JP2001521625A

JP2001521625A - 標的生物学的物質を単離するための方法、捕獲相、検出相、及び試薬

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Publication number: JP2001521625A
Application number: JP54357298A
Authority: JP
Inventors: エライサリ，アブデルハミド; デュラシェ，ダヴィッド; ピショ，クリスティアン; マレ，フランソワ; ノヴリ−ルソー，アルメル
Original assignee: ベーイーオーメリュー
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2001-11-06
Also published as: AU7436298A; FR2762394A1; CA2286382A1; WO1998047000A3; EP0975968A2; US20020160526A1; WO1998047000A2; FR2762394B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、以下の段階より成る、サンプル中に含まれる標的生物学的物質を単離するための方法に関する：マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも第一の徴粒子または線上ポリマー、及び第一の錯体化基より成る捕獲相を提供することであり、錯体化基は標的生物学的物質を特異的に認識することが可能な第一の生物学的種にそれ自体結合する第一の遷移金属に対する配位によって結合している；上記標的生物学的物質を少なくとも捕獲相と接触させること；及び任意に、微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも第二の微粒子または線上ポリマー、及び第二の錯体化基より成る検出相を使用して、捕獲相−標的生物学的物質錯体を検出することであり、錯体化基は標的生物学的物質を特異的に認識することが可能な第二の生物学的種にそれ自体結合する第二の遷移金属、及びマーカーに対する配位によって結合している。

Description

【発明の詳細な説明】標的生物学的物質を単離するための方法、捕獲相、検出相、及び試薬本発明は、捕獲相(capture phase)及び任意に検出相(detection phase)を使用した方法による、サンプル中に含まれる、標的(target)生物学的物質として称される生物学的物質の単離または検出に関し、該方法に従って、上記物質は少なくとも捕獲相にさらされ、次いで形成された捕獲相／標的生物学的物質錯体を、任意に上記検出相を使用して検出する。以下に本発明を提示する際、特に標的タンパク質生物学的物質の単離について言及するか、言うまでもなく本発明の範囲は、それに制限されるものではない。それ故、本発明に従って、用語、「生物学的物質」は、特に抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素または基質、及びそれらの断片のようなタンパク質または糖タンパク質物質を意味する；しかし、核酸(ＤＮＡまたはＲＮＡ) 、核酸断片、プローブまたはプライマーのような核酸物質、そしてホルモンもまた意味する。 M.Kempe等（１）記載の文献に従って、ポリヒスチジン配列、主にＲＮアーゼＡを含む標的タンパク質を捕獲するための方法が周知であり、該方法に従って、金属に対するヒスチジンのイミダゾール基の高い親和性が使用される。この方法は以下の工程を含む： − メタクリラート基を使用して官能化されたシリカ粒子より成る捕獲相を使用すること、 − 標的タンパク質及び金属錯化剤、主にN-(4-ビニル)ベンジルイミノ二酢酸（ＶＢＩＤＡ）を、金属とヒスチジンのイミダゾール基の間の配位結合、及び金属とＶＢＩＤＡのカルボキシル基の間の配位結合から生ずる錯体を得るために、金属と接触させること、並びに、 − 上記官能化シリカ粒子を、上記形成された錯体と接触させること。この固定化方法は、標的タンパク質の最適な結合を導くものではない。米国特許第４，２４６，３５０号の文献は、遷移金属に結合した錯体化基を含むマクロポーラスポリマーより成る捕獲相を使用して、酵素を固定化するための方法を記載する。上記捕獲相の欠点は、該ポリマーのマクロポーラスの性質から直接に起因する。この理由は、このマクロポーラスの性質により、捕獲相への酵素の吸着を最適化することができるとしても、該ポリマーの孔に吸着された酵素の群は、上記検出相に対して接近し難いと思われるので、検出相を使用した酵素の単離の検出時間の点で不利となるためである。本発明に従って、捕獲相への標的生物学的物質の結合を最適化することを可能にするような捕獲相を使用した、標的生物学的物質を単離するための方法が提供され、該方法は同時に、上記捕獲相への上記物質の吸着のいずれかの副反応を減少、または一様に除去するものである。捕獲相の間の相互作用は特異的であり、それ故単離する間を通して、捕獲相に対して効率的に結合する生物学的物質の群を検出することが可能である。この目的のため、標的生物学的物質を単離するための方法は、以下の性質を有する捕獲相を使用する：それはマイクロ微粒子形態または直鎖状形態であり、それは外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第一の微粒子または直鎖状ポリマー、及び共有結合した第一の錯体化基より成り、第一の錯体化基は、第一の遷移金属に対する配位によって結合しており、第一の遷移金属は、それ自体、標的生物学的物質を特異的に認識することが可能である第一の生物学的種に対するキレート化によって結合している。本発明の方法の一つの変異型に従って、上記定義された捕獲相は、検出相を得るために、マーカーを含む。本発明のもう一つの変異型に従って、以下の性質を有する検出相も使用されるそれはマイクロ微粒子または直鎖状形態であり、それは外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第二の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第二の錯体化基より成り、第二の錯体化基は、第二の遷移金属に対する配位によって結合しており、第二の遷移金属は、それ自体、標的生物学的物質を特異的に認識することが可能である第二の生物学的種、及びマーカーに対するキレート化によって結合しており、それはマーカーを含む。本発明に従って、用語、「マイクロ微粒子」は、粒径において１０μｍ以下である粒子の形態を意味する。好ましくはそれらは、粒径において５μｍを越えることはない。第一及び／または第二の微粒子または直鎖状ポリマーは、有利には、親水性ポリマーであり、特に水溶性モノマー、アクリルアミド、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミドまたはメタクリルアミド誘導体、少なくとも一つの架橋剤、及び少なくとも一つの官能性モノマーの重合によって得られる官能化ポリマーである。この有利なポリマーを得るために、水溶性モノマーは好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド、N-エチルメタクリルアミド、N-n-プロピルアクリルアミド、N-n-プロピルメタクリルアミド、N-n-イソプロピルメタクリルアミド、N-シクロプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド、及びN-メチル-N-n-プロピルアクリルアミドから選択され、該モノマーは好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）である。官能性モノマーは好ましくは、以下の式（Ｉ）に相当する群に属する：ＣＨ₂＝Ｃ（Ｚ）−（Ｘ）_m−（Ｒ）_p−（Ｙ）_n （Ｉ）式中、Ｚは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、またはベンジル、−ＣＯＯＨまたは −ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂基を表し、Ｙは、−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）₂、Ｘは、−ＮＨ(ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＨ₂−)₂、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）(ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、またはＣＨ（ＣＯＯＨ）−を表し、Ｒは、任意にＯまたはＮのような少なくとも一つのヘテロ原子が間に入った直鎖状炭化水素ベース鎖を表し、ｍおよびｐはそれぞれ、互いに独立な０または１に等しい整数であり、そしてｎは、１から３の間の範囲の整数である。例として、官能性モノマーは、任意に窒素を含むカルボン酸、イタコン酸、アクリル酸誘導体及びメタクリル酸誘導体から選択される。上記記載のように、本発明の捕獲相は、マイクロ微粒子形態または直鎖状形態で存在することができる。それが微粒子形態である場合、それは上記微粒子ポリマーのみから成ることができ、または代わりにそれは微粒子及び／または直鎖状形態の上記第一のポリマーを使用して被覆された、有機または無機の、親水性または疎水性コアのような、微粒子の支持体を含むことができる。上記コアは有利には、ポリスチレン、シリカ及び金属酸化物を含む群から選択される。それはまた、磁性化合物を含むこともできる。捕獲相はまた、微粒子及び／または直鎖状形態の第一のポリマーを使用して、部分的または完全に被覆された平坦な支持体を含むこともできる。本明細書の実施例が説明するように、本発明の第一及び第二の好ましい微粒子ポリマーは、イタコン酸またはマレイン酸−共−メチルビニルエーテルから由来する錯体化基を含むポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（ＰＮＩＰＡＭ）である。第一及び／または第二の遷移金属は有利には、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、鉄、マグネシウム、マンガン、鉛、パラジウム、白金及び金から選択される。本発明の方法の好ましい実施態様に従って、第一の生物学的種を捕獲相と接触させること、及び／または第二の生物学的種を検出相と接触させることは、それぞれ上記第一及び第二の生物学的種の等電点以上のｐＨで実施される。用語、「生物学的種」は、単離された形態の、上記記載のような生物学的物質を意味し、標的生物学的物質に関して、抗原一抗体、酵素−基質、ホルモン−レセプター、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ等のタイプの複合体を上記物質と共に形成する親和性を有する。有利には、第一の生物学的種はタンパク質である。例として、それは、患者の血清から、一つまたは他のタンパク質に対して向けられた抗体を単離することを目的とした、ＨＩＶのｐ２４またはｇｐ１６０タンパク質である。第一及び／または第二の生物学的種は、遷移金属と反応することが可能な部分を含み、この部分は好ましくはヒスチジンに富む及び／またはシステインに富む領域より成る。遷移金属イオンに対する生物学的種の親和性の部位は有利には、ヒスチジン、システイン、チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニンから選択されるアミノ酸に富む部位より成る。該部位は、上記同一のまたは異なる、連続的なまたは非連続的な、しかし近傍のアミノ酸の配列の形態で存在することができる。これらの部位は、特にそれがタンパク質である場合、生物学的種において天然で存在することができる。代わりに、それらは、樹脂上にＩＭＡＣ(Immobilized Metal Ion-Affinity Chromatography：固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)法によるタンパク質の精製に対して使用される方法のような、当業者に周知の方法に従って、以下に定義されるような「標識」("tag")の形態で、生物学的種内に前もって「付加する」("reported")ことができる(２，３)。例として、上記部位は、組換えタンパク質を得るために、遺伝学的操作によって、タンパク質性生物学的種、特にタンパク質内に取り込ませることができる。「標識」とは、アミノ酸の付加された配列、すなわち本来の配列の好ましい部位に導入された、本来の生物学的種に付加された配列として定義することができ、その場合それは、遷移金属とのキレート化のため適切な方法にさらす。本配列は、上記記載されたものから選択されるアミノ酸を含み、それは該配列中で連続的に(特に二つの上記記載の連続的なアミノ酸、好ましくは６個の上記記載の連続的なアミノ酸)、または十分な密度を有して（特に２５％、好ましくは３３％以上）配置される。一連の６個のヒスチジン及び／またはシステイン残基より成る「標識」が好ましいであろう。本発明の方法にしたがって、標的生物学的物質は、上記記載の捕獲相を使用した凝集反応によって単離することができる。検出相に対するマーカーは有利には、酵素、ビオチン、イミノビオチン、蛍光成分、放射性活性成分、化学発光成分、電子密度成分、磁性成分、抗原、ハプテン及び抗体より成る群から選択される。本発明の方法にしたがって、標的生物学的物質は、上記記載の捕獲相及び検出相を使用したＥＬＩＳＡ法によって単離することができる。本発明はまた以下のものに関する： − マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第一の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第一の錯体化基より成る、標的生物学的物質を捕獲するための相であり、第一の錯体化基は、標的生物学的物質を認識することかできる第一の生物学的種にそれ自体結合した第一の遷移金属に対する配位によって結合している、 − マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第二の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第二の錯体化基より成る、標的生物学的物質を検出するための相であり、第二の錯体化基は、標的生物学的物質を認識することができる第二の生物学的種にそれ自体結合した第二の遷移金属、及びマーカーに対する配位によって結合している、 − 上記記載の捕獲相、及び任意に上記記載の検出相を含む、標的生物学的物質を単離するための試薬、 − 上記記載の性質を有する捕獲相及び検出相のそれぞれ。本発明の特徴及び利点は、実施例１から５，及び図１から３によって以下に説明される：図１は、ＭＡＶＥポリマーの、微粒子ポリマー、ポリ（Ｓｔ−ＮＩＰＡＭ−ＡＥＭ）粒子との結合についての等温線を表す。図２は、媒体のｐＨ及び塩濃度の機能としての、微粒子ポリマー、ポリ（Ｓｔ −ＮＩＰＡＭ−ＭＡＶＥ）上に吸着したＲＨ２４タンパク質の量における変化を表す。図３は、媒体のｐＨ及び塩濃度、及び０．３ＭのオーダーのＺｎ²⁺イオン濃度に対する機能としての、微粒子ポリマー、ポリ（Ｓｔ−ＮＩＰＡＭ−ＭＡＶＥ）と錯体化したＲＨ２４タンパク質の量を表す。実施例１：本発明の捕獲相の調製のために使用される試薬モノマー： − ９９％スチレン(Janssen Chemica,ref.13279-87)、Ｍｗ＝１０４．５ｇ・ｍｏｌ^-1 それは真空下での蒸留による精製の後に使用される。 − N-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）(Kodak ref.10982)、Ｍｗ＝１１３．１６ｇ・ｍｏｌ^-1 それは以下のように、使用前に再結晶化される。それは、ヘキサン／トルエン混合物（６０／４０，ｖ／ｖ）中に溶解される。官能性モノマー： − 塩化2-アミノエチルメタクリル酸（ＡＥＭ）(Kodak ref.18513)、Ｍｗ＝１６５．６２ｇ・ｍｏｌ^-1 それは再結晶化されることなく使用される。架橋剤： − N,N-メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）(Amilabo ref.10897)、Ｍｗ＝２７１．１９ｇ・ｍｏｌ^-1 それは再結晶化されることなく使用される。プライマー： − 塩酸2,2'-アゾビス(2-アミジノプロパン)（Ｖ５０）(Wako登録商標)、Ｍｗ＝２７１．１９ｇ・ｍｏｌ^-1 Ｖ５０は、以下のように、使用前に再結晶化される。該プライマーを、水及びアセトンの６０／４０混合物内に溶解する。該溶液を、３０％の収率を有する真空下で濾過する。 − 過硫酸カリウム(Prolabo)、Ｍｗ＝２７０．３２ｇ・ｍｏｌ^-1 それは再結晶化することなく使用される。錯体化基： − イタコン酸(Aldrich)、Ｍｗ＝１３２ｇ・ｍｏｌ^-1 それは再結晶化することなく使用される。 − 無水マレイン酸−共−メチルビニルエーテル（ＭＡＶＥ）(Polysciences) それは再結晶化することなく使用される。実施例２：官能化ポリマー、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)−イタコン酸の合成４．３８ｇのN-イソプロピルアクリルアミド、２００ｇの水、０．３７ｇのＭＢＡ、０．５ｇのイタコン酸、及び０．４５ｇのアクリルアミドを、２５０ｍｌのサーモスタットで制御された反応器内に配する。該混合物に対して、窒素環境の下で７０℃の温度で、一分当たり３００回転での攪拌を維持する。水溶性プライマーである過硫酸カリウム（０．０５ｇ）を、重合反応を開始するために最終時点で該溶液内に添加する(５ｇの水に溶解する)。重合反応を、同じ条件の下で５時間継続する。重合の転換の程度は、９８％と見積もられる。得られた官能化ポリマーは、以下の性質を有する： − 動的光散乱によって測定した粒径が１５００ｎｍである、 − 表面機能のアッセイ、引き続き電気伝導度のアッセイにより、弱酸基（−ＣＯＯＨ）の０．３ｍｍｏｌ／ｇのラテックスが得られた。実施例３：錯体化直鎖状ポリマー、ポリＭＡＶＥを接合することによるアミノ親水性粒子の修飾１）微粒子ポリマー、ポリ（スチレン−ＮＩＰＡＭ）の合成ａ）親水性微粒子ポリマーの調製本実施例に従って、調製は以下のものより成る：第一の段階として、２００ｇの水、１８ｇのスチレン、２ｇのＮＩＰＡＭ及び０．２ｇのＶ５０を使用して、密閉反応器における重合に従って、ベースモノマー、すなわちスチレン及びＮＩＰＡＭを含むポリマー、ポリ（Ｓｔ−ＮＩＰＡＭ）を組み合わせる、引き続き、第二の段階として、所定の程度の変換のために、官能性モノマー（ＡＥＭ）を、単独またはベース試薬、すなわち５ｇのＮＩＰＡＭ、０から４％のＡＥＭ(ＮＩＰＡＭに対して)、０．１２２ｇのＶ５０及び０．０６９ｇのＢＡの存在の下で加える。本方法は、機能性モノマーの表面での混入を最適化することを可能にする。合成条件は、密閉反応器における重合に対するものと同様である、すなわち、一定温度及び攪拌である。ｂ）得られた微粒子ポリマーの性質得られたポリマーの構造に関する結果として、その粒径及びその多分散性は、以下の表１に表される。（ａ）２０℃及び５０℃で動的光散乱によって測定された直径（ｂ）Hairは粒子の表面でのＰＮＩＰＡＭの厚さに相当する（ｃ）電子顕微鏡によって得られた直径及び多分散性指標ポリマーの表面で存在するアミン官能基のアッセイの結果として表される、得られたポリマーの官能化の程度は、以下の表２に表される。 ^*：動的光散乱によって測定された２０℃でのサイズを使用して計算された荷電密度２）アミノ化粒子に対するポリＭＡＶＥの接合錯体化基を、１）に従って得られたポリマーに共有結合し、これらの錯体化基は、本実施例に従って、直鎖状ポリマーであるＭＡＶＥ（無水マレイン酸−共− メチルビニルエーテル：Maleic Anhydride-co-Mcthyl Vinyl Ether）から由来する基より成る。ＭＡＶＥの使用は二つの利点を有する：一つは、その高い反応性の無水物官能基のため、それが微粒子ポリマーの表面に存在するアミンと容易にカップリングすることを許容すること、及びもう一つは、一度カップリングが形成されると、それは遷移金属（Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｃｏ等）と相互作用するいくつかの錯体化ジカルボン酸基を露出することである。ＭＡＶＥは、微粒子ポリマーのアミン官能基とのカップリング反応を可能にする、無水物官能基の加水分解を避けるために、無水ＤＭＳＯにおける溶液として使用される。カップリング反応は、該ポリマーのアミン官能基のプロトン化を避けるために、塩基性媒体において実施されるべきである。使用されるバッファーは、ｐＨ８．２で１０^-2Ｍのイオン強度を有するホウ酸緩衝液である。カップリング媒体は、１０容量％のＤＭＳＯを越えない。図１に表された結果は、二つの分析方法の間の明白な相関関係を示す。カップリング等温線の最初の傾斜は、該反応が淵加されたＭＡＶＥの少量に対して飽和することを示す。定常期の値は２．７５ｍｇ・ｍ^-2であり、ＭＡＶＥの低濃度に対して非常に迅速に到達される。実施例４：錯体化基を含むポリマーを使用した遷移金属の錯体化実施例２または３に従って得られた、錯体化基を含むポリマーの溶液内への遷移金属の添加は、粒子の錯体化によって該金属を結合させるはずである。この錯体化は、無水物官能基の酸素原子によって生ずる。酸素原子の孤立電子対の存在により、遷移金属との配位結合を形成することが可能である。使用される金属（Ｚｎ²⁺）は、１０^-4Ｍの金属イオン溶液の濃度を得るために、該ポリマー溶液内に添加される。溶液内に存在する過剰な金属カチオンは、連続的な遠心分離によって除去される。実施例５：本発明の捕獲相を得るための、生物学的種として使用されるＲＨ２４タンパク質の錯体化本実施例のために選択された生物学的種は、ヒスチジン「標識」（６個の連続的なヒスチジン残基の配列）を使用してＮ末端で修飾された組換えタンパク質（ＲＨ２４と称される）である(５)。このタンパク質は、２７×１０³ｇ・ｍｏｌ^- ¹ の質量を有し、６．１の等電点を有する。この修飾は、本発明の捕獲相を得るために、微粒子支持体上への該タンパク質の錯体化を成し遂げるために利用された。ラテックス上に錯体化したタンパク質の濃度を測定することを可能にするために、該タンパク質の吸着の研究を並行して実施した。従来技術が示すように、親水性ポリマー上への該タンパク質の吸着を決定する静電相互作用が存在する(６)。それ故、吸着されるタンパク質の量に対するイオン強度及びｐＨの影響を、該吸着がほとんど生じない、または全く存在しない条件を決定するために研究した。図２は、実施例３に従って得られたポリ（Ｓｔ−ＮＩＰＡＭ−ＭＡＶＥ）上へのＲＨ２４タンパク質の吸着を示す。図２に従って、ＲＨ２４の吸着の程度は、非常にｐＨ依存的であることが示される。同様な研究を、同じパラメータを変化することによって錯体化について実施した。図３は、様々なイオン強度、及び錯体化イオン（Ｚｎ²⁺）の一定濃度に対する、ｐＨに依存した錯体化の結果を示す。この図に示されるように、亜鉛の存在の下でのポリ（Ｓｔ−ＮＩＰＡＭ−ＭＡＶＥ）との該タンパク質の錯体化は、低いイオン強度の場合を除いて、ｐＨにほとんど依存しない。この結果により、吸着することのない錯体化のための最適な条件を決定することが可能である。それ故、７以上のｐＨが、実質的に全く吸着を有しないことを可能にする一方で、同時に１．５ｍｇ・ｍ^-2に近い錯体化を有する。イオン強度に関して、これは錯体化を促進するために最小でなければならない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月１４日（１９９９．６．１４）【補正内容】明細書標的生物学的物質を単離するための方法、捕獲相、検出相、及び試薬本発明は、捕獲相(capture phase)及び任意に検出相(detection phase)を使用した方法による、サンプル中に含まれる、標的(target)生物学的物質として称される生物学的物質の単離または検出に関し、該方法に従って、上記物質は少なくとも捕獲相にさらされ、次いで形成された捕獲相／標的生物学的物質錯体を、任意に上記検出相を使用して検出する。以下に本発明を提示する際、特に標的タンパク質生物学的物質の単離について言及するが、言うまでもなく本発明の範囲は、それに制限されるものではない。それ故、本発明に従って、用語、「生物学的物質」は、特に抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素または基質、及びそれらの断片のようなタンパク質または糖タンパク質物質を意味する；しかし、核酸(ＤＮＡまたはＲＮＡ) 、核酸断片、プローブまたはプライマーのような核酸物質、そしてホルモンもまた意味する。欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０，５１６，１９８に従って、磁性粒子よりなる捕獲相を使用する生物学的物質を検出するための方法が記載されている。この捕獲相は、遷移金属と、上記金属の原子が結合するのに利用可能な配位部位を有するポリマーの共沈降によって得られ、引き続き二官能性試薬を介して上記ポリマーの反応部位に対する生物学的種の結合を生じ、上記種は検出される物質に対する親和性を有する。 M.Kempe等（１）記載の文献に従って、ポリヒスチジン配列、主にＲＮアーゼＡを含む標的タンパク質を捕獲するための方法が周知であり、該方法に従って、金属に対するヒスチジンのイミダゾール基の高い親和性が使用される。この方法は以下の工程を含む： − メタクリラート基を使用して官能化されたシリカ粒子より成る補獲相を使用すること、 − 標的タンパク質及び金属錯化剤、主にN-(4-ビニル)ベンジルイミノニ酢酸（ＶＢＩＤＡ）を、金属とヒスチジンのイミダゾール基の間の配位結合、及び金属とＶＢＩＤＡのカルボキシル基の間の配位結合から生ずる錯体を得るために、金属と接触させること、並びに、 − 上記官能化シリカ粒子を、上記形成された錯体と接触させること。この固定化方法は、標的タンパク質の最適な結合を導くものではない。米国特許第４，２４６，３５０号の文献は、遷移金属に結合した錯体化基を含むマクロポーラスポリマーより成る捕獲相を使用して、酵素を固定化するための方法を記載する。上記捕獲相の欠点は、該ポリマーのマクロポーラスの性質から直接に起因する。この理由は、このマクロポーラスの性質により、捕獲相への酵素の吸着を最適化することかできるとしても、該ポリマーの孔に吸着された酵素の群は、上記検出相に対して接近し難いと思われるので、検出相を使用した酵素の単離の検出時間の点で不利となるためである。本発明に従って、捕獲相への標的生物学的物質の結合を最適化することを可能にするような捕獲相を使用した、標的生物学的物質を単離するための方法が提供され、該方法は同時に、上記捕獲相への上記物質の吸着のいずれかの副反応を減少、または一様に除去するものである。捕獲相と生物学的物質の間の相互作用は特異的であり、それ故単離する間を通して、捕獲相に対して効率的に結合する生物学的物質の群を検出することが可能である。この目的のため、標的生物学的物質を単離するための方法は、以下の性質を有する捕獲相を使用する：それはマイクロ微粒子形態または直鎖状形態であり、それは外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第一の微粒子または直鎖状ポリマー、及び共有結合した第一の錯体化基より成り、第一の錯体化基は、第一の遷移金属に対する配位によって結合しており、第一の遷移金属は、それ自体、標的生物学的物質を特異的に認識することが可能である第一の生物学的種に対するキレート化によって結合している。本発明の方法の一つの変異型に従って、上記定義された捕獲相は、検出相を得るために、マーカーを含む。本発明のもう一つの変異型に従って、以下の性質を有する検出相も使月されるそれはマイクロ微粒子または直鎖状形態であり、それは外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第二の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第二の錯体化基より成り、第二の錯体化基は、第二の遷移金属に対する配位によって結合しており、第二の遷移金属は、それ自体、標的生物学的物質を特異的に認識することが可能である第二の生物学的種に対するキレート化によって結合しており、それはマーカーを含む。本発明に従って、用語、「マイクロ微粒子」は、粒径において１０μｍ以下である粒子の形態を意味する。好ましくはそれらは、粒径において５μｍを越えることはない。第一及び／または第二の微粒子または直鎖状ポリマーは、有利には、親水性ポリマーであり、特に水溶性モノマー、アクリルアミド、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミドまたはメタクリルアミド誘導体、少なくとも一つの架橋剤、及び少なくとも一つの官能性モノマーの重合によって得られる官能化ポリマーである。この有利なポリマーを得るために、水溶性モノマーは好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド、N-エチルメタクリルアミド、N-n-プロピルアクリルアミド、N-n-プロピルメタクリルアミド、N-n-イソプロピルメタクリルアミド、N-シクロプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドから選択され、該モノマーは好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）である。官能性モノマーは好ましくは、以下の式（Ｉ）に相当する群に属する：ＣＨ₂＝Ｃ（Ｚ）−（Ｘ）_m−（Ｒ）_p−（Ｙ）_n （Ｉ）式中、Ｚは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、またはベンジル、−ＣＯＯＨまたは −ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂基を表し、Ｙは、−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）₂、Ｘは、−ＮＨ(ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＨ₂−）₂、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）(ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、またはＣＨ（ＣＯＯＨ）−を表し、請求の範囲１．捕獲相を使用し、標的生物学的物質を少なくとも捕獲相と接触させ、捕獲相／標的生物学的種錯体を検出することを特徴とする、サンプル中に含まれる標的生物学的物質を単離するための方法であって、捕獲相はマイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第一の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第一の錯体化基より成り、これらの基は、上記第一のポリマーに対して共有結合し、および標的生物学的物質を特異的に認識することか可能な第一の生物学的種にキレート化によってそれ自体結合する第一の遷移金属により配位によって結合していることを特徴とする方法。２．捕獲相が、上記生物学的物質を検出するための相を得るためにマーカーを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。３．マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第二の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第二の錯体化基より成る検出相も使用し、これらの基は標的生物学的物質を特異的に認識することが可能な第二の生物学的種にそれ自体結合する第二の遷移金属、及びマーカーに対する配位によって結合していることを特徴とする請求項１記載の方法。４．第一のポリマーが、親水性ポリマーの群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。５．第二のポリマーが、親水性ポリマーの群から選択されることを特徴とする請求項３、または請求項４及び３の組み合わせに記載の方法。６．第一のポリマーが、水溶性モノマー、アクリルアミド、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミドまたはメタクリルアミド誘導体、少なくとも一つの架橋剤、及び少なくとも一つの官能性モノマーの重合によって得られる官能化ポリマーであることを特徴とする請求項４記載の方法。７．第二のポリマーが、水溶性モノマー、アクリルアミド、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミドまたはメタクリルアミド誘導体、少なくとも一つの架橋剤、及び少なくとも一つの官能性モノマーの重合によって得られる官能化ポリマーであることを特徴とする請求項５，及び任意に請求項６記載の方法。８．水溶性モノマーが、N-イソプロピルアクリルアミド、N-エチルメタクリルアミド、N-n-プロピルアクリルアミド、N-n-プロピルメタクリルアミド、N-n-イソプロピルメタクリルアミド、N-シクロプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド、及びN-メチル-N-n-プロピルアクリルアミドから選択され、第一のモノマーは好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）であることを特徴とする請求項６及び／または７記載の方法。９．官能性モノマーが、以下の式(Ｉ)：ＣＨ₂＝Ｃ（Ｚ）−（Ｘ）_m−（Ｒ）_p−（Ｙ）_n （Ｉ）［式中、Ｚは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、またはベンジル、−ＣＯＯＨまたは −ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂基を表し、Ｙは、−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）₂、Ｘは、−ＮＨ(ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＨ₂−）₂、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）(ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、またはＣＨ（ＣＯＯＨ）−を表し、Ｒは、任意にＯまたはＮのような少なくとも一つのヘテロ原子が間に入った直鎖状炭化水素ベース鎖を表し、ｍおよびｐはそれぞれ、互いに独立な０または１に等しい整数であり、そしてｎは、１から３の間の範囲の整数である］に相当することを特徴とする請求項６及び／または７記載の方法。１０．官能性モノマーが、任意に窒素を含有するカルボン酸誘導体、イタコン酸、アクリル酸誘導体、及びメタクリル酸誘導体から選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。１１．捕獲相がマイクロ微粒子形態で存在し、平均粒径が５μｍ以下であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか一項記載の方法。１２．検出相がマイクロ微粒子形態で存在し、平均粒径が５μｍ以下であることを特徴とする請求項３及び５ないし１１のいずれか一項記載の方法。１３．捕獲相が平坦なまたは微粒子支持体も含むことを特徴とする請求項１記載の方法。１４．支持体が微粒子であり、有機または無機の、親水性または疎水性のコアより成ることを特徴とする請求項１３記載の方法。１５．上記コアが、ポリスチレン、シリカ及び金属酸化物を含む群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。１６．上記コアが磁性化合物も含むことを特徴とする請求項１４または１５記載の方法。１７．上記コアが上記第一のポリマーを使用して被覆されており、このポリマーが直鎖状であることを特徴とする請求項１４ないし１６のいずれか一項記載の方法。１８．上記コアが上記ポリマーを使用して被覆されており、上記ポリマーが微粒子であることを特徴とする請求項１４ないし１６のいずれか一項記載の方法。１９．第一のポリマーが、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）であり、錯体化基がイタコン酸または無水マレイン酸−共−メチルビニルエーテルから由来することを特徴とする請求項１記載の方法。２０．第二のポリマーが、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）であり、錯体化基がイタコン酸または無水マレイン酸−共−メチルビニルエーテルから由来することを特徴とする請求項３、または請求項３及び１９の組み合わせに記載の方法。２１．第一の遷移金属が、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、鉄、マグネシウム、マンガン、鉛、パラジウム、白金及び金から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。２２．第二の遷移金属が、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、鉄、マグネシウム、マンガン、鉛、パラジウム、白金及び金から選択されることを特徴とする請求項３，または請求項３及び２１の組み合わせに記載の方法。２３．第一の生物学的種を捕獲相と接触させることが、上記第一の生物学的種の等電点以上のｐＨで実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。２４．第二の生物学的種を検出相と接触させることが、上記第二の生物学的種の等電点以上のｐＨで実施されることを特徴とする請求項３，または請求項３及び２３の組み合わせに記載の方法。２５．第一の生物学的種が、ヒスチジン及び／またはシステインに富むことを特徴とする請求項１記載の方法。２６．第二の生物学的種が、ヒスチジン及び／またはシステインに富むことを特徴とする請求項３，または請求項３及び２５の組み合わせに記載の方法。２７．凝集反応が使用されることを特徴とする請求項１記載の方法。２８．検出相のためのマーカーが、酵素、ビオチン、イミノビオチン、蛍光成分、放射性活性成分、化学発光成分、電子密度成分、磁性成分、抗原、ハプテン及び抗体より成る群から選択されることを特徴とする請求項２または３記載の方法。２９．ＥＬＩＳＡ法が使用されることを特徴とする請求項２または３記載の方法。３０．マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、標的生物学的物質を捕獲するための相としての、外見上親水性の性質を有する第一の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第一の錯体化基の使用であり、第一の錯体化基は、標的生物学的物質を認識することが可能な第一の生物学的種にそれ自体結合する第一の遷移金属に対する配位によって結合していることを特徴とする使用。３１．マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、標的生物学的物質を検出するための相としての、外見上親水性の性質を有する第二の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第二の錯体化基の使用であり、第二の錯体化基は、標的生物学的物質を認識することが可能な第二の生物学的種にそれ自体結合する第二の遷移金属、及びマーカーに対する配位によって結合していることを特徴とする使用。３２．標的生物学的物質を単離するための試薬における、請求項３０に記載の第一のポリマーの使用、及び／または請求項３１に記載の第二のポリマーの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ピショ，クリスティアンフランス国 69960 コルバアレロランガロ５ (72)発明者マレ，フランソワフランス国 69100 ヴィルーバンヌリュアナトールフランス 84 (72)発明者ノヴリ−ルソー，アルメルフランス国 38180 セイザンリュデュパルク 29

Claims

【特許請求の範囲】１．捕獲相を使用し、標的生物学的物質を少なくとも捕獲相と接触させ、捕獲相／標的生物学的種錯体を検出することを特徴とする、サンプル中に含まれる標的生物学的物質を単離するための方法であって、捕獲相はマイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第一の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第一の錯体化基より成り、これらの基は標的生物学的物質を特異的に認識することが可能な第一の生物学的種にそれ自体結合する第一の遷移金属に対する配位によって結合していることを特徴とする方法。２．捕獲相が、検出相を得るためにマーカーを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。３．マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第二の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第二の錯体化基より成る検出相も使用し、これらの基は標的生物学的物質を特異的に認識することが可能な第二の生物学的種にそれ自体結合する第二の遷移金属、及びマーカーに対する配位によって結合していることを特徴とする請求項１記載の方法。４．第一及び／または第二のポリマーが、親水性ポリマーの群から選択されることを特徴とする請求項１または３記載の方法。５．第一及び／または第二のポリマーが、水．溶性モノマー、アクリルアミド、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミドまたはメタクリルアミド誘導体、少なくとも一つの架橋剤、及び少なくとも一つの官能性モノマーの重合によって得られる官能化ポリマーであることを特徴とする請求項４記載の方法。６．水溶性モノマーが、N-イソプロピルアクリルアミド、N-エチルメタクリルアミド、N-n-プロピルアクリルアミド、N-n-プロピルメタクリルアミド、N-n-イソプロピルメタクリルアミド、N-シクロプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド、及びN-メチル-N-n- プロピルアクリルアミドから選択され、第一のモノマーは好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）であることを特徴とする請求項５記載の方法。７．官能性モノマーが、以下の式(Ｉ)：ＣＨ₂＝Ｃ（Ｚ）−（Ｘ）_m−（Ｒ）_p−（Ｙ）_n （Ｉ）［式中、Ｚは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル基、またはベンジル、−ＣＯＯＨまたは −ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂基を表し、Ｙは、−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）₂、Ｘは、−ＮＨ(ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＨ₂−）₂、−Ｎ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）(ＣＨ₂−ＣＨ₂−)、またはＣＨ（ＣＯＯＨ）−を表し、Ｒは、任意にＯまたはＮのような少なくとも一つのヘテロ原子が間に入つた直鎖状炭化水素ベース鎖を表し、ｍおよびｐはそれぞれ、互いに独立な０または１に等しい整数であり、そしてｎは、１から３の間の範囲の整数である］に相当することを特徴とする請求項５記載の方法。８．官能性モノマーが、任意に窒素を含有するカルボン酸誘導体、イタコン酸、アクリル酸誘導体、及びメタクリル酸誘導体から選択されることを特徴とする請求項７記載の方法。９．捕獲相及び／または検出相がマイクロ微粒子形態で存在し、平均粒径が５μ ｍ以下であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか一項記載の方法。１０．捕獲相が平坦なまたは微粒子支持体も含むことを特徴とする請求項１記載の方法。１１．支持体が微粒子であり、有機または無機の、親水性または疎水性のコアより成ることを特徴とする請求項１０記載の方法。１２．上記コアが、ポリスチレン、シリカ及び金属酸化物を含む群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。１３．上記コアが磁性化合物も含むことを特徴とする請求項１１または１２記載の方法。１４．上記コアが上記第一のポリマーを使用して被覆されており、このポリマーが直鎖状であることを特徴とする請求項１１ないし１３のいずれか一項記載の方法。１５．上記コアが上記ポリマーを使用して被覆されており、上記ポリマーが微粒子であることを特徴とする請求項１１ないし１３のいずれか一項記載の方法。１６．第一及び／または第二のポリマーが、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）であり、錯体化基がイタコン酸または無水マレイン酸−共−メチルビニルエーテルから由来することを特徴とする請求項１または３記載の方法。１７．第一及び／または第二の遷移金属が、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、鉄、マグネシウム、マンガン、鉛、パラジウム、白金及び金から選択されることを特徴とする請求項１または３記載の方法。１８．第一の生物学的種を捕獲相と接触させること、及び／または第二の生物学的種を検出相と接触させることが、それぞれ上記第一及び第二の生物学的種の等電点以上のｐＨで実施されることを特徴とする請求項１または３記載の方法。１９．第一及び／または第二の生物学的種が、ヒスチジン及び／またはシステインに富むことを特徴とする請求項１または３記載の方法。２０．凝集反応が使用されることを特徴とする請求項１及び４ないし１９のいずれか一項記載の方法。２１．検出相のためのマーカーが、酵素、ビオチン、イミノビオチン、蛍光成分、放射性活性成分、化学発光成分、電子密度成分、磁性成分、抗原、ハプテン及び抗体より成る群から選択されることを特徴とする請求項２または３記載の方法。２２．ＥＬＩＳＡ法が使用されることを特徴とする請求項２または３及び４ないし１９または２１のいずれか一項記載の方法。２３．マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第一の徴粒子または直鎖状ポリマー、及び第一の錯体化基より成り、これらの基は標的生物学的物質を認識することが可能な第一の生物学的種にそれ自体結合する第一の遷移金属に対する配位によって結合していることを特徴とする、標的生物学的物質を捕獲するための相。２４．マイクロ微粒子または直鎖状形態で存在し、外見上親水性の性質を有する少なくとも一つの第二の微粒子または直鎖状ポリマー、及び第二の錯体化基より成り、これらの基は標的生物学的物質を認識することが可能な第二の生物学的種にそれ自体結台する第二の遷移金属、及びマーカーに対する配位によって結合していることを特徴とする、標的生物学的物質を検出するための相。２５．請求項２３に記載の捕獲相、及び／または請求項２４に記載の検出相を含む、標的生物学的物質を単離するための試薬。