JPWO2010004777A1 - 無機ナノ粒子標識剤 - Google Patents
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Abstract
生物及び医学の分野で標識体として利用可能な適応性があり、安定な発光強度の蛍光が得られる無機ナノ粒子標識剤を提供する。本発明の無機ナノ粒子標識剤は、有機化合物により表面修飾された無機ナノ粒子を含有する無機ナノ粒子標識剤であって、当該無機ナノ粒子の平均粒径が1〜10nmであり、当該有機化合物がポリエチレングリコール鎖を有する化合物であり、当該無機ナノ粒子標識剤の平均粒径:Dが8〜25nmであり、かつ当該有機化合物の当該無機ナノ粒子1個当たりの量:M(mol)と当該有機化合物の当該無機ナノ粒子表面からの長さ:L(nm)が、下記関係式(I)で表される関係にあることを特徴とする。関係式(I):(M×1022)×L/D=1.0〜4.5
Description
本発明は、無機ナノ粒子、特に半導体ナノ粒子の表面に有機化合物による修飾を施した無機ナノ粒子標識剤に関する。
ナノテクノロジーにおける最近の進歩は、無機ナノ粒子を、検出、診断、感知及びその他の用途に使用することの可能性を示唆している。また、生物系と相互作用する無機ナノ粒子は、最近生物及び医学の分野で広く関心を集めている。これらの無機ナノ粒子は、感知(例えば画像化)及び治療目的(例えば薬物送達)の両方にとって新規血管内プローブとして有望であると考えられている。
一般に、無機ナノ粒子の中で、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め(quantum confinement)効果を示す物質からなるナノ粒子は、「量子ドット」と称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった10数nm程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。
したがって、量子ドットの大きさ又は物質組成を調節すると、エネルギーバンドギャップを調節することができて様々な水準の波長帯のエネルギーを光として利用することができる可能性があると考えられている。このため、最近、当該半導体ナノ粒子を生物及び医学の分野で生体細胞を構成する化学物質・分子等に関する各種情報を得るための標識体として応用する技術の発展が期待されている。
しかしながら、無機ナノ粒子ないし半導体ナノ粒子を生物及び医学の分野で標識体として利用する場合、無機ナノ粒子は、生体組織・細胞内における親和性及び分散性が乏しく、凝集を引き起こし易く、生体内へ滞留してしまうという問題がある。また、標的分子等に吸着させた際に、本来の標識機能が失われるという問題がある。したがって、そのままの粒子構造では標識体には成りえず、生体分子への親和性・結合性を得るために表面修飾を施し上記問題を解決することが検討されているが、生体分子の動態を知るための標識体等に求められる高度なレベルの適応性には十分に応えられない状況である(例えば特許文献1及び2参照)。
特表2006−517985号公報
特開2007−178239号公報
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、生物及び医学の分野で標識体として利用可能な適応性があり、安定な発光強度の蛍光が得られる無機ナノ粒子標識剤を提供することである。
本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
1.有機化合物により表面修飾された無機ナノ粒子を含有する無機ナノ粒子標識剤であって、当該無機ナノ粒子の平均粒径が1〜10nmであり、当該有機化合物がポリエチレングリコール鎖を有する化合物であり、当該無機ナノ粒子標識剤の平均粒径:Dが8〜25nmであり、かつ当該有機化合物の当該無機ナノ粒子1個当たりの量:M(mol)と当該有機化合物の当該無機ナノ粒子表面からの長さ:L(nm)が、下記関係式(I)で表される関係にあることを特徴とする無機ナノ粒子標識剤。
関係式(I):(M×1022)×L/D=1.0〜4.5
2.前記無機ナノ粒子が、半導体ナノ粒子であることを特徴とする前記1に記載の無機ナノ粒子標識剤。
関係式(I):(M×1022)×L/D=1.0〜4.5
2.前記無機ナノ粒子が、半導体ナノ粒子であることを特徴とする前記1に記載の無機ナノ粒子標識剤。
3.前記半導体ナノ粒子が、シリコン(Si)を含有することを特徴とする前記2に記載の無機ナノ粒子標識剤。
4.前記半導体ナノ粒子が、コア/シェル構造を有しており、当該コアとシェルの組成が異なることを特徴とする前記2又は3に記載の無機ナノ粒子標識剤。
本発明の上記手段により、生物及び医学の分野で標識体として利用可能な適応性があり、安定な発光強度の蛍光が得られる無機ナノ粒子標識剤を提供することができる。
すなわち、無機ナノ粒子の表面を、特定態様条件下、特定有機化合物で修飾することにより、生体組織内での親水性ならびに非特異的結合性を制御するこができ、生体分子の動態を知るための標識体としても好適に使用できる。
本発明の無機ナノ粒子標識剤は、有機化合物により表面修飾された無機ナノ粒子を含有する無機ナノ粒子標識剤であって、当該無機ナノ粒子の平均粒径が1〜10nmであり、当該有機化合物がポリエチレングリコール鎖を有する化合物であり、当該無機ナノ粒子標識剤の平均粒径:Dが8〜25nmであり、かつ当該有機化合物の当該無機ナノ粒子1個当たりの量:M(mol)と当該有機化合物の当該無機ナノ粒子表面からの長さ:L(nm)が、前記記関係式(I)で表される関係にあることを特徴とする。この特徴は、請求の範囲第1項から第4項に係る発明に共通する技術的特徴である。
本発明の実施態様としては、前記無機ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である態様であることが好ましい。また、当該半導体ナノ粒子が、シリコン(Si)又はゲルマニウム(Ge)の少なくとも一方を含有することが好ましい。更に、当該半導体ナノ粒子が、コア/シェル構造を有しており、当該コアとシェルの組成が異なる態様であることが好ましい。
以下、本発明、その構成要素、及び本発明を実施するための最良の形態・態様について説明する。
(無機ナノ粒子)
本発明に係る無機ナノ粒子の材料としては、公知の種々の蛍光発光性化合物及びその原料を用いることができる。例えば、後述する半導体材料のほかに、エルビウム(Er)、ホロミウム(Ho)、プラセオジウム(Pr)、ツリウム(Tm)、ネオジウム(Nd)、ガドリニウム(Gd)、ユウロピウム(Eu)、イッテルビウム(Yb)、サマリウム(Sm)及びセリウム(Ce)等の希土類元素及びこれらを含有するハロゲン化合物等を用いることができる。
本発明に係る無機ナノ粒子の材料としては、公知の種々の蛍光発光性化合物及びその原料を用いることができる。例えば、後述する半導体材料のほかに、エルビウム(Er)、ホロミウム(Ho)、プラセオジウム(Pr)、ツリウム(Tm)、ネオジウム(Nd)、ガドリニウム(Gd)、ユウロピウム(Eu)、イッテルビウム(Yb)、サマリウム(Sm)及びセリウム(Ce)等の希土類元素及びこれらを含有するハロゲン化合物等を用いることができる。
本発明においては、無機ナノ粒子として、下記の半導体ナノ粒子を用いることが好ましい。
〈半導体ナノ粒子〉
本発明に係る半導体ナノ粒子の材料としては、公知の種々の蛍光発光性化合物及びその原料を用いることができる。例えば、従来、半導体ナノ粒子の材料として知られている種々の半導体材料を用いて形成することができる。具体的には、例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−V族の半導体化合物及びこれらの化合物を構成する元素を含む原料化合物を用いることができる。
本発明に係る半導体ナノ粒子の材料としては、公知の種々の蛍光発光性化合物及びその原料を用いることができる。例えば、従来、半導体ナノ粒子の材料として知られている種々の半導体材料を用いて形成することができる。具体的には、例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−V族の半導体化合物及びこれらの化合物を構成する元素を含む原料化合物を用いることができる。
II−VI族の半導体の中では、特に、MgS、MgSe、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、HgS、HgSe及びHgTeを挙げることができる。
III−V族の半導体の中では、GaAs、GaN、GaPGaSb、InGaAs、InP、InN、InSb、InAs、AlAs、AlP、AlSb及びAlSを挙げることができる。
IV族の半導体の中では、Ge及びSiは特に適している。
上記の各種半導体材料のうち、安全性を満たす組成という観点から、特に、Si、Ge、ZnS、InN、InPが好ましい材料として挙げられるが、これらのうちで、本発明に係る半導体ナノ粒子を構成する主要成分原子としては、シリコン(Si)、亜鉛(Zn)及びゲルマニウム(Ge)が最も好ましい。なお、本願において、「半導体ナノ粒子を構成する主要成分原子」とは、当該半導体ナノ粒子を構成する原子のうち含有比率が最大である原子をいう。
なお、本発明においては、半導体ナノ粒子をコア/シェル構造を有する粒子にすることが好ましい。この場合、半導体ナノ粒子は半導体微粒子からなるコア粒子と当該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア/シェル構造を有する半導体ナノ微粒子であって、該コア粒子とシェル層の化学組成が相異するものであることが好ましい。これにより、シェルのバンドギャップは、コアより高くすることが好ましい。
シェルはコア粒子の表面欠陥を安定化し輝度を向上させるために必要であるし、表面修飾剤が吸着・結合しやすい面を形成するためにも重要となる。本発明の効果にとっても検出感度の精度を向上するうえで重要な構成である。
以下、コア粒子とシェル層について説明する。
〈コア粒子〉
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、GaAs、GaP、GaSb、InGaAs、InP、InN、InSb、InAs、AlAs、AlP、AlSb、AlS、PbS、PbSe、Ge、Si、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、Si、Zn及びGeである。
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、GaAs、GaP、GaSb、InGaAs、InP、InN、InSb、InAs、AlAs、AlP、AlSb、AlS、PbS、PbSe、Ge、Si、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、Si、Zn及びGeである。
本発明に係るコアの平均粒径に関しては、0.5〜15nmであることが好ましい。
なお、本発明において、半導体ナノ粒子の平均粒径は本来3次元で求める必要があるが、微粒子過ぎるため難しく、現実には二次元画像で評価せざるを得ないため、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて電子顕微鏡写真の撮影シーンを変えて数多く撮影し平均化することで求めることが好ましい。従って、TEMで撮影する粒子数としては100個以上が好好ましい。
本発明に係る半導体ナノ粒子は、赤外線領域の波長領域において蛍光発光する、すなわち赤外発光するように、コアの平均粒径を調整することが好ましい。
〈シェル層〉
シェルに用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdO、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、GaS、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InAs、InN、InP、InSb、AlAs、AlN、AlP、AlSb、又はこれらの混合物等が挙げられる。
シェルに用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdO、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、GaS、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InAs、InN、InP、InSb、AlAs、AlN、AlP、AlSb、又はこれらの混合物等が挙げられる。
本発明において、特に好ましい半導体材料は、SiO2、GeO2、及びZnSである。
なお、本発明に係るシェル層は、コア粒子が部分的に露出して弊害を生じない限り、コア粒子の全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。
〈ドーパント〉
本発明に係る半導体ナノ粒子は、それを構成する主要成分原子と等価の価電子配置をもつ異種原子もしくは当該異種原子の原子対をドーパントとして含有し、かつ当該ドーパントが半導体ナノ粒子表面又はその近傍に均一に分布していることが好ましい。
本発明に係る半導体ナノ粒子は、それを構成する主要成分原子と等価の価電子配置をもつ異種原子もしくは当該異種原子の原子対をドーパントとして含有し、かつ当該ドーパントが半導体ナノ粒子表面又はその近傍に均一に分布していることが好ましい。
なお、「価電子」とは、原子を構成する電子殻(K殻、L殻、M殻・・・)の最外殻に保有される電子のことをいう。従って、半導体ナノ粒子構成する主要成分原子をシリコン(Si)とした場合は、その価電子は4電子を最外殻に配置しているため、等価の価電子配置をとる原子もしくは原子対はBe−Be(Be対)、Mg−Mg(Mg対)、Geなどが挙げられる。
本発明に係る半導体ナノ粒子構成する主要成分原子をシリコン(Si)又はゲルマニウム(Ge)にした場合、ドーパントとして、特にBe−Beが好ましい。
なお、本発明において、ドーパントの含有位置としては、半導体ナノ粒子の表面又はその近傍であることを要する。ここで、「表面の近傍」とは、半導体ナノ粒子の表面から半径の30%の範囲以内、特に好ましくは15%の以内範囲である。
本発明に係るドーパントの分布状態は、X線光電子分光分析法(XPS/ESCA;XPS:X−ray Photoelectron Spectroscopy/ESCA:Electron Spectroscopy for Chemical Analysis)により観察・測定することができる。なお、X線光電子分光分析法は、単色の光(X線)照射で飛び出す電子の運動エネルギーを測定することにより、固体表面及びその近傍の状態(例えば元素の組成)を調べる方法である。
〈半導体ナノ粒子の粒径〉
本発明に係る無機ナノ粒子、例えば半導体ナノ粒子の平均粒径は、1〜10nmであることを特徴とする。好ましくは、1〜5nmである。
本発明に係る無機ナノ粒子、例えば半導体ナノ粒子の平均粒径は、1〜10nmであることを特徴とする。好ましくは、1〜5nmである。
なお、本発明に係る半導体ナノ粒子のうち、電子の波長(10nm程度)より小さい粒子径を有するナノサイズの粒子は、量子サイズ効果として電子の運動に対するサイズ有限性の影響が大きくなってくるために、バルク体とは異なる特異な物性を示すことが知られている。一般に、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め(quantum confinement)効果を示す半導体ナノ粒子は、「量子ドット」とも称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった10数nm程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。したがって、量子ドットの大きさまたは物質組成を調節すると、エネルギーバンドギャップを調節することができて様々な水準の波長帯のエネルギーを利用することができる。また、量子ドット、すなわち半導体ナノ粒子は、同一組成で、粒径を変化させることで、発光波長をコントロールできるという特徴をもつ。
本発明に係る半導体ナノ粒子は、350〜1100nmの範囲の蛍光を発光するように調整することができるが、本発明においては、生体細胞自らがもつ発光の影響をなくしSN比を向上するため、近赤外領域の波長の発光も好ましく用いられる。
(半導体ナノ粒子の製造方法)
本発明に係る半導体ナノ粒子の製造方法としては、従来公知の液相法又は気相法による製造方法を用いることができる。
本発明に係る半導体ナノ粒子の製造方法としては、従来公知の液相法又は気相法による製造方法を用いることができる。
液相法の製造方法としては、沈殿法、共沈法、ゾル−ゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である(例えば、特開2002−322468号、特開2005−239775号、特開平10−310770号、特開2000−104058号公報等を参照)。
なお、液相法により、半導体ナノ粒子を製造する場合においては、当該半導体の前駆体を還元反応により還元する工程を有する製造方法であることが好ましい。また、当該半導体前駆体の反応を界面活性剤の存在下で行う工程を有する態様が好ましい。なお、本発明に係る半導体前駆体は、上記の半導体材料として用いられる元素を含む化合物であり、たとえば半導体がシリコン(Si)の場合、半導体前駆体としてはSiCl4などが挙げられる。その他半導体前駆体としては、InCl3、P(SiMe3)3、ZnMe2、CdMe2、GeCl4、トリブチルホスフィンセレンなどが挙げられる。
反応前駆体の反応温度としては、半導体前駆体の沸点以上かつ溶媒の沸点以下であれば、特に制限はないが、70〜110℃の範囲が好ましい。
〈還元剤〉
半導体前駆体を還元する還元剤としては、従来周知の種々の還元剤を反応条件に応じて選択し用いることができる。本発明においては、還元力の強さの観点から、水素化アルミニウムリチウム(LiAlH4)、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、水素化ビス(2−メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム、水素化トリ(sec−ブチル)ホウ素リチウム(LiBH(sec−C4H9)3)及び水素化トリ(sec−ブチル)ホウ素カリウム、水素化トリエチルホウ素リチウムなどの還元剤が好ましい。特に、還元力の強さから水素化アルミニウムリチウム(LiAlH4)が好ましい。
半導体前駆体を還元する還元剤としては、従来周知の種々の還元剤を反応条件に応じて選択し用いることができる。本発明においては、還元力の強さの観点から、水素化アルミニウムリチウム(LiAlH4)、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、水素化ビス(2−メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム、水素化トリ(sec−ブチル)ホウ素リチウム(LiBH(sec−C4H9)3)及び水素化トリ(sec−ブチル)ホウ素カリウム、水素化トリエチルホウ素リチウムなどの還元剤が好ましい。特に、還元力の強さから水素化アルミニウムリチウム(LiAlH4)が好ましい。
〈溶媒〉
半導体前駆体の分散用溶媒としては、従来周知の種々の溶媒を使用できるが、エチルアルコール、sec−ブチルアルコール、t−ブチルアルコール等のアルコール類、トルエン、デカン、ヘキサンなどの炭化水素類溶媒を使用することが好ましい。本発明においては、特に、トルエン等の疎水性の溶媒が分散用溶媒として好ましい。
半導体前駆体の分散用溶媒としては、従来周知の種々の溶媒を使用できるが、エチルアルコール、sec−ブチルアルコール、t−ブチルアルコール等のアルコール類、トルエン、デカン、ヘキサンなどの炭化水素類溶媒を使用することが好ましい。本発明においては、特に、トルエン等の疎水性の溶媒が分散用溶媒として好ましい。
〈界面活性剤〉
界面活性剤としては、従来周知の種々の界面活性剤を使用でき、陰イオン、非イオン、陽イオン、両性界面活性剤が含まれる。なかでも第四級アンモニウム塩系である、テトラブチルアンモニウムクロリド、ブロミド又はヘキサフルオロホスフェート、テトラオクチルアンモニウムブロミド(TOAB)、またはトリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミドが好ましい。特に、テトラオクチルアンモニウムブロミドが好ましい。
界面活性剤としては、従来周知の種々の界面活性剤を使用でき、陰イオン、非イオン、陽イオン、両性界面活性剤が含まれる。なかでも第四級アンモニウム塩系である、テトラブチルアンモニウムクロリド、ブロミド又はヘキサフルオロホスフェート、テトラオクチルアンモニウムブロミド(TOAB)、またはトリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミドが好ましい。特に、テトラオクチルアンモニウムブロミドが好ましい。
なお、液相法による反応は、液中の溶媒を含む化合物の状態により大きく変化する。単分散性の優れたナノサイズの粒子を製造する際には、特に注意を要する必要がある。例えば、逆ミセル反応法では、界面活性剤の濃度や種類により、反応場となる逆ミセルの大きさや状態が変わってくるため、ナノ粒子が形成される条件が限られてしまう。したがって、適切な界面活性剤は溶媒との組み合わせが必要となる。
気相法の製造方法としては、(1)対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法(例えば特開平6−279015号公報参照)、(2)電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法(例えば特表2003−515459号公報参照)、(3)レーザーアブレーション法(例えば特開2004−356163号参照)、(4)高速スパッタリング法(例えば特開2004−296781号参照)などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。
〈半導体ナノ粒子形成後の後処理〉
本発明に係る半導体ナノ粒子の製造方法においては、半導体ナノ粒子形成後、特にシェル形成後にプラズマ、熱、放射線、又は超音波による処理のいずれかの後処理を行う工程を含む態様も好ましい。
本発明に係る半導体ナノ粒子の製造方法においては、半導体ナノ粒子形成後、特にシェル形成後にプラズマ、熱、放射線、又は超音波による処理のいずれかの後処理を行う工程を含む態様も好ましい。
プラズマ処理であれば、その粒子組成・結晶性・表面性を考慮し低温・高温プラズマ、マイクロ波プラズマ、大気圧プラズマなど適応するものを選択するが、マイクロ波プラズマが好ましい。
熱処理については、大気、真空、不活性ガス領域のいずれかを選択し、熱を施すが蛍光体粒子の構成によりその適用する温度領域は異なる。温度が高すぎた場合にはコアとシェルの間にひずみが生じたり、剥がれが生じることもある。低温では効果に乏しく100℃以上300℃以下が好ましく用いられる。
放射線処理は、高エネルギーを要するX線、γ線、中性子線が用いられたり、エネルギーは低いものの真空紫外線(VUV)、紫外線や短パルスレーザーなどが用いられる。その処理時間は放射線の種類によって異なる。X線などにおいては透過能が高いため、どのような組成においても比較的短時間で済むことが多く、紫外線においては比較的長時間の照射が必要となる。
これら後処理の効果については、原理的なものは解明できてないがコア/シェル型粒子のコアとシェルの界面の接合性を強化し、不動態化が促進した結果、発光効率が向上したと推定している。赤外発光体にはその影響が著しく現れ、特性に反映したものと推定する。
本発明においては、シェルのバンドギャップはコアより高いことが好ましい。シェルはコア粒子の表面欠陥を安定化し輝度を向上させるために必要であるし、蛍光標識剤とする為に表面修飾剤が吸着・結合しやすい面を形成するために重要となる。
(無機ナノ粒子の表面修飾)
本発明の無機ナノ粒子標識剤は、有機化合物により表面修飾された無機ナノ粒子を含有する無機ナノ粒子標識剤であって、当該無機ナノ粒子の平均粒径が1〜10nmであり、当該有機化合物がポリエチレングリコール鎖を有する化合物であり、当該無機ナノ粒子標識剤の平均粒径:Dが8〜25nmであり、かつ当該有機化合物の当該無機ナノ粒子1個当たりの量:M(mol)と当該有機化合物の当該無機ナノ粒子表面からの長さ:L(nm)が、下記関係式(I)で表される関係にあることを特徴とする無機ナノ粒子標識剤。
関係式(I):(M×1022)×L/D=1.0〜4.5
表面修飾の方法としては、従来公知の種々の方法を用いることができる。本発明においては、基本的には、例えば、無機ナノ粒子の表面を過酸化水素水等を用いて水酸化させる。次に、水酸化された表面にメルカプト基又は/及びアミノ基等の官能基を有するシランカップリング剤を反応させる。その後、当該官能基と反応する官能基を持つポリエチレングリコール鎖を有する化合物(ポリエチレングリコール類)を反応させることにより、本発明に係る態様の表面修飾を施した無機ナノ粒子標識剤を作製することができる。
本発明の無機ナノ粒子標識剤は、有機化合物により表面修飾された無機ナノ粒子を含有する無機ナノ粒子標識剤であって、当該無機ナノ粒子の平均粒径が1〜10nmであり、当該有機化合物がポリエチレングリコール鎖を有する化合物であり、当該無機ナノ粒子標識剤の平均粒径:Dが8〜25nmであり、かつ当該有機化合物の当該無機ナノ粒子1個当たりの量:M(mol)と当該有機化合物の当該無機ナノ粒子表面からの長さ:L(nm)が、下記関係式(I)で表される関係にあることを特徴とする無機ナノ粒子標識剤。
関係式(I):(M×1022)×L/D=1.0〜4.5
表面修飾の方法としては、従来公知の種々の方法を用いることができる。本発明においては、基本的には、例えば、無機ナノ粒子の表面を過酸化水素水等を用いて水酸化させる。次に、水酸化された表面にメルカプト基又は/及びアミノ基等の官能基を有するシランカップリング剤を反応させる。その後、当該官能基と反応する官能基を持つポリエチレングリコール鎖を有する化合物(ポリエチレングリコール類)を反応させることにより、本発明に係る態様の表面修飾を施した無機ナノ粒子標識剤を作製することができる。
本発明において用いることができるポリエチレングリコール鎖を有する化合物(ポリエチレングリコール類)としては、分子量300〜3000までの種々のものを用いることができるが末端に生体分子をターゲットするアミノ基、カルボキシル基、マレイミド基をもつポリエチレングリコール類を挙げることができる。
本発明において用いることができるシランカップリング剤としては、下記一般式で表されるシラン化合物又はその誘導体を用いることができる。
一般式:X−A−Si(OR)nR’n−3
上記式中、Xは、官能基であり、例えば、アミノ基、メルカプト基、ハロゲン、エポキシ基、ビニル基、メタクリロキシ基、アクリロキシ基、N−(アミノアルキル)−アミノ基などである。
上記式中、Xは、官能基であり、例えば、アミノ基、メルカプト基、ハロゲン、エポキシ基、ビニル基、メタクリロキシ基、アクリロキシ基、N−(アミノアルキル)−アミノ基などである。
Aは、炭化水素鎖などであり、例えば、−(CH2)2−、−(CH2)3−、−(CH2)4−などが挙げられ、R及びR’は同一でも異なっていてもよく、直鎖または分岐鎖のアルキル基であり、一般的には炭素数1〜6のものである。
当該シランカップリング剤の代表的なものとしては、例えば、N−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、N−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシラン、N−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリエトキシシラン、3−アミノプロピルトリメトキシシラン、3−アミノプロピルトリエトキシシラン、3−トリエトキシシリル−N−(1,3−ジメチル−ブチリデン)プロピルアミン、N−フェニル−3−アミノプロピルトリメトキシシラン、N−(ビニルベンジル)−2−アミノエチル−3−アミノプロピルトリメトキシシラン、3−ウレイドプロピルトリエトキシシラン、3−クロロプロピルトリメトキシシラン、3−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ビス(トリエトキシシリルプロピル)テトラスフィド、3−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン、2−(3,4−エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシラン、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、3−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、3−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、3−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、3−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、3−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、3−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、p−スチリルトリメトキシシラン、ビニルトリクロルシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリアセトキシシラン、オクタデシルジメチル[3−(トリメトキシシリル)プロピル]アンモニウムクロライドなどが挙げられる。本発明では、上記のうち、アミノ基又はメルカプト基を有するシラン化合物を好適に使用できる。
カップリング剤は、下記分散溶媒を使用した希釈液として使用することができ、一般的には水溶液として使用されるが、場合によっては酢酸を少量添加した水溶液の形態であってもよい。カップリング剤の濃度は,適宜好適な濃度として使用でき、例えば、0.001〜5.0%の濃度のもの、あるいは0.01〜1.0%の濃度のものを、無機ナノ粒子の分散液に添加してよい。
本発明において用いることができる分散溶媒としては、表面修飾化合物の種類により溶解性が異なるため一概には言えないが、水やアセトン、メチルエチルケトンのようなケトン類、酢酸エチルのようなエステル類、メタノール、エタノールのようなアルコール類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ジグリム、ヘキサメチルリン酸トリアミドのような非プロトン性極性溶媒、その他、ニトロメタン、アセトニトリル等が挙げられる。特に、水や水を混合したアルコールやケトンのような親水性有機溶剤が好適に用いうる。
本発明においては、無機ナノ粒子の表面を修飾するための有機化合物がポリエチレングリコール鎖を有する化合物であり、当該無機ナノ粒子標識剤の平均粒径:Dが8〜25nmであり、かつ当該有機化合物の当該無機ナノ粒子1個当たりの量:M(mol)と当該化合物の表面からの長さ:L(nm)が、前記関係式(I)で表される関係にあることを特徴とする。
従って、無機ナノ粒子標識剤の平均粒径が、8〜25nmの範囲内になるように、また、当該有機化合物の量と長さを関係(I)の範囲内になるように制御するために、ポリエチレングリコール類及びシランカップリング剤の種類の選択と、これらの使用量の調整をすることを要する。
なお、無機ナノ粒子標識剤の平均粒径は、前記の半導体ナノ粒子の平均粒径の測定方法に準じた電子顕微鏡観察法により測定できる。
また、当該有機化合物(ポリエチレングリコール類)の量は、表面修飾のための反応終了後の反応液中の当該化合物の分光学的測定を紫外可視分光光度計を用いてすること、又は表面修飾後に無機ナノ粒子から当該有機化合物を酸分解等により完全に脱離させ、その量を上記と同様に分光学的測定をすることにより明確にすることができる。
本発明の無機ナノ粒子標識剤の有機化合物の長さLは修飾前の無機ナノ粒子の粒径と修飾後の標識剤粒径をレーザー動的光散乱法を用いた粒径測定装置やTEMを用いることにより測定し、その差を求めることで得られる。
無機ナノ粒子1個当たりの化合物量Mについては、TGAを用いて質量減少から表面有機物量を測定することで用いた無機ナノ粒子の量と粒径から1個当たりの表面修飾化合物の個数を求めることができる。
(無機ナノ粒子標識剤)
本発明の無機ナノ粒子標識剤は、無機ナノ粒子の表面に適当な表面修飾化合物を配置することにより標的(ターゲット)物質を蛍光標識するための蛍光標識剤に適用できる。特に、当該粒子表面にその表面に生体に親和性を有する、もしくは、接合できる表面修飾化合物を配置し、タンパク質やペプチドなどの標的物質を蛍光標識するための生体分子蛍光標識剤(生体物質蛍光標識剤)とすることに適している。
本発明の無機ナノ粒子標識剤は、無機ナノ粒子の表面に適当な表面修飾化合物を配置することにより標的(ターゲット)物質を蛍光標識するための蛍光標識剤に適用できる。特に、当該粒子表面にその表面に生体に親和性を有する、もしくは、接合できる表面修飾化合物を配置し、タンパク質やペプチドなどの標的物質を蛍光標識するための生体分子蛍光標識剤(生体物質蛍光標識剤)とすることに適している。
なお、生体分子蛍光標識剤(生体物質蛍光標識剤)とする場合、近赤外〜赤外励起で赤外発光する特性を有するように半導体ナノ粒子の発光特性を粒径等により調整することが生体分子に対する非侵襲性、生体組織の透過性等の観点から好ましい。
本発明においては、表面修飾化合物としては、少なくとも1つの官能基と少なくとも1つの半導体ナノ粒子に結合する基を有する化合物であることが好ましい。後者は疎水性の半導体ナノ粒子に吸着できる基であり、他方は生体物質に親和性があり生体分子に結合する官能基である。互いの表面修飾化合物は互いをつなぐ各種のリンカーを使用してもよい。
例えば、半導体ナノ粒子に結合する基としては、当該半導体ナノ粒子を形成するための半導体材料に結合する官能基であれば良い。本発明においては、当該官能基として、特にメルカプト基(チオール基)が好ましい。
生体物質に親和的に結合する官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、フォスフォン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。
なお、ここで、「生体物質」とは、細胞、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、蛋白質、抗体、抗原、小胞体、核、ゴルジ体等を指す。
また、半導体ナノ粒子に結合させる方法としては、表面修飾に適するpHに調整することによりメルカプト基を粒子に結合させることができる。それぞれ他端にはアルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基が導入され、生体のアミノ基、カルボキシル基とペプチド結合することができる。また、DNA、オリゴヌクレオチドなどにアミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基を導入しても同様に結合させることができる。
本発明に係る半導体ナノ粒子を用いて生体分子蛍光標識剤(生体物質蛍光標識剤)を作製する具体的方法としては、例えば、親水化処理された半導体ナノ粒子を有機分子を介して分子標識物質と結合させる方法を挙げることができる。この方法により作製された生体分子蛍光標識剤(生体物質蛍光標識剤)において、分子標識物質は、標的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応することにより、生体物質の蛍光標識が可能となる。
当該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原及びシクロデキストリン等が挙げられる。
また、有機分子としては半導体ナノ粒子と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビン及びカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
具体的には、半導体ナノ粒子をメルカプトウンデカン酸で親水化処理した場合は、有機分子としてアビジン及びビオチンを用いることができる。この場合親水化処理された当該ナノ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに分子標識物質と結合することにより生体分子蛍光標識剤(生体物質蛍光標識剤)となる。
〔半導体ナノ粒子の親水化処理〕
上述した半導体ナノ粒子表面は、一般的には、疎水性であるため、例えば生体分子標識試薬として使用する場合は、このままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題があるため、半導体ナノ粒子の表面を親水化処理することが好ましい。
上述した半導体ナノ粒子表面は、一般的には、疎水性であるため、例えば生体分子標識試薬として使用する場合は、このままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題があるため、半導体ナノ粒子の表面を親水化処理することが好ましい。
親水化処理の方法としては、例えば、表面の親油性基をピリジン等で除去した後に粒子表面に表面修飾剤を化学的及び/または物理的に結合させる方法がある。表面修飾剤としては、親水基として、カルボキシル基・アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどがあげられる。具体的には、例えば、Ge/GeO2型ナノ粒子10−5gをメルカプトウンデカン酸0.2gが溶解した純水10ml中に分散させて、40℃、10分間攪拌し、シェルの表面を処理することで半導体ナノ粒子の表面をカルボキシル基で修飾することができる。
なお、半導体ナノ粒子の表面修飾のための具体的調製は、例えば、Dabbousi等(1997)J.Phys.Chem.B101:9463、Hinesら(1996)J.Phys.Chem.100:468−471、Peng等(1997)J.Am.Chem.Soc.119:7019−7029、及びKuno等(1997)J.Phys.Chem.106:9869に記載されている方法に準拠して行うことができる。
(無機ナノ粒子標識剤とそれを用いた生体分子検出システム)
本発明の無機ナノ粒子標識剤は、上記特徴を有することにより、当該無機ナノ粒子標識剤を標的となる生細胞又は生組織に供給し、半導体ナノ粒子の放射線励起により放出される蛍光を検出することにより当該標的となる生細胞又は生体組織における生体分子を検出することを特徴とする生体分子検出システムに好ましく適応できる。
本発明の無機ナノ粒子標識剤は、上記特徴を有することにより、当該無機ナノ粒子標識剤を標的となる生細胞又は生組織に供給し、半導体ナノ粒子の放射線励起により放出される蛍光を検出することにより当該標的となる生細胞又は生体組織における生体分子を検出することを特徴とする生体分子検出システムに好ましく適応できる。
標的(追跡)生体分子を有する生細胞もしくは生体組織に本発明に係る無機ナノ粒子標識剤を添加することで、標的分子と結合もしくは吸着し、当該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光(放射線)を照射し、当該励起光に応じて半導体ナノ粒子(蛍光半導体微粒子)から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的(追跡)生体分子の蛍光動態イメージングを行うことができる。すなわち、本発明に係る無機ナノ粒子標識剤は、バイオイメージング法(生体物質を構成する生体分子やその動的現象を可視化する技術手段)に利用することができる。
なお、励起のための放射線としては、ハロゲンランプ、タングステンランプなどの可視光からLED、近赤外レーザー光、赤外レーザー光、X線、γ線などが含まれる。
〈分子・細胞イメージング法〉
本発明に係る半導体ナノ粒子は、標的(ターゲット)とする細胞組織の内部若しくは表面に存在する分子に特異的に反応するプローブ分子(探索用分子)を結合させて無機ナノ粒子標識剤として使用することができる。
本発明に係る半導体ナノ粒子は、標的(ターゲット)とする細胞組織の内部若しくは表面に存在する分子に特異的に反応するプローブ分子(探索用分子)を結合させて無機ナノ粒子標識剤として使用することができる。
本願において、「標的(ターゲット)」とは、半導体ナノ粒子の標的とする生体分子等をいい、例えば、組織及び細胞で優先的に発現したりするタンパクであったり、細胞内のゴルジ体、核、膜タンパクなどである。なお、適当なターゲット物質としては、例えば、酵素及び蛋白質、細胞表面受容体;核酸;脂質及びリン脂質を挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明において、プローブ分子としては、生体内部の画像化、細胞内の物質動態計測等を目的として、標的(測定)物質に対応する適切なプローブ分子を採用することが好ましい。
本発明に係る半導体ナノ粒子を利用した無機ナノ粒子標識剤(生体分子蛍光標識剤)は、従来公知の種々の分子・細胞イメージング法に適用することができる。例えば、レーザインジェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などによる分子・細胞イメージング法が挙げられる。これらの方法うち、レーザインジェクション法による分子・細胞イメージング法に適用することが好ましい。
ここで、「レーザインジェクション法」とは、レーザ光を細胞に直接照射し、細胞に微細な穴を開けて遺伝子などの外来物質を導入する光学的方法をいう。
「マイクロインジェクション法」とは、微細な針(マイクロピペット、マイクロシリンジ)を用いて空気圧で機械的に、細胞内に遺伝子などの外来物質を直接注入して導入する方法をいう。
また、「エレクトロポレーション法」(「電気穿孔法」ともいう。)とは、細胞に電気的刺激を印加し、細胞の変形を誘起して細胞内に遺伝子などの外来物質を導入する物理的方法をいう。例えば、細胞懸濁液に数千V/cmの高電圧を数十マイクロ秒のパルスで与えた時に細胞膜に短時間生じる小孔を通して外液が取り込まれることを利用して、細胞外液にDNA等の注入したい試料を加えておき、これを細胞内に導入する方法である。
<無機ナノ粒子の調製>
(Siコア粒子及びSi/SiO2・コア/シェル粒子の調製)
〈HFエッチング法〉
熱処理したSiOx(x=1.999)のフッ酸中溶解によりSiの無機蛍光体ナノ粒子(以下において「Si半導体微粒子」又は「Siコア粒子」ともいう。)を製造する場合、先ず、プラズマCVDによりシリコンウエハー上に成膜したSiOx(x=1.999)を不活性ガス雰囲気中で1100℃、アニールを行う。これにより、SiO2膜中にSi半導体微粒子(結晶)が析出する。アニール時間を調整させることによりサイズの異なるSi微粒子を析出させた。
(Siコア粒子及びSi/SiO2・コア/シェル粒子の調製)
〈HFエッチング法〉
熱処理したSiOx(x=1.999)のフッ酸中溶解によりSiの無機蛍光体ナノ粒子(以下において「Si半導体微粒子」又は「Siコア粒子」ともいう。)を製造する場合、先ず、プラズマCVDによりシリコンウエハー上に成膜したSiOx(x=1.999)を不活性ガス雰囲気中で1100℃、アニールを行う。これにより、SiO2膜中にSi半導体微粒子(結晶)が析出する。アニール時間を調整させることによりサイズの異なるSi微粒子を析出させた。
次に、このシリコンウエハーを室温で1%程度のフッ酸水溶液で処理することによりSiO2膜を除去し、液面に凝集した数nmサイズのSi半導体微粒子を回収する。なお、このフッ酸処理により、半導体微粒子(結晶)表面のSi原子のダングリングボンド(未結合手)が水素終端され、Si結晶が安定化する。その後、回収したSi半導体微粒子の表面を酸素雰囲気中で800℃〜1000℃で約1.5時間加熱して熱酸化し、Si半導体微粒子からなるコアの周囲にSiO2からなるシェル層を形成する。このSi/SiO2・コア/シェルからなる無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径はシスメックス社ゼータサイザーを用いて測定し、結果を表1示した。
(Si/ZnS・コア/シェル粒子の調製)
上記で得られたSiコア粒子をピリジン中に分散させ100℃に保温する。別途、Zn(C2H5)2と((CH3)3Si)2S、P(C4H9)3をアルゴンガス雰囲気下、超音波をかけながら100℃でゆっくり混合した。
上記で得られたSiコア粒子をピリジン中に分散させ100℃に保温する。別途、Zn(C2H5)2と((CH3)3Si)2S、P(C4H9)3をアルゴンガス雰囲気下、超音波をかけながら100℃でゆっくり混合した。
これをピリジン分散液に滴下して添加する。添加後、温度を100℃に制御し、pH(8.0)を一定に保ちゆっくり30分攪拌した。これの遠心分離を行い沈降した粒子を捕集した。得た粒子の元素分析を行ってみたところSiとZnSが確認され、XPS分析によりZnSがSiの表面に被覆していることがわかった。このSi/ZnS・コア/シェルからなる無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径はシスメックス社ゼータサイザーを用いて測定し、表1に結果を示した。
(表面修飾化合物の導入)
上記無機蛍光体ナノ粒子により生体物質を標識する場合、当該粒子と生体物質の双方に、互いに結合する官能基等を導入する必要があるが、下記のように行った。
上記無機蛍光体ナノ粒子により生体物質を標識する場合、当該粒子と生体物質の双方に、互いに結合する官能基等を導入する必要があるが、下記のように行った。
〈Si/SiO2・コア/シェル粒子への修飾官能基の導入〉
メルカプト基(SH基)同士の結合を利用して蛍光半導体微粒子にカルボキシル基を導入する。
メルカプト基(SH基)同士の結合を利用して蛍光半導体微粒子にカルボキシル基を導入する。
先ず、上記のSiコア/シェル粒子を30%過酸化水素水中に10分間分散させ、結晶表面を水酸化させる。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランをトルエンの2%加えて、2時間かけてSiコア粒子の最表面のSiO2をシラン化すると共に末端にメルカプト基を導入する。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入された、表1に示すような一般式Iの化合物長さLに適合するポリエチレングリコール鎖の長さが異なる化合物(末端はメトキシ基)を選択し、過剰量を加えて3時間攪拌した。反応の際、反応条件(反応時間、温度、pH、触媒の有無)を変更し、表面被覆率Cを表1の如く導いた。こうして目的の標識剤を得た。得られた標識剤の作製に用いた各原材料成分を選択的に吸着する複数カラムと、最終カラムの穴径を変えることでサイズ選択性を付与した最終カラムを用いて、連続もしくは別々に全てのカラムでのHPLC処理を行い、標識A以外の原材料・溶媒などの成分を除いた。
尚、表1に示す標識剤サイズの微調整にはポリエチレングリコール鎖の長さを利用して行う。
〈Si/ZnS・コア/シェル粒子への修飾官能基の導入〉
上記で得たSi/ZnS・コア/シェル粒子をバッファ塩溶液に分散して、上記と同様な種類の一旦にメルカプト基の導入されたPEG化合物(末端はメトキシ基)を過剰量加えて適温で2時間攪拌し、粒子表面にメルカプト基を結合させ標識剤を得た。得られた標識剤の作製に用いた各原材料成分を選択的に吸着する複数カラムと、最終カラムの穴径を変えることでサイズ選択性を付与した最終カラムを用いて、連続もしくは別々に全てのカラムでのHPLC処理を行い、標識A以外の原材料・溶媒などの成分を除いた。標識サイズの調整はPEGの長さを調整して行った。
上記で得たSi/ZnS・コア/シェル粒子をバッファ塩溶液に分散して、上記と同様な種類の一旦にメルカプト基の導入されたPEG化合物(末端はメトキシ基)を過剰量加えて適温で2時間攪拌し、粒子表面にメルカプト基を結合させ標識剤を得た。得られた標識剤の作製に用いた各原材料成分を選択的に吸着する複数カラムと、最終カラムの穴径を変えることでサイズ選択性を付与した最終カラムを用いて、連続もしくは別々に全てのカラムでのHPLC処理を行い、標識A以外の原材料・溶媒などの成分を除いた。標識サイズの調整はPEGの長さを調整して行った。
これにより表面に本発明にかかる表面修飾化合物のある表1記載の長さLの表面修飾化合物が導入される。反応の際、反応条件(反応時間、温度、pH、触媒の有無)を変更し、表面の修飾化合物量Mを表1の如く導いた。
粒子表面からの表面修飾化合物の長さLに関しては、粒子の粒径をあらかじめ測定しておき、表面修飾した後に再度粒径測定を行い、その引き算で求める。粒径測定法はレーザー動的光散乱法を用いた測定装置やTEMを用いても求めることができる。
粒子あたりの存在量に関して粒径から計算で求めた体積と比重の積を使用した粒子の質量を割ることにより粒子数が求まる。表面修飾後にTGA(熱重量分析装置)を用いて表面修飾化合物を燃焼した分の質量減少を求めることで表面修飾量が知ることができる。この量を粒子数で割ることで平均的な1粒子当たりの表面修飾量を求めることができる。
(蛍光標識生体分子観察例)
上記で得た標識を事前に羊血清アルブミン(SSA)と等濃度で混和し、個別にVero細胞へ取り込ませた。37℃2時間培養した後、トリプシン処理して5%FBS加DMEM再浮遊させ、同一ガラスボトムディッシュに播種した。37℃で一晩培養した細胞は4%ホルマリンで固定しDAPIで核を染色して、共焦点レーザースキャン顕微鏡(励起405nm)で蛍光観察を行った。
上記で得た標識を事前に羊血清アルブミン(SSA)と等濃度で混和し、個別にVero細胞へ取り込ませた。37℃2時間培養した後、トリプシン処理して5%FBS加DMEM再浮遊させ、同一ガラスボトムディッシュに播種した。37℃で一晩培養した細胞は4%ホルマリンで固定しDAPIで核を染色して、共焦点レーザースキャン顕微鏡(励起405nm)で蛍光観察を行った。
本標識の細胞質のエンドソームへ取り込まれ膜タンパクへの集積状態を蛍光強度に依存した濃度及び分散状態で評価した。即ち本標識が細胞へ取り込まれてエンドソームへ移動集積の移動効率が均一で高い場合はエンドソームでの蛍光強度が高く、その分布も均一で面積も広い。これは標識体の凝集・結合が無い状況を反映する。一方、凝集及び非特異的吸着の影響で取り込み、移動率が低い場合には蛍光強度は低く、不均一な斑模様で発光は場所によって大きく強度がことなり発光累積面積も小さい。この観察の様子を表1に記した。
表1に記載したように本発明の構成にかかる蛍光体標識化合物は凝集することなく分散性にすぐれ目的の生体標識への検出性が非常に安定で鮮明であることがわかる。
Claims (4)
- 有機化合物により表面修飾された無機ナノ粒子を含有する無機ナノ粒子標識剤であって、当該無機ナノ粒子の平均粒径が1〜10nmであり、当該有機化合物がポリエチレングリコール鎖を有する化合物であり、当該無機ナノ粒子標識剤の平均粒径:Dが8〜25nmであり、かつ当該有機化合物の当該無機ナノ粒子1個当たりの量:M(mol)と当該有機化合物の当該無機ナノ粒子表面からの長さ:L(nm)が、下記関係式(I)で表される関係にあることを特徴とする無機ナノ粒子標識剤。
関係式(I):(M×1022)×L/D=1.0〜4.5 - 前記無機ナノ粒子が、半導体ナノ粒子であることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の無機ナノ粒子標識剤。
- 前記半導体ナノ粒子が、シリコン(Si)を含有することを特徴とする請求の範囲第2項に記載の無機ナノ粒子標識剤。
- 前記半導体ナノ粒子が、コア/シェル構造を有しており、当該コアとシェルの組成が異なることを特徴とする請求の範囲第2項又は第3項に記載の無機ナノ粒子標識剤。
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