CN101206220A

CN101206220A - 非特异吸附防止剂、探针结合粒子以及它们的制造方法

Info

Publication number: CN101206220A
Application number: CNA2007101987754A
Authority: CN
Inventors: 田守功二; 高本英司
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2006-12-14
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2027-12-12
Also published as: JP2008170417A; JP5062410B2; CN101206220B

Abstract

本发明提供易于制造并且具有充分的噪音减低效果的非特异吸附防止剂、探针结合粒子以及它们的制造方法。非特异吸附防止剂的制造方法是使(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与(B)多胺反应，该多胺合计具有3～12个氨基和亚氨基或它们中的任一种。

Description

非特异吸附防止剂、探针结合粒子以及它们的制造方法

技术领域

本发明涉及可以适用于例如免疫诊断用粒子表面的非特异吸附防止剂、探针结合粒子以及它们的制造方法。

背景技术

近年来，出于疾病早期发现等的目的，要求检查的高灵敏化，诊断试剂的灵敏度提高成为重要课题。在使用磁性粒子等固相的诊断试剂中，为了提高灵敏度，作为检测法逐渐由使用酶显色的方式转换为可以得到更高灵敏度的使用荧光、化学发光的方式。由于这些检测技术的发展，据称理论上已达到在一分子检测对象物质的存在下即可检测的水平，但实际上却并未取得充分的灵敏度。其原因是，在血清等生物体分子的混合存在下检测特定物质的诊断中，共存的生物体分子和二次抗体、发光基质等非特异性地吸附于固相，其结果是噪音增加而妨碍高灵敏化。因此，在免疫诊断测定中，为了减少特异性结合物质以外的物质吸附于免疫反应中使用的固相表面(非特异吸附)而导致的灵敏度降低，通常将白蛋白、酪蛋白、明胶等来源于生物体的物质作为封阻剂来使用(或者，也称为“非特异吸附防止剂”)，由此抑制非特异吸附，降低噪音。

但是，即使进行这样的封阻操作，非特异性吸附仍然残留，而且使用这样的来源于生物体的封阻剂时，有BSE所代表的生物污染的可能性等，因此期望由化学合成得到的高性能封阻剂的开发。

作为由化学合成得到的封阻剂，提出了侧链上具有聚氧乙烯的乙烯基单体的共聚物(特开平11-287802号公报)，但是在这样的共聚物的制造中，分子量缺乏重现性，作为其结果是封阻效果缺乏重现性。另外，提出了单末端上具有2个氨基的聚氧乙烯(特许第3407397号说明书)，但是这样的封阻剂与固相的相互作用不充分，添加的封阻剂多数残存于水相中，是不经济的。进而，提出了将聚氧乙烯/五亚乙基六胺嵌段共聚物作为封阻剂(特开2006-226982号公报)，但是这样的共聚物的合成中，易生成聚氧乙烯的两末端经五亚乙基六胺修饰的化合物，制造·纯化困难。此外，作为与聚氧乙烯/五亚乙基六胺嵌段共聚物类似的封阻剂，公开了将缩醛末端的聚氧乙烯作为中间体的制造方法(再公表特许第WO2005/010529号说明书)，但是在该制造方法中，聚氧乙烯的二聚物大量生成，制造·纯化上存在问题。

发明内容

本发明的目的在于提供易于制造、具有充分的噪音减低效果的化学合成的非特异吸附防止剂、探针结合粒子以及它们的制造方法。

本发明者们为解决上述课题发现了作为非特异吸附防止剂易于制造的合成方法，进而发现，通过使用本非特异吸附防止剂来对免疫诊断用粒子进行处理，该粒子表现信号增强的效果，从而完成了本发明。

本发明一种方式涉及的非特异吸附防止剂的制造方法是使(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与(B)多胺反应，所述多胺合计具有3～12个氨基和亚氨基(-NH-)或它们中的任一种。

上述非特异吸附防止剂的制造方法中，上述(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物可以是在胺化合物的存在下使聚氧乙烯单甲醚与对甲苯磺酰氯反应而得的反应物。

上述非特异吸附防止剂的制造方法中，上述胺化合物可以是选自三甲胺盐酸盐、三甲胺氢溴酸盐、三甲胺氢氟酸盐、三甲胺硫酸盐、三甲胺硝酸盐、三甲胺磷酸盐、三乙胺、三丙胺和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺中的1种以上。

上述非特异吸附防止剂的制造方法中，上述胺化合物可以是将三甲胺盐酸盐与三甲胺以外的胺化合物混合而得的。

本发明一种方式涉及的非特异吸附防止剂含有下述通式(1)所示的化合物。

[式中，n为4～2000所示的数，R¹和R²各自独立地表示氢原子或者具有1～11个氨基和亚氨基或它们中的任一种的基团，并且R¹和R²所含有的氨基和亚氨基合计为2～11个。]

对于上述非特异吸附防止剂，在上述通式(1)中，R¹和R²可以分别表示下述通式(2a)和(2b)所示的基团。

[式中，x1和x2分别是1～4所示的数，y1和y2分别是0～11所示的数，y1+y2为2～11。]

本发明一种方式涉及的探针结合粒子的制造方法包括：使探针结合于粒子表面的工序以及使用上述非特异吸附防止剂来对结合有上述探针的上述粒子进行处理的工序。

在上述探针结合粒子的制造方法中，使上述探针结合的工序中，上述粒子可以具有选自羧基、活性酯基、甲苯磺酰基和环氧基中的至少1种基团。

在上述探针结合粒子的制造方法中，上述粒子可以是磁性粒子。

本发明一种方式涉及的探针结合粒子由上述探针结合粒子的制造方法得到。

本发明一种方式涉及的探针结合粒子在表面具有上述非特异吸附防止剂。

上述非特异吸附防止剂易于制造，并且由于是化学合成品而没有生物污染的可能性，而且与以往所使用的非特异吸附防止剂相比，噪音减低效果高。

此外，上述非特异吸附防止剂用于免疫诊断中使用的粒子(例如磁性粒子)时可以表现信号增强的效果。

具体实施方式

以下，对本发明一种实施方式涉及的非特异吸附防止剂、探针结合粒子以及它们的制造方法进行说明。

1.非特异吸附防止剂及其制造方法

本发明一种实施方式涉及的非特异吸附防止剂是(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与(B)多胺的反应生成物，所述多胺合计具有3～12个氨基和亚氨基(-NH-)或它们中的任一种。本实施方式的非特异吸附防止剂适于用作例如粒子的信号增强剂。此外，本实施方式的非特异吸附防止剂可以是上述反应生成物其本身，或者可以根据需要含有溶剂。

以下，说明本实施方式的非特异吸附防止剂的制造及构成。

1.1.(A)甲苯磺酰化物

所谓(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物，是通过将聚氧乙烯单甲醚进行甲苯磺酰化而得的α-甲基-ω-甲苯磺酰基聚氧乙烯。应予说明的是，本发明中所谓“甲苯磺酰化”，是指将羟基(-OH)转化为对甲苯磺酰氧基(-OTs基)。

在本实施方式中，聚氧乙烯单甲醚可以适用公知的物质，例如作为日本油脂公司制Uniox M系列、日本乳化剂公司制MPG系列、LION公司制LEOSOLB PEM系列等，各种分子量的聚氧乙烯单甲醚可以工业获得。

聚氧乙烯单甲醚的分子量优选200～100000，进而优选1000～10000。分子量如果不足200或超过100000，则都可能有噪音减低效果和信号增强效果不足的情况。

作为将聚氧乙烯单甲醚进行甲苯磺酰化的方法可以使用公知的方法，例如，通过使聚氧乙烯单甲醚与对甲苯磺酸盐反应而将聚氧乙烯单甲醚所具有的末端羟基的氢原子转化为甲苯磺酰基。作为对甲苯磺酸盐并无特别限制，可以列举对甲苯磺酰氯等。该工序典型的是，将聚氧乙烯单甲醚溶解于吡啶、二氯甲烷、乙腈等有机溶剂后，根据需要并用由胺化合物构成的胺催化剂，每1mol聚氧乙烯单甲醚添加1～5mol的对甲苯磺酰氯，在室温下反应10分钟～24小时来进行。由以上工序得到α-甲基-ω-甲苯磺酰基聚氧乙烯。

这里作为胺催化剂优选单独使用或合用以下的化合物：三甲胺盐酸盐、三甲胺氢溴酸盐、三甲胺氢氟酸盐、三甲胺硫酸盐、三甲胺硝酸盐、三甲胺磷酸盐、三乙胺、三丙胺和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺等。合用三甲胺盐酸盐与其它胺化合物来使用由于可以缩短反应时间、提高甲苯磺酰化率，因而特别优选。单独使用胺催化剂时，相对于每1mol聚氧乙烯单甲醚，胺催化剂的优选使用量为1.5～10mol；合用三甲胺盐酸盐与其它胺来使用时，三甲胺盐酸盐为0.1～3mol，其它胺为1.5～10mol。反应后的α-甲基-ω-甲苯磺酰基聚氧乙烯可以用乙醚、己烷等使其沉淀来纯化。通过这样的沉淀纯化，可以除去残余的对甲苯磺酸盐，可以防止与以下多胺的副反应。

1.2.(B)多胺

能够在本实施方式的非特异吸附防止剂的制造中使用的多胺是(B)合计具有3～12个氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺。

如果使用合计具有2个以下氨基和亚氨基或它们中任一种的胺化合物，即如果使用单胺或二胺，则生成的非特异吸附防止剂与固相的相互作用不充分，添加的非特异吸附防止剂多数残存于水相中，因此是不经济的，而且，以非特异吸附防止剂处理后在洗涤时容易解吸，因此噪音减低效果不充分。此外，解吸的非特异吸附防止剂有时会阻碍检测体系中添加的蛋白等，而使信号下降。

另一方面，如果使用合计具有13个以上氨基和亚氨基或它们中任一种的多胺，则经非特异吸附防止剂处理后的固相表面基于氨基而成为阳离子性，非特异性吸附增加，有时使噪音恶化。

作为(B)合计具有3～12个氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺，具体可以列举二亚甲基三胺、三亚甲基四胺、四亚甲基五胺、五亚甲基六胺、六亚甲基七胺、七亚甲基八胺、八亚甲基九胺、九亚甲基十胺、十亚甲基十一胺、十一亚甲基十二胺等多亚甲基胺(polymethyleneamine)；二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、六亚乙基七胺、七亚乙基八胺、八亚乙基九胺、九亚乙基十胺、十亚乙基十一胺、十一亚乙基十二胺等多亚乙基胺(polyethylene amine)；精胺、亚精胺等亚丙基-亚丁基系胺类等，这些多胺可以单独或将两种以上组合使用。考虑到作为非特异吸附防止剂在水中的溶解性及噪音减低效果等，优选(B)多胺为多亚乙基胺，更优选三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺，进而优选五亚乙基六胺。

1.3.非特异吸附防止剂的制造

(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与(B)合计具有3～12个氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺的反应典型的是，可以如下进行：在溶解有相对于(A)甲苯磺酰化物的摩尔数为2倍～100倍的(B)多胺的溶液中，在室温～60℃下，用1～24小时边滴加(A)的溶液边反应。该工序中可适用的溶剂是乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二甲基乙酰胺等非质子系极性溶剂。由以上工序生成本实施方式的非特异吸附防止剂。

所生成的非特异吸附防止剂优选用乙醚、异丙醇等有机溶剂沉淀而纯化。作为这时的有机溶剂，也可以很好地使用非极性溶剂与极性溶剂的混合溶剂，例如，己烷与乙酸乙酯的混合溶剂等。作为其它纯化方法，可以将生成的非特异吸附防止剂溶液溶解于水中，通过透析管、渗析器、ACILYZER等除去低分子化合物。这时，可以在溶于水之前用蒸发仪除去有机溶剂。通过这样的纯化可以除去残余的多胺、甲苯磺酰基化合物、催化剂等，可以维持高的噪音减低效果。

1.4.非特异吸附防止剂的制造

本实施方式的非特异吸附防止剂的典型结构是α-甲基-ω-多氨基化聚氧乙烯。

本实施方式的非特异吸附防止剂可以是多胺的末端伯胺基与聚氧乙烯的末端结合，也可以是多胺的非末端仲胺基与聚氧乙烯的末端结合。

此外，2分子以上的聚氧乙烯可以与1分子多胺结合。即，多胺的末端伯胺基和非末端仲胺基两者可以各自结合于聚氧乙烯的末端。

从噪音减低效果和信号增强效果的观点出发，本实施方式优选的非特异吸附防止剂的结构是1分子聚氧乙烯与1分子多胺结合的结构。1分子聚氧乙烯与1分子多胺结合的非特异吸附防止剂可以通过柱纯化而分离。此外，相对于1分子多胺结合多少分子的聚氧乙烯可以由液相色谱法进行分子量测定来判断。

本实施方式的非特异吸附防止剂中，多胺的末端伯胺基或仲胺基与聚氧乙烯的末端结合时，本实施方式的非特异吸附防止剂可以含有例如下述通式(1)所示结构的化合物。

上述通式(1)中，n优选20～200。

这时，在上述通式(1)中，R¹和R²可以分别表示下述通式(2a)和(2b)所示的基团。

上述通式(2)中，优选x1和x2为2，更优选y1和y2分别为1～6(但满足y1+y2＝2～11)。

1.5.非特异吸附防止剂的用途及探针结合粒子的制造

本实施方式的非特异吸附防止剂可以通过代替以往免疫诊断测定中使用的白蛋白、酪蛋白、明胶等，进一步抑制非特异吸附，减低噪音。

例如，在平板法中，可以向平板结合抗体等探针后，添加本实施方式的非特异吸附防止剂，对平板表面进行处理。

此外，本实施方式的非特异吸附防止剂可适用于例如探针结合粒子的制造。本实施方式的探针结合粒子的制造方法包括使探针结合于粒子表面的工序以及使用本实施方式的非特异吸附防止剂来对结合有探针的粒子进行处理的工序。

这里，使用本实施方式的非特异吸附防止剂来对结合有探针的粒子进行处理的工序，可以通过例如使本实施方式的非特异吸附防止剂与粒子表面接触规定时间来进行。由此，可以抑制粒子表面的非特异吸附，减低噪音。此外，该工序可以在例如使粒子分散于本实施方式的非特异吸附防止剂溶液中的状态下进行。

这时，使探针结合的粒子优选至少在表面具有选自羧基、活性酯基、甲苯磺酰基和环氧基中的至少1种基团(对其理由以下叙述)。此外，这时优选粒子为磁性粒子。

更具体来说，例如在免疫色谱法中，可以在使抗体等探针结合于着色粒子后，添加本实施方式的非特异吸附防止剂来对着色粒子的表面进行处理，从而得到探针结合粒子。此外，在例如EIA、CLIA、CLEIA等测定方法中，可以在使抗体等探针结合于磁性粒子表面后，添加本实施方式的非特异吸附防止剂来对该磁性粒子表面进行处理，从而得到探针结合粒子。

正如以上所说明的，根据本实施方式的非特异吸附防止剂，可以抑制非特异吸附，减低噪音。

使用本实施方式的非特异吸附防止剂来对特别是至少在表面具有羧基、活性酯基、甲苯磺酰基和环氧基等活性基团的粒子(例如磁性粒子)进行处理时，非特异吸附防止剂中的氨基与粒子表面的活性基团形成共价键，提高免疫诊断用抗体的定向性，因此表现增强信号的效果。此外，由于可以抑制非特异吸附防止剂的解吸，因此成为对含有表面活性剂等的缓冲液类极富稳定性的检测试剂。

表现本实施方式的非特异吸附防止剂的特别良好效果的载体是具有羧基的粒子(例如磁性粒子)。作为其优选的处理方法，可以列举将具有羧基的粒子用水溶性碳二亚胺等制成活性酯，结合免疫诊断探针后，以本实施方式的非特异吸附防止剂(信号增强剂)来处理的方法。

本实施方式的探针结合粒子可以由上述的探针结合粒子的制造方法而得到。例如，本实施方式的探针结合粒子可以在表面具有上述非特异吸附防止剂。

2.实施例

以下列举实施例对本发明进一步进行详细说明，但本发明并不受这些实施例的限制。

2.1.实施例1

将平均分子量4000的聚氧乙烯单甲醚(日本油脂(株)制，商品名“Uniox M-4000”)10g溶解于吡啶100g，装入带有搅拌器的可拆式烧瓶(separable flask)中。在另外的容器中将对甲苯磺酰氯2g溶解于吡啶20g，将所得溶液用1小时滴加入上述可拆式烧瓶中，进而在室温下反应6小时。将所得反应物滴加入乙醚1L中，通过沉淀纯化来除去残余的对甲苯磺酸盐，得到聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物(A-1)8g。

并且，将溶解有五亚乙基六胺(B-1)2g的水溶液50g边搅拌边在室温下用2小时滴加入溶解有甲苯磺酰化物(A-1)8g的水溶液80g中来反应。将所得反应物滴加入乙醚1L中，通过沉淀纯化来除去残余的五亚乙基六胺(B-1)，进而通过真空干燥得到非特异吸附防止剂(C-1)6g。该非特异吸附防止剂(C-1)由液相色谱法测定的分子量分布是以分子量4200为主峰的宽峰，高分子量侧可见微弱肩峰。由滴定测定的碱价为1.1mmol/g。

接着，在分散有具有羧基的磁性粒子(JSR公司制MAG1101)1mg的固体成分浓度1％的水分散体中，添加1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(同仁化学公司制)水溶液后在室温下旋转搅拌2小时，由此活化羧基。将其进行磁力分离而舍去上清后，加入对于作为肿瘤标记的人α胎蛋白(以下称为“AFP”)的抗体(以下称为“抗AFP抗体”，Cosmo Bio公司制)10μg，在室温下反应3小时。反应后，在非特异吸附防止剂(C-1)为0.4％的水溶液中，加入上述粒子的水分散体125μL，进而在室温下反应15小时。将其磁力分离，用洗涤液(25mmol/L Tris-HCl，pH7.4，含0.01％Tween20)反复洗涤后，用洗涤液进行稀释，使得粒子浓度达到0.5％，得到结合有作为一次探针的抗AFP抗体的探针结合粒子(免疫检测用粒子)。取所得探针结合粒子的分散液10μl(相当于粒子50μg)于试管，与以胎牛血清(FCS)稀释为100ng/mL的AFP抗原(Nippon Bio-Test公司制)的标准样品50μl混合，在37℃反应10分钟。进行磁力分离，分离出粒子并除去上清后，添加作为二次抗体的以碱性磷酸酯酶(以下称为“ALP”)标记的抗AFP抗体(使用FUJIREBIO公司制，附属于Lumipulse AFP-N的试剂)40μl，在37℃反应10分钟。接着进行磁力分离并除去上清后，将以PBS反复洗涤3次后得到的粒子分散于50μl的0.01％Tween20中，转移至新试管。加入ALP基质液(Lumipulse基质液：Fujirebio公司制)100μl，在37℃反应10分钟后，测定化学发光量。

化学发光的测定使用Berthold Japan公司制的化学发光测定装置(商品名：Lumat LB9507)。其结果，信号强度为123563RIU。此外，除了使用不含AFP抗原的胎牛血清(FCS)50μl代替以FCS稀释为100ng/mL的AFP抗原的标准样品50μl之外，与上述同样地测定噪音强度，结果为67RIU。

2.2.比较例1

使用乙二胺代替实施例1中的五亚乙基六胺(B-1)，除此之外与实施例1同样地得到比较例1的非特异吸附防止剂。比较例1的非特异吸附防止剂由液相色谱法测定的分子量分布是以分子量4000为主峰的宽峰。由滴定测定的碱价为0.2mmol/g。信号强度为109104RIU，噪音强度为105RIU。

2.3.比较例2

使用分子量约1200的聚乙烯亚胺(1分子中的平均氨基数为28个)代替实施例1中的五亚乙基六胺(B-1)，除此之外与实施例1同样地得到比较例2的非特异吸附防止剂。比较例2的非特异吸附防止剂由液相色谱法测定的分子量分布是分子量11000的宽峰。由滴定测定的碱价为2.5mmol/g。信号强度为65503RIU，噪音强度为180RIU。

2.4.比较例3

使用牛血清白蛋白代替实施例1中的非特异吸附防止剂(C-1)，除此之外与实施例1同样地测定信号和噪音。信号强度为92762RIU，噪音强度为83RIU。

2.5.比较例4

在实施例1中不使用非特异吸附防止剂(C-1)，除此之外与实施例1同样地测定信号和噪音。信号强度为94673RIU，噪音强度为123RIU。

由以上结果确认，实施例1的非特异吸附防止剂(C-1)，由于是(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与(B)合计具有3～12个氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺的反应物，因此与作为非特异吸附防止剂使用牛血清白蛋白的情况(比较例3)以及未使用非特异吸附防止剂的情况(比较例4)相比，具有充分的减低噪音效果。

与此相对，比较例1的非特异吸附防止剂由于是(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与合计具有2个以下氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺的反应物，因此噪音减低效果并不充分。此外，比较例2的非特异吸附防止剂由于是(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与合计具有13个以上氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺的反应物，因此噪音增加。

2.6.实施例2

将平均分子量5000的聚氧乙烯单甲醚(Fluka公司制)100g、三甲胺盐酸盐5g、三丙胺8g、对甲苯磺酰氯8g溶解于乙腈300g，装入带有搅拌器的可拆式烧瓶中，边搅拌边在30℃下反应2小时，由此得到聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物(A-2)的溶液。

并且，将五亚乙基六胺(B-2)47g溶解于乙腈230g，装入另外的带有搅拌器的可拆式烧瓶中，保持在40℃进行搅拌，用1小时滴加上述甲苯磺酰化物(A-2)，进而持续搅拌9小时使之反应。反应后，在室温下静置16小时，以倾析法除去沉淀下来的副产物。将由倾析得到的上清用蒸发仪浓缩，将其溶解于水500g后过滤，进而使用渗析器纯化，由此得到非特异吸附防止剂(C-2)为2％的水溶液。该非特异吸附防止剂(C-2)由液相色谱法测定的分子量分布是以分子量5200为主峰的峰，高分子量侧可见微弱肩峰。由质子NMR而得的邻接于亚氨基的CH峰面积与醚键的CH峰面积之比，确认聚氧乙烯单甲醚与五亚乙基六胺以1∶1结合。

接着，在分散有具有羧基的磁性粒子(JSR公司制MAG2303)1mg的固体成分浓度1％的水分散体中，添加1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(同仁化学公司制)水溶液，在室温下旋转搅拌2小时，由此活化羧基。将其进行磁力分离而舍去上清后，加入对于作为肿瘤标记的人α胎蛋白(以下称为“AFP”)的抗体(以下称为“抗AFP抗体”，Cosmo Bio公司制)10μg，在室温下反应3小时。反应后，在非特异吸附防止剂(C-1)为0.4％的水溶液中，加入上述粒子的水分散体125μL，进而在室温下反应15小时。将其磁力分离，用洗涤液(25mmol/L Tris-HCl，pH7.4，含0.01％Tween20)反复洗涤后，用洗涤液进行稀释，使得粒子浓度达到0.5％，得到结合有作为一次探针的抗AFP抗体的探针结合粒子(免疫检测用粒子)。取所得探针结合粒子的分散液10μl(相当于粒子50μg)于试管，与以胎牛血清(FCS)稀释为100ng/mL的AFP抗原(Nippon Bio-Test公司制)的标准样品50μl混合，在37℃反应10分钟。进行磁力分离，分离出粒子并除去上清后，添加作为二次抗体的以碱性磷酸酯酶(以下称为“ALP”)标记的抗AFP抗体(使用Fujirebio公司制，附属于Lumipulse AFP-N的试剂)40μl，在37℃反应10分钟。接着进行磁力分离并除去上清后，将以PBS反复洗涤3次后得到的粒子分散于50μl的0.01％Tween20中，转移至新试管。加入ALP基质液(Lumipulse基质液：Fujirebio公司制)100μl，在37℃反应10分钟后，测定化学发光量。

化学发光的测定使用Berthold Japan公司制的化学发光测定装置(商品名：Lumat LB9507)。其结果，信号强度为182983RIU。此外，除了使用不含AFP抗原的胎牛血清(FCS)50μl代替以FCS稀释为100ng/mL的AFP抗原的标准样品50μl之外，与上述同样地测定噪音强度，结果为72RIU。

2.7.比较例5

使用乙二胺代替实施例2中的五亚乙基六胺(B-2)，除此之外与实施例2同样地得到比较例5的非特异吸附防止剂。比较例5的非特异吸附防止剂由液相色谱法测定的分子量分布是以分子量5000为主峰的峰。由滴定测定碱价。信号强度为135872RIU，噪音强度为107RIU。

2.8.比较例6

使用分子量约1200的聚乙烯亚胺(1分子中的平均氨基数为28个)代替实施例2中的五亚乙基六胺(B-2)，除此之外与实施例2同样地得到比较例6的非特异吸附防止剂。比较例6的非特异吸附防止剂由液相色谱法测定的分子量分布是分子量12000的宽峰。信号强度为72377RIU，噪音强度为193RIU。

2.9.比较例7

使用牛血清白蛋白代替实施例2中的非特异吸附防止剂(C-2)，除此之外与实施例2同样地测定信号和噪音。信号强度为129246RIU，噪音强度为90RIU。

2.10.比较例8

在实施例2中不使用非特异吸附防止剂(C-2)，除此之外与实施例2同样地测定信号和噪音。信号强度为127195RIU，噪音强度为131RIU。

由以上结果确认，实施例2的非特异吸附防止剂(C-2)，由于是(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与(B)合计具有3-12个氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺的反应物，因此与作为非特异吸附防止剂使用牛血清白蛋白的情况(比较例7)以及未使用非特异吸附防止剂的情况(比较例8)相比，具有充分的噪音减低效果。

与此相对，比较例5的非特异吸附防止剂由于是(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与合计具有2个以下氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺的反应物，因此噪音减低效果并不充分。此外，比较例6的非特异吸附防止剂由于是(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与合计具有13个以上氨基和亚氨基或它们中的任一种的多胺的反应物，因此噪音增加。

Claims

1.一种非特异吸附防止剂的制造方法，其特征在于，使(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物与(B)多胺反应，所述多胺合计具有3～12个氨基和亚氨基(-NH-)或它们中的任一种。

2.根据权利要求1所述的非特异吸附防止剂的制造方法，其特征在于，所述(A)聚氧乙烯单甲醚的甲苯磺酰化物是在胺化合物的存在下使聚氧乙烯单甲醚与对甲苯磺酰氯反应而得的反应物。

3.根据权利要求2所述的非特异吸附防止剂的制造方法，其特征在于，所述胺化合物是选自三甲胺盐酸盐、三甲胺氢溴酸盐、三甲胺氢氟酸盐、三甲胺硫酸盐、三甲胺硝酸盐、三甲胺磷酸盐、三乙胺、三丙胺和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺中的1种以上。

4.根据权利要求2或3所述的非特异吸附防止剂的制造方法，其特征在于，所述胺化合物是将三甲胺盐酸盐与三甲胺以外的胺化合物混合而得的。

5.一种非特异吸附防止剂，其特征在于，含有下述通式(1)所示的化合物：

式中，n为4～2000所示的数，R¹和R²各自独立地表示氢原子或者具有1～11个氨基和亚氨基或它们中的任一种的基团，并且R¹和R²所含的氨基和亚氨基合计为2～11个。

6.根据权利要求5所述的非特异吸附防止剂，其特征在于，在所述通式(1)中，R¹和R²分别表示下述通式(2a)和(2b)所示的基团：

式中，x1和x2分别是1～4所示的数，y1和y2分别是0～11所示的数，y1+y2为2～11。

7.一种探针结合粒子的制造方法，其特征在于，包括使探针结合于粒子表面的工序以及使用权利要求5或6所述的非特异吸附防止剂对结合有所述探针的所述粒子进行处理的工序。

8.根据权利要求7所述的探针结合粒子的制造方法，其特征在于，使所述探针结合的工序中，所述粒子具有选自羧基、活性酯基、甲苯磺酰基和环氧基中的至少1种基团。

9.根据权利要求7所述的探针结合粒子的制造方法，其特征在于，所述粒子是磁性粒子。

10.一种探针结合粒子，其特征在于，由权利要求7所述的探针结合粒子的制造方法得到。

11.一种探针结合粒子，其特征在于，在表面具有权利要求5或6所述的非特异吸附防止剂。