JPWO2008035565A1 - 生体分子検出用試薬及びそれを用いた生体分子検出方法 - Google Patents
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Abstract
半導体ナノ粒子表面上に、生体検出用分子が均等に存在し、蛍光強度のばらつきが小さく、蛍光強度の低減・変動が少ない生体分子検出用試薬、特に半導体ナノ粒子1個当たり、生体分子と特異的に結合する検出用分子が1個存在する生体分子検出用試薬は、半導体ナノ粒子集合体を構成する各半導体ナノ粒子が表面上に生体分子と特異的に結合する検出用分子を有し、かつ各半導体ナノ粒子上に存在する該検出用分子数の標準偏差が5%以下であることを特徴とする。
Description
本発明は、半導体ナノ粒子集合体を利用した生体分子検出用試薬及びそれを用いた生体分子検出方法に関する。
ナノテクノロジーにおける最近の進歩は、ナノ粒子を、検出、診断、感知及びその他の用途に使用することの可能性を示唆している。また、生物系と相互作用するナノ粒子複合体は、最近生物及び医学の分野で広く関心を集めている。これらの複合体は、感知(例えば画像化)及び治療目的(例えば薬物送達)の両方にとって新規血管内プローブとして有望であると考えられている。
一般に、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め(quantum confinement)効果を示す物質は「量子ドット」と称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった10数nm程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。したがって、量子ドットの大きさまたは物質組成を調節すると、エネルギーバンドギャップを調節することができて様々な水準の波長帯のエネルギーを利用することができる。
ところで、分子生物学の進歩によって生体が活動するさまざまな仕組みが明らかになり脳やいろいろな臓器の病気やガンなどを分子レベルで解明する試みが行われている。そのひとつとして生体の機能とその異常を蛍光画像として捉える所謂バイオ・イメージング法が進展しつつある。この分野において、生体分子検出方法として、従来分子標識物質をマーカー物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が検討されている。しかし、当該方法で従来使用されてきた有機蛍光色素などのマーカー物質は、紫外線照射時の劣化が激しく寿命が短いことが欠点であり、また発光効率が低く、感度も十分ではなかった。
そのため、近年、上記マーカー物質として半導体ナノ粒子を用いる方法が注目されている。例えば、極性官能基を有する高分子を半導体ナノ粒子の表面に物理的および/または化学的に吸接合した生体物質標識剤が検討されている(例えば、特許文献1参照。)。また、有機分子をSi/SiO2型半導体ナノ粒子の表面に結合した生体物質標識剤が検討されている(例えば、特許文献2参照。)。
例えば、粒径の違いにより異なる励起波長及び蛍光を持つ半導体ナノ粒子を利用して、DNAやタンパク質等の生体高分子を容易に検出する技術が開示されている(例えば、特許文献3参照)。
しかしながら、上記の従来公知の方法においては、半導体ナノ粒子1個当たり1〜1000個の検出用分子を結合させた生体物質標識剤又は生体分子検出用試薬となっているため、複数の抗原に1個のナノ粒子が結合してしまい、発光シグナルの低減・変動等が起こり、所望の結果が得られない。また、液中での混合攪拌では全てのナノ粒子に均等に結合分子が付かず、ばらつきが大きいといような問題があった。
また、近年、半導体ナノ粒子を用いた種々の検出方法が開発されてきているが、半導体ナノ粒子と検出用分子とを1対1で反応させる技術がなかった。
特開2003−329686号公報
特開2005−172429号公報
特開2003−322654号公報
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、半導体ナノ粒子を利用した生体分子検出用試薬において、半導体ナノ粒子表面上に、生体検出用分子が均等に存在し、蛍光強度のばらつきが小さく、蛍光強度の低減・変動が少ない生体分子検出用試薬を提供することである。特に、半導体ナノ粒子1個当たり、生体分子と特異的に結合する検出用分子が1個存在する生体分子検出用試薬を提供することである。
本発明に係る上記課題は下記の手段により解決される。
1.半導体ナノ粒子集合体を利用した生体分子検出用試薬であって、該半導体ナノ粒子集合体を構成する各半導体ナノ粒子が表面上に生体分子と特異的に結合する検出用分子を有し、かつ各半導体ナノ粒子上に存在する該検出用分子数の標準偏差が5%以下であることを特徴とする生体分子検出用試薬。
2.前記半導体ナノ粒子1個当たり、生体分子と特異的に結合する検出用分子が1個存在することを特徴とする前記1に記載の生体分子検出用試薬。
3.前記半導体ナノ粒子が粒径の違いにより異なる波長の蛍光を発することを特徴とする前記1又は2に記載の生体分子検出用試薬。
4.前記検出用分子がアビジン若しくはストレプトアビジン、又はビオチンであることを特徴とする前記1〜3のいずれか1項に記載の生体分子検出用試薬。
5.前記1〜4のいずれか1項に記載の生体分子検出用試薬を用いることを特徴とする生体分子検出方法。
6.前記5に記載の生体分子検出方法であって、半導体ナノ粒子をアビジン又はストレプトアビジンと結合させ、ビオチンにより標識された生体分子を該半導体ナノ粒子の蛍光により検出することを特徴とする生体分子検出方法。
7.前記5又は6に記載の生体分子検出方法であって、マイクロアレイ上で実施することを特徴とする生体分子検出方法。
本発明の上記手段により、半導体ナノ粒子を利用した生体分子検出用試薬において、半導体ナノ粒子表面上に、生体検出用分子が均等に存在し、蛍光強度のばらつきが小さく、蛍光強度の低減・変動が少ない生体分子検出用試薬を提供することができる。特に、半導体ナノ粒子1個当たり、生体分子と特異的に結合する検出用分子が1個存在する生体分子検出用試薬を提供することができる。
以下、本発明と構成要素等について詳細な説明をする。
(生体分子検出用試薬)
本発明の生体分子検出用試薬は、半導体ナノ粒子集合体を利用した生体分子検出用試薬であって、該半導体ナノ粒子集合体を構成する各半導体ナノ粒子が表面上に生体分子と特異的に結合する検出用分子を有し、かつ各半導体ナノ粒子上に存在する該検出用分子数の標準偏差が5%以下であることを特徴とする。この特徴は、請求の範囲1〜4に係る発明に共通する特徴である。
本発明の生体分子検出用試薬は、半導体ナノ粒子集合体を利用した生体分子検出用試薬であって、該半導体ナノ粒子集合体を構成する各半導体ナノ粒子が表面上に生体分子と特異的に結合する検出用分子を有し、かつ各半導体ナノ粒子上に存在する該検出用分子数の標準偏差が5%以下であることを特徴とする。この特徴は、請求の範囲1〜4に係る発明に共通する特徴である。
ここで、本発明に係る「半導体ナノ粒子集合体」とは、半導体ナノ粒子を含有する溶液、半導体ナノ粒子が分散したシート、半導体ナノ粒子からなる粉体などを指す。
なお、本発明の生体分子検出用試薬は、粒径の違いにより異なる波長の蛍光を発する複数の半導体ナノ粒子を使用することも好ましい態様の一つである。この場合にも、各半導体ナノ粒子上に存在する該検出用分子数の標準偏差が5%以下であることを要する。
以下、本発明の生体分子検出用試薬の構成要素について説明する。
〈半導体ナノ粒子〉
本発明の生体分子検出用試薬を構成する半導体ナノ粒子は種々の半導体材料を用いて形成することができる。例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−V族の半導体化合物を用いることができる。
本発明の生体分子検出用試薬を構成する半導体ナノ粒子は種々の半導体材料を用いて形成することができる。例えば、元素の周期表のIV族、II−VI族、及びIII−V族の半導体化合物を用いることができる。
II−VI族の半導体の中では、特に、MgS、MgSe、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、HgS、HgSe及びHgTeを挙げることができる。
III−V族の半導体の中では、GaAs、GaN、GaPGaSb、InGaAs、InP、InN、InSb、InAs、AlAs、AlP、AlSb及びAlSが好ましい。
IV族の半導体の中では、Ge、Pb及びSiは特に適している。
本発明においては、半導体ナノ粒子をコア/シェル構造を有する粒子にすることもできる。この場合、所謂コア/シェル型半導体ナノ粒子は半導体ナノ粒子からなるコア粒子と該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア/シェル構造を有する半導体ナノ粒子であって、該コア粒子とシェル層の化学組成が相異するものであることが好ましい。
以下、コア粒子とシェル層について説明する。
〈コア粒子〉
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、GaAs、GaP、GaSb、InGaAs、InP、InN、InSb、InAs、AlAs、AlP、AlSb、AlS、PbS、PbSe、Ge、Si、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、Siである。
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、GaAs、GaP、GaSb、InGaAs、InP、InN、InSb、InAs、AlAs、AlP、AlSb、AlS、PbS、PbSe、Ge、Si、又はこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい半導体材料は、Siである。
なお、必要があればGaなどのドープ材料を極微量含んでもよい。
本発明に係るコアの平均粒径に関しては、発明の効果発現のために、1〜10nmであることが好ましい。なお、平均粒径を1〜10nmとすることにより小粒径の生体分子の標識及び検知が可能となり、更に、1〜5nmであれば、十分に生体1分子に対する標識並びに動態イメージングが可能となる。従って、特に好ましいのは1〜5nmである。
なお、本発明に係るコア粒子の「平均粒径」とは、レーザー散乱法により測定される累積50%体積粒径をいう。
〈シェル層〉
シェル層に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdO、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、GaS、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InAs、InN、InP、InSb、AlAs、AlN、AlP、AlSb、又はこれらの混合物等が挙げられる。
シェル層に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdO、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、GaS、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InAs、InN、InP、InSb、AlAs、AlN、AlP、AlSb、又はこれらの混合物等が挙げられる。
なお、好ましいシェル層の材料としては、半導性ナノ結晶コアより高いバンドギャップエネルギーを有する半導性材料が挙げられる。
半導性微粒子結晶コアより高いバンドギャップエネルギーを有することに加えて、シェルに適切な材料は、コア半導性ナノ結晶に関して、良好な伝導性および原子価バンドオフセットを有するべきである。従って、伝導性バンドは、コア半導性ナノ結晶の伝導性バンドよりも望ましくは高く、そして原子価バンドは、コア半導性ナノ結晶の原子価バンドよりも望ましくは低い。可視で(例えば、Si、Ge、GaP、)または近赤外で(例えば、InP、InN、PbS、PbSe)エネルギーを放出する半導性ナノ結晶コアについて、紫外線領域でバンドギャップエネルギーを有する材料が使用され得る。具体例としては、例えば、ZnS、GaNおよびマグネシウムカルコゲニド(例えば、MgS、MgSeおよびMgTe)が挙げられる。
近赤外で放出する半導性ナノ結晶コアについて、可視でバンドギャップエネルギーを有する材料もまた使用され得る。
本発明において、特に好ましい半導体材料は、SiO2、ZnSである。
なお、本発明に係るシェル層は、コア粒子が部分的に露出して弊害を生じない限り、コア粒子の全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。
〈半導体ナノ粒子の製造方法〉
本発明の半導体ナノ粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いることができる。
本発明の半導体ナノ粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いることができる。
液相法の製造方法としては、沈殿法である、共沈法、ゾルーゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である(例えば、特開2002−322468号、特開2005−239775号、特開平10−310770号、特開2000−104058号の各公報を参照。)。
気相法の製造方法としては、(1)対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法(例えば、特開平6−279015号公報参照。)、(2)電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法(例えば、特表2003−515459号公報参照。)、レーザーアブレーション法(例えば、特開2004−356163号参照。)などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。
本発明の蛍光半導体微粒子の製造方法としては、特に液相法による製造方法が好ましい。
なお、本発明に係る半導体ナノ粒子の粒径や発光強度の均一性を実現するために、原材料の純度、合成濃度、合成温度と時間、粒子形成後のアニール温度・時間等の条件を最適化して、格子欠陥が少なく結晶性の高い半導体ナノ粒子とすることを要する。
〈検出用分子による半導体ナノ粒子の表面修飾〉
本発明に係る半導体ナノ粒子集合体表面は、一般的には、疎水性であるため、そのままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題が生じる場合がある。従って、ナノ粒子の表面(コア/シェル型半導体ナノ粒子の場合は、シェル層の表面)を親水化処理することが好ましい。
本発明に係る半導体ナノ粒子集合体表面は、一般的には、疎水性であるため、そのままでは水分散性が悪く、粒子が凝集してしまう等の問題が生じる場合がある。従って、ナノ粒子の表面(コア/シェル型半導体ナノ粒子の場合は、シェル層の表面)を親水化処理することが好ましい。
親水化処理の方法としては例えば、表面の親油性基をピリジン等で除去した後に粒子表面に表面修飾剤を化学的および/または物理的に結合させる方法がある。表面修飾剤としては、親水基として、カルボキシル基・アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどがあげられる。
本発明に係る検出用分子としては、生体高分子の特異的検出のために使用し得るものであれば特に限定するものではないが、例えばアビジン若しくはストレプトアビジンまたはビオチン、抗原または抗体、DNAまたはRNA等のオリゴ若しくはポリヌクレオチド等が挙げられる。
例えば、アビジン若しくはストレプトアビジンを検出用分子として結合させる場合には、例えば置換アルキルチオールとしてカルボキシル基を有するアルキルチオール化合物(以下、チオールカルボン酸という場合もある。)を用い、カルボキシル基が表面に露出した半導体ナノ粒子を調製し、これを更に例えばN−ヒドロキシスルホスクシンイミド等を用いて誘導体化した後、アビジンまたはストレプトアビジン(例えばシグマアルドリッチジャパン株式会社等から入手可能。)と反応させて結合することができる。
また、ビオチンを検出用分子として結合させる場合には、例えば置換アルキルチオールとしてアミノ基を有するアルキルチオール化合物(以下、アミノチオールという場合もある)を用い、アミノ基が表面に露出した半導体ナノ粒子を調製し、これを、例えばBiotin−Sulfo−Osu(スルホスクシンイミジルD−ビオチン)(株式会社同仁科学研究所)等の誘導体化したビオチンと反応させて結合することができる。
当業者であれば、半導体ナノ粒子上の官能基と目的の検出用分子の種類等に応じて、置換反応による結合に適した反応条件及び試薬を適宜選択することができる。
本発明においては、検出用分子がアビジン、ストレプトアビジン、又はビオチンであることが好ましい。
本発明の生体分子検出用試薬においては、半導体ナノ粒子の表面に生体分子と特異的に結合する検出用分子が存在することを特徴とする。各半導体ナノ粒子上に存在する該検出用分子数の標準偏差が5%以下であることを特徴とする。ここでいう標準偏差は半導体ナノ粒子に接合した検出分子数のちらばりの度合いを表したもので、半導体毎の検出分子数とそれらの平均値との差(偏差)の二乗の平均の平方根で表される。更に、本発明において請求の範囲第2項に記載したように半導体ナノ粒子1個に生体分子と特異的に結合する検出用分子が1個存在することが特に好ましい。
この特徴を実現するためには、種々の方法が考えられ、特に限定されないが、例えば、MEMS(micro electro mechanical systems)等の微細流路を用いて、半導体ナノ粒子1個と検出用分子1個を結合させる方法、又は、半導体ナノ粒子ナノ粒子をポーラスアルミナや多孔質シリカ膜のような基板上に1層堆積させた後、検出用分子をナノ粒子表層に吸着させる方法等により半導体ナノ粒子表面に検出用分子を反応させ表面修飾をすることができる。
(生体分子検出方法)
本発明の生体分子検出用試薬を用いた生体高分子等の生体分子の検出は、生体分子、例えば予め検出用分子と特異的に反応し得る分子によって標識されたポリヌクレオチドやタンパク質を含有するサンプルに本発明の生体分子検出用試薬を添加し、特異的結合が生じた半導体ナノ粒子を単離してその蛍光を検出することによって行うことができ、溶液中で結合反応及び検出を行うこともできる。
本発明の生体分子検出用試薬を用いた生体高分子等の生体分子の検出は、生体分子、例えば予め検出用分子と特異的に反応し得る分子によって標識されたポリヌクレオチドやタンパク質を含有するサンプルに本発明の生体分子検出用試薬を添加し、特異的結合が生じた半導体ナノ粒子を単離してその蛍光を検出することによって行うことができ、溶液中で結合反応及び検出を行うこともできる。
検出は、生体分子を含有する細胞中で行っても良く、また、DNAチップやタンパク質チップ等のマイクロアレイ上で反応させても良い。
本発明の方法の一実施形態として、例えば、DNAチップ上に固定されたオリゴヌクレオチドとビオチンにより標識されたオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせた後、これにアビジン若しくはストレプトアビジンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。尚、本明細書中において、「オリゴヌクレオチド」とは、特に限定するものではないが、100塩基長以下の長さのDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドをいい、天然起源のものでも合成したものでも良い。
また、DNAチップ上に固定されたcDNAとビオチンにより標識されたcDNAとをハイブリダイゼーションさせた後、これにアビジン若しくはストレプトアビジンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。
さらに、DNAチップ上に固定されたオリゴヌクレオチドとビオチンにより標識されたcDNAとをハイブリダイゼーションさせた後、これにアビジン若しくはストレプトアビジンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。
あるいはまた、DNAチップ上に固定されたオリゴヌクレオチドとアビジン若しくはストレプトアビジンにより標識されたオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせた後、これにビオチンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。上記と同様に、ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。
また、DNAチップ上に固定されたcDNAとアビジン若しくはストレプトアビジンにより標識されたcDNAとをハイブリダイゼーションさせた後、これにビオチンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる、ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。
また、DNAチップ上に固定されたオリゴヌクレオチドとアビジン若しくはストレプトアビジンにより標識されたcDNAとをハイブリダイゼーションさせた後、これにビオチンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。ハイブリダイゼーションの有無によって、対象サンプル中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することができる。
一方、タンパク質の検出の場合には、例えば、タンパク質チップ上に固定されたタンパク質とビオチンにより標識されたタンパク質とを結合させた後、これにアビジン若しくはストレプトアビジンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってタンパク質間の結合の有無を検出することができる。
また、タンパク質チップ上に固定されたタンパク質とアビジン若しくはストレプトアビジンにより標識されたタンパク質とを結合させた後、これにビオチンを結合させた半導体ナノ粒子を添加することによってタンパク質間の結合の有無を検出することができる。
本発明に係る生体分子検出方法としては、半導体ナノ粒子をアビジン又はストレプトアビジンと結合させ、ビオチンにより標識された生体分子を該半導体ナノ粒子の蛍光により検出する態様の方法が好ましい。
本発明の方法においては、粒径または化学組成の異なる複数種類の半導体ナノ粒子を用いて複数種類の生体高分子を検出することができる。用いる半導体ナノ粒子の蛍光スペクトルの各ピークが識別可能であれば複数種類の生体高分子を同時に検出することができ、ピークの鋭さにも依存するが、例えば100nm程度離れた2本のピークは十分識別可能である。尚、検出可能範囲は400nmから700nmである。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
生体検出用試薬の合成(ビオチンで表面修飾された半導体ナノ粒子の合成)
(比較例)
アミノチオールを用いて半導体ナノ粒子を表面修飾した。表面修飾剤のアミノ基をアミノ基標識用のビオチンにて修飾する。
(比較例)
アミノチオールを用いて半導体ナノ粒子を表面修飾した。表面修飾剤のアミノ基をアミノ基標識用のビオチンにて修飾する。
20nmのインジウムガリウムリン/硫化亜鉛コア/シェル型半導体ナノ粒子の懸濁液にS−2−(3−エチルアミノプロピルアミノ)エチル二水素ホスホロチオエートを投入して窒素雰囲気下で24時間撹拌した後、チオール化合物の有するアミノ基と等量のスルホスクシンイミジルD−ビオチンを反応液に投入した。その後、窒素雰囲気下で1時間撹拌してビオチンを結合した半導体ナノ粒子を得た。
なお、半導体に接合する1ビオチン分子毎にFITC(fluorescein isocyanate)1分子を結合させたものを用い、ビオチン結合させた半導体ナノ粒子をベックマンコールター社製フローサイトメトリー装置を用いて、1粒子当たりのFITCの発光強度を検出した。予めFITCの分子数と発光強度との検量線グラフを作成しておいた。得た発光強度から検量線を用いてFITCの数を求め、半導体ナノ粒子1粒子ごとのビオチン接合数を求めた。その結果を100粒子について求めビオチン吸着数の標準偏差を求めたところ6%であった。
(実施例)
20nmのインジウムガリウムリン/硫化亜鉛コア/シェル型半導体ナノ粒子の懸濁液にS−2−(3−エチルアミノプロピルアミノ)エチル二水素ホスホロチオエートを投入して窒素雰囲気下で24時間撹拌した後、孔径を25〜30nmに制御した多孔質シリカ膜上に半導体ナノ粒子を堆積させた。その後、チオール化合物の有するアミノ基と等量のスルホスクシンイミジルD−ビオチンを半導体ナノ粒子が堆積した多孔質シリカ膜に投入し、それを窒素雰囲気下で1時間撹拌した後、未反応物を除去、洗浄してビオチンを1個だけ結合させた半導体ナノ粒子を得た。即ち、本発明の最も好ましい、検出用分子数の標準偏差が0%を指す。
20nmのインジウムガリウムリン/硫化亜鉛コア/シェル型半導体ナノ粒子の懸濁液にS−2−(3−エチルアミノプロピルアミノ)エチル二水素ホスホロチオエートを投入して窒素雰囲気下で24時間撹拌した後、孔径を25〜30nmに制御した多孔質シリカ膜上に半導体ナノ粒子を堆積させた。その後、チオール化合物の有するアミノ基と等量のスルホスクシンイミジルD−ビオチンを半導体ナノ粒子が堆積した多孔質シリカ膜に投入し、それを窒素雰囲気下で1時間撹拌した後、未反応物を除去、洗浄してビオチンを1個だけ結合させた半導体ナノ粒子を得た。即ち、本発明の最も好ましい、検出用分子数の標準偏差が0%を指す。
アビジン−ビオチン系を利用して標識するDNA(ターゲット)はハイブリダイゼーション反応(チップ上のDNAの検出)を行い検出される。その末端をアビジンで修飾したDNAを使用する。半導体ナノ粒子はビオチンで修飾されており、DNAの蛍光標識となる。
1 mRNA抽出
組織1gあたり10mlのsolution D(チオシアン酸グアニジン、n−laurylサルコシン、1Mクエン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール)を加えホモジェナイズし酢酸塩ナトリウム(2M,pH4.0)、酸性フェノール、クロロフォルムをそれぞれ混合しながら加え撹拌した。15分間氷上で冷やした後、15000rpmで30分遠心分離し、水層に等量のイソプロパノールを加え、1時間−20℃で冷やした後、70%エタノールで洗浄した。15000rpm15分4℃で遠心分離し、4mlのDEPC処理水で再度懸濁し5M塩化ナトリウムを650μl、CTAB/尿素溶液を8ml加え、15000rpm15分室温で遠心分離した。8mlのエタノールを加え1時間−20℃で冷やし、15000rpm15分4℃で遠心分離した。70%エタノールで洗浄しDEPC処理水で再度懸濁した。
組織1gあたり10mlのsolution D(チオシアン酸グアニジン、n−laurylサルコシン、1Mクエン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール)を加えホモジェナイズし酢酸塩ナトリウム(2M,pH4.0)、酸性フェノール、クロロフォルムをそれぞれ混合しながら加え撹拌した。15分間氷上で冷やした後、15000rpmで30分遠心分離し、水層に等量のイソプロパノールを加え、1時間−20℃で冷やした後、70%エタノールで洗浄した。15000rpm15分4℃で遠心分離し、4mlのDEPC処理水で再度懸濁し5M塩化ナトリウムを650μl、CTAB/尿素溶液を8ml加え、15000rpm15分室温で遠心分離した。8mlのエタノールを加え1時間−20℃で冷やし、15000rpm15分4℃で遠心分離した。70%エタノールで洗浄しDEPC処理水で再度懸濁した。
2 RT−PCR
poly(A)−RNAとアビジン化済みオリゴ(dT)プライマーとDEPC処理水を加え、70℃10分間インキュベートし氷上にて急冷した。次いでRNAサンプル/プライマー混合液、10×PCRバッファー、25mM MgCl2、10mM dNTPミックス、0.1MDTT、逆転写酵素1μlを加えて42℃で50分間インキュベートして反応を停止させ、RNaseHを1μl加え37℃20分間インキュベートしPCRを行い、アビジン化したcDNAを得た。
poly(A)−RNAとアビジン化済みオリゴ(dT)プライマーとDEPC処理水を加え、70℃10分間インキュベートし氷上にて急冷した。次いでRNAサンプル/プライマー混合液、10×PCRバッファー、25mM MgCl2、10mM dNTPミックス、0.1MDTT、逆転写酵素1μlを加えて42℃で50分間インキュベートして反応を停止させ、RNaseHを1μl加え37℃20分間インキュベートしPCRを行い、アビジン化したcDNAを得た。
3 ハイブリダイゼーション
チューブに20×SSCとイオン交換水と上記のアビジン化したcDNAを加え、95℃で3分間インキュベートしDNAを変性させ、10%SDSを加えた。このハイブリダイゼーション溶液を、DNAチップにかけカバーガラスを乗せて65℃で20時間インキュベートしてハイブリダイゼーション後、2×SSC 0.1%SDS溶液にスライドガラスを浸しカバーガラスをはずした。SSCにて洗浄を繰り返し、1000rpmで2分間遠心分離して室温で乾燥させた。
チューブに20×SSCとイオン交換水と上記のアビジン化したcDNAを加え、95℃で3分間インキュベートしDNAを変性させ、10%SDSを加えた。このハイブリダイゼーション溶液を、DNAチップにかけカバーガラスを乗せて65℃で20時間インキュベートしてハイブリダイゼーション後、2×SSC 0.1%SDS溶液にスライドガラスを浸しカバーガラスをはずした。SSCにて洗浄を繰り返し、1000rpmで2分間遠心分離して室温で乾燥させた。
4 半導体ナノ微粒子による標識
ハイブリダイゼーション反応後のDNAチップに、ビオチンを結合させた半導体ナノ微粒子を添加し、反応させることでハイブリダイズしたcDNAを標識した。蛍光スキャナによりDNAチップ上の各スポットの蛍光強度を測定した。
ハイブリダイゼーション反応後のDNAチップに、ビオチンを結合させた半導体ナノ微粒子を添加し、反応させることでハイブリダイズしたcDNAを標識した。蛍光スキャナによりDNAチップ上の各スポットの蛍光強度を測定した。
比較例と実施例の半導体ナノ粒子について、上記操作を100回行ったときの蛍光強度(シグナル)の標準偏差を確認した。
測定結果は、比較例の標準偏差が8.6%であるのに対し、本発明に係る実施例の標準偏差は3.3%であった。
この結果から明らかなように、本発明の生体分子検出用試薬を使用した実施例は、比較例に比べ、DNAチップ上の各スポットの蛍光強度の標準偏差値が小さく、検出精度が高く、再現性も高いことがわかる。これは、本発明にかかる構成を得ることにより本発明の生体分子検出用試薬の半導体ナノ粒子には、生体検出用分子が均等に付き、蛍光強度のばらつきが小さくなったことにある。また、蛍光強度の大きさ(絶対値)から、半導体ナノ粒子1個に生体分子と特異的に結合する検出用分子が実質的に1個存在することが分かった。
なお、粒径の違いにより異なる波長の蛍光を発する複数の半導体ナノ粒子を使用した生体分子検出用試薬の場合にも同様の結果を得た。
Claims (7)
- 半導体ナノ粒子集合体を利用した生体分子検出用試薬であって、該半導体ナノ粒子集合体を構成する各半導体ナノ粒子が表面上に生体分子と特異的に結合する検出用分子を有し、かつ各半導体ナノ粒子上に存在する該検出用分子数の標準偏差が5%以下であることを特徴とする生体分子検出用試薬。
- 前記半導体ナノ粒子1個当たり、生体分子と特異的に結合する検出用分子が1個存在することを特徴とする請求の範囲第1項に記載の生体分子検出用試薬。
- 前記半導体ナノ粒子が粒径の違いにより異なる波長の蛍光を発することを特徴とする請求の範囲第1項又は第2項に記載の生体分子検出用試薬。
- 前記検出用分子がアビジン若しくはストレプトアビジン、又はビオチンであることを特徴とする請求の範囲第1項乃至第3項のいずれか1項に記載の生体分子検出用試薬。
- 請求の範囲第1項乃至第4項のいずれか1項に記載の生体分子検出用試薬を用いることを特徴とする生体分子検出方法。
- 請求の範囲第5項に記載の生体分子検出方法であって、半導体ナノ粒子をアビジン又はストレプトアビジンと結合させ、ビオチンにより標識された生体分子を該半導体ナノ粒子の蛍光により検出することを特徴とする生体分子検出方法。
- 請求の範囲第5項又は第6項に記載の生体分子検出方法であって、マイクロアレイ上で実施することを特徴とする生体分子検出方法。
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