KR20080054962A

KR20080054962A - Ｄｎａ 서열을 포함하는 폴리다이아세틸렌 센서칩 및 그제조방법

Info

Publication number: KR20080054962A
Application number: KR1020060127712A
Authority: KR
Inventors: 안동준; 김종만; 양두호; 김은진; 김주미
Original assignee: 안동준; 김종만
Priority date: 2006-12-14
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2008-06-19
Also published as: KR100847311B1

Abstract

본 발명은 DNA 서열을 포함하는 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene) 센서칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 분석대상에 대응되는 프루브(probe) DNA 서열, 폴리다이아세틸렌 소포(vesicle), 및 기판을 결합시켜 분석대상에 별도의 표지처리 없이 빠른 응답시간을 보이는 센서칩 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 핵산 서열의 검출을 위한 프루브로서의 DNA 서열을 폴리다이아세틸렌 소포에 결합시킴과 아울러, 상기 소포를 글래스슬라이드에 마이크로어레이 형태로 점적, 고정화하여 센서칩을 제조할 수 있으며, 상기 센서칩은 프루브 DNA 서열과 핵산 서열의 특정 결합에 의해서만 소포의 색전이 및 형광 발현을 일으킬 수 있어, 본 발명의 마이크로어레이 형태의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 분석대상에 대한 별도의 표지 없이도, 그리고 종래 액상 반응에 비해 훨씬 적은 양의 폴리다이아세틸렌 및 분석대상물로, DNA 서열 - 핵산 서열 수준의 반응을 검출할 수 있다. 나아가, 고감도를 나타내면서도 소형화를 달성하여 휴대가 용이한 장점 또한 가지고 있다. 특히, 입수가 용이하고 소독제나 환경 변화에 대한 내성이 강해 생화학무기로의 활용가능성이 높은 탄저균의 특이유전자에 대해서도 짧은 시간 내에 정확한 분석이 가능함을 확인한 바, 진단분야 등에서의 이용가능성도 매우 높은 것으로 판단된다.

폴리다이아세틸렌, 센서칩, 마이크로어레이, 색전이, 형광, 탄저균

Description

ＤＮＡ 서열을 포함하는 폴리다이아세틸렌 센서칩 및 그 제조방법 {Polydiacetylene Sensor Chip Comprising DNA Sequence and Manufacturing Process thereof}

도 1은 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조 및 분석대상물 검출에 대한 일실시예의 개략도이다.

도 2는 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩의 각 제조단계를 형광 현미경으로 촬영한 사진 및 각 단계의 개념도이다.

도 3은 대장균 특이유전자 및 이에 대응하는 프루브 DNA 서열이다.

도 4 및 5는 분석대상 DNA 서열의 농도를 달리하며 촬영한 사진 및 감도 측정 그래프이다.

도 6은 대장균 특이유전자에 대응하는 프루브 DNA 서열 및 상기 특이유전자의 염기를 변경한 일례이다.

도 7은 대장균 특이유전자 정상서열 및 상기 도 6의 변경서열을 검출한 결과를 촬영한 사진이다.

도 8은 프루브 DNA 서열의 염기를 변경하며 분석대상을 검출한 결과에 대한 일실시예를 촬영한 사진이다.

본 발명은 DNA 서열을 포함하는 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene) 센서칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 분석대상에 대응되는 프루브(probe) DNA 서열이 결합된 폴리다이아세틸렌 소포(小胞. vesicle)를 기판에 결합시켜 분석대상에 별도의 표지처리 없이 빠른 응답시간을 보이는 센서칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.

나노바이오센서란 첨단 나노기술에 의해 개선된 바이오센서로서 생체인지물질과의 결합에 의한 반응을 신호로 변환시키며, 특정한 물질에 대해 빠른 검사가 가능한 센서를 가리킨다. 이는 생물학적 개념의 효소-기질 복합체와 같은 원리로 하나의 리간드는 상기 리간드에 대한 특이 성분을 가지는 한 가지 물질에 대해서만 반응성을 보이며, 그 반응성 정도를 측정한다는 원리이다. 나노기술을 응용한 소형화된 바이오센서는 인체손상을 극소화하여 무통 인체진단을 가능하게 하며, 단일 세포를 직접 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한 나노기술을 응용한 높은 안정성, 빠른 응답시간, 고감도, 높은 선택성 등 동작특성이 향상된 바이오센서는 인체진단의 연속측정을 가능하게 하며 단분자 단위의 분석을 수행할 수 있게 한다

한편, 공액 폴리다이아세틸렌 소포는 독특한 발색 성질 때문에 화학적 또는 생물학적 센서로서 많은 연구가 이루어지고 있다. 10,12-펜타코사디이노익 애시드 (10,12-pentacosadiynoic acid. PCDA)와 같은 다이아세틸렌 단량체는 자외선 조사 하에서 1,4-첨가반응을 통해 중합이 이루어지며, 그 형태는 엔-인(ene-yne) 결합이 교대로 나타나는 중합사슬로서, 리포좀(liposome)과 유사한 소포를 형성한다.

상기 폴리다이아세틸렌 소포는 외부 교란, 예컨대 열, pH, 물리적 또는 화학적 자극, 또는 용매 등에 의해 청색에서 적색으로 변색하는 양색 발현능을 보인다. 나아가, 적색의 폴리다이아세틸렌 소포는 형광을 발현하는 성질까지 가지고 있어, 이러한 성질을 이용하여 각종 센서로서 개발되어 왔다. 예를 들어, 폴리다이아세틸렌 센서는 인플루엔자 바이러스, 콜레라 독성물질, 대장균, 올리고누클레오타이드, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides), 항체 및 항원 등을 성공적으로 검출해냈다.

그러나, 지금까지 바이오센서로서의 폴리다이아세틸렌의 적용은 대부분 수용액 상에서 이루어져, 다량의 소포, 항체 및 분석대상물질이 필요한 단점이 있었다. 이러한 한계 때문에 고체 물질 상에 고정화된 미세 패턴 형태의 바이오센서, 즉 바이오칩으로의 가능성이 모색되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 분석대상에 대응되는 프루브(probe) DNA 서열이 결합된 폴리다이아세틸렌 소포를 기판에 결합시킨 센서칩을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 폴리다이아세틸렌 센서칩을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여,

기판;

상기 기판에 결합되고, 하기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌(diacetylene)이 중합된 소포(vesicle); 및

상기 소포에 결합된 프루브(probe) DNA 서열

을 포함하는 것을 특징으로 한다:

A-(L₁)_d-(CH₂)_e-C≡C-C≡C-(CH₂)_f-(L₂)_g-B (1)

상기 식에서

d + g는 0, 1 또는 2이고,

e + f는 2 내지 50의 정수이고,

e 및 f는 1보다 큰 정수이고,

A 및 B는 서로 동일하거나 또는 동일하지 않고, 메틸기, 아민기, 카르복실기, 하이드록시기, 말레이미드기, 바이오틴(biotin)기, 하이드록시석신이미드(hydroxysuccinimide)기, 벤조산기 또는 에스테르기이고,

L₁ 및 L₂는 서로 동일하거나 또는 동일하지 않고, 탄소수가 2 이상인 알킬기, 하나 이상의 에틸렌옥시드기, 아민기, 아미드기, 에스테르기 또는 카르보닐기임.

또한, 상기 다이아세틸렌의 일부는 A 또는 B가 바이오틴기 또는 하이드록시석신이미드기인 것이 바람직하다.

또한, 상기 기판과 소포 사이, 상기 소포와 프루브 DNA 서열 사이, 또는 상기 기판과 소포 사이 및 상기 소포와 프루브 DNA 서열 사이가, 아비딘(avidin)-바이오틴 결합, 스트렙타비딘(streptavidin)-바이오틴 결합, 또는 하이드록시석신이미드에 의한 아민 치환결합인 것이 바람직하다.

또한, 상기 다이아세틸렌은

10,12-펜타코사디이노익 애시드-노르말-하이드록시석신이미드 [10,12-pentacosadiynoic acid-normal-hydroxysuccinimide. PCDA-NHS], PCDA-스페이서(spacer)-NHS, PCDA-바이오틴(Biotin), PCDA-스페이서-바이오틴 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 결합용 다이아세틸렌; 및

PCDA, PCDA-아닐린(aniline), PCDA-아미노부티릭 애시드(PCDA-aminobutyric acid. PCDA-ABA), PCDA-메타벤조익 애시드(PCDA-meta-benzoic acid. PCDA-mBzA) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 기타 다이아세틸렌

을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 결합용 다이아세틸렌은 PCDA-스페이서-NHS이고, 상기 기타 다이아세틸렌은 PCDA-mBzA인 것이 바람직하다.

또한, 상기 스페이서는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol. PEG)인 것이 바람직하다.

또한, 상기 스페이서는 2,2'-(에틸렌디옥시)-비스-(에틸아미드)-석시닉 안하 이드라이드[2,2'-(ethylenedioxy)-bis-(ethylamide)-succinic anhydride]인 것이 바람직하다.

또한, 상기 결합용 다이아세틸렌 : 기타 다이아세틸렌의 몰비는 1 내지 50 : 50 내지 99 인 것이 바람직하다.

또한, 상기 다이아세틸렌에 추가로 지질(lipid)이 첨가된 것이 바람직하다.

또한, 상기 지질은 1,2-디미리스토일-락-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-phosphocholine. DMPC)인 것이 바람직하다.

또한, 상기 지질은 다이아세틸렌 : 지질 = 100 : 0.001 내지 70의 몰비로 첨가되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 프루브 DNA 서열은 그 말단에 아민기를 결합시킨 것이 바람직하다.

또한, 상기 기판은 아민, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 말레이미드 또는 탄수화물로 표면이 개질된 유리, 금속 또는 플라스틱 재질의 기판인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법은,

(A) 상기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌을 소수성 용매에 용해시키고 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하거나, 물 또는 친수성 용매에 직접 혼합하는 단계;

(B) 상기 혼합된 다이아세틸렌 혼합물을 초음파 처리하여 분산시키는 단계;

(C) 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액을 기판에 점적(spotting)하는 단계; 및

(D) 상기 점적된 다이아세틸렌 분산액을 고정화시키는 단계

를 포함하고, 상기 단계 (B) 이후에,

(E) 상기 다이아세틸렌에 프루브 DNA 서열을 반응시키는 단계; 및

(F) 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액에, 또는 상기 다이아세틸렌 분산액으로 점적된 상기 기판에 자외선을 노광시켜 상기 다이아세틸렌을 중합시키는 단계

를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 단계 (A)의 소수성 용매는 클로로포름, 디메틸포름아미드(dimethylformamide. DMF), 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide. DMSO), 디클로로메탄, 헥산, 사이클로헥산, 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran. THF), 아세톤, 알콜 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 (A)에서 상기 소수성 용매에 용해시킨 후, 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하기 전에,

질소 또는 비활성 기체 (inert gas)를 주입하여 상기 소수성 용매를 제거하는 단계

를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 친수성 용매는 완충액을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 (A)의 물 또는 친수성 용매에 혼합한 후 70 내지 95 ℃에서 10 내지 30 분간 가열하는 단계

를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 상기 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 외부 자극에 의해 청색에서 적색으로 색전이를 일으키고 적색 형광을 나타내는 폴리다이아세틸렌 소포에 프루브(probe) DNA 서열을 결합시키고, 상기 소포를 기판에 결합시킨 폴리다이아세틸렌 센서칩을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.

여기서, 폴리다이아세틸렌은 상기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌 단량체를 정렬, 중합시켜 제조한다.

본 발명은 색전이 및 형광을 발현할 뿐만 아니라, 구조적으로 상기 기판 및 프루브 DNA 서열을 매개하는 폴리다이아세틸렌 소포가 기판 및 프루브 DNA 서열과 각각 결합할 수 있도록 상기 다이아세틸렌의 일부가 그 말단에 바이오틴기 또는 하이드록시석신이미드기를 가지는 것이 바람직하다.

특히, 상기 기판과 소포 사이, 상기 소포와 프루브 DNA 서열 사이, 또는 상 기 기판과 소포 사이 및 상기 소포와 프루브 DNA 서열 사이가, 아비딘-바이오틴 결합, 스트렙타비딘-바이오틴 결합, 또는 하이드록시석신이미드에 의한 아민 치환결합에 의해 결합되는 것이 바람직하다. 이를 통해, 프루브 DNA 서열에 일정한 방향성을 부여함으로써 분석 효율을 높일 수 있게 된다.

아비딘-바이오틴 결합, 스트렙타비딘-바이오틴 결합, 또는 하이드록시석신이미드에 의한 아민 치환결합에 의해 상기 기판 및 프루브 DNA 서열과 결합하는 다이아세틸렌의 예로는 PCDA-EDEA-SA-NHS (화학식 2), 및 PCDA-바이오틴 (화학식 3) 등을 들 수 있다.

물론, 기판 또는 프루브 DNA 서열과의 결합 길이 조절을 위해 PCDA와 NHS, 또는 PCDA와 바이오틴 사이에 스페이서를 도입할 수 있다. 상기 스페이서로는 소포의 색전이 및 형광 발현능을 해치지 않고, 프루브 DNA 서열의 결합을 방해하지 않으면 그 종류에 제한이 없으며, 이미 예시된 EDEA-SA 외에 예컨대 PEG 등을 들 수 있다.

이들 결합용 다이아세틸렌과 기타 다이아세틸렌, 예컨대 PCDA (화학식 4), PCDA-아닐린 (화학식 5), PCDA-ABA (화학식 6), 또는 PCDA-mBzA (화학식 7)를 혼합하여 본 발명의 소포용 다이아세틸렌 혼합물을 준비한다.

상기 혼합물 중, PCDA-바이오틴의 바이오틴기가 기판 또는 프루브 DNA 서열 의 아비딘(또는 스트렙타비딘)과 결합함으로써 상기 소포가 기판 또는 프루브 DNA 서열에 결합되고, PCDA-EDEA-SA-NHS의 하이드록시석신이미드기가 기판 또는 프루브 DNA 서열의 아민기로 치환되면서 상기 소포가 기판 또는 프루브 DNA 서열에 결합하게 된다. 이를 위해 프루브 DNA 서열의 말단, 바람직하게는 5' 말단에 아민기를 도입하는 것이 보다 바람직하다.

프루브로서 DNA 서열을 사용하는 본 발명에서는 결합용 다이아세틸렌으로서 PCDA-EDEA-SA-NHS를, 기타 다이아세틸렌으로서 PCDA-mBzA를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 다이아세틸렌 혼합물은 결합용 다이아세틸렌 : 기타 다이아세틸렌 몰비가 1 내지 50 : 50 내지 99 일 때 결합효율 및 분석효율이 높은 것으로 조사되었으며, 이러한 결과는 유사한 다른 단량체에서도 동일한 경향을 보였다.

나아가, 상기 다이아세틸렌에 추가로 1,2-디미리스토일-락-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-phosphocholine. DMPC. 화학식 8)과 같은 지질(lipid)을 첨가하는 경우 분석에 소요되는 시간이 단축되고 색전이가 더욱 선명하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 소포에 지질이 첨가됨에 따라 다이아세틸렌의 정렬이 흐트러져 수소결합력이 약화되고, 때문에 소포가 외부 자극에 더욱 민감하게 반응하는 결과를 초래하기 때문이다. 이러한 지질의 첨가량은 다이아세틸렌 : 지질 = 100 : 0.001 내지 70의 몰비로 첨가되는 것이 바람직하다.

그리고, 상기 프루브 DNA 서열은 DNA 서열이나 RNA 서열과 같은 핵산 서열을 검출할 수 있으면 그 종류에 제한이 없다.

그리고, 상기 기판은 아민, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 말레이미드 또는 탄수화물로 표면이 개질된 유리, 금속 또는 플라스틱 재질의 기판인 것이 바람직하며, 특히 아민으로 표면이 개질된 유리기판이 바람직하다.

첨부한 서열목록 1 및 2는 각각 대장균 및 탄저균의 특이유전자의 검출을 위한 프루브 DNA 서열의 일실시예로서 [서열목록 1 - http://www.ncbi.nlm.nih.gov, gi48994873, Escherichia coli K-12 MG1655, 서열목록 2 - T. Andrew Taton, Chad A. Mirkin and Rovert L. Letsinger, "Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes," Science, 289, 1757-1760 (2000)], 5' 말단에 바이오틴기 또는 아민기를 결합시킨 앱타머는 다음과 같다.

[서열목록 1-1]

바이오틴-5'-gtt acc cgt agg tag-3'

[서열목록 1-2]

아민-5'-gtt acc cgt agg tag-3'

[서열목록 2-1]

바이오틴-5'-atc ctt atc aat att taa caa taa tcc-3'

[서열목록 2-2]

아민-5'-atc ctt atc aat att taa caa taa tcc-3'

한편, 본 발명의 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법은, 먼저 상기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌을 소수성 용매에 용해시키고 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하거나, 물 또는 친수성 용매에 직접 혼합하는 단계로부터 시작된다. 이때 상기 소수성 용매에 용해시킨 후, 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하기 전에, 질소 또는 비활성 기체 (inert gas)를 주입하여 상기 소수성 용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 소수성 용매는 상기 다이아세틸렌을 용해시킬 수 있는 것이면 제한이 없으며, 일반적으로 클로로포름, DMF, DMSO, 디클로로메탄, 헥산, 사이클로헥산, THF, 아세톤, 알콜 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하고, 특히 DMSO가 바람직하다.

그리고, 상기 친수성 용매로는 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술포닉 애시드 (2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonic acid. HEPES), 인산 완충 함염물 (phosphate buffered saline. PBS), 2-(N-모르폴리노)에탄술포닉 애시드 [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid. MES]와 같은 완충액을 포함할 수 있다.

또한, 상기 물 또는 친수성 용매에 혼합한 후 70 내지 95 ℃에서 10 내지 30 분간 가열하여 다이아세틸렌 단량체들을 정렬함으로써 이후 자외선 조사에 의한 중 합시 중합도를 높일 수 있다.

상기 혼합된 다이아세틸렌 혼합물은 그 다음 초음파 처리하여 분산시키게 된다. 초음파 처리를 거친 다이아세틸렌 분산액은 여과한 후 저온에서 안정화시킨다. 이때 분산액에 바로 자외선을 조사하여 광중합시키는 것도 가능하나, 중합효율을 고려하면 이후 기판에 점적(spotting) 후 중합시키는 것이 더 바람직하다.

상기 다이아세틸렌 소포를 기판에 고정시키는 단계는 다음과 같다.

우선 기판과 소포 사이가 아비딘 또는 스트렙타비딘-바이오틴 결합으로 연결되는 경우는 아민으로 표면이 개질된 기판에 바이오틴기를 가진 화합물을 반응시켜 기판으로부터 바이오틴기가 노출되도록 한 다음, 상기 노출된 바이오틴기를 아비딘 또는 스트렙타비딘과 반응시킴으로써 기판으로부터 최종적으로 아비딘 또는 스트렙타비딘이 노출되도록 한다. 여기에 앞서 제조한 다이아세틸렌 분산액을 상기 기판에 점적하여, 상기 다이아세틸렌의 바이오틴기와 기판으로부터 노출된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 결합시킴으로써 소포를 기판에 고정화시킨다. 상기 바이오틴기를 가진 화합물은 바이오틴-노르말-하이드록시석신이미드(Biotin-normal-hydroxysuccinimide. 바이오틴-NHS)인 것이 특히 바람직하다.

기판과 소포 사이가 하이드록시석신이미드의 아민 치환결합으로 직접 연결되는 경우는 소포의 하이드록시석신이미드기를 기판의 아민으로 치환함으로써 직접 고정화가 이루어진다.

한편, 분석대상물과 직접 반응하는 프루브 DNA 서열은 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액, 상기 기판에 고정화된 다이아세틸렌 소포, 또는 자외선 조사에 의한 광중합이 이루어진 폴리다이아세틸렌 소포 중 어느 경우에도 결합이 가능하나, 기판에 고정화시키기 전 다이아세틸렌 분산액 상태에서 프루브 DNA 서열과 혼합하여 결합시키는 것이 결합효율 면에서 바람직하다.

상기 소포와 프루브 DNA 서열 사이는 프루브 DNA 서열의 아민기가 소포의 하이드록시석신이미드기를 치환결합함으로써 연결된다.

또는 프루브 DNA 서열을 바이오틴-NHS와 같은 바이오틴 함유 화합물과 반응시켜 바이오틴기가 말단에 위치하도록 처리하고, 소포의 바이오틴기에는 별도의 아비딘 또는 스트렙타비딘을 결합시킴으로써, 결과적으로 소포의 아비딘 또는 스트렙타비딘과 프루브의 바이오틴을 결합시키는 것도 가능하다. 이러한 결합 방식은 아비딘(또는 스트렙타비딘)과 바이오틴의 반응속도가 빠르다는 장점과 함께, 소포 위에 프루브의 오리엔테이션(방향성)을 일정하게 유지할 수 있다는 장점이 있어, 분석대상물과의 반응성을 향상시키고 분석효율을 높이는 결과를 가져온다.

먼저 다이아세틸렌 단량체 혼합물은 자가조립 단계를 거쳐 헤테로 나노좀 형태의 소포를 형성한다.

상기 소포는 바이오틴기 및 하이드록시석신이미드기가 노출되어 있는 중합 전의 소포로서 발색 및 형광을 띠지 않고 있다.

이를 단일가닥의 프루브 DNA 서열과 결합시킨 후 아민 또는 아비딘이 노출되어 있는 기판에 점적하고, 자외선 조사를 통해 광중합시키면, 소포의 하이드록시석 신이미드가 기판의 아민기에 의해 치환결합하거나, 소포의 바이오틴기가 기판의 아비딘과 결합하고, 프루브 DNA 서열의 아민기가 소포의 하이드록시석신이미드기를 치환결합하였으며, 중합 결과 소포는 청색을 띠게 된다.

여기에 분석대상물로서 목적가닥인 핵산 서열을 통과시키면, 상기 목적가닥은 소포에 결합된 프루브 DNA 서열과 혼성화되고, 그 결과 소포는 적색으로 색전이가 일어나며, 형광을 발현하여 분석이 가능하게 된다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.

실시예

실시예 1: PCDA - EDEA - SA - NHS 제조

하이드록시석신이미드기를 포함하는 다이아세틸렌 중 하나인 PCDA-EDEA-SA-NHS를 다음과 같이 합성하였다.

30 ml의 디메틸포름아미드(dimethylformamide. DMF)에 말단이 아민으로 치환되어 있는 PCDA-EDEA (J.-M. Kim, E.-K. Ji, S.-M. Woo, H.-W. Lee, and D.J. Ahn, “Immobilized polydiacetylene vesicles on solid substrates for use as chemosensors,” Advanced Materials, 15, 1118-1121 (2003)) 1 g (1.98 mmol)을 넣은 용액을 먼저 준비하고, 이것을 역시 30 ml DMF에 0.792 g (7.92 mmol)의 석시닉 안하이드라이드 (succinic anhydride)가 녹아 있는 용액에 적하(dropwise)시키고, 하루 동안 실온에서 교반시켰다. 그 다음 진공에서 농축시켜 수득한 잔류물을 에틸아세테이트에 용해시키고 물과 함께 추출했다. 이렇게 수득한 유기층을 모아 농축시켜 하얀색의 파우더(PCDA-EDEA-SA)를 얻었다 (1.07 g, 89 %).

그런 다음 얻어진 파우더 (0.40 g, 0.66 mmol PCDA-EDEA-SA)를 30 ml 클로로포름에 녹이고 여기에 0.23 g (1.98 mmol) 노르말-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)와 0.51 mg (2.64 mmol) (1-에틸디메틸아미노프로필)-카르보디이미드((1-ethyldimethylaminopropyl)-carbodiimide. EDC)를 함께 넣어주고 0 ℃ 에서 하루 동안 교반시켰다. 역시 진공에서 농축시키고 에틸아세테이트에 넣어 용해시킨 후 그 용액을 물과 함께 추출했다. 그 때의 유기층을 모아 농축시켜 최종적으로 PCDA-EDEA-SA-NHS 파우더를 수득했다 (0.24 g, 51 %).

실시예 2: 소포 제조

PCDA-EDEA-SA-NHS (실시예 1), PCDA-mBzA (D.J. Ahn, E.-H. Chae, G.-S. Lee, H.-Y. Shim, T.-E. Chang, K.-D. Ahn, and J.-M. Kim, "Colorimetric reversibility of polydiacetylene supramolecules having enhanced hydrogen-bonding under thermal and pH stimuli," Journal of the American Chemical Society, 125, 8976-8977 (2003))를 2.5 : 7.5의 몰비로 혼합하고, DMSO에 용해시켰다. 용해된 혼합물에 질소를 주입하여 상기 DMSO를 제거했다. 여기에 상기 단량체의 총농도가 1.0 mM이 되도록 증류수를 첨가하고, 80 ℃에서 15 분간 가열하여 분산시켰다. 상기 혼합물에 15 분간 초음파 처리 (Fisher Sonic Dismembrator Model 550 W, 동력의 25 %)하여, 단량체들을 정렬한 후 0.8 ㎛ PTFE 필터로 여과하고, 4 ℃에서 4 시간 동안 냉각시켰다.

실시예 3-1: 프루브 DNA 서열 결합 및 고정화 (1)

실시예 2의 소포 용액 200 ㎕에, 5' 말단에 아민기가 결합된 100 nM의 대장 균 특이유전자 서열 검출용 프루브 DNA 서열 (서열목록 1-1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov, gi48994873, Escherichia coli K-12 MG1655) 용액 100 ㎕를 첨가하고, 상온에서 2 시간 동안 인큐베이팅했다. 상기 프루브 DNA 서열이 결합된 소포 용액을 아민 코팅 글래스슬라이드 (NC-AMCS, Nuricell co.)에 점적했다 (Nano-plotter v 1.2, GeSim, German). 37 ℃에서 2 시간 동안 고정화한 후, 1 mM의 PBS (pH 7.2)로 1 분간 세척한 다음, 1 mW/㎠의 254 nm UV를 15 분간 조사하여 상기 소포 단량체를 중합시켰다.

실시예 3-2: 프루브 DNA 서열 결합 및 고정화 (1)

실시예 3-1과 동일한 과정을 거치되, 프루브 DNA 서열의 3' 말단에 형광 이소티오시아네이트 [fluorescein isothiocyanate. FITC - H. Lucy Tang and Jason G. Cyster,“Chemokine Up-Regulation and Activated T Cell Attraction by Maturing Dendritic Cells,”Science, 30, 819-822 (1999)]를 결합시켜, 표지 처리하였다.

실시예 4-1: 대장균 특이유전자 검출

하기 서열목록 3의 대장균 특이유전자 10 ㎕ (농도 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, 10 fM, 1 fM)를 상기 실시예 3-1 및 3-2의 글래스슬라이드 위에 분산시킨 후, 커버글래스로 덮고 상온에서 2 시간 동안 35 ℃에서 인큐베이팅한 다음, 1 mM의 PBS (pH 7.2)로 3 회 세척하고 색전이 및 형광도를 관찰하였다 (Olympus BX51).

[서열목록 3]

3'-caa tgg gca tcc atc-5'

실시예 4-2: 탄저균 특이유전자 검출

실시예 4-1과 동일한 과정을 거치되, 대장균 특이유전자 대신 하기 서열목록 4의 탄저균 특이유전자 (농도 10 nM)[서열목록 2 - T. Andrew Taton, Chad A. Mirkin and Rovert L. Letsinger, "Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes," Science, 289, 1757-1760 (2000)]를 사용하였으며, 인큐베이팅 온도는 43 ℃로 하였다.

[서열목록 4]

3'-tag gaa tag tta taa att gtt att agg-5'

비교예 1: 대장균 특이유전자의 염기서열 일부가 변경된 경우

상기 실시예 4-1의 대장균 특이유전자의 서열 대신 그 염기서열의 일부를 변경시킨 하기 서열목록 5 내지 8 (농도 10 nM)을 사용하고, 프루브 DNA 서열은 형광 표지된 상기 실시예 3-2의 것을 사용하였다.

[서열목록 5]

3'-caa tgg tag tcc atc-5'

[서열목록 6]

3'-caa tgg gaa tcc atc-5'

[서열목록 7]

3'-caa tgg gga tcc atc-5'

[서열목록 8]

3'-caa tgg gta tcc atc-5'

비교예 2: 무작위 프루브 DNA 서열을 사용한 경우

상기 실시예 3-1의 대장균 특이유전자 검출용 프루브 DNA 서열 대신 무작위 서열을 사용하였다.

도 2의 상단은 기판 위의 소포가 중합된 직후 녹색 필터 및 적색 필터로 촬영한 사진 및 개념도이다. 중합된 소포는 청색을 띠고 있으나, 아무런 형광을 발현하지 못하므로, 양 필터로 촬영하여도 아무런 형체가 나타나지 않았다.

중단은 말단이 형광물질로 표지된 프루브 DNA 서열을 상기 소포에 결합시킨 다음 촬영한 사진 및 개념도로서, 녹색 필터로 촬영시 상기 프루브 DNA 서열에 표지된 형광물질을 확인할 수 있다. 이를 통해 상기 소포가 기판에 고정화되어 있음을 알 수 있다. 다만, 소포 자체는 여전히 청색을 띠고 있는 바, 적색 형광을 관찰할 수 있는 적색 필터에서는 여전히 아무런 형체도 나타나지 않았다.

하단은 분석대상인 목적 DNA 서열이 프루브 DNA 서열과 혼성화된 후의 상태를 촬영한 사진 및 개념도로서, 상기 혼성화에 의해 소포가 적색으로 색전이를 일으키며, 적색 형광을 발현하게 되므로 녹색 필터에서 뿐만 아니라 적색 필터에 의해서도 형광을 확인할 수 있다.

도 3은 본 발명의 효과를 확인하기 위한 일실시예로서 분석대상인 목적가닥으로서의 대장균 특이유전자 (하단) 및 이에 대응하는 DNA 서열인 프루브 (상단)를 나타낸 것이다 (서열목록 1-1 및 3).

실시예 4-1에서와 같이 분석대상인 대장균 특이유전자의 농도를 달리하며 촬영한 결과 1 fM의 극미량 목적가닥도 검출할 수 있음을 확인하였다. 이는 종래 액상 반응에 의한 분석이 다량의 시료 (분석대상인 목적가닥)를 필요로 했던 문제점을 극복한 것으로, 기판 위에 폴리다이아세틸렌 소포를 도입한 칩 형태인 본 발명의 장점을 극명하게 보여준다.

도 6은 본 발명의 프루브 DNA 서열의 선택성 내지 특이성을 확인하기 위해 대장균 특이유전자의 염기서열을 변경한 일례를 나타낸다.

도 7은 대장균 특이유전자 정상서열 및 상기 도 6의 변경서열을 검출한 결과를 촬영한 사진이다 (비교예 1).

대장균 특이유전자의 정상서열과 반응시킨 경우 적색 형광을 발현하나, 인접한 세 염기를 다른 서열로 치환한 경우 목적 DNA와 혼성화가 이루어지지 않아 적색 형광을 발현하지 않으며, 그 결과 적색 필터에서 아무런 형체도 확인할 수 없었다. 나아가, 분석대상 DNA 서열의 염기 하나만 다른 염기로 치환하여도 형광이 나타나지 않으므로, 프루브 DNA 서열의 선택성 내지 특이성이 대단히 뛰어남을 알 수 있다.

소포의 고정화 확인을 위해 녹색 필터로 촬영한 결과 적색 형광을 보이지 않은 모든 샘플에서 녹색 형광을 관찰할 수 있으므로, 소포는 기판에 정확히 고정화 되었음을 알 수 있다.

도 8은 도 6 및 7의 경우와 반대로 프루브 DNA 서열의 염기서열을 변경한 경우의 형광 현미경 사진이다 (비교예 2).

도 8의 ①번 열은 서열목록 1-1의 서열을 가진 프루브 DNA 서열로 실험한 결과이며, ②번 및 ③번 열은 무작위로 합성된 프루브 DNA 서열로 검출실험을 수행한 결과이다.

도 8에서 확인할 수 있듯이 프루브 DNA 서열이 변경되는 경우 분석대상인 대장균 특이유전자를 검출하지 못함을 알 수 있다.

상기 시험결과들을 종합하면, 본 발명의 프루브 DNA 서열을 구비한 폴리다이아세틸렌 센서칩은 분석대상인 핵산 서열 중 염기 하나만 변경된 시료도 구별해 낼 만큼 높은 선택성을 지니고 있으면서도, fM 단위의 극미량 시료도 분석이 가능할 만큼 높은 감도를 가지고 있어, 핵산 서열의 분석을 위한 바이오센서로서 그 활용도가 매우 크다고 할 것이다. 특히, 탄저균은 입수가 용이하고 소독제나 환경 변화에 대한 내성이 강해 생화학무기로 전용될 위험성이 높아서 이에 대한 신속, 간편하면서도 정확한 분석기법이 강하게 요구되어 온 바, 본 발명의 센서칩은 상기 탄저균의 특이유전자를 신속, 정확하게 검출함으로써 이러한 요구를 충족시킬 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명에서는 프루브 DNA 서열과 세포의 특이유전자로 실험하였으나, 프루브 DNA 서열을 적절히 선택하면 콜레라 독성물질, 포스포라이페이즈(phospholipases), HIV 프로티에이즈 (HIV protease), MAP 카이네이즈 (MAP kinases), MEK 카이네이즈 (MEK kinases), 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 (Phosphoinositide 3-kinases), X인자 (Factor X), PDGF, FGF, ICAM, VCAM, E-셀렉틴(E-selectin), 트롬빈(thrombin), 브라디키닌(bradykinin), PGF2 등의 단백질과 관련된 핵산 서열, 및 대장균이나 탄저균, 바실러스, 살모넬라, 리스테리아, 결핵균, 불루셀라, 레지오넬라, 비브리오 등 미생물의 특이유전자와, 독감 바이러스, 간염바이러스, AIDS 바이러스, 헤퍼스바이러스, 한탄바이러스, 로타바이러스 등 바이러스의 특이유전자를 동일한 방식으로 검출할 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

본 발명에 따르면 DNA나 RNA와 같은 핵산 서열의 검출을 위한 프루브로서 DNA 서열을 폴리다이아세틸렌 소포에 결합시킴과 아울러, 상기 소포를 글래스슬라이드에 마이크로어레이 형태로 점적, 고정화하여 센서칩을 제조할 수 있으며, 상기 센서칩은 프루브 DNA 서열과 핵산 서열의 특정 결합에 의해서만 소포의 색전이 및 형광 발현을 일으킬 수 있어, 본 발명의 마이크로어레이 형태의 폴리다이아세틸렌 센서칩은 분석대상에 대한 별도의 표지 없이도, 그리고 종래 액상 반응에 비해 훨 씬 적은 양의 폴리다이아세틸렌 및 분석대상물로, DNA 서열 - 핵산 서열 수준의 반응을 검출할 수 있다. 나아가, 고감도를 나타내면서도 소형화를 달성하여 휴대가 용이한 장점 또한 가지고 있다. 특히, 입수가 용이하고 소독제나 환경 변화에 대한 내성이 강해 생화학무기로의 활용가능성이 높은 탄저균의 특이유전자에 대해서도 짧은 시간 내에 정확한 분석이 가능함을 확인한 바, 진단분야 등에서의 이용가능성도 매우 높은 것으로 판단된다.

<110> AHN, Dong June KIM, Jong-Man <120> POLYDIACETYLENE SENSOR CHIP COMPRISING DNA SEQUENCE AND MANUFACTURING PROCESS THEREOF <130> M04-5856-FD <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 gttacccgta ggtag 15 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 2 atccttatca atatttaaca ataatcc 27

Claims

기판;

상기 기판에 결합되고, 하기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌(diacetylene)이 중합된 소포(vesicle); 및

상기 소포에 결합된 프루브(probe) DNA 서열

을 포함하는 폴리다이아세틸렌 센서칩:

[화학식 1]

A-(L₁)_d-(CH₂)_e-C≡C-C≡C-(CH₂)_f-(L₂)_g-B (1)

상기 식에서

d + g는 0, 1 또는 2이고,

e + f는 2 내지 50의 정수이고,

e 및 f는 1보다 큰 정수이고,

A 및 B는 서로 동일하거나 또는 동일하지 않고, 메틸기, 아민기, 카르복실기, 하이드록시기, 말레이미드기, 바이오틴(biotin)기, 하이드록시석신이미드(hydroxysuccinimide)기, 벤조산기 또는 에스테르기이고,

L₁ 및 L₂는 서로 동일하거나 또는 동일하지 않고, 탄소수가 2 이상인 알킬기, 하나 이상의 에틸렌옥시드기, 아민기, 아미드기, 에스테르기 또는 카르보닐기임.
제 1 항에 있어서,

상기 다이아세틸렌의 일부는 A 또는 B가 바이오틴기 또는 하이드록시석신이미드기인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 1 항에 있어서,

상기 기판과 소포 사이, 상기 소포와 프루브 DNA 서열 사이, 또는 상기 기판과 소포 사이 및 상기 소포와 프루브 DNA 서열 사이가, 아비딘(avidin)-바이오틴 결합, 스트렙타비딘(streptavidin)-바이오틴 결합, 또는 하이드록시석신이미드에 의한 아민 치환결합인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 1 항에 있어서, 상기 다이아세틸렌은

10,12-펜타코사디이노익 애시드-노르말-하이드록시석신이미드 [10,12-pentacosadiynoic acid-normal-hydroxysuccinimide. PCDA-NHS], PCDA-스페이서(spacer)-NHS, PCDA-바이오틴(Biotin), PCDA-스페이서-바이오틴 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 결합용 다이아세틸렌; 및

PCDA, PCDA-아닐린(aniline), PCDA-아미노부티릭 애시드(PCDA-aminobutyric acid. PCDA-ABA), PCDA-메타벤조익 애시드(PCDA-meta-benzoic acid. PCDA-mBzA) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 기타 다이아세틸렌

을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 4 항에 있어서,

상기 결합용 다이아세틸렌은 PCDA-스페이서-NHS이고, 상기 기타 다이아세틸렌은 PCDA-mBzA인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 4 항에 있어서,

상기 스페이서는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol. PEG)인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 4 항에 있어서,

상기 스페이서는 2,2'-(에틸렌디옥시)-비스-(에틸아미드)-석시닉 안하이드라이드[2,2'-(ethylenedioxy)-bis-(ethylamide)-succinic anhydride]인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 8 항에 있어서,

상기 결합용 다이아세틸렌 : 기타 다이아세틸렌의 몰비는 1 내지 50 : 50 내지 99 인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 1 항에 있어서,

상기 다이아세틸렌에 추가로 지질(lipid)이 첨가된 것을 특징으로 하는 폴리 다이아세틸렌 센서칩.
제 9 항에 있어서,

상기 지질은 1,2-디미리스토일-락-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-phosphocholine. DMPC)인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 9 항에 있어서,

상기 지질은 다이아세틸렌 : 지질 = 100 : 0.001 내지 70의 몰비로 첨가되는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 1 항에 있어서,

상기 프루브 DNA 서열은 그 말단에 아민기를 결합시킨 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
제 1 항에 있어서,

상기 기판은 아민, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 말레이미드 또는 탄수화물로 표면이 개질된 유리, 금속 또는 플라스틱 재질의 기판인 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩.
(A) 하기 화학식 1의 구조를 가지는 다이아세틸렌을 소수성 용매에 용해시키고 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하거나, 물 또는 친수성 용매에 직접 혼합하는 단계:

[화학식 1]

A-(L₁)_d-(CH₂)_e-C≡C-C≡C-(CH₂)_f-(L₂)_g-B (1)

상기 식에서

d + g는 0, 1 또는 2이고,

e + f는 2 내지 50의 정수이고,

e 및 f는 1보다 큰 정수이고,

A 및 B는 서로 동일하거나 또는 동일하지 않고, 메틸기, 아민기, 카르복실기, 하이드록시기, 말레이미드기, 바이오틴(biotin)기, 하이드록시석신이미드기, 벤조산기 또는 활성화된 에스테르기이고,

L₁ 및 L₂는 서로 동일하거나 또는 동일하지 않고, 탄소수가 2 이상인 알킬기, 하나 이상의 에틸렌옥시드기, 아민기, 아미드기, 에스테르기 또는 카르보닐기임;

(B) 상기 혼합된 다이아세틸렌 혼합물을 초음파 처리하여 분산시키는 단계;

(C) 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액을 기판에 점적(spotting)하는 단계; 및

(D) 상기 점적된 다이아세틸렌 분산액을 고정화시키는 단계

를 포함하고, 상기 단계 (B) 이후에,

(E) 상기 다이아세틸렌에 프루브 DNA 서열을 반응시키는 단계; 및

(F) 상기 분산된 다이아세틸렌 분산액에, 또는 상기 다이아세틸렌 분산액으로 점적된 상기 기판에 자외선을 노광시켜 상기 다이아세틸렌을 중합시키는 단계

를 추가로 포함하는 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene) 센서칩의 제조방법.
제 14 항에 있어서,

상기 단계 (A)에서 상기 소수성 용매에 용해시킨 후, 이를 물 또는 친수성 용매에 혼합하기 전에,

질소 또는 비활성 기체 (inert gas)를 주입하여 상기 소수성 용매를 제거하는 단계

를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법.
제 14 항에 있어서,

상기 친수성 용매는 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법.
제 14 항에 있어서,

상기 단계 (A)의 물 또는 친수성 용매에 혼합한 후 70 내지 95 ℃에서 10 내지 30 분간 가열하는 단계

를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리다이아세틸렌 센서칩의 제조방법.
제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 폴리다이아세틸렌 센서칩.