JP3520757B2 - 非特異反応吸収剤及び該吸収剤を用いる免疫測定法 - Google Patents
非特異反応吸収剤及び該吸収剤を用いる免疫測定法Info
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ド・ディスムターゼ(SOD)融合蛋白質が結合した試
薬を含む免疫測定に用いる一般式H2 N−A−CO2 H
(I) (Aは置換もしくは無置換の直鎖状、分枝状又は環状の
炭素数3〜12の炭化水素基である)で表されるアミノ
カルボン酸化合物からなる非特異反応吸収剤、及びこの
吸収剤を用いる免疫測定法に関する。
する方法では、対応する抗体、抗原等を免疫測定用の固
相に結合させ試薬と検体とを反応させ、この固相に免疫
反応によって免疫複合体を形成して結合する抗原、抗体
等を測定することが行われている。従って検体中の抗体
を測定する場合には、抗原を結合した固相が用いられ
る。この抗原としては、例えば生体や培養液から得られ
た天然型蛋白質、遺伝子組換え法によって製造した組換
え蛋白質、アミノ酸を縮合反応させて製造した合成蛋白
質等が知られている。近年、遺伝子組換え蛋白質(以下
組換え蛋白質という)は検体中の抗体との特異的な反応
性が高く、均一な性質を有する蛋白質を大量に製造する
ことができるため広く用いられるようになった。
伝子を組み込んだプラスミドを含む大腸菌を培養し、培
養液中に産生される蛋白質を精製して取得することがで
きる。その際、蛋白質を効率よく発現させるために、製
造される蛋白質の上流の発現部位にチオレドキシン(T
RX,特表平5−507209号)、SOD(Kuo,
G;Science,244,366−364(198
9))、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GS
T,特表平1−503441号)等のプロモーター配列
を接続することが行われている。殊に肝炎ウイルス蛋白
質を産生に利用されるプロモーターとしてはSODが広
く用いられていた。その結果、SODプロモーターを用
いる遺伝子組換え法によって取得される蛋白質には、S
ODが付加した蛋白質(以下SOD融合蛋白質という)
が得られることがあった。
子と結合させて免疫測定用の試薬が製造されている。こ
の試薬では、SOD自体が抗原性を持ち、このSODと
ヒト血清中に含まれる反応物質とがしばしば非特異反応
を起こし、その結果測定精度の高い結果が得られないと
いう問題点があった。そこで、SOD融合蛋白質を使用
した試薬では、SOD又は熱、酸、アルカリ等によって
物理的又は化学的に処理した変性SODを反応系内に添
加して非特異反応を同時吸収する方法が用いられてい
た。
性SODは、疎水性が高く吸収剤として反応溶液に添加
するためには可溶化剤として界面活性剤、尿素、塩類等
を溶液に添加することが必要であった。これら可溶化剤
は、測定に関与する免疫反応とともに、吸収剤の反応も
低下させ、また添加されたSOD又は変性SODは、溶
液中で保存すると徐々に変性が起こり吸収剤としての活
性が低下することが認められた。
意研究した結果、前記一般式(I)で表されるアミノカ
ルボン酸化合物が、SOD融合蛋白質を結合した免疫測
定試薬を用いた測定における優れた非特異反応吸収剤と
なることを見出し本発明を完成した。
した試薬を含む測定溶液に、前記一般式(I)で表され
るアミノカルボン酸化合物からなる免疫測定用の非特異
反応吸収剤を添加する免疫測定法を提供する。
カルボキル基とを有するアミノカルボン酸化合物であ
り、前記一般式(I)で表されるアミノカルボン酸化合
物中Aは、置換もしくは無置換の直鎖状、分枝鎖状又は
環状の炭素数3〜12の炭化水素基を挙げることができ
る。直鎖状の炭化水素基としては、例えば炭素数3から
8の炭化水素であり1,3−プロパンジイル基、1,4
−ブタンジイル基、1,5−ペンタンジイル基、1,6
−ヘキサンジイル基、1,7−ヘプタンジイル基、1,
8−オクタンジイル基等を挙げることができる。分枝鎖
及び環状の炭化水素基としては、炭素数4〜12の炭化
水素基であり、例えば1,3−ブタンジイル基、2−メ
チル−1,5−ペンタンジイル基、2−メチル−1,6
−ヘキサンジイル基、2−メチル−1,7−ヘプタンジ
イル基、2−メチル−1,8−オクタンジイル基、
は置換基を有していてもよく、例えば、ハロゲン原子、
アミノ基、水酸基、メルカプト基、カルボキシル基、カ
ルバモイル基等を挙げることができる。置換基を有する
アミノカルボン酸化合物としては、例えばリジン、β−
リジン等のアミノ酸化合物から該当する化合物を選択し
て使用することもできる。
溶液中に添加されることができ、例えば血清希釈液中、
試薬溶液中、検体液中等に添加することができる。この
吸収剤を血清希釈液の添加する場合には、10mM〜5
00mM程度添加し用いることが好ましい。
型、B型、C型、G型等の肝炎ウイルス蛋白質、HIV
−1、HIV−2、HTLV−I、HTLV−II等の
レトロウイルス蛋白質、梅毒トレポネーマ(TP)抗原
等とSODが融合した抗原を挙げることができる。これ
らのSOD融合蛋白質は、遺伝子組換え法により製造し
た周知の組換え蛋白質を挙げることができる。
用の固相に結合させて試薬を製造することができる。そ
の結合には、組換え蛋白質と固相の官能基を架橋剤、縮
合剤等を用いて化学結合させる方法、物理吸着法等を挙
げることができる。
測定法、例えば間接凝集免疫測定法(RHA,PA)、
酵素免疫測定法、放射免疫測定法、イムノクロマト法、
金属コロイド粒子を標識物とした標識免疫測定法等の各
種測定法に使用することができる。
る。
製造 (HCV抗原の調製)Kuo,G;Science,2
44,366−364(1989)に記載の方法に従い
HCV C200蛋白質にSODを融合した蛋白質を酵
母菌により発現させ、精製してC200−SOD融合蛋
白質を得た。同様にHCV C22−3コア蛋白質にS
ODを融合した蛋白質を酵母菌により発現させ、精製し
てC22−3−SOD融合蛋白質を得た。
酸緩衝生理食塩水PBS(pH7.2)の5(V/V)
%ゼラチン粒子(特公昭63−29223号に記載され
た方法に従い製造した粒子)の溶液20mlと10pp
mタンニン酸PBS(pH7.2)溶液20mlとを、
37℃10分間インキュベートした。このゼラチン粒子
を生理食塩水で1回洗浄したあとPBS(pH6.4)
で全量を20mlとしタンニン酸処理粒子PBS溶液を
得た。前記C200−SOD融合蛋白質とC22−3−
SOD融合蛋白質との混合物を含むPBS(pH6.
4)で希釈したものを20ml準備し、前記タンニン酸
処理ゼラチン粒子PBS(pH6.4)20mlと等量
混合し37℃で40分間インキュベートした。この粒子
を生理食塩水40mlで1回洗浄後、1%NRS(正常
家兎血清)を含む10mlのPBS(pH7.2)に浮
遊し、試薬容器に0.3mlずつ分注し凍結乾燥を行
い、HCV融合蛋白質感作粒子を得た。
により製造したSODを前記方法に従いタンニン酸処理
したゼラチン粒子と混合し、SOD感作粒子を得、凍結
乾燥を行った。
(pH7.2)に1% NRSと抗菌剤として0.1%
アジ化ナトリウムを加えた溶液を検体希釈液として用い
た。
0.15MPBS(pH7.2)を調製した。
液の調製)3本の1%NRSを添加した0.15MPB
S(pH7.2)溶液にp−アミノメチルシクロヘキサ
ンカルボン酸、ε−アミノカプロン酸又はL−リジンを
それぞれ加え、検体希釈液を調製した。
る測定 実施例1で調製した凍結乾燥品のHCV融合蛋白質感作
粒子又はSOD感作粒子は溶解用液をそれぞれに4ml
加え復元をして用いた。96ウェルU底のマイクロプレ
ートの第1穴目にドロッパーなどを用い血清希釈液を1
00μl滴下し、第2穴から第3穴(定量試験の場合は
第12穴まで)に25μlずつ血清希釈液を滴下する。
第1穴目に検体25μlをマイクロピペットで加え、2
5μl用ダイリュータで攪拌しながら順に次穴に25μ
lずつ液を送り連続した2N希釈系列を作る。第2穴目
に未感作粒子を25μl滴下し、第3穴目(定量試験の
場合は第3穴から第12穴まで)に感作粒子を25μl
滴下し混合後、蓋をかぶせ室温で2時間静置し反応像を
形成させた。
血清及び抗HCV抗体陰性血清の検体について、実施例
1で調製した50mMのp−アミノメチルシクロヘキサ
ンカルボン酸、ε−アミノカプロン酸又はL−リジンを
含む検体希釈液用いて測定を行った。その測定結果を表
1〜3に示す。また、比較例として、アミノカルボン酸
化合物を含まない検体希釈液で同一検体について測定
し、その結果を表1〜3に併せ記載する。
応に対してのみ反応を抑制し、抗HCV抗体陽性血清又
は陰性血清に対しては影響が無いことがわかった。
ミノカルボン酸化合物をSOD融合蛋白質が結合した試
薬を含む測定の溶液中に添加すると、固相化抗原又は標
識化抗原への非特異結合が低減するため、検体中の測定
対象物を感度よく測定することができる。また、前記一
般式(I)で表されるアミノカルボン酸化合物は、溶液
中で安定であるため、その吸収剤として効果が長時間持
続する。
Claims (4)
- 【請求項1】 スーパーオキサイド・ディスムターゼ
(SOD)融合蛋白質が結合した試薬を含む免疫測定に
用いる一般式H2 N−A−CO2 Hで表されるアミノカ
ルボン酸化合物からなる非特異反応吸収剤(Aは置換も
しくは無置換の直鎖状、分枝状又は環状の炭素数3〜1
2の炭化水素基である)。 - 【請求項2】 アミノカルボン酸化合物がε−アミノカ
プロン酸、p−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
又はリジンである請求項1記載の吸収剤。 - 【請求項3】 蛋白質が、遺伝子組換え肝炎ウイルス抗
原である請求項1又は2に記載の吸収剤。 - 【請求項4】 請求項1ないし3記載のいづれか1項に
記載の吸収剤を用いる免疫測定法。
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JPH11218534A JPH11218534A (ja) | 1999-08-10 |
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