JP5136548B2 - 蛍光体標識化合物 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光体標識化合物に関し、更に詳しくは、分子イメージングの基礎研究に用いられる蛍光体標識化合物に関する。

生細胞もしくは小動物を対象に生体内の分子をターゲットにした可視化イメージングで、分子動態、分子間相互作用、分子位置情報を明らかに、生命科学機構の解明、創薬に繋げようとする分子イメージングの基礎研究が活発に行われている。従来標識は蛍光で感度が高いといわれる有機色素、有機蛍光タンパクが主に用いられている。しかし、十分な感度とはいえず検出感度を高めようと励起光強度を上げようとした時に生体分子に侵襲性をもたらす光毒性の課題、光分解し耐久性に乏しい課題が生じている。そのため、耐久性が高く、感度も高い無機蛍光体について種々の研究・検討がされている。

無機蛍光体を使用した従来の標識用無機蛍光体標識は検出光をだすコア又はコア／シェル粒子と表面修飾剤から構成される。表面修飾剤は生体内条件に合う水様媒体中で分散させること、及び標的生体分子に特異的吸着させる目的で種々の表面修飾剤（例えば、特許文献１参照）が使われている。

これら従来標識は凝集、会合が不均一に生じるなどして、標的分子の検出感度がばらつき、生体分子検出の真偽精度を落とす課題を生じていた。
特開２００６−７０２４９号公報

本発明の目的は、生体標識への検出性が非常に安定で感度も高い蛍光体標識化合物を提供することにある。

本発明の上記目的は、以下の構成により達成することができる。

１．表面に表面修飾化合物が配置されており、かつ平均粒径が１．０〜２０ｎｍである無機蛍光体ナノ粒子からなる蛍光体標識化合物において、該無機蛍光体ナノ粒子の粒径に対する、該表面修飾化合物の該無機蛍光体ナノ粒子の表面からの長さの比率が０．１０〜０．５０であり、かつ該表面修飾化合物がついていない無機蛍光体ナノ粒子の比重に対する、該表面修飾化合物がついた無機蛍光体ナノ粒子の比重の比率が０．８０〜０．４０であることを特徴とする蛍光体標識化合物。

２．前記無機蛍光体ナノ粒子が半導体ナノ結晶コアと半導体シェルからなるコアシェル型無機蛍光体ナノ粒子であることを特徴とする前記１記載の蛍光体標識化合物。

３．前記無機蛍光体ナノ粒子が近赤外〜赤外光励起で赤外発光することを特徴とする前記１又は２記載の蛍光体標識化合物。

本発明により、生体標識への検出性が非常に安定で感度も高い蛍光体標識化合物を提供することができた。

本発明を更に詳しく説明する。

本発明の表面修飾化合物の長さは無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径に対して０．１０〜０．５０倍であるが、好ましくは０．１５〜０．４倍であり、最も好ましくは０．２〜０．３５倍である。

表面修飾化合物の長さは公知の方法で測定できるが、例えばシスメックス社ゼータサイザーを用いて表面修飾化合物の付いている蛍光体標識化合物の平均粒径を測定する。そして同一の方法で予め測定した、表面修飾化合物を付ける前の無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径から算出できる。

本発明の表面修飾化合物は無機蛍光体ナノ粒子の表面に吸着する基と、生体分子に結合・吸着する基を有する化合物である。無機蛍光体ナノ粒子の表面に吸着する基としては、メルカプト基、アミノ基、ホスホン酸、スルホン酸、シリケート化合物等が挙げられるが無機蛍光体の組成によって適するものを選択できる。生体分子に結合・吸着する基としてはアミノ酸に適するものがふさわしくカルボキシル基、アミノ基等が挙げられる。

具体的な表面修飾化合物としては、例えば以下の化合物を挙げることができるが、本発明はこれらの化合物に限定されない。

Ａ：メルカプト酢酸
Ｂ：２−メルカプトプロピオン酸
Ｃ：３−メルカプトプロピオン酸
Ｄ：２−メルカプト酪酸
Ｅ：４−メルカプト酪酸
Ｆ：８−メルカプトオクタン酸
Ｇ：１１−メルカプトウンデカン酸
Ｈ：１１−メルカプトドデカン酸
表面修飾化合物の長さは種々の手段で変えることができ、無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径に合わせて本発明の範囲に入るように調整される。例えば、無機蛍光体ナノ粒子の表面に吸着する基と、生体分子に結合・吸着する基の間を、アルキル鎖、エチレングリコール鎖（−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｘ−）などの長さで調整する。又、表面修飾化合物がついた無機蛍光体ナノ粒子の比重は、表面修飾化合物がついていない無機蛍光体ナノ粒子の比重の０．８０〜０．４０倍であるが、好ましくは０．８０〜０．４５倍であり、最も好ましくは０．６０〜０．５０倍である。

本発明で規定する比重は浮力を利用したアルキメデス法にて測定できる。比重が既知の液体を使用することで空気中の固体の秤量値Ａ、液体中の固体の秤量値Ｂから浮力Ｆ＝Ａ−Ｂを求め、液体の密度をρｏとしたときに固体の密度ρ＝（Ａ／Ｆ）×ρｏで求められる。この固体を無機蛍光ナノ粒子もしくは表面修飾化合物が吸着した無機蛍光ナノ粒子にすることで同様に求めることができる。

本発明の無機蛍光体ナノ粒子は、平均粒径が１．０〜２０ｎｍであるが、好ましくは１．０〜１０ｎｍである。表面修飾化合物がついた無機蛍光体ナノ粒子及びついていない無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径は公知の方法で測定できるが、例えばシスメックス社ゼータサイザーを用いて測定できる。

本発明の無機蛍光体ナノ粒子はコア／シェル構造であることが好ましい。シェルのバンドギャップがコアより高いことが好ましい。シェルはコア粒子の表面欠陥を安定化し輝度を向上させるために必要であるし、表面修飾剤が吸着・結合しやすい面を形成するためにも重要となる。本発明の効果にとっても検出感度の精度を向上するうえで重要構成となった。

本発明の無機蛍光体ナノ粒子は、近赤外線（約７００ｎｍ〜１３００ｎｍ）などの放射線を使用して励起され、赤外線を発光し得る、コア粒径を有する半導体ナノ粒子である。これは量子サイズ効果を利用し、赤外領域に粒径を調整することで実現できる。シェルはコア粒子の発する蛍光を十分に発揮できるように表面欠陥を安定化し調製される。

また、本発明の標識は近赤外〜赤外励起で赤外発光であることが生体分子に対する非侵襲性という観点で望ましい。また小動物イメージングの場合には赤外領域の波長であることから生体組織の透過性という観点でより深いＩｎ ｖｉｖｏ領域を高感度で検出できるという観点で非常に有用である。特に本発明の構成はふさわしい。

後述する、ＨＦエッチング法において、Ｓｉの無機蛍光体ナノ粒子（以下において、「Ｓｉ半導体微粒子」、「Ｓｉ微粒子」又は「Ｓｉコア粒子」ともいう。）は、アニール時間を調整させることによりサイズの異なるＳｉ微粒子を析出させることができる。また、陽極酸化法においては、通電時間を変更することによりサイズの異なるＳｉ微粒子を得ることができる。

無機蛍光体ナノ粒子は賦活剤を用いた無機蛍光体、半導体ナノ粒子が挙げられる。半導体ナノ粒子は好ましくは量子効果を発揮する量子ドットが好ましく用いられる。

量子ドットとは無機の半導体粒子がナノレベルの粒径サイズ（組成により異なる）になることで、量子閉じ込め効果が発現し、励起エネルギーが保存されることで高効率に蛍光に変換され高い発光強度を生じたり、量子サイズ効果によりサイズが変わることで発光波長が異なる特長を有する粒子を指す。標識剤として用いれば色素などに比較して高検出性を示し、高い耐久性を示す特長がある。

量子ドットは好ましくは周期律表のIV族を用いる。更に好ましくはＳｉ、Ｇｅを使用する。

本発明の無機蛍光体ナノ粒子は３５０ｎｍ〜１１００ｎｍの範囲に蛍光発光する。生体細胞自らがもつ発光の影響をなくしＳＮ比を向上するため、近赤外発光が好ましく用いられる。

本発明の半導体ナノ粒子はコア組成とその表面を覆うシェル組成を有してもよい。半導体ナノ粒子が量子ドットの場合にシェル化することによりコア表面の欠陥を不動態化し、量子効率を向上することができる。ＳｉであればＳｉＯ_２、ＧｅであればＧｅＯ_２を用いることができるが限定されずＺｎＳもシェルに用いることができる。

表面修飾する前の無機蛍光体ナノ粒子の粒径は１〜２０ｎｍである。好ましくは１〜１０ｎｍである。２０ｎｍより大きい場合は標識化合物として細胞イメージングに適用が難しく適用範囲が狭くなる。１ｎｍ未満では逆に表面修飾とのバランスが難しく、発光の阻害を生じる。

（Ｓｉコア粒子及びＳｉ／ＳｉＯ_２・コア／シェル粒子の調製）
〈ＨＦエッチング法〉
熱処理したＳｉＯ_ｘ（ｘ−１．９９９）のフッ酸中溶解によりＳｉの無機蛍光体ナノ粒子を製造する場合、先ず、プラズマＣＶＤによりシリコンウエハー上に成膜したＳｉＯ_ｘ（ｘ−１．９９９）を不活性ガス雰囲気中で１１００℃、アニールを行う。これにより、ＳｉＯ_２膜中にＳｉ半導体微粒子（結晶）が析出する。

次に、このシリコンウエハーを室温で１％程度のフッ酸水溶液で処理することによりＳｉＯ_２膜を除去し、液面に凝集した数ｎｍサイズのＳｉ半導体微粒子を回収する。尚、このフッ酸処理により、半導体微粒子（結晶）表面のＳｉ原子のダングリングボンド（未結合手）が水素終端され、Ｓｉ結晶が安定化する。その後、回収したＳｉ半導体微粒子の表面を酸素雰囲気中で８００〜１０００℃で１．５時間加熱して熱酸化し、Ｓｉ半導体微粒子からなるコアの周囲にＳｉＯ_２からなるシェル層を形成する。このＳｉ／ＳｉＯ_２・コア／シェルからなる無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径はシスメックス社ゼータサイザーを用いて測定し、結果を表１示した。

〈陽極酸化法〉
また、ｐ型シリコンウエハーの陽極酸化によりＳｉ半導体微粒子を製造する場合、先ず、フッ酸（４６％）、メタノール（１００％）及び過酸化水素水（３０％）を１：２：２の割合で混合した溶液中で、ｐ型シリコンウエハー及び白金を対向電極として３２０ｍＡ／ｃｍ^２、２５℃で２０分間通電し、Ｓｉ半導体微粒子（結晶）を析出させる。このようにして得られたＳｉ半導体微粒子の表面を酸素雰囲気中、５００〜６５０℃で１．５時間熱酸化し、Ｓｉ結晶からなるコアの周囲にＳｉＯ_２からなるシェル層を形成する。このＳｉ／ＳｉＯ_２・コア／シェルからなる無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径はシスメックス社ゼータサイザーを用いて測定し、表１に結果を示した。

（Ｓｉ／ＺｎＳ・コア／シェル粒子の調製）
上記で得られたＳｉコア粒子をピリジン中に分散させ１００℃に保温する。別途、Ｚｎ（Ｃ_２Ｈ_５）_２と（（ＣＨ_３）_３Ｓｉ）_２Ｓ、Ｐ（Ｃ_４Ｈ_９）_３をアルゴンガス雰囲気下、超音波をかけながら１００℃でゆっくり混合した。

これをピリジン分散液に滴下して添加する。添加後、温度を１００℃に制御し、ｐＨ（８．０）を一定に保ちゆっくり３０分攪拌した。これの遠心分離を行い沈降した粒子を捕集した。得た粒子の元素分析を行ってみたところＳｉとＺｎＳが確認され、ＸＰＳ分析によりＺｎＳがＳｉの表面に被覆していることがわかった。このＳｉ／ＺｎＳ・コア／シェルからなる無機蛍光体ナノ粒子の平均粒径はシスメックス社ゼータサイザーを用いて測定し、表１に結果を示した。

（表面修飾化合物の導入）
上記無機蛍光体ナノ粒子により生体物質を標識する場合、当該粒子と生体物質の双方に、互いに結合する官能基等を導入する必要があるが、下記のように行った。

〈Ｓｉ／ＳｉＯ_２・コア／シェル粒子への修飾官能基の導入〉
メルカプト基（ＳＨ基）同士の結合を利用して蛍光半導体微粒子にカルボキシル基を導入する。

先ず、上記のＳｉコア／シェル粒子を３０％過酸化水素水中に１０分間分散させ、結晶表面を水酸化させる。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランをトルエンの２％加えて、２時間かけてＳｉコア粒子の最表面のＳｉＯ_２をシラン化すると共にメルカプト基を導入する。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、更に一端にメルカプト基の導入された表１に示す化合物を選択し、適量加えて３時間攪拌した。そこで、Ｓｉコア粒子と選択された酸と結合させる。表１に選択した表面修飾化合物とそのナノ粒子サイズに対する長さ比率（標識体サイズ比）を示した。

尚、表１に主なサイズを決定する表面修飾化合物を記載したが本発明のサイズへの微調整にはアルコール類とのエステル結合を利用してサイズ調整を施している。

〈Ｓｉ／ＺｎＳ・コア／シェル粒子への修飾官能基の導入〉
上記で得たＳｉ／ＺｎＳ・コア／シェル粒子をバッファ塩溶液に分散して、上記と同様な種類の酸を適量加えて適温で２時間攪拌し、粒子表面にメルカプト基を結合させた。これにより表面にカルボキシル基のある表１記載の長さ比率の表面修飾化合物が導入される。

表面修飾化合物の有り無しでの比重については上記で生成したものに対し評価し表１に標識体比重比として示した。

比重の測定は島津製ＳＭＫ−３０１を用いてマニュアルに従い、測定を行った。

上記で得た標識を事前に羊血清アルブミン（ＳＳＡ）と等濃度で混和し、個別にＶｅｒｏ細胞へ取り込ませた。３７℃２時間培養した後、トリプシン処理して５％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ再浮遊させ、同一ガラスボトムディッシュに播種した。３７℃で一晩培養した細胞は４％ホルマリンで固定しＤＡＰＩで核を染色して、共焦点レーザースキャン顕微鏡（励起７００ｎｍ）で赤外蛍光観察を行った。

本標識の細胞質のエンドソームへ取り込まれた時の膜タンパクへの集積状態を蛍光強度に依存する濃度及び分散状態で評価した。即ち本標識が細胞へ取り込まれてエンドソームへ移動集積の移動効率が均一で高い場合はエンドソームでの蛍光強度が高く、その分布も均一で面積も広い。これは標識体の凝集・結合がない状況を反映する。一方、凝集及び比重などの影響で取り込み、移動率が低い場合には蛍光強度は低く、不均一な斑模様で発光は場所によって大きく強度がことなり発光累積面積も小さい。この観察の様子を表１に記した。

表１において、標識体サイズ比とは「無機蛍光体ナノ粒子の粒径に対する、表面修飾化合物の無機蛍光体ナノ粒子の表面からの長さの比率」である。標識体比重比とは「表面修飾化合物がついていない無機蛍光体ナノ粒子の比重に対する、表面修飾化合物がついた無機蛍光体ナノ粒子の比重の比率」である。

表１に記載したように本発明の構成にかかる蛍光体標識化合物は生体標識への検出性が非常に安定で感度も高いことがわかる。

Claims (3)

1. 表面に表面修飾化合物が配置されており、かつ平均粒径が１．０〜２０ｎｍである無機蛍光体ナノ粒子からなる蛍光体標識化合物において、該無機蛍光体ナノ粒子の粒径に対する、該表面修飾化合物の該無機蛍光体ナノ粒子の表面からの長さの比率が０．１０〜０．５０であり、かつ該表面修飾化合物がついていない無機蛍光体ナノ粒子の比重に対する、該表面修飾化合物がついた無機蛍光体ナノ粒子の比重の比率が０．８０〜０．４０であることを特徴とする蛍光体標識化合物。
2. 前記無機蛍光体ナノ粒子が半導体ナノ結晶コアと半導体シェルからなるコアシェル型無機蛍光体ナノ粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の蛍光体標識化合物。
3. 前記無機蛍光体ナノ粒子が近赤外〜赤外光励起で赤外発光することを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の蛍光体標識化合物。