FR2863053A1 - Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee - Google Patents
Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee Download PDFInfo
- Publication number
- FR2863053A1 FR2863053A1 FR0313978A FR0313978A FR2863053A1 FR 2863053 A1 FR2863053 A1 FR 2863053A1 FR 0313978 A FR0313978 A FR 0313978A FR 0313978 A FR0313978 A FR 0313978A FR 2863053 A1 FR2863053 A1 FR 2863053A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- molecules
- gold
- organic
- grafted
- particles according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 title description 19
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 154
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 144
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 140
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 139
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 52
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 39
- 125000006850 spacer group Chemical class 0.000 claims description 36
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 32
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 30
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 24
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 21
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 17
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 claims description 15
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 claims description 15
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 claims description 15
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 claims description 15
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 claims description 15
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 claims description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229940071240 tetrachloroaurate Drugs 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- -1 polysiloxanes Polymers 0.000 claims description 7
- VMKYTRPNOVFCGZ-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanylphenol Chemical class OC1=CC=CC=C1S VMKYTRPNOVFCGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical class [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 claims description 4
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical class O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 3
- IZFHEQBZOYJLPK-SSDOTTSWSA-N (R)-dihydrolipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC[C@@H](S)CCS IZFHEQBZOYJLPK-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 2
- XEIPQVVAVOUIOP-UHFFFAOYSA-N [Au]=S Chemical compound [Au]=S XEIPQVVAVOUIOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 2
- JAJIPIAHCFBEPI-UHFFFAOYSA-N 9,10-dioxoanthracene-1-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2S(=O)(=O)O JAJIPIAHCFBEPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims 3
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims 1
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 25
- SXQCTESRRZBPHJ-UHFFFAOYSA-M lissamine rhodamine Chemical class [Na+].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O SXQCTESRRZBPHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000004054 semiconductor nanocrystal Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5,6-pentafluorophenol Chemical compound OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- CMIHHWBVHJVIGI-UHFFFAOYSA-N gadolinium(iii) oxide Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Gd+3].[Gd+3] CMIHHWBVHJVIGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N pentachloro-phenol Natural products OC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical group C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 3
- 229940075613 gadolinium oxide Drugs 0.000 description 3
- 229910001938 gadolinium oxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N sulfurochloridic acid Chemical compound OS(Cl)(=O)=O XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- VRVRGVPWCUEOGV-UHFFFAOYSA-N 2-aminothiophenol Chemical compound NC1=CC=CC=C1S VRVRGVPWCUEOGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N Folic acid Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000004998 X ray absorption near edge structure spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- XCTFOFPZPRZOFV-UHFFFAOYSA-M sodium;1-sulfanylethanesulfonate Chemical compound [Na+].CC(S)S([O-])(=O)=O XCTFOFPZPRZOFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SDKPSXWGRWWLKR-UHFFFAOYSA-M sodium;9,10-dioxoanthracene-1-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2S(=O)(=O)[O-] SDKPSXWGRWWLKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- NJRXVEJTAYWCQJ-UHFFFAOYSA-N thiomalic acid Chemical compound OC(=O)CC(S)C(O)=O NJRXVEJTAYWCQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100294139 Caenorhabditis elegans aph-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical class [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 238000004917 polyol method Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 230000005476 size effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000004763 sulfides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003463 sulfur Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007944 thiolates Chemical group 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000004684 trihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
- B01J13/0004—Preparation of sols
- B01J13/0043—Preparation of sols containing elemental metal
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Particules sondes hybrides comprenant une nanoparticule d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm à la surface de laquelle sont greffées par des liaisons or-soufre, d'une part, au moins une, et de préférence de une à 100, molécules organiques sondes et d'autre part, au moins 10, et de préférence 10 à 10000, molécules à activité luminescente, ainsi que leur procédé de préparation.
Description
La présente invention concerne le domaine technique des sondes pour la
détection, le suivi et la quantification dans les systèmes biologiques. Plus particulièrement, l'invention a pour objet de nouvelles particules sondes hybrides dont le coeur est constitué par une nanoparticule d'or sur laquelle sont immobilisées
d'une part des molécules sondes et d'autre part des molécules à activité luminescente, ainsi que leur procédé de préparation.
L'emploi de sondes associées à un marqueur, dans les systèmes biologiques pour la détection (reconnaissance) ou le suivi de substances spécifiques, appelées cibles, est une technique usuelle dans le domaine du diagnostic médical et de la recherche en biologie. De telles sondes sont particulièrement utilisées pour la cytométrie de flux, l'histologie, les tests immunologiques ou la microscopie de fluorescence aussi bien pour l'étude de matériaux biologiques que de matériaux non biologiques.
Des systèmes de marquage usuels sont par exemple des isotopes radioactifs de l'iode, du phosphore et d'autres éléments comme l'enzyme peroxydase ou la phosphatase alcaline dont la détection nécessite un substrat particulier. Dans la plupart des cas, le couplage sélectif entre le marqueur et la substance à détecter est effectué par une seule ou une association de molécules fonctionnelles. La sélectivité de la liaison est essentielle afin d'identifier sans ambiguïté la substance cible à détecter. Les réactions assurant le couplage sont connues et décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques , G. T. Hermanson, Academic Press, 1996 ou dans Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis , Second Edition, W. T. Mason, ed., Academic Press, 1999.
Les colorants organiques fluorescents sont très utilisés pour le marquage. Il s'agit de la fluorescéine, du Texas Red ou de Cy5, qui sont sélectivement liés à une substance biologique ou organique déterminée jouant le rôle de sonde. Après excitation de la sonde marquée par une source externe, le plus souvent électromagnétique, la présence des substances biologiques ou organiques cibles liées à la sonde est mise en évidence par l'émission de fluorescence de la part de cette dernière.
L'abaissement des seuils de détection constitue un objectif majeur qui permettrait de déboucher sur l'amélioration des biopuces (analyse et identification de biomolécules) et sur le développement de sondes plus performantes capables d'assurer la traque individuelle de biomolécules cibles, afin d'étudier leur activité cellulaire, ou capables de mettre en évidence les interactions existant entre des êtres unicellulaires (bactéries, protozoaires..) et des minéraux qui se manifestent par des modifications physico-chimiques locales de l'environnement (variation du pH, de la force ionique, de la concentration en oxygène).
La limitation actuelle à l'abaissement des seuils de détection réside dans la difficulté de fonctionnaliser une biomolécule ou un site particulier d'un substrat biologique, constituant la cible à détecter, par plus d'une fonction (le plus souvent une molécule) organique fluorescente.
Pour abaisser le seuil de détection, il est proposé dans l'art antérieur de marquer la sonde destinée à se lier avec la cible à détecter, avec des particules intrinsèquement luminescentes. En particulier, des nanoparticules de matériau semi-conducteur ont donné lieu à d'intenses recherches. Le brevet US 5,990,479, et les demandes de brevet internationales publiées sous le numéro WO 00/17642 et WO 00/29617 montrent que les nanocristaux semiconducteurs fluorescents, qui appartiennent à la classe des éléments II-VI ou III-V et ceux qui, sous certaines conditions, sont composés des éléments du 4ème groupe principal du tableau périodique, peuvent être utilisés comme marqueur fluorescent pour les systèmes biologiques. En raison du phénomène connu sous le vocable quantum size effect , la longueur d'onde d'émission d'un nanocristal semiconducteur fluorescent est imposée par sa taille. Ainsi, en faisant varier la taille de ces nanocristaux, une large gamme du spectre peut être couverte, de la lumière visible au proche infra-rouge. Leur utilisation comme marqueur biologique est décrit par Warren C.W. Chan, Shuming Nie, Science, 281, 2016-2018, 1998, et par Marcel Bruchez Jr, Mario Moronne, Peter Gin, Shimon Weiss, A. Paul Alivisatos, Science, 281, 2013-2016, 1998. La préparation de nanocristaux semiconducteurs avec une longueur d'onde d'émission bien définie, c'est-à-dire avec une faible dispersion en taille, exige une très grande précision et nécessite une parfaite maîtrise des conditions opératoires et du déroulement de la synthèse. Ils sont, par conséquent, très difficiles à produire. La palette étendue de couleurs qu'offrent ces cristaux semiconducteurs résulte d'une variation de taille de l'ordre de quelques Angstrdm (c'est- à-dire quelques couches atomiques). Les synthèses en solution permettent rarement d'atteindre un tel degré de précision. De plus, la recombinaison de paires électron-trou observée à la surface des nanocristaux limite le rendement quantique à une faible valeur.
Pour contourner ce problème, une structure coeur / coquille ( core / shell ) a été proposée: il s'agit d'enrober individuellement les nanocristaux semiconducteurs fluorescents par une couche de matériau semiconducteur avec un plus large gap (ZnS, CdS). De plus, le marquage sélectif de biomolécules par des nanocristaux semi-conducteurs fluorescents nécessite la formation d'une couche de polysiloxane fonctionnalisé par des groupes amines (époxy et acide carboxylique). Ces derniers constitueront des points d'ancrage pour les biomolécules. La préparation de ces nanocristaux demande, donc, au moins trois étapes de synthèse dont les deux premières sont très délicates et est donc difficilement industrialisable.
Le marquage par des nanoparticules d'oxyde rendues luminescentes grâce au dopage par des ions luminescents (terre rare) n'est pas, malgré des résultats prometteurs, encore très répandu. Son principal inconvénient réside dans le faible rendement quantique qui nécessite l'utilisation d'un laser pour exciter les ions luminescents présents dans la matrice cristalline. D'autre part, les propriétés de luminescence sont très nettement altérées, lorsque ces particules sont utilisées directement en milieu aqueux.
Le marquage par des vésicules ou billes polymères, ou de polysiloxanes, remplies de composés organiques luminescents est efficace pour la visualisation en luminescence, mais nécessite souvent des particules assez grandes (plusieurs dizaines 25 de nanomètres) et reste délicat à employer dans certaines applications où une plus grande molécularité est recherchée.
Différentes stratégies faisant appel à des particules d'or greffées ont déjà été développées. Aucune cependant n'a réussi à augmenter, de façon satisfaisante, la luminescence émise. La plupart des travaux a été focalisée sur le marquage et la détection d'oligonucléotides dont une des extrémités a été modifiée par une fonction thiol. Si le greffage d'un brin d'oligonucléotide constitue une étape commune des différentes stratégies recensées dans l'art antérieur, les moyens mis en oeuvre pour la détection sont très variables.
En effet, Pileni et al. dans J. Phys. Chem B, 107, 27, 6497-6499, 2003 décrivent l'immobilisation de nanoparticules fonctionnalisées par des brins d'oligonucléotide thiolés par hybridation avec le brin complémentaire présent sur des îlots nanométriques d'or déposés sur une surface de verre. L'immobilisation (et par conséquent la détection de l'oligonucléotide) est mise en évidence par une augmentation importante de la sensibilité de la spectroscopie en transmission de résonance du plasmon de surface (T-SPR). La détection électrochimique d'oligonucléotides a également été envisagée par Li et al. dans Analyst, 128, 917-923, 2003 et Hsing et al. dans Langmuir 19, 4338-4343, 2003. L'immobilisation de nanoparticules d'or fonctionnalisées par des brins d'oligonucléotide sur des biopuces (par hybridation) facilite la germination de cristaux d'argent (par réduction des sels de cations argent (I)) induisant une augmentation du courant de détection.
Les propriétés optiques de l'or ont également été mises à profit pour le marquage et la détection. Ainsi, Richards-Kortum et al. dans Cancer Research, 63, 1999-2004, 2003, ont montré que des nanoparticules d'or pouvaient être utilisées pour la détection de cellules cancéreuses. En effet, l'immobilisation sur les nanoparticules de biomolécules interagissant sélectivement avec des cellules cancéreuses permet d'obtenir des sondes dont la détection est basée sur la capacité des nanoparticules à réfléchir la lumière incidente émise par le microscope confocal. Les nanoparticules d'or peuvent être utilisées comme agent de contraste optique grâce aux propriétés optiques d'absorption et de réflexion associées aux plasmons de l'or. Une autre approche a été développée par Mirkin et al. dans J. Am. Chem. Soc. 125, 1643-1654, 2003 qui ont montré que l'hybridation de deux brins complémentaires d'oligonucléotide, portés par deux particules d'or distinctes, induisait un rapprochement de ces particules et donc un déplacement de la bande plasmon (résultant des oscillations collectives des électrons de la bande de conduction). Le changement de couleur du colloïde (du rouge au violet) peut alors être mis à profit pour la détection d'oligonucléotides en solution ou sur des biopuces à ADN.
Dubertret et al. dans Nature Biotechnology, 19, 365-370, 2001, se sont, quant à eux, appuyés sur l'extinction de fluorescence observée pour certains colorants organiques adsorbés sur l'or pour préparer des sondes à ADN. Ils ont montré que l'hybridation d'un brin d'oligonucléotide marqué par un fluorophore et immobilisé à la surface de l'or avec un brin libre permettait de restaurer la luminescence du fluorophore, grâce à l'éloignement de celui-ci de la surface d'or, générée par l'hybridation. L'émission d'une lumière de longueur d'onde caractéristique du fluorophore organique indique la présence de l'oligonucléotide libre. Cette technique par extinction de luminescence sert à détecter la présence d'oligonucléotide en solution.
Toutes ces démarches de l'art antérieur sont restrictives, car elles ne peuvent s'appliquer que dans certaines conditions. La détection électrochimique ne permet pas de suivre le devenir d'une biomolécule in vivo. La technique de Mirkin et al. est limitée à la détection d'acides nucléiques. Par ailleurs, le déplacement de la bande plasmon peut être provoqué par d'autres facteurs (augmentation de la concentration en sel, température, vieillissement).
Dans ce contexte, l'un des problèmes que se propose de résoudre l'invention est de fournir de nouvelles sondes biologiques de taille nanométrique permettant la détection, le marquage et la quantification, in vitro et in vivo, dans des systèmes biologiques, avec sensibilité et reproductibilité.
Un autre problème, que se propose de résoudre l'invention, est de fournir de nouvelles sondes biologiques facilement détectables, de part leur émission de fluorescence ou de luminescence exacerbée après excitation.
L'invention vise également à fournir de nouvelles sondes biologiques 25 polyfonctionnelles de taille et de composition contrôlées, produites selon un procédé simple, facilement industrialisable.
Pour atteindre ces objectifs, l'invention propose des nouvelles particules sondes hybrides comprenant une nanoparticule d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm à la surface de laquelle sont greffées par des liaisons or- soufre d'une part, au moins une, et de préférence de 1 à 100, molécules organiques sondes et d'autre part, au moins 10, et de préférence 10 à 10000 molécules organiques à activité luminescente.
L'invention propose également un nouveau type de sonde où la luminescence exacerbée est couplée à un coeur métallique nanométrique dense, permettant ainsi un autre système d'investigation comme la microscopie électronique à transmission et/ou basée sur les propriétés de réflexion, d'absorption et/ou de diffusion associées aux plasmons.
L'invention a également pour objet différents procédés de préparation des particules sondes hybrides telles que définies ci-dessus.
La description ci-après, en référence aux figures annexées, permet de mieux comprendre l'objet de l'invention.
La Fig. 1 met en évidence la persistance de la luminescence des dérivés de lissamine rhodamine B après greffage sur des nanoparticules d'or.
La Fig. 2 représente les spectres d'absorption d'une solution colloïdale de nanoparticules d'oxyde de gadolinium seules ou associées avec des nanoparticules d'or.
La Fig. 3 est une illustration schématique du principe de la biopuce utilisée.
La Fig. 4 montre l'influence de la dilution (Laser Argon, ,exe = 480 nm, P = 600 W) lors de l'immobilisation par hybridation sur une biopuce de nanoparticules d'or fonctionnalisées par 5 molécules à activité luminescente (dérivé thiolé de la lissamine rhodamine B) et par un oligonucléotide.
La Fig. 5 représente la fluorescence observée après immobilisation sur des billes de Sépharose par hybridation de nanoparticules d'or comportant un oligonucléotide et un nombre variable de molécules à activité luminescente (lissamine rhodamine B thiolée: rhoda-SH).
La Fig. 6 représente la quantification du signal de fluorescence observé sur la 25 Fig. 5.
La Fig. 7 compare l'intensité lumineuse obtenue après marquage d'oligonucléotide par une seule molécule à activité luminescente (dérivé de la lissamine rhodamine B) et par une nanoparticule d'or comportant 100 molécules à activité luminescente (lissamine rhodamine B thiolée).
En préalable, les définitions de certains termes utilisés dans la présente demande de brevet sont données ci-après.
Les termes molécule à activité luminescente , fluorophore , colorant , molécule fluorescente seront indifféremment utilisés pour désigner des entités qu'il est possible de détecter grâce à leur activité d'émission optique dans le visible et le proche infrarouge.
Par molécule organique sonde, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique.
Le terme "polynucléotide" signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique, au niveau du squelette. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique.
Par "polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés.
Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires, les enzymes les récepteurs, les complexes enzyme/substrat, les glycoprotéines, les anticorps, les antigènes.
Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps.
Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune.
Par nanoparticule, on entend une particule de taille nanométrique Ces nanoparticules peuvent être de n'importe quelle forme. Les particules de forme 30 sphérique sont, néanmoins, préférées.
Le coeur des particules hybrides sondes selon l'invention est constitué par une nanopaticule d'or, préférentiellement de diamètre moyen compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, de préférence dans la gamme allant de 4 à 20 nm et préférentiellement dans la gamme allant de 5 à 16 nm. La taille moyenne étant déduite ici par spectroscopie de corrélation de photon (diffusion quasi-élastique de la lumière, 2. = 633 nm) et par analyse de clichés réalisés en microscopie électronique à transmission (MET). L'utilisation d'or est particulièrement avantageuse pour les raisons suivantes: - l'or est compatible avec les organismes vivants et possède un seuil de tolérance assez élevé, - l'or est un métal très difficilement oxydable, ce qui permet d'obtenir des 10 nanoparticules présentant une grande stabilité (notamment la conservation de son état d'oxydation zéro et du comportement métallique), - la synthèse de nanoparticules d'or est aisée, l'or est non- paramagnétique, l'or présente une affinité particulière pour le soufre, ce qui rend possible le 15 greffage de dérivés thiolés, la liaison or- soufre étant connue pour être particulièrement forte, - l'or est visible en imagerie MET, - l'or présente une absorption en plasmon de surface, ce qui permet d'obtenir des informations sur la nanoparticule, notamment sur sa taille.
Ces nanoparticules d'or sont polyfonctionnalisées par greffage de différents dérivés thiolés qui apportent: - la reconnaissance biologique donnée par greffage d'au moins une, de préférence de une à 100 et préférentiellement de 1 à 10, molécules organiques sondes, - la luminescence en milieu biologique donnée par greffage d'au moins 10, de préférence de 10 à 10000, préférentiellement 10 à 1000, molécules organiques à activité luminescente, avantageusement 100 à 500, - la solubilité adaptée en fonction du milieu de travail, - la redispersion, la non agrégation.
La fonctionnalisation est aisée, les différentes molécules greffées étant liées de façon quasi covalente à la nanoparticule d'or par des liaisons or-soufre. Si, actuellement, la nature de la liaison Au-S demeure indéterminée, il est néanmoins reconnu que les groupes thiolates sont fortement liés à la surface de l'or. D'après Dubois, et Nuzzo dans Ann. Phys. Chem. 43, 437-, 1992 et Ulman A. dans Chemical Reviews 96, 15331554, 1996, l'énergie de liaison est de 40 kcal.mol-1 (contre 87kcal.mol-1 pour la liaison S-H) et le bilan énergétique de l'adsorption d'un alcanethiolate sur l'or est négatif (---5kcal.mol"l, réaction exothermique). L'interaction Au-S s'établissant après greffage de dérivés thiolés est si forte que ces derniers ne peuvent pas être expulsés de la surface par des lavages successifs. L'utilisation de dérivés thiolés apparaît donc particulièrement appropriée pour immobiliser des molécules de colorants et des biomolécules à la surface de nanoparticules d'or.
Un grand nombre de molécules organiques à activité luminescente est greffé en surface des nanoparticules d'or. De façon avantageuse, le nombre de molécules à activité luminescente greffées en surface de la nanoparticule d'or est au moins 10 fois plus important que le nombre de molécules organiques sondes greffées.
De plus, au sens de l'invention, les molécules organiques à activité luminescente, également nommées colorants, sont fixées sur l'or soit directement (dans ce cas les colorants sont thiolés) soit indirectement par l'intermédiaire d'un espaceur court (l'espaceur étant, de préférence, une molécule thiolée comportant entre 2 et 50 atomes de carbone). Les colorants ne sont donc pas liés à un oligonucléotide ou à un fragment d'ADN, comme décrit dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 03/027678. Selon l'invention, les colorants sont liés de façon quasi covalente sur la nanoparticule d'or par liaison or soufre. Par cette méthode, la fluorescence des colorants est préservée après greffage et n'est pas réduite par la présence de l'or qui absorbe fortement vers 520 nm, ce qui n'était pas le cas des composés précédemment choisis et adsorbés directement sur l'or. De plus, la fonction luminescente est assurée par un grand nombre de molécules organiques à activité luminescente greffées sur la nanoparticule d'or, conduisant à une émission forte en fluorescence après excitation, ce qui permet d'obtenir une luminescence finale globale par objet largement exaltée. Les nanoparticules hybrides selon l'invention deviennent alors visualisables à la fois en microscopie confocale en raison de l'absorption ou de la réflectivité (agent de contraste optique) et en microscopie électronique (agent de contraste électronique).
En effet, tout d'abord, la biomolécule cible est plus facilement repérée car, au lieu d'être marquée par un seul fluorophore, elle est "marquée" par plusieurs dizaines de molécules luminescentes. Une biopuce composée de billes de Sepharose porteuses d'oligonucleotide (d(A)22), immobilisée à la surface d'un élastomère (Fig. 3) est utilisée, pour mettre en évidence l'amplification obtenue grâce à l'utilisation de nanoparticules sondes hybrides selon l'invention porteuses de dérivés de lissamine rhodamine B et d'oligonucléotides. Les brins complémentaires à ceux immobilisés à la surface de la biopuce sont marqués, soit par une molécule unique de fluorophore (Lissamine rhodamine B) (Fig. 3A), soit par une nanoparticule hybride selon l'invention porteuse d'une multitude (2-200) de molécule de lissamine rhodamine B thiolée (Fig. 3B et Fig. 4). Les Fig. 5 et 6 mettent clairement en évidence l'augmentation de la fluorescence avec le nombre de molécules organiques fluorescentes (lissamine rhodamine B fonctionnalisée par une fonction thiol). Cependant, au delà de 400 molécules fluorescentes, l'intensité n'augmente plus et conserve la valeur mesurée pour des nanoparticules d'or sur lesquelles sont immobilisées 400 molécules organiques fluorescentes. Ces résultats ont été obtenus sur des nanoparticules d'or de diamètre 12 nm.
Comme présenté sur la Fig. 3, suite à la réaction d'hybridation entre brins complémentaires, pour un même nombre de brins marqués ayant réagi avec les brins immobilisés, c'est à dire un même nombre de molécules cibles dans l'échantillon, une intensité de fluorescence supérieure est attendue. Ceci est illustré sur la Fig. 7 présentant la variation d'intensité de fluorescence obtenue en fonction de la quantité de brins présents dans l'échantillon, marqués soit par une molécule de lissamine rhodamine B, soit par une particule sonde hybride selon l'invention. Dans ce cas précis, plusieurs brins peuvent être présents à la surface de la nanoparticule, mais il est admis qu'un seul de ces brins aura la possibilité de réagir avec un brin immobilisé. La courbe présentée sur la Fig. 7, tient compte de ces paramètres et suppose qu'une centaine de brins est présente à la surface de la nanoparticule, un seul réagissant avec le brin immobilisé. Comme on peut l'observer, une augmentation du signal d'un facteur dix peut être obtenue entre les molécules marquées par un fluorophore (carré blanc) et celles marquées par une particule hybride sonde selon l'invention portant une centaine de fluorophores (carré noir). Malgré l'absorption partielle du signal lumineux émis par le colorant organique due au colloïde d'or, une augmentation d'intensité d'un facteur 10 est observée.
Selon une première variante avantageuse de l'invention, les colorants greffés émettent à une longueur d'onde située en dehors du maximum d'absorption du plasmon de l'or (à 540 mn).
De façon avantageuse, les molécules à activité luminescente sont des colorants organiques fluorescents dont le maximum d'émission s'écarte d'au moins 25 nm du maximum d'absorption du plasmon de l'or. Des composés électroluminescents ou chimiluminescents, par exemple des dérivés du luminol pourront être utilisés. Des composés luminescents, dits à deux photons ou à émission anti-stokes, dont la longueur d'onde de la lumière émise est supérieure à la longueur d'onde d'excitation, de préférence d'au moins 200 nm pourront également être greffés. Les complexes de lanthanides, les dérivés de la rhodamine et plus particulièrement ceux de la lissamine rhodamine B sont des colorants particulièrement préférés.
Comme le montre la Fig. 1, le greffage de lissamine rhodamine B et de ses dérivés sur des nanoparticules d'or n'entraîne qu'une diminution d'un facteur 3 de l'intensité de luminescence obtenue, comparée à la même quantité de colorants libres (molécules individualisées). En augmentant le nombre de molécules de lissamine rhodamine B greffées, la luminescence par molécule biologique à détecter est encore augmentée.
Selon une autre variante avantageuse de réalisation de l'invention, les transferts non radiatifs entre les colorants organiques et l'or sont limités, de façon à obtenir des nanoparticules à extinction de luminescence réduite. Pour cela, on peut, par exemple, recouvrir au plus 75 % de la nanoparticule d'or d'un matériau de couverture présentant des caractéristiques diélectriques permettant le décalage de la bande plasmon de l'or en dehors de la zone d'émission des molécules à activité luminescente. Ce matériau de couverture est, par exemple, choisi parmi les polysiloxanes, SiO2, ZrO2,Ln2O3 et les oxohydroxydes de lanthanide. La couverture doit être partielle, de manière à laisser sur la nanoparticule d'or une surface libre suffisamment importante pour le greffage des molécules luminescentes et biologiques. La fig. 2 montre, à titre illustratif, comment le greffage par un oxyde de gadolinium permet d'éliminer l'absorption du plasmon de surface dans le domaine visible.
Une autre façon d'obtenir des nanoparticules à extinction de luminescence réduite est de greffer les molécules à activité luminescente par l'intermédiaire d'un espaceur thiolé. L'utilisation de colorants organiques préalablement greffés sur des espaceurs rigides (molécules thiolées organiques comportant par exemple un cycle benzénique) permet de maintenir le centre luminescent à une distance moyenne de la surface supérieure à 0,5 nm. Ces espaceurs contiennent, de préférence, au moins 6 carbones et moins de 50, et sont par exemple choisis parmi les mercaptophénols, l'acide dihydrolipoïque et les thio-poly(éthylèneglycol).
Par ailleurs, les nanoparticules sondes hybrides selon l'invention sont relativement photostables.
Les sondes selon l'invention sont parfaitement adaptées à une grande diversité de ciblage biologique, les spécificités étant dépendantes de la nature des molécules sondes greffées à la surface de la nanoparticule d'or. Les molécules sondes biologiques sont avantageusement choisies parmi les polynucléotides de type ADN, ARN ou oligonucléotides, les protéines de type anticorps, récepteur, enzyme, complexe enzyme/substrat, glycoprotéines, les polypeptides, les glycolipides, les oses, les polyosides et les vitamines. Les oligonucléotides thiolés ou liés à un espaceur thiolé sont particulièrement préférés. Les molécules organiques sondes peuvent également être tout type de molécules permettant l'interaction biotine-streptavidine.
Il est également possible de greffer sur la nanoparticule d'or d'autres molécules organiques thiolées, distinctes des molécules organiques sondes et des molécules à activité luminescente. Ces molécules organiquesthiolées comportent, de préférence, au moins une fonction alcool, amine, sulfonate, acide carboxylique ou phosphate. On pourra choisir de greffer 1 à 1000, de préférence, 10 à 1000, de ces molécules organiques autres. Les fonctions apportées par ces autres molécules sont par exemple une meilleure stabilité, une solubilité adaptée en fonction du milieu de travail, une redispersion aisée, une non agrégation, une meilleure sélectivité.
L'invention combine donc astucieusement nanoparticules d'or, molécules sondes biologiques et molécules à activité luminescente, de manière à ce que la luminescence ne soit pas détruite par l'absorption de l'or, mais au contraire globalement augmentée par rapport à une molécule isolée (effet de nombre des composés greffés) et que les molécules sondes conservent leur efficacité vis-à-vis des cibles biologiques.
Les nanoparticules hybrides d'or selon l'invention sont facilement synthétisées par la méthode de Frens (voie citrate) dont il existe de nombreuses variantes (citrate/acide tannique) ou par celle de Brust appelée voie NaBH4.
Pour la voie citrate, on pourra par exemple se référer à Nature Physical Science 241, 20-22, 1973. Dans ce cas, la réduction de tétrachloroaurate d'hydrogène par le citrate en phase aqueuse fournit des nanoparticules d'or recouvertes de citrate. Ce dernier joue un double rôle: il permet le contrôle de la croissance des nanoparticules et empêche la formation d'agrégats. L'association citrate/acide tannique fournit également des nanoparticules recouvertes de citrate dont les dimensions sont plus petites. Le greffage de molécules thiolées sur les nanoparticules d'or procède par remplacement progressif des molécules de citrate grâce à une addition par portion de la solution de molécules thiolées. Cette étape est délicate car un remplacement trop brutal induit la précipitation des nanoparticules. L'immobilisation de différentes molécules thiolées s'effectue en autant d'étapes (une étape = ajout complet d'une solution d'espèces thiolées) qu'il y a de molécules différentes.
Pour la voie NaBH4, on pourra notamment se référer à J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1655-1656, 1995. La voie NaBH4 consiste essentiellement à faire réagir, en milieu aqueux et en présence de borohydrure de sodium, du tétrachloroaurate d'hydrogène avec les dérivés thiolés que l'on souhaite greffer. Les dérivés thiolés greffés sont préparés selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art. Par dérivés thiolés, on entend une molécule organique comportant au moins une fonction thiol-SH. Ces fonctions thiols peuvent être obtenues à partir de sulfures de dialkyl ou disulfures de dialkyle.
Ces différentes voies sont bien connues de l'homme du métier qui pourra y apporter de nombreuses variantes. A titre non limitatif, une description de différentes variantes avantageuses du procédé est donnée ci-après.
Selon une première variante, le procédé de préparation de particules sondes hybrides selon l'invention comprend les étapes suivantes: préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction d'un sel d'or, et en particulier de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de citrate, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes thiolées venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique de molécules à activité luminescente venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate.
Dans le cas des voies citrate et citrate / acide tannique, la préparation des particules sondes hybrides comporte au moins trois étapes. De façon avantageuse, la première consiste à préparer en phase aqueuse des particules d'or de dimension nanométrique comprise, généralement, entre 10 et 20 nm selon la voie citrate et entre 6 et 15 mn selon la voie citrate / acide tannique, et ce, avantageusement, par réduction de HAuC14. 3H2O par le citrate (voie citrate) dans un rapport Au/Citrate compris entre 0,170 et 0,255 et par le couple citrate / acide tannique (voie citrate / acide tannique) dans des rapports Au/citrate et acide tannique/citrate compris entre 0,170 et 0,255 et entre 0,030 et 10, respectivement. Les nanoparticules d'or sont alors recouvertes par des molécules de citrate adsorbées sur leur surface. Les colloïdes peuvent éventuellement être purifiés par dialyse contre l'eau.
Dans le cas des voies citrate et citrate / acide tannique, la fonctionnalisation des nanoparticules est réalisée en plusieurs étapes. Chaque étape correspond au greffage d'une seule sorte de molécules. Le greffage s'opère par remplacement du citrate présent à la surface des nanoparticules et nécessite donc une addition lente de la solution contenant les molécules à greffer comportant une fonction thiol. La quantité de molécules greffées sur les nanoparticules d'or est avantageusement comprise entre 0,1 et 60 % des sites libres.
Le greffage de molécules à activité biologique, par exemple oligonucléotides thiolées, acide folique modifié par une fonction thiol ou greffé sur du poly(éthylène glycol) (PEG) thiolé, est réalisé, de préférence, par addition de 1 à 500 l d'une solution aqueuse de concentration comprise entre 0,1 M et 40 M. La quantité de 5 molécules sondes greffée à la surface des nanoparticules d'or est avantageusement comprise entre 1 et 200 molécules sondes par particule.
La deuxième étape consiste à greffer le colorant organique portant une ou plusieurs fonctions thiols par addition, de préférence, de 3 à 200 gl d'une solution aqueuse (ou éthanolique) du colorant thiolé de concentration comprise entre 0,1 et 400 itM. Le nombre de colorants thiolés greffés est avantageusement compris entre 10 et 400 par particules, pour des particules de diamètre 12 nm notamment.
On peut indifféremment effectuer le greffage des sondes biologiques avant ou après celui des colorants. Eventuellement peuvent être successivement ajoutées avant, entre ou après les deux étapes précédentes et dans un ordre indifférent les solutions de différentes espèces thiolées comme le mercaptoéthanesulfonate de sodium, l'acide succinique, le PEG terminé par une fonction thiol. Lorsque la fonctionnalisation est complète, les nanoparticules d'or hybrides sont purifiées par chromatographie sur colonne (SephadexTM G-25 M, éluant: solution tampon de pH compris entre 7 et 9).
Selon une autre variante de la voie citrate ou citrate/acide tannique, le procédé comprend les étapes suivantes: préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en 25 présence de citrate, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique d'espaceurs thiolés fonctionnalisés avec une fonction ionisable susceptible de réagir avec les molécules organiques sondes ou les molécules à activité luminescente à greffer, les dits espaceurs venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or, et/ou ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or.
Au lieu de greffer directement une molécule organique thiolée à activité luminescente ou biologique à la surface d'une nanoparticule d'or, cette autre variante consiste à réaliser le greffage par condensation entre deux fonctions réactives complémentaires présentes pour l'une dans la molécule active à greffer (colorant, sonde...) et pour l'autre à l'extrémité d'une molécule thiolée immobilisée à la surface de l'or et jouant le rôle d'espaceur. Le greffage d'une molécule organique à activité luminescente ou biologique nécessite la présence d'une fonction thiol pour lui assurer une immobilisation durable sur la particule d'or. La plupart de ces molécules en sont dépourvues. La fonction thiol peut être introduite par synthèse organique avant greffage (cas du protocole citrate). Une autre façon de procéder consiste à greffer la molécule active dépourvue de fonction thiol sur un espaceur thiolé présente à la surface de la nanoparticule d'or. Par rapport au protocole précédent l'étape de greffage de molécules actives thiolées est remplacée par deux étapes. La première consiste à immobiliser l'espaceur thiolé servant de point d'ancrage (bras espaceur) à la molécule à activité luminescente ou biologique. Avantageusement, de 1 à 500 111 d'une solution aqueuse de l'espaceur de concentration comprise entre 0,1 et 400 M est alors ajoutée au colloïde de nanoparticules d'or. Le nombre de molécules thiolées immobilisées est avantageusement compris entre 0,1% et 50 % de sites libres.
Ensuite, une solution aqueuse de la molécule active à greffer est ajoutée lentement. Cette solution peut éventuellement contenir un réactif facilitant le couplage. L'élimination des produits secondaires est réalisée par dialyse de la solution colloïdale contre l'eau. L'espaceur utilisé comme site de greffage doit nécessairement comporter une fonction thiol (indispensable pour l'immobilisation sur l'or) et au moins une fonction réactive (-OH, -NH2, -COC1...) pour assurer le greffage ultérieur de la molécule active. Afin d'obtenir les meilleurs résultats en luminescence, la chaîne carbonée entre la fonction thiol et la fonction réactive doit être rigide et comporte de préférence de 6 à 50 atomes de carbone. La molécule organique à activité luminescente ou biologique doit nécessairement comporter une fonction réactive (-SO2C1, - COCI, -OH, -NH2) capable de réagir avec celle portée par le bras espaceur immobilisé à la surface des nanoparticules d'or. On pourra notamment se référer à Chem. Eur. J, 8, 16, 3808-3814, 2002 et Chem. Commun. 1913-1914, 2000.
Quel que soit le protocole utilisé (molécule active thiolée ou espaceur thiolé), le nombre de molécules à activité luminescente immobilisées à la surface des nanoparticules est déterminé par spectroscopie UV-visible de la solution après précipitation des nanoparticules. La différence entre le nombre de molécules ajoutées au colloïde et le nombre de molécules présentes dans le surnageant (après filtration du précipité) indique le nombre de molécules immobilisées à la surface des nanoparticules d'or.
Selon une autre variante mettant en oeuvre la voie NaBH4, le procédé comprend les étapes suivantes: - préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction de sel d'or, et en particulier de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de NaBH4, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique d'espaceurs thiolés fonctionnalisés avec une fonction ionisable susceptible de réagir avec les molécules organiques sondes ou les molécules à activité luminescente à greffer, les dits espaceurs venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or, - ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or.
Dans lé cas de la voie NaBH4, les molécules thiolées présentes à la surface des nanoparticules d'or ont en général été introduites lors de la synthèse. Certaines peuvent être substituées mais avec un contrôle incertain du nombre de molécules remplacées. L'immobilisation de molécules à activité biologique et de colorants organiques s'effectuera dans la plupart des cas (pour une meilleure efficacité) par greffage sur des espaceurs thiolés présents à la surface des nanoparticules d'or. La synthèse par la voie NaBH4 de nanoparticules hybrides pour le marquage biologique nécessite également plusieurs étapes. La première consiste à préparer dans un alcool, de préférence, le méthanol, l'éthanol ou le diméthylformamide, les nanoparticules d'or recouvertes de molécules thiolées possédant une fonction ionisable en une seule étape par réduction de HAuC14.3H2O par une solution aqueuse de NaBH4 (Au/NaBH4 compris, par exemple, entre 0,05 et 0,5) en présence des molécules organiques thiolées possédant une fonction ionisable dont le rapport Au/S est, avantageusement, compris entre 0,2 et 10. Par cette méthode, la couverture des nanoparticules d'or est quasi totale.
Comme le remplacement des molécules thiolées à la surface des nanoparticules d'or est difficile et comme la surface est complètement recouverte, le choix des molécules thiolées est déterminant. Ces molécules doivent permettre à la fois une excellente redispersion des nanoparticules dans une solution aqueuse afin d'obtenir un colloïde stable et le greffage de molécules sondes et de colorants organiques. Des espaceurs thiolées possédant également une fonction ionisable (-NH2, - COOH) apparaissent appropriées pour préparer des nanoparticules hybrides d'or redispersables et stables (sous certaines conditions de pH) en solution aqueuse. De plus, ces fonctions ionisables peuvent servir à immobiliser des molécules sondes et des colorants organiques par de simples réactions de condensation (formation d'ester, d'amide, de dérivés de l'urée ou de la thiourée...).
Après réduction et donc formation des nanoparticules d'or, un précipité apparaît. Au maximum 2/3 du solvant (méthanol ou éthanol) sont alors évaporés sous pression réduite à une température inférieure à 40 C. Le précipité est filtré sur membrane polymère (avec, par exemple, un diamètre de pores égal à 0,22 m) et lavé méticuleusement avec différents solvants (choisis selon la nature du thiol immobilisé à la surface). Ce lavage vise à éliminer les co-produits de la réduction et la grande quantité de thiols non adsorbés.
La poudre obtenue est, après séchage à l'air, redispersée en phase aqueuse dans une gamme de pH contrôlée (qui dépend de la nature du groupement ionisable présent dans la molécule thiolée). Le colorant organique est ensuite greffé sur la nanoparticule par réaction entre une fonction réactive, du type -NH2, -COOH, - SO2C1, -N=C=O, -N=C=S notamment, présente sur le colorant et la fonction ionisable de l'espaceur thiolé greffé sur les nanoparticules d'or. Cette réaction est réalisée en additionnant à la solution colloïdale une solution aqueuse ou aquoalcoolique de colorant organique dont la quantité est au moins quatre fois supérieure au nombre de molécules thiolées adsorbées sur les nanoparticules d'or. Entre 0,5 et 10 % des fonctions ionisables des molécules thiolées adorbées sur l'or réagissent en général. Les produits secondaires en excès sont alors éliminés par précipitation des nanoparticules obtenue par une forte variation du pH (ApH 2). Le précipité est filtré sur membrane (diamètre des pores égal à 0,22 m par exemple) et lavé méticuleusement avant d'être redispersé en solution aqueuse dans une gamme de pH contrôlée.
Les molécules sondes sont greffées sur une partie des 85 à 90 % des fonctions ionisables restantes après le greffage du colorant organique. Le couplage est effectué par addition d'une solution aqueuse de molécules sondes dont la quantité est au moins supérieure au nombre de molécules thiolées adsorbées sur les nanoparticules d'or. Entre 0,1 et 2 % des fonctions ionisables des molécules thiolées greffées sur l'or réagissent. Afin d'éviter la dénaturation par la répétition des étapes de séparation, lavage et redispersion, le greffage des molécules sondes est, avantageusement, réalisé après celui des colorants organiques. Les produits secondaires en excès sont éliminés comme précedemment.
La caractérisation des nanoparticules est réalisée à l'état solide par XPS, XANES, ATG et à l'état liquide par spectroscopie UV-visible et XANES.
Une autre variante du procédé consiste à immobiliser les molécules sondes par échange de molécules sondes thiolés avec d'autres molécules thiolées déjà greffées à la surface des nanoparticules d'or. Afin d'éviter l'échange préjudiciable avec une partie des molécules thiolées couplées à des colorants, il est indispensable dans ce cas de réaliser l'immobilisation des molécules à activité biologique avant celle des colorants organiques. Cependant, ces réactions d'échange sont relativement aléatoires et difficiles à maîtriser.
Il faut noter que dans la voie NaBH4, la couverture des nanoparticules d'or par les molécules thiolées est quasiment complète. L'introduction de nouvelles molécules thiolées s'effectue par conséquent uniquement par échange.
Il est important de noter que pour les nanoparticules sondes hybrides préparées en présence de citrate, il n'y a pas d'échange significatif de thiols: les nanohybrides sont donc stables dans ces cas et les propriétés conservées. La voie proposée permet donc de déterminer le revêtement de la nanoparticule d'or, et donc les caractéristiques de la particule sonde obtenue.
Selon l'invention, il est possible de greffer, à la surface des nanoparticules d'or, des quantités variables mais déterminées de molécules fluorescentes et de sondes biologiques. Le nombre de molécules à la surface des nanoparticules peut être aisément déterminé par spectroscopie UV après précipitation des particules d'or, permettant ainsi de connaître la composition chimique de la surface.
Les nouvelles particules sondes selon l'invention présentent un intérêt tout particulier, notamment, dans l'amélioration des biopuces, l'étude de l'interaction entre des microorganismes et leur environnement, la traque individuelle de biomolécules pour l'étude du trafic cellulaire et de l'activité cellulaire.
Les exemples ci-après sont donnés à titre purement illustratif et n'ont pas de caractère limitatif.
Exemple 1
Préparation d'une suspension colloïdale de nanoparticules d'or par la méthode citrate / acide tannique.
mg de citrate de sodium et 10 mg d'acide tannique sont dissous dans 20 ml d'eau ultra pure. Parallèlement, 10 mg de tétrachloroaurate d'hydrogène, trihydrate HAuC14.3H2O sont dissous dans 80 ml d'eau ultra pure. Les deux solutions sont ensuite chauffées à 60 C puis réunies par transvasement de la solution citrate de sodium/acide tannique dans la solution d'or. Le mélange est alors chauffé à 60 C à reflux pendant 1 heure puis porté à ébullition pendant 10 minutes et enfin refroidi à température ambiante en maintenant l'agitation. Les nanoparticules obtenues ont un diamètre moyen de 8 nm, ce qui renvoie à une concentration de 1,67.10-$ moles de nanoparticules /litre.
Exemple 2
Préparation de nanoparticules d'or stabilisées et prêtes à être fonctionnalisées par greffage de dérivés thiolés.
La surface des nanoparticules synthétisées selon l'exemple 1 est recouverte par des dérivés thiolés dans des proportions précises. Les dérivés thiolés utilisés sont le mercaptoéthanesulfonate de sodium (MES), l'acide thiomaléique (AT) et le mercaptophénol (MP). A une solution de 60 ml de nanoparticules sont ajoutés 2 ml de solutions aqueuses de chaque dérivé thiolé dont les concentrations sont les suivantes: AT: 1,112.10-7 M obtenu par dissolution de 16,69 mg dans 100 ml d'eau deionisée, MES: 1, 112.10-7 M obtenu par dissolution de 18,26 mg dans 100 ml d'eau deionisée, MP: 2,224.10"7 M obtenu par dissolution de 28,50 mg dans 100 ml d'eau deionisée. Les ajouts sont faits successivement toutes les 30 minutes, la solution est maintenue sous agitation constante.
Exemple 3
Préparation d'une suspension colloïdale de nanoparticules d'or luminescentes par la méthode citrate I acide tannique dans les mêmes conditions que celles de 20 l'exemple 2.
Sur les fonctions hydroxyles des mercaptophénols greffés à la surface des nanoparticules d'or sont immobilisées des molécules fluorescentes de rhodamine lissamine B. Sur 30 ml de solution préparée selon l'exemple 2 est ajouté 1 ml d'une solution aqueuse de sulfochlorure de lissamine rhodamine B de concentration 10-7 M en présence de 10 ml de triéthylamine concentrée. On obtient ainsi des nanoparticules d'or portant en moyenne 200 molécules de lissamine rhodamine B.
Exemple 4
Synthèse d'un dérivé thiolé de la rhodamine lissamine B. Ce dérivé est obtenu par réaction de la fonction amine de l'aminothiophénol sur la fonction sulfochlorure de la rhodamine lissamine B. La réaction se déroule à température ambiante par dissolution dans 100 ml de chloroforme de 125 mg de sulfochlorure lissamine rhodamine B et 26,9 mg d'aminothiophénol en présence d' l ml de triéthylamine. La solution est agitée durant un jour puis purifiée par colonne chromatographique de silice avec un éluant dichlorométhane/méthanol, 9 /1 (v/v).
Exemple 5
Greffage de dérivés thiolés de la lissamine rhodamine B préparés selon l'exemple 4 sur la surface de nanoparticules d'or préparées selon l'exemple 1. La préparation est réalisée par ajout de solutions de lissamine rhodamine B thiolée à la solution de nanoparticules d'or sous agitation mécanique. Cet ajout est de quantité et de concentration variables selon le nombre de molécules fluorescentes désirées par nanoparticule; ce nombre peut varier de 1 à 400 pour des nanoparticules de 12 nm de diamètre.
Pour exemple, pour un rapport désiré de 100 molécules de lissamine rhodamine B par nanoparticule, l'ajout sera de 1 ml d'une solution aqueuse à 1,67.10-5 M de lissamine rhodamine B thiolée sur 10 ml d'une solution à 1,67.10"8 M de nanoparticules d'or.
Exemple 6
Greffage d'un dérivé de l'acide folique à terminaison soufrée.
Un dérivé soufré de l'acide folique est obtenu par greffage d'un bisaminopropylpolyéthylèneglycol puis modification par le réactif de Traut afin d'obtenir une fonction thiol. Ce dérivé est greffé à la surface de nanoparticules d'or par ajout à une solution de nanoparticules préparée selon l'exemple 1.
Exemple 7
Greffage d'oligonucléotides sur les nanoparticules d'or Les oligonucléotides d(T)22 terminés par une fonction thiol utilisés sont préalablement filtrés sur colonne, 69 nanomoles d'oligonucléotides diluées dans 2,33 ml d'eau, soit une concentration de 29,6.10-6 M, sont récupérées. De 3,35 l à 335,1 30 l (de 0,2 à 20 oligonucléotides par nanoparticule) de cette solution sont ensuite ajoutés à 1 ml de nanoparticules d'or préparées selon l'exemple 1, 3 ou 5.
Exemple 8
Greffage de dérivés thiolés de la lissamine rhodamine B préparés selon l'exemple 4 sur la surface de nanoparticules d'or préparées selon l'exemple 7. Sur les nanoparticules préparées selon l'exemple 7, on greffe des dérivés de lissamine rhodamine B thiolés préparés selon l'exemple 4 dans un rapport 100 pour une nanoparticule d'or. Ce greffage se fait comme décrit précédemment dans l'exemple 5.
Exemple 9
Synthèse de particules d'or partiellement entourées de particules d'oxyde de gadolinium pour décalage de l'absorption en dehors de la zone d'émission des molécules à activité luminescente greffées.
Le colloïde de nanoparticules de Gd2O3 5% Tb3+ a été préparé selon la méthode polyol (R. Bazzi, M.A. Flores-Gonzalez, C. Louis, K. Lebbou, C. Dujardin, A. Brenier, W. Zhang, O. Tillement, E. Bernstein and P. Perriat dans Journal of Luminescence 102-103, 445-450, 2003). Elle consiste à précipiter directement des nanoparticules d'oxydes luminescents à partir de sels métalliques dissous dans du diéthylène glycol. Après synthèse, le colloïde obtenu est dialysé à 40 C dans du diéthylène glycol (1:20 en volume).
Ensuite, HAuC14, 3H2O est dissous dans le colloïde (1:3 en masse de sels initiaux). La solution est agitée pendant 15 minutes, pour devenir jaune. Deux solutions aqueuses contenant pour la première 1 g.l-I de citrate de sodium et 1,5 g.l-1 d'acide tannique et pour la seconde 0,5 g.l-1 de NaBH4 sont préparées afin de réduire le sel d'or.
La première solution est ajoutée au colloïde, sous agitation. Au bout de cinq minutes, la deuxième solution est ajoutée (1:1:1 en volume). L'ajout se fait lentement au goutte à goutte. Le colloïde, au cours des différents ajouts, perd sa couleur jaune pour passer par une phase transparente, puis par une phase rouge intense, qui apparaît progressivement, preuve directe de la présence de nanoparticules d'or. Sous certaines conditions, la luminescence peut être grandement exacerbée (d'au moins un facteur 10).
Exemple 10
Synthèse de nanoparticules d'or stabilisées par des molécules thiolées portant à leur extrémité une fonction acide carboxylique.
A 60 ml de méthanol contenant 49.10-5 mol d'acide tétrachloroaurique (HAuC14, 3H20) sont ajoutés 38 ml de méthanol contenant de 49 à 196.10-5 mol d'acide carboxylique portant une ou deux fonctions thiols et 1,96 ml d'acide éthanoïque. Après 5 minutes d'agitation, 13,2 ml d'une solution aqueuse contenant 480.10-5 mol de tétrahydruroborate de sodium (NaBH4) sont ajoutés goutte à goutte au mélange qui noircit.
Après 1 heure d'agitation, 4 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique (HC1, 1 N) sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension noire obtenue est concentrée par évaporation partielle du méthanol sous pression réduite. Le solide noir est filtré, lavé par 3x30 ml d'HCl 0,1 N, 2x20 ml d'eau et 3x30 ml d'éther de diéthyle. Le mélange réactionnel est ensuite séché à la température ambiante. La poudre obtenue peut être aisément redispersée dans une solution aqueuse dont le pH est supérieur ou égal à 7.
Exemple 11
Greffage de luminol sur les nanoparticules d'or préparées selon l'exemple 10.
8 mg de nanoparticules d'or (de diamètre moyen égal à 5 nm) sont dispersées dans 10 ml d'une solution aqueuse de pH 8-10. 1 ml d'une solution de 0,1 M de 1-éthyl-3-(3-diméthylamino)propyl carbodiimide (EDC) et 0,2 M de pentafluorophénol dans le propan-2-ol est ajouté à la solution colloïdale de nanoparticules d'or. Après 90 minutes, 154 pl à 1, 54 ml d'une solution aqueuse à 10"2 M de luminol sont ajoutés.
Après 150 minutes, les nanoparticules sont précipitées par ajout d'une solution aqueuse de HC1 1 N. Le précipité résultant est filtré et lavé avant d'être redispersé dans une solution aqueuse de pH 7.
Variante: au lieu d'une solution de propan-2-ol contenant 0,1 M de d'EDC et 0,2 M de pentafluorophénol, une solution aqueuse de 0,1 M d'EDC et 0,2 M de 30 N-hydroxysuccinimide peut être utilisée.
Exemple 12
Greffage d'un oligonucléotide thiolé sur les nanoparticules préparées selon l'exemple 11.
A 1 ml d'une solution colloïdale de nanoparticules d'or (6,7.1017 nanoparticules/litre) sont ajoutées 1,11.10-9 mol d'oligonucléotides thiolés. Après 1 h, les particules sont précipitées par ajout de nanoparticules de HC1 1 N. Le précipité résultant est filtré et lavé avant d'être redispersé dans une solution aqueuse de pH 7.
Exemple 13 Greffage d'un oligonucléotide terminé par une fonction amine sur les
nanoparticules préparées selon l'exemple 11.
A 1 ml d'une solution colloïdale de nanoparticules d'or (6,7.1017 nanoparticules/litre) est ajouté 1 ml d'une solution à 0,1 M d'EDC et 0,2 M de pentafluorophénol dans le propan-2-ol. Après 90 minutes, 1,11.10-9 mol d'oligonucléotides thiolés d(T)22 terminés par une fonction amine sont ajoutés. Après 2 heures et 30 minutes, les nanoparticules sont précipitées par ajout d'une solution aqueuse de HC1 1 N. Le précipité résultant est filtré et lavé avant d'être redispersé dans une solution aqueuse de pH 8-10.
Variante: au lieu d'une solution de propan-2-ol contenant 0,1 M d'EDC et 0,2 M de 20 pentafluorophénol, une solution aqueuse de 0,1 M d'EDC et 0,2 M de N-hydroxysuccinimide peut être utilisée.
Claims (17)
1 - Particules sondes hybrides comprenant une nanoparticule d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm à la surface de laquelle sont greffées par des liaisons or-soufre, d'une part, au moins une, et de préférence de une à 100, molécules organiques sondes et d'autre part, au moins 10, et de préférence 10 à 10000, molécules à activité luminescente.
2 - Particules sondes hybrides selon la revendication 1 caractérisées en ce que le nombre de molécules à activité luminescente greffées en surface de la nanoparticule d'or est au moins 10 fois plus important que le nombre de molécules organiques sondes greffées.
3 - Particules sondes hybrides selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que 10 à 1000, de préférence 100 à 500, molécules à activité luminescente sont greffées sur la nanoparticule d'or.
4 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont des colorants organiques fluorescents dont le maximum d'émission s'écarte d'au moins 25 nm du maximum d'absorption du plasmon de l'or.
- Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont des composés électroluminescents ou chimiluminescents, par exemple des dérivés du luminol.
6 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont des composés luminescents dont la longueur d'onde de la lumière émise est supérieure à la longueur d'onde d'excitation, de préférence d'au moins 200 nm.
7 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont des complexes de lanthanides.
8 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont choisies parmi les dérivés de la rhodamine et en particulier ceux de la lissamine rhodamine B. 9 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisées en ce qu'au plus 75 % de la nanoparticule d'or est recouverte d'un matériau de couverture présentant des caractéristiques diélectriques permettant le décalage de la bande plasmon de l'or en dehors de la zone d'émission des molécules à activité luminescente.
- Particules sondes hybrides selon la revendication 9 caractérisées en ce que le matériau de couverture est choisi parmi les polysiloxanes, SiO2, ZrO2,Ln2O3 et les 5 oxohydroxydes de lanthanide.
11 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont greffées à la nanoparticules d'or par l'intermédiaire d'un espaceur thiolé, cet espaceur n'étant pas identique aux molécules organiques sondes.
12 - Particules sondes hybrides selon la revendication 11 caractérisées en ce que l'espaceur contient de 6 à 50 atomes de carbone et est, par exemple, choisi parmi les mercaptophénols, l'acide dihydrolipoïque et les thio-poly(éthylèneglycol).
13 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisées en ce que la nanoparticule d'or présente un diamètre compris dans la gamme allant de 4 à 20 nm, de préférence dans la gamme allant de 5 à 16 nm.
14 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisées en ce que 1 à 10 molécules organiques sondes sont greffées sur la nanoparticule d'or.
- Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisées en ce que les molécules organiques sondes sont choisies parmi les polynucléotides de type ADN, ARN ou oligonucléotides, les protéines de type anticorps, récepteur, enzyme, complexe enzyme/substrat, glycoprotéines, les polypeptides, les glycolipides, les oses, les polyosides et les vitamines.
16 - Particules sondes hybrides selon la revendication 14 caractérisées en ce que les molécules organiques sondes sont des oligonucléotides thiolés ou liés à un 25 espaceur thiolé.
17 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisées en ce que les molécules organiques sondes sont des molécules permettant l'interaction biotine - streptavidine.
18 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisées en ce qu' en outre, 10 à 1000 molécules organiques thiolées autres, distinctes des molécules organiques sondes et des molécules à activité luminescente, sont greffées sur la nanoparticule d'or, ces molécules organiques thiolées autres comportant, de préférence, au moins une fonction alcool, amine, sulfonate, acide carboxylique ou phosphate.
19 - Procédé de préparation de particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 18 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction d'un sel d'or, et en particulier de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de citrate, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes thiolées venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate, - ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique de molécules à activité luminescente venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate.
- Procédé de préparation de particules sondes hybrides caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de citrate, - ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique d'espaceurs thiolés fonctionnalisés avec une fonction ionisable susceptible de réagir avec les molécules organiques sondes ou les molécules à activité luminescente à greffer, les dits espaceurs venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or- soufre en remplacement de molécules de citrate, - ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or, et/ou ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or.
21 - Procédé de préparation de particules sondes hybrides selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que la réduction du sel d'or est réalisée en présence d'acide tannique.
22 - Procédé de préparation de particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 18 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction de sel d'or, et en particulier de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de NaBH4, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique d'espaceurs thiolés fonctionnalisés avec une fonction ionisable susceptible de réagir avec les molécules organiques sondes ou les molécules à activité luminescente à greffer, les dits espaceurs venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0313978A FR2863053B1 (fr) | 2003-11-28 | 2003-11-28 | Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee |
| JP2006540543A JP2007512522A (ja) | 2003-11-28 | 2004-11-26 | 強発光を有する新規のハイブリッド・プローブ |
| EP04805567A EP1690091A1 (fr) | 2003-11-28 | 2004-11-26 | Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee |
| US10/581,052 US20070275383A1 (en) | 2003-11-28 | 2004-11-26 | Novel Hybrid Probes with Heightened Luminescence |
| PCT/FR2004/003039 WO2005054858A1 (fr) | 2003-11-28 | 2004-11-26 | Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0313978A FR2863053B1 (fr) | 2003-11-28 | 2003-11-28 | Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2863053A1 true FR2863053A1 (fr) | 2005-06-03 |
| FR2863053B1 FR2863053B1 (fr) | 2007-04-06 |
Family
ID=34566218
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0313978A Expired - Fee Related FR2863053B1 (fr) | 2003-11-28 | 2003-11-28 | Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070275383A1 (fr) |
| EP (1) | EP1690091A1 (fr) |
| JP (1) | JP2007512522A (fr) |
| FR (1) | FR2863053B1 (fr) |
| WO (1) | WO2005054858A1 (fr) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007070115A1 (fr) * | 2005-12-15 | 2007-06-21 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Particules d'agregats metalliques luminescentes et leurs utilisations |
| WO2007133704A2 (fr) * | 2006-05-11 | 2007-11-22 | Nanosphere, Inc. | Dosage par code -barres biologique non basé sur des acides nucléiques pour détecter des matériaux biologiques |
| FR2922106A1 (fr) * | 2007-10-16 | 2009-04-17 | Univ Claude Bernard Lyon I Eta | Utilisation de nanoparticules a base de lanthanides comme agents radiosensibilisants. |
| WO2010109268A1 (fr) * | 2009-03-23 | 2010-09-30 | Yeditepe Universitesi | Synthèse de nanoparticules en or recouvertes d'argent et fixées à un oligonucléotide |
| FR2946267A1 (fr) * | 2009-06-05 | 2010-12-10 | Centre Nat Rech Scient | Procede de preparation d'une composition organocompatible et hydrocompatible de nanocristaux metalliques et composition obtenue |
| WO2012175665A1 (fr) * | 2011-06-22 | 2012-12-27 | Total Sa | Nanotraceurs pour le marquage d'eaux d'injection de champs petroliers |
| WO2020249912A1 (fr) * | 2019-06-12 | 2020-12-17 | Centre National De La Recherche Scientifique | Nanoparticules prefonctionnalisees a l'aide d'une monocouche auto-assemblee et leur methode de preparation |
| US11590225B2 (en) | 2016-12-08 | 2023-02-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bismuth-gadolinium nanoparticles |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2867180B1 (fr) * | 2004-03-02 | 2006-06-16 | Univ Claude Bernard Lyon | Nanoparticules hybrides comprenant un coeur de ln203 porteuses de ligands biologiques et leur procede de preparation |
| JP4626377B2 (ja) * | 2005-04-26 | 2011-02-09 | セイコーエプソン株式会社 | 標的分子の検出方法、遺伝子多型の検出方法、ならびにこれらの検出方法に用いられる基板およびキット |
| GB0701444D0 (en) * | 2007-01-25 | 2007-03-07 | Iti Scotland Ltd | Detecting analytes |
| GB0717150D0 (en) * | 2007-09-04 | 2007-10-17 | Univ Warwick | Apparatus and method |
| CN101900723B (zh) * | 2009-05-27 | 2013-05-08 | 中国科学技术大学 | 鲁米诺直接键合的纳米金在免疫分析中的应用 |
| CN102021226B (zh) * | 2009-09-11 | 2014-04-23 | 中国科学技术大学 | 鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及其应用 |
| CN102191034A (zh) * | 2010-03-03 | 2011-09-21 | 中国科学技术大学 | 一种n-(4-氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金及其制备方法和应用 |
| JP5455878B2 (ja) * | 2010-11-30 | 2014-03-26 | シスメックス株式会社 | 被検物質の電気化学的検出方法 |
| KR101311920B1 (ko) * | 2010-12-21 | 2013-09-26 | 한국생명공학연구원 | 란타나이드 금속착체를 이용한 형광 나노입자 및 그 제조방법 |
| CN102559170B (zh) * | 2010-12-30 | 2014-08-13 | 中国科学技术大学 | 一种鲁米诺发光功能化的纳米银及其制备方法和应用 |
| CN102286280B (zh) * | 2011-05-04 | 2013-11-13 | 北京化工大学 | 一种三角形纳米金溶胶及其制备方法和应用 |
| FR2985724B1 (fr) * | 2012-01-16 | 2014-03-07 | Saint Gobain | Substrat muni d'un empilement a proprietes thermiques comportant quatre couches fonctionnelles metalliques. |
| US20150031571A1 (en) * | 2012-02-07 | 2015-01-29 | University Of Kansas | Chemiluminescent nanoparticles and uses thereof |
| GB201212135D0 (en) | 2012-07-09 | 2012-08-22 | Base4 Innovation Ltd | Improved sequencing apparatus |
| BR112019003709A2 (pt) | 2016-08-25 | 2019-05-28 | Centre Nat Rech Scient | nanopartículas de silício multifuncionalizadas, usos de nanopartículas de silício multifuncionalizadas, composição e métodos para medir um analito por um método in vitro |
| CN111117302A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-05-08 | Tcl华星光电技术有限公司 | 纳米染料分子、彩色滤光片及显示面板 |
| US11453781B2 (en) | 2019-12-17 | 2022-09-27 | Tcl China Star Optoelectronics Technology Co., Ltd. | Nano dye molecule, color filter, and display panel |
| CN113681022B (zh) * | 2021-08-27 | 2022-10-25 | 华南理工大学 | 一种无荧光背景的金纳米材料及其制备方法与用于体外检测组胺和活体内组胺成像的方法 |
| CN114767851B (zh) * | 2022-04-06 | 2023-11-21 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种金纳米簇及其制备方法与在制备放射动力学治疗肿瘤药物中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999001766A1 (fr) * | 1997-07-04 | 1999-01-14 | Universiteit Utrecht | Particule metallique, sa preparation et son utilisation, et materiau ou dispositif comprenant cette particule metallique |
| WO2001039873A1 (fr) * | 1999-12-03 | 2001-06-07 | Surromed, Inc. | Ensemencement par hydroxylamine de nanoparticules metalliques colloidales |
| WO2002018951A2 (fr) * | 2000-08-29 | 2002-03-07 | The Rockefeller University | Procedes mettant en application une extinction de fluorescence par des surfaces metalliques |
| WO2003027678A1 (fr) * | 2001-09-26 | 2003-04-03 | Psychiatric Genomics, Inc. | Dosage de proximite par fluorescence |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5514602A (en) * | 1986-06-09 | 1996-05-07 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Method of producing a metal sol reagent containing colloidal metal particles |
| US6635418B2 (en) * | 1998-02-13 | 2003-10-21 | Igen International, Inc. | Assay methods for nucleic acid in a sample |
| EP1116029B1 (fr) * | 1998-09-24 | 2007-12-26 | Promega Corporation | Anticorps marqueurs d'apoptose et methodes d'utilisations |
| US6515113B2 (en) * | 1999-02-18 | 2003-02-04 | The Regents Of The University Of California | Phthalamide lanthanide complexes for use as luminescent markers |
| US6530944B2 (en) * | 2000-02-08 | 2003-03-11 | Rice University | Optically-active nanoparticles for use in therapeutic and diagnostic methods |
| AU2001249459A1 (en) * | 2000-03-24 | 2001-10-08 | The State Of Oregon, Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon | Scaffold-organized clusters and electronic devices made using such clusters |
| US20040197793A1 (en) * | 2002-08-30 | 2004-10-07 | Arjang Hassibi | Methods and apparatus for biomolecule detection, identification, quantification and/or sequencing |
-
2003
- 2003-11-28 FR FR0313978A patent/FR2863053B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-11-26 EP EP04805567A patent/EP1690091A1/fr not_active Withdrawn
- 2004-11-26 US US10/581,052 patent/US20070275383A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-26 JP JP2006540543A patent/JP2007512522A/ja not_active Withdrawn
- 2004-11-26 WO PCT/FR2004/003039 patent/WO2005054858A1/fr active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999001766A1 (fr) * | 1997-07-04 | 1999-01-14 | Universiteit Utrecht | Particule metallique, sa preparation et son utilisation, et materiau ou dispositif comprenant cette particule metallique |
| WO2001039873A1 (fr) * | 1999-12-03 | 2001-06-07 | Surromed, Inc. | Ensemencement par hydroxylamine de nanoparticules metalliques colloidales |
| WO2002018951A2 (fr) * | 2000-08-29 | 2002-03-07 | The Rockefeller University | Procedes mettant en application une extinction de fluorescence par des surfaces metalliques |
| WO2003027678A1 (fr) * | 2001-09-26 | 2003-04-03 | Psychiatric Genomics, Inc. | Dosage de proximite par fluorescence |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007070115A1 (fr) * | 2005-12-15 | 2007-06-21 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Particules d'agregats metalliques luminescentes et leurs utilisations |
| WO2007133704A2 (fr) * | 2006-05-11 | 2007-11-22 | Nanosphere, Inc. | Dosage par code -barres biologique non basé sur des acides nucléiques pour détecter des matériaux biologiques |
| WO2007133704A3 (fr) * | 2006-05-11 | 2008-03-13 | Nanosphere Inc | Dosage par code -barres biologique non basé sur des acides nucléiques pour détecter des matériaux biologiques |
| FR2922106A1 (fr) * | 2007-10-16 | 2009-04-17 | Univ Claude Bernard Lyon I Eta | Utilisation de nanoparticules a base de lanthanides comme agents radiosensibilisants. |
| WO2009053644A2 (fr) * | 2007-10-16 | 2009-04-30 | Universite Claude Bernard Lyon I | Utilisation de nanoparticules a base de lanthanides comme agents radiosensibilisants |
| WO2009053644A3 (fr) * | 2007-10-16 | 2009-06-25 | Univ Claude Bernard Lyon | Utilisation de nanoparticules a base de lanthanides comme agents radiosensibilisants |
| WO2010109268A1 (fr) * | 2009-03-23 | 2010-09-30 | Yeditepe Universitesi | Synthèse de nanoparticules en or recouvertes d'argent et fixées à un oligonucléotide |
| FR2946267A1 (fr) * | 2009-06-05 | 2010-12-10 | Centre Nat Rech Scient | Procede de preparation d'une composition organocompatible et hydrocompatible de nanocristaux metalliques et composition obtenue |
| WO2012175665A1 (fr) * | 2011-06-22 | 2012-12-27 | Total Sa | Nanotraceurs pour le marquage d'eaux d'injection de champs petroliers |
| FR2976825A1 (fr) * | 2011-06-22 | 2012-12-28 | Total Sa | Nanotraceurs pour le marquage d'eaux d'injection de champs petroliers |
| FR2976826A1 (fr) * | 2011-06-22 | 2012-12-28 | Total Sa | Nanotraceurs pour le marquage d'eaux d'injection de champs petroliers |
| US11590225B2 (en) | 2016-12-08 | 2023-02-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bismuth-gadolinium nanoparticles |
| WO2020249912A1 (fr) * | 2019-06-12 | 2020-12-17 | Centre National De La Recherche Scientifique | Nanoparticules prefonctionnalisees a l'aide d'une monocouche auto-assemblee et leur methode de preparation |
| FR3097129A1 (fr) * | 2019-06-12 | 2020-12-18 | Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs | Nanoparticules prefonctionnalisees a l’aide d’une monocouche auto-assemblee et leur methode de preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005054858A1 (fr) | 2005-06-16 |
| US20070275383A1 (en) | 2007-11-29 |
| FR2863053B1 (fr) | 2007-04-06 |
| EP1690091A1 (fr) | 2006-08-16 |
| JP2007512522A (ja) | 2007-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2863053A1 (fr) | Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee | |
| EP1723431B1 (fr) | Nanoparticules hybrides comprenant un coeur de ln2o3 porteuses de ligands biologiques et leur procede de preparation | |
| de Dios et al. | Multifunctional nanoparticles: analytical prospects | |
| Petryayeva et al. | Quantum dots in bioanalysis: a review of applications across various platforms for fluorescence spectroscopy and imaging | |
| CA2403620C (fr) | Bioconjugues chromophore inorganique | |
| Wang et al. | Ultraefficient cap-exchange protocol to compact biofunctional quantum dots for sensitive ratiometric biosensing and cell imaging | |
| JP4985541B2 (ja) | ナノ粒子内包シリカ、それを用いた生体物質の標識物質および生体物質の標識方法 | |
| US8815158B2 (en) | Granular nanoparticles having bright fluorescence and giant raman enhancements | |
| WO2008146966A1 (fr) | Kits et procédés de détection biologique utilisant des points quantiques | |
| Ren et al. | Quantum dot probes for cellular analysis | |
| JPWO2009066548A1 (ja) | 半導体ナノ粒子、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法 | |
| WO2019025618A1 (fr) | Procede de detection ultra-sensible a l'aide de particules photoluminescentes | |
| JP2009520101A (ja) | ルミネセンス性金属酸化物フィルム | |
| US8313957B2 (en) | Fluorescent sensor based on two fluorescent moieties, one of which is a semiconductor nanocrystal, and methods of using and making | |
| CN110726710A (zh) | 基于Au-Se界面的SERS传感器用于超灵敏高保真生物分子定量检测 | |
| JP5024291B2 (ja) | 蛍光半導体微粒子、その製造方法、それを用いた生体物質蛍光標識剤及びそれを用いたバイオイメージング法 | |
| JP5136548B2 (ja) | 蛍光体標識化合物 | |
| Aguilar | Quantum Dots for Bioimaging | |
| Zhong et al. | Synthesis of mercaptoethylamine-coated CdSe/CdS nanocrystals and their use for DNA probe | |
| Nadeau et al. | Quantum dot systems for specific biosensing applications | |
| CN109735323A (zh) | 一种量子点发光复合物的制备方法 | |
| WO2018211109A1 (fr) | Particules luminescentes a base de terres rares et leur utilisation a titre d'agent de diagnostic | |
| Samukaitė-Bubnienė | Study of polypyrrole based biosensing systems by fluorescence methods | |
| Cui et al. | Dynamic Article Links C | |
| Huang | Development of nanoparticle applications in cell imaging, bioassay and reactive oxygen species detection based on surface-enhanced raman spectroscopy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 14 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 15 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 17 |
|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20210705 |