
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、蒸留水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、目的物である標識物質(化1)を得た(収率71.4%)。
表1は、前述のようにして得たルテニウム錯体(化1)の1H-NMR結果である。
(4−2)ルテニウム錯体修飾アビジンの合成
ストレプトアビジン1.0mgをpH7.4に調整した10mMのリン酸緩衝液1mLに溶解させた。これに、N−ヒドロキシ琥珀酸イミドを1.0mg(8.69μmol)、1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)−carbodiimide hydrochlorideを14.0mg(73.0μmol)添加して、30℃で1時間反応させた。その後、ルテニウム錯体1.3mg(1.52μmol)とトリエチルアミン0.4μL(2.86μmol)を1mLの10mMのリン酸緩衝液で溶解させた溶液を添加し、さらに30℃で18時間反応させた。
ストレプトアビジン1.0mgをpH7.4に調整した10mMのリン酸緩衝液1mLに溶解させた。これに、N−ヒドロキシ琥珀酸イミドを1.0mg(8.69μmol)、1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)−carbodiimide hydrochlorideを14.0mg(73.0μmol)添加して、30℃で1時間反応させた。その後、ルテニウム錯体1.3mg(1.52μmol)とトリエチルアミン0.4μL(2.86μmol)を1mLの10mMのリン酸緩衝液で溶解させた溶液を添加し、さらに30℃で18時間反応させた。
この反応液を透析膜に注入し、10mMのリン酸緩衝液で2日間透析を行い、未反応のルテニウム錯体などを除去することで、ルテニウム錯体修飾アビジンを得た。
(5)ビオチンビス体の合成
ビオチンビス体(化2)は以下のようにして合成した。まず、ビオチン50mg(205μmol)をDMF15mLに溶解させ、これにジシクロヘキシルカルボジイミド(以降、DCCと略す)を172mg(834μmol)添加し、25℃で2時間反応させた。
ビオチンビス体(化2)は以下のようにして合成した。まず、ビオチン50mg(205μmol)をDMF15mLに溶解させ、これにジシクロヘキシルカルボジイミド(以降、DCCと略す)を172mg(834μmol)添加し、25℃で2時間反応させた。
1,4−シクロヘキサンビス(メチルアミン)12.8mg(90μmol)とトリエチルアミン28.7μL(205μmol)とをDMF1mLに溶解させた溶液を、前記ビオチン溶液に滴下して、さらに18時間25℃で攪拌させた。
反応後、エバポレーターによりDMFを留去した後、酢酸エチルを添加して、目的物を溶解させ、残渣をろ過で除去した。再度エバポレーターにより酢酸エチルを留去し、ジエチルエーテルとメタノールの混合溶媒を添加して、残留したDCC等を除去することにより、ビオチンビス体を得た。
このビオチンビス体は、1H−NMRで構造を確認したところ、1〜3ppmにかけてシグナルが重複していたため、ビオチン単体との識別が出来なかった。そこで、薄層クロマトグラフィーにて確認した。固定相をシリカ、移動相をメタノール:クロロホルム=1:3の体積比で混合させた溶液で展開させたところ、ビオチンのRf値は0.28であったのに対し、生成物は0.68であった。なお、他の原料も確認したが、これとは違う位置であったため、目的物のビオチンビス体が合成できたと判断した。
(6)ビオチン修飾抗体とルテニウム錯体修飾アビジンとの結合
(3)でビオチン修飾抗体を結合させた磁気ビーズは、0.1%TritonX−100含有10mMリン酸緩衝液で3回洗浄操作を行った。この磁気ビーズに、(4)で合成したルテニウム錯体修飾アビジンを5μL採取し、1%BSA含有10mMリン酸緩衝液440μLで希釈した溶液を添加した。
(3)でビオチン修飾抗体を結合させた磁気ビーズは、0.1%TritonX−100含有10mMリン酸緩衝液で3回洗浄操作を行った。この磁気ビーズに、(4)で合成したルテニウム錯体修飾アビジンを5μL採取し、1%BSA含有10mMリン酸緩衝液440μLで希釈した溶液を添加した。
30℃で30分間攪拌させた後、再度0.1%TritonX−100含有10mMリン酸緩衝液で3回洗浄操作を行った。さらに10mMリン酸緩衝液で洗浄し、上澄みを完全に除去した後、同緩衝液で20μLに置換した。
(7)ビオチンビス体・ルテニウム錯体修飾アビジンの複合体形成
(5)で合成したビオチンビス体をジメチルスルホキシドに溶解させて、10mMに濃度調整し、さらに10mMリン酸緩衝液を添加して、1万倍希釈した。このビオチンビス体溶液450μLを(6)の磁気ビーズ液に添加し、10分攪拌させた後、ルテニウム錯体修飾アビジン10μLを1%BSA含有10mMリン酸緩衝液440μLで希釈した溶液を添加した。
(5)で合成したビオチンビス体をジメチルスルホキシドに溶解させて、10mMに濃度調整し、さらに10mMリン酸緩衝液を添加して、1万倍希釈した。このビオチンビス体溶液450μLを(6)の磁気ビーズ液に添加し、10分攪拌させた後、ルテニウム錯体修飾アビジン10μLを1%BSA含有10mMリン酸緩衝液440μLで希釈した溶液を添加した。
30℃で30分間反応させた後、0.1%TritonX−100含有10mMリン酸緩衝液で3回洗浄操作を行った。さらに10mMリン酸緩衝液で洗浄し、上澄みを完全に除去した後、同緩衝液で20μLに置換した。
(8)磁気ビーズの電極固定
電極には、金電極を使用した。この金電極は、ガラス基板上にスパッタ装置(アルバック製SH−350)によりチタン10nmを下地に金200nmを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで準備した。60℃に加熱したホットプレート上に電極を置き、上述で得られた磁気ビーズ液を2.5μL滴下して乾燥固定した。これを、実施例とした。
電極には、金電極を使用した。この金電極は、ガラス基板上にスパッタ装置(アルバック製SH−350)によりチタン10nmを下地に金200nmを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで準備した。60℃に加熱したホットプレート上に電極を置き、上述で得られた磁気ビーズ液を2.5μL滴下して乾燥固定した。これを、実施例とした。
なお、従来例として、工程1、2、3、4、6により得られた、ビオチン−ルテニウム錯体修飾アビジン結合サンプルを作製し、同様の工程で電極上に磁気ビーズを乾燥固定させた。また、さらに、コントロールとして、TNF−αを添加することなく、各工程を行った磁気ビーズも電極に乾燥固定させた。
(9)電気化学発光測定
0.1Mのリン酸緩衝液及び、0.1Mのトリエチルアミンを混合した電解液をそれぞれの電極に80μL滴下し、電極に電圧を印加することにより発生した電気化学発光の発光量を測定した。電圧の印加は、0Vから1.3Vまで走査し、4秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管(浜松ホトニクス製H7360−01)を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
0.1Mのリン酸緩衝液及び、0.1Mのトリエチルアミンを混合した電解液をそれぞれの電極に80μL滴下し、電極に電圧を印加することにより発生した電気化学発光の発光量を測定した。電圧の印加は、0Vから1.3Vまで走査し、4秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管(浜松ホトニクス製H7360−01)を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
図2は、実施例、従来例及びコントロールにおけるTNF−αの電気化学発光量の測定結果である。従来例の最大発光量は366カウントだが、実施例の最大発光量は6482カウントと従来例の18倍の値を示している。なお、コントロールとしてTNF−αを含まないサンプルを測定したときの最大発光量は124カウントであったことから、実施例は、アナライトに対して特異的に発光していることが分かる。以上の結果から、実施例は、ビオチンビス体により、ルテニウム錯体修飾アビジンが連鎖的に複合体を形成したと考えられる。このように、本発明の手法を用いれば、高感度に目的のアナライトを検出できることが分かる。
本発明にかかるアナライト分析方法は、ビオチンビス体を用いて、標識物質修飾アビジンの複合体を効率よく形成させる。そのため、試料中に存在する特定のアナライトを高感度に検出することができ、免疫診断、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途等に適用できる。
1 固相(磁気ビーズ)
2 リガンド(抗体)
3 アナライト(抗原)
4 ビオチン修飾リガンド(抗体)
5 ビオチン
6 標識物質
7 アビジン
8 リンカー
9 ビオチンビス体
10 電極
2 リガンド(抗体)
3 アナライト(抗原)
4 ビオチン修飾リガンド(抗体)
5 ビオチン
6 標識物質
7 アビジン
8 リンカー
9 ビオチンビス体
10 電極
Claims (8)
- アナライトとビオチン修飾リガンドとを反応させ結合体を形成させる結合体形成ステップと、
前記結合体に標識物質修飾アビジンとビオチンビス体とを添加しアビジン−ビオチン反応を行い結合体と標識物質修飾アビジンとの複合体を形成させる複合体形成ステップと、
前記複合体中の標識物質修飾アビジンの標識物質から信号を生成させ前記信号を検出することでアナライトの分析を行う分析ステップと、
からなる、アナライト分析方法。 - 前記ビオチンビス体は、2つのビオチンをリンカーにより架橋させた構造である請求項1に記載のアナライト分析方法。
- 前記リンカーの長さは、0.14nmから6nmである請求項2に記載のアナライト分析方法。
- 前記リンカーは、アルキル、アルコール、カルボン酸、スルホン酸、エステル、ケトン、チオール、エーテル、アミン、ニトロ、ニトリル、糖、リン酸、アミノ酸、メタクリル酸、アミド、イミド、イソプレン、ウレタン、ウロン酸、エチレン、カーボネート、ビニル、ヒドラゾン、環式化合物、ヘテロ環式化合物またはこれらの組み合わせからなる請求項2に記載のアナライト分析方法。
- 前記アビジンは、卵白アビジン、ストレプトアビジン、リコンビナントアビジンである、請求項1に記載のアナライト分析方法。
- 前記アナライトは、抗原、抗体、核酸のいずれかでありリガンドと特異的に結合する物質である請求項1に記載のアナライト分析方法。
- 前記リガンドは、抗原、抗体、核酸のいずれかであり前記アナライトと特異的に結合する物質である請求項6に記載のアナライト分析方法。
- 前記標識物質は、電気化学発光性あるいは化学発光性のいずれかを性質を有する請求項1に記載のアナライト分析方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008288443A JP2010117140A (ja) | 2008-11-11 | 2008-11-11 | アナライト分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008288443A JP2010117140A (ja) | 2008-11-11 | 2008-11-11 | アナライト分析方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010117140A true JP2010117140A (ja) | 2010-05-27 |
Family
ID=42304919
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008288443A Pending JP2010117140A (ja) | 2008-11-11 | 2008-11-11 | アナライト分析方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2010117140A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012029202A1 (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Panasonic Corporation | A method for immobilizing streptavidin on a self-assembled monolayer |
JP2012225885A (ja) * | 2011-04-22 | 2012-11-15 | Nara Institute Of Science & Technology | 被検物質の電気化学的検出方法 |
US8871457B2 (en) | 2010-10-19 | 2014-10-28 | Panasonic Healthcare Co., Ltd | Method for immobilizing glucose oxidase on a self-assembled monolayer |
US8980645B2 (en) | 2010-01-25 | 2015-03-17 | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | Method for immobilizing protein A on a self-assembled monolayer |
CN108351351A (zh) * | 2015-11-09 | 2018-07-31 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 使用亲和素和生物素的试验 |
WO2023088402A1 (zh) * | 2021-11-22 | 2023-05-25 | 菲鹏生物股份有限公司 | 一种捕获法检测抗体的方法和应用 |
-
2008
- 2008-11-11 JP JP2008288443A patent/JP2010117140A/ja active Pending
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8980645B2 (en) | 2010-01-25 | 2015-03-17 | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | Method for immobilizing protein A on a self-assembled monolayer |
WO2012029202A1 (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Panasonic Corporation | A method for immobilizing streptavidin on a self-assembled monolayer |
JP2012526725A (ja) * | 2010-08-30 | 2012-11-01 | パナソニック株式会社 | ストレプトアビジンを自己組織化膜上に固定する方法 |
US8785143B2 (en) | 2010-08-30 | 2014-07-22 | Panasonic Healthcare Co., Ltd. | Method for immobilizing streptavidin on a self-assembled monolayer |
US8871457B2 (en) | 2010-10-19 | 2014-10-28 | Panasonic Healthcare Co., Ltd | Method for immobilizing glucose oxidase on a self-assembled monolayer |
JP2012225885A (ja) * | 2011-04-22 | 2012-11-15 | Nara Institute Of Science & Technology | 被検物質の電気化学的検出方法 |
CN108351351A (zh) * | 2015-11-09 | 2018-07-31 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 使用亲和素和生物素的试验 |
WO2023088402A1 (zh) * | 2021-11-22 | 2023-05-25 | 菲鹏生物股份有限公司 | 一种捕获法检测抗体的方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105153115B (zh) | 含两性离子的吖啶鎓化合物 | |
JP5070057B2 (ja) | 新規な蛍光標識化合物 | |
JP2010117140A (ja) | アナライト分析方法 | |
CN1612861A (zh) | 非特异性结合特性改善的ecl标记物、其使用方法以及包含该标记物的试剂盒 | |
CN109030829A (zh) | 一种均相化学发光法检测犬il-6的定量试剂盒及其使用方法 | |
CN106066324B (zh) | 一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法 | |
US8389298B2 (en) | Methods using novel chemiluminescent labels | |
US20210130876A1 (en) | Method of improving electrochemiluminescence signal in bioanalytical assays | |
JPH08504751A (ja) | ビオチニル化した化学発光性標識、結合体、測定法及び測定法キット | |
CN103649069B (zh) | 闪光和辉光1,2-二氧杂环丁烷类 | |
JP2010107207A (ja) | 免疫分析試薬及びそれを用いた免疫分析方法 | |
US20060205094A1 (en) | Methods using novel chemiluminescent labels | |
JP4701176B2 (ja) | 遺伝子検出方法、及び挿入剤 | |
JP2007232675A (ja) | 遺伝子検出方法 | |
JP2007232676A (ja) | 遺伝子検出方法 | |
JP2009139308A (ja) | 遺伝子検出方法 | |
JP5408905B2 (ja) | 抗体又は抗原の定量方法 | |
JP2012177683A (ja) | 甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途 | |
JP5344450B2 (ja) | 電解発光物質を内封するリポソームを用いた迅速高感度アッセイ法 | |
US20080166712A1 (en) | Gene detection method | |
JP6735665B2 (ja) | 安定性が改善され迅速に発光する親水性高量子収率アクリジニウムエステル | |
JP2009234934A (ja) | 電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物 | |
JPWO2006038686A1 (ja) | 遺伝子検出方法、及び遺伝子検出装置 | |
JP2009192349A (ja) | 生体サンプル分析方法 | |
JP2006345834A (ja) | 遺伝子検出方法、及び標識プローブ |