CN117310150A - 一种基于量子点标记的过敏原特异性IgE检测方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于量子点标记的过敏原特异性IgE检测方法和用途。本发明公开了一种量子点标记的抗人IgE抗体偶联物及其制备方法，并提供了一种量子点免疫层试纸条，主要由底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上；所述硝酸纤维素膜上设置有一条检测线和一条质控线。本发明所制备的抗体偶联物及检测板条不仅能够快速检测样本中的过敏原特异性IgE，并且较现有技术大大拓宽了检测范围。

Description

一种基于量子点标记的过敏原特异性IgE检测方法和用途
技术领域
本发明涉及过敏原特异性IgE快速检测方法和用途，具体地说，本发明涉及一种基于量子点标记的过敏原特异性IgE检测方法和用途。
背景技术
过敏性疾病是临床常见病。据WHO统计，全球约22％人群受到过敏性疾病的干扰，且发病人数呈逐年上升趋势，给社会带来了沉重的经济负担。过敏原特异性IgE是过敏主要的致病分子之一。当过敏原第一次进入机体，可导致机体形成过敏原特异性IgE，后者与效应细胞嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE高亲和力受体FcεRI结合，此为致敏过程；当过敏原再次进入机体，其可与效应细胞表面的特异性IgE结合，导致相邻的FcεRI交联，引起效应细胞激活。激活的效应细胞立刻释放胞浆内预先合成的颗粒，颗粒富含的释放炎症介质、细胞因子和趋化因子等，导致毛细血管扩张、血管通透性增加、平滑肌收缩、腺体分泌增加的活性因子，引起局部或全身过敏反应症状，包括过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、食物过敏、药物过敏等。
目前临床上对于过敏性疾病的诊断，除了病史、体格检查外，实验室检查是重要辅助诊断手段。常用的实验室检查包括体内激发试验和体外过敏原特异性IgE检测(sIgE)以及血清总IgE检测。体内试验虽然准确性较高，但存在诱发严重过敏反应的风险、多种抗原过敏时的交叉反应结果难以判断，而且检测时患者尤其是儿童比较痛苦。体外试验中总IgE水平受多种因素影响，特异性较低。目前，过敏原sIgE检测是过敏性疾病诊断应用最广泛的检测手段。临床常用的检测方法有荧光酶标法(UniCAP系统)和免疫印迹法(AllergyScreen)，这些检测法多为国外进口产品、试剂成本高，检测种类有限，操作步骤繁杂，耗时长。
与传统的临床实验室免疫诊断相比，近年来发展起来的免疫层析技术具有快速、高效、成本低、标本用量少等特点。胶体免疫层析技术是研究最早也是目前应用最广的快速免疫诊断方法。虽然具有检测结果肉眼可见、无需特殊检测设备等优点，但该方法检测灵敏度不够高，多为定性或半定量检测结果，无法满足疾病诊断中超微量检测的需求。随着纳米技术的不断发展，许多新型的纳米材料被不断制备，应用于免疫分析，给研发新一代诊断试剂盒带来了新的机遇。
量子点(QDs)，也称半导体纳米晶，作为一种新型荧光纳米粒子，具有：荧光尺寸效应、发射峰狭窄对称、激发波长范围广、量子产率高、荧光寿命长、化学和光稳定性好等特点。近年来量子点作为探针在快速免疫诊断领域有较多的研究报道。2008年，Lin等首次报道以量子点为探针，采用免疫层析技术，结合荧光定量仪，实现对前列腺癌特异性抗原的快速、定量检测。所建立的量子点免疫层析检测方法具有灵敏度高(检测低限达0.02ng/mL)和重复性好(R.S.D.小于7％)的优点，检测时间仅需10分钟，与ELISA检测方法的相关性好。随后，国内外学者也将该检测技术成功地应用于毒素小分子、血清甲胎蛋白、总IgE快速定量检测。建立基于量子点标记的过敏原特异性IgE免疫层析检测技术，可能实现对过敏性疾病的快速、准确、便捷的诊断。
然而，本领域目前的过敏原特异性IgE检测技术无法在快速便捷诊断的同时保证较宽的检测范围。
因此，本领域需要开发一种检测范围更宽的量子点标记的过敏原特异性IgE免疫层析检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供基于量子点标记的过敏原特异性IgE检测抗体偶联物、试剂盒及其用途。
本发明的目的之二是，提供基于量子点标记的过敏原特异性IgE检测的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种制备用于检测过敏原特异性IgE的抗体偶联物的方法，所述方法包括步骤：
(S1)提供量子点微球和待标记的抗人IgE抗体；和
(S2)将所述抗人IgE抗体与量子点微球偶联，从而得到所述的抗体偶联物；
其中，所述的步骤(S2)中包括：
步骤(i)稀释所述待标记的抗人IgE抗体至0.1-10mg/mL，从而得到稀释的抗体；
步骤(ii)在所述稀释的抗体中加入活化试剂，从而得到活化抗体，其中所述的活化试剂与所述抗体的摩尔比为1-100:1；和
步骤(iii)将所述量子点微球与步骤(ii)得到的活化抗体混合反应，以得到反应混合物，其中，所述活化抗体与量子点微球的摩尔比为0.1-10:1。
在另一优选例中，步骤(i)中待标记的抗人IgE抗体优选地稀释至1-5mg/mL；进一步优选地稀释至2mg/mL。
在另一优选例中，步骤(ii)中所述的活化试剂与所述抗体的优选摩尔比为10-50:1；更优选地为20:1。
在另一优选例中，步骤(iii)中所述活化抗体与量子点微球的优选摩尔比为1-5:1；更优选地为2.7:1。
在另一优选例中，所述的步骤(iii)中，所述反应的温度优选为37℃，和/或所述反应的时间优选为12-24小时，更优选为14-20小时，进一步优选为16小时。
在另一优选例中，所述的步骤(S2)中包括步骤(iv)加入封闭液对所述反应混合物进行封闭反应，从而得到封闭的反应混合物，所述封闭反应温度优选为37℃，和/或所述封闭反应的时间优选为4小时。
在另一优选例中，所述的步骤(S2)中包括步骤(v)对所述反应混合物进行离心去除未标记的抗体，从而得到所述的抗体偶联物。
在另一优选例中，所述离心中，离心力优选为4000-12000g，更优选为6000-10000g，进一步优选为8000g；和/或离心时间为5-30分钟，优选为10-25分钟，进一步优选为20分钟。
在另一优选例中，所述的方法偶联效率>40％。
在另一优选例中，所述的抗人IgE抗体选自羊抗人IgE抗体。
在另一优选例中，所述方法制备得到的偶联物粒径为50-150nm，优选地为100-150nm，更优选地为140-150nm。
在另一优选例中，所述方法制备得到的偶联物Zeta电位为-28～-15mV，优选地为为-25～-18mV，更优选地为为-22～-19mV。
在另一优选例中，所述方法制备得到的偶联物多分散指数PDI值为<0.5，优选地为<0.3，更优选地为<0.2。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测过敏原特异性IgE的抗体偶联物，所述抗体偶联物为量子点微球和抗人IgE抗体的偶联物，并且所述的抗体偶联物由如本发明第一方面所述的方法制备得到。
在另一优选例中，所述的偶联物粒径为50-150nm，优选地为100-150nm，更优选地为140-150nm。
在另一优选例中，所述的偶联物Zeta电位为-28～-15mV，优选地为为-25～-18mV，更优选地为为-22～-19mV。
在另一优选例中，所述的偶联物多分散指数PDI值为<0.5，优选地为<0.3，更优选地为<0.2。
在本发明的第三方面，提供了一种检测过敏原特异性IgE的试剂盒，所述试剂盒包括：
(A)如本发明第二方面所述的偶联物；
(B)试剂条，所述试剂条包括：底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
其中，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述检测线包被有过敏原。
在另一优选例中，所述包被的过敏原浓度为0.1-5mg/mL，优选地为0.5-1mg/mL。
在另一优选例中，所述的过敏原包括过敏原粗提物、天然提取的过敏原组分和重组过敏原组分。
在另一优选例中，所述的过敏原选自下组：户尘螨、粉尘螨、德国小蠊、艾蒿、烟曲霉、狗毛屑、猫皮屑、虾、小麦、花生、蟹、虾、鸡蛋、牛奶、芝麻、大豆、普通豚草、艾蒿、藜、苍耳、及其组分、及其组合。
在另一优选例中，若样本中存在过敏原特异性IgE，过敏原特异性IgE可与本发明第二方面所述的偶联物形成“抗体偶联物-过敏原特异性IgE”复合物；所述检测线上的过敏原能够与所述“过敏原特异性IgE-抗体偶联物”复合物再次结合形成“过敏原-过敏原特异性IgE-抗体偶联物”三聚物。
在另一优选例中，所述的硝酸纤维素膜上，在检测线远端还设置有质控线，所述质控线包被有抗-抗人IgE抗体的第二抗体，所述第二抗体能够与本发明第二方面所述的偶联物形成“抗体偶联物-第二抗体”复合物。
在另一优选例中，所述的第二抗体为兔抗羊IgG抗体。
在另一优选例中，所述包被的抗体浓度为1mg/mL。
在另一优选例中，所述的试剂条的组装方法包括步骤：
(S1)将过敏原和第二抗体喷涂至硝酸纤维素膜上，分别作为检测线与质控线；
(S2)将喷涂后的硝酸纤维素膜干燥；
(S3)样品垫、喷涂后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次连接组装；
(S4)用样本垫处理液浸润样本，取出后干燥。
在另一优选例中，所述的试剂条的组装方法包括步骤：
(S1)将0.5-1mg/mL过敏原蛋白和1mg/mL兔抗羊IgG喷涂至硝酸纤维素膜上，分别作为检测线与质控线；
(S2)将喷涂后的硝酸纤维素膜37℃干燥16h；
(S3)样品垫、喷涂后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次连接组装；
(S4)用样本垫处理液浸润样本30min，取出后37℃干燥24h。
在另一优选例中，所述的样本垫处理液为含1.0％BSA、0.5％Tween-20pH8.4的0.1M磷酸盐缓冲液。
在另一优选例中，所述的检测为半定量检测。
在另一优选例中，所述的试剂盒包含说明书，所述说明书记载有使用试剂盒进行检测的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提供来自检测对象的待测样本；
(2)将待测样本、如本发明第二方面所述的偶联物和稀释液混合制备混合液；
(3)将所述混合液滴加在样本垫上；
(4)读取检测线值(T)和质控线值(C)，计算比值(即T/C)；
(5)根据T/C比值，参照标准曲线计算得到所述待测样本中的过敏原特异性IgE浓度。
在另一优选例中，所述的样本优选为血清。
在另一优选例中，所述的待测样本、偶联物和稀释液的体积比为按体积比10-100:1-5:10-50。
在另一优选例中，所述的待测样本-稀释液-偶联物比例为30:2:20。
在另一优选例中，所述的说明书中记载有标准曲线的制作方法，其包括步骤：
(1)提供已知浓度的过敏原特异性IgE阳性血清作为标准品，和过敏原特异性IgE阴性对象混合血清作为稀释血清，利用稀释血清将标准品稀释至梯度浓度；
(2)将稀释的标准品、如本发明第二方面所述的偶联物和稀释液按体积比30:2:20混合制备混合液；
(3)将所述混合液滴加在样本垫上；
(4)读取检测线值(T)和质控线值(C)，计算比值(即T/C)；
(5)以T/C比值为横坐标，过敏原特异性IgE为纵坐标，制作标准曲线。
在另一优选例中，所述的说明书记载有标准曲线。
在另一优选例中，所述的稀释液含有：磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1％TWEEN20，2％BSA和3％蔗糖。
在另一优选例中，所述的试剂盒的检测范围为0.1-100KU/L，优选为0.2-80KU/L，更优选地为0.2-73.4KU/L。
在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面所述的偶联物的用途，用于制备试剂盒，所述试剂盒用于：
(a)检测样本中的过敏原特异性IgE；和/或
(b)诊断过敏性疾病。
在另一优选例中，所述的过敏性疾病选自下组：过敏性哮喘、鼻炎、皮炎、或其组合。
在另一优选例中，所述的过敏原选自下组：户尘螨、粉尘螨、德国小蠊、艾蒿、烟曲霉、狗毛屑、猫皮屑、虾、小麦、花生、蟹、虾、鸡蛋、牛奶、芝麻、大豆、普通豚草、艾蒿、藜、苍耳、及其组分、及其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种过敏原特异性IgE检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提供来自检测对象的待测样本；
(2)将待测样本、如本发明第二方面所述的偶联物和稀释液混合制备混合液；
(3)将所述混合液滴加在样本垫上；
(4)读取检测线值(T)和质控线值(C)，计算比值(即T/C)；
(5)根据T/C比值，参照标准曲线计算得到所述待测样本中的过敏原特异性IgE浓度。
在另一优选例中，所述的过敏原选自下组：户尘螨、粉尘螨、德国小蠊、艾蒿、烟曲霉、狗毛屑、猫皮屑、虾、小麦、花生、蟹、虾、鸡蛋、牛奶、芝麻、大豆、普通豚草、艾蒿、藜、苍耳、及其组分、及其组合。
在另一优选例中，所述的检测方法使用如本发明第三方面所述的试剂盒进行检测。
在另一优选例中，所述的检测为半定量检测。
在另一优选例中，所述的方法为体外非诊断性检测方法。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了量子点微球在日光(A)及紫外(365nm)(B)下的照片。
图2显示了量子点微球及量子点微球-羊抗人IgE荧光光谱图。
图3显示了量子点微球及量子点微球-羊抗人IgE紫外-可见吸收光谱图。
图4显示了羊抗人IgE与量子点微球在偶联前(A)以及偶联后离心上清溶液(B)的SDS-PAGE结果。
图5显示了欧蒙印迹法与量子点免疫层析法检测血清尘螨过敏原特异性IgE比对。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种基于量子点标记的过敏原特异性IgE检测方法和用途。具体的，本发明经过大量筛选，发现了一种更佳的量子点抗体偶联物及其制备方法。本发明所制备的抗体偶联物及检测试剂盒不仅能够快速检测样本中的过敏原特异性IgE，并且较现有技术大大拓宽了检测范围。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
术语“含有”或“包括(包含)”可以使开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”或“由…构成”。
应理解，对于本文所述的包括一个以上步骤的任何方法，步骤的顺序不一定限于这些实施例中描述的顺序。
量子点微球-抗人IgE抗体偶联物
如本文所用，术语“本发明的偶联物”和“本发明的抗体偶联物”、“量子点微球-抗人IgE抗体偶联物”可互换使用，均指本发明第二方面所述的，偶联有量子点微球的抗人IgE抗体的偶联物。
本文所用的术语“量子点(Quantum Dots,QDs)”，也称半导体纳米晶，作为一种新型荧光纳米粒子，具有：荧光尺寸效应、发射峰狭窄对称、激发波长范围广、量子产率高、荧光寿命长、化学和光稳定性好等特点。
可能影响免疫层析检测结果的因素包括但不限于：量子点-抗体偶联物的粒径、电荷；抗体的质量；量子点的质量；及保存方法等。
本发明提供了用于检测过敏原特异性IgE的偶联物及其制备方法，该制备方法包括步骤：
(S1)提供量子点微球和待标记的抗人IgE抗体；和
(S2)将所述抗人IgE抗体与量子点微球偶联，从而得到所述的抗体偶联物；
其中，所述的步骤(S2)中包括：
步骤(i)稀释所述待标记的抗人IgE抗体至0.1-10mg/mL，从而得到稀释的抗体；
步骤(ii)在所述稀释的抗体中加入活化试剂，从而得到活化抗体，其中所述的活化试剂与所述抗体的摩尔比为1-100:1；和
步骤(iii)将所述量子点微球与步骤(ii)得到的活化抗体混合反应，以得到反应混合物，其中，所述活化抗体与量子点微球的摩尔比为0.1-10:1。
本发明通过调整制备过程中抗人IgE抗体的稀释浓度(0.1-10mg/mL，优选地1-5mg/mL；进一步优选地2mg/mL)、活化试剂与抗体的摩尔比(1-100:1，优选地为10-50:1；更优选地为20:1)和活化抗体与量子点微球的摩尔比(0.1-10:1，优选地为1-5:1；更优选地为2.7:1)，使制备得到偶联物粒径适中、有良好的稳定性和均一性、且不影响微球的荧光特性，从而在免疫层析检测中能够获得更宽的免疫检测范围。
在优选的实施方式中，本发明偶联物粒径为50-150nm，优选地为100-150nm，更优选地为140-150nm。
在优选的实施方式中，本发明偶联物Zeta电位为-28～-15mV，优选地为为-25～-18mV，更优选地为为-22～-19mV。
在优选的实施方式中，本发明偶联物多分散指数PDI值为<0.5，优选地为<0.3，更优选地<0.2。
在本发明的一个优选实施方式中，量子点微球-抗人IgE抗体偶联物按照以下方法制备得到：
(1)采样量子点微球-抗体标记试剂盒将羊抗人IgE与量子点微球偶联。
(2)采用反应工作液稀释待标记抗体至2mg/mL，加入活化试剂(活化试剂与抗体的摩尔比约为20:1)，充分混匀。
(3)量子点微球溶液(1μM)与已活化的抗体混合(抗体与量子点微球的摩尔比约为2.7:1)，37℃继续反应过夜。
(4)加入封闭液，37℃封闭4小时。
(5)离心去除未标记的抗体，重悬、混匀，合成了偶联抗人IgE抗体的量子点微球(量子点微球-抗人IgE抗体)。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明的量子点微球-抗人IgE抗体偶联物粒径为140-150nm，Zeta电位为-22～-19mV，多分散指数PDI<0.2，抗体偶联效率>40％。
试剂盒
本发明提供了检测过敏原特异性IgE的试剂盒，所述试剂盒包括：
(A)如本发明第二方面所述的偶联物；
(B)试剂条，所述试剂条包括：底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
其中，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述检测线包被有过敏原。
本发明检测的原理为：若样本中存在过敏原特异性IgE，过敏原特异性IgE可与本发明第二方面所述的偶联物形成“抗体偶联物-过敏原特异性IgE”复合物；检测线上的过敏原能够与“过敏原特异性IgE-抗体偶联物”复合物再次结合形成“过敏原-过敏原特异性IgE-抗体偶联物”三聚物。
硝酸纤维素膜上还在检测线远端还设置有质控线，所述质控线包被有抗-抗人IgE抗体的第二抗体，所述第二抗体能够与本发明第二方面所述的偶联物形成“抗体偶联物-第二抗体”复合物。
本发明试剂盒中试剂条的组装方法包括步骤：
(S1)将过敏原和第二抗体喷涂至硝酸纤维素膜上，分别作为检测线与质控线；
(S2)将喷涂后的硝酸纤维素膜干燥；
(S3)样品垫、喷涂后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次连接组装；
(S4)用样本垫处理液浸润样本，取出后干燥。
本发明的试剂盒采用免疫层析技术进行检测，并且至少可在0.2-73.4KU/L范围内半定量检测过敏原特异性IgE。
可能影响免疫层析检测结果的因素包括但不限于：试剂条(包括其包含的膜、结合垫、样品垫、吸水纸)、膜的包被条件(膜的封闭条件、检测线和质控线上抗原/抗体的浓度)、稀释缓冲液的质量、样品的类型(优选为血清样本，避免纤维蛋白原影响层析结果)、加样量、样本-稀释液-偶联物比例、检测试纸条的避光保存等。
在本发明中，提供了优化的检测试剂条制备方法。本发明通过调整制备过程中检测线和质控线上抗原/抗体的浓度、样品垫处理条件、样本-稀释液-偶联物比例等条件，使得所制备的免疫层析试剂条检测结果稳定、在可检测范围内灵敏度和特异性均较佳。
在本发明的优选实施方式中，所述检测线上包被的过敏原浓度为0.1-5mg/mL，优选地为0.5-1mg/mL。
在另一优选例中，所述的过敏原包括过敏原粗提物、天然提取的过敏原组分和重组过敏原组分。
在本发明的优选实施方式中，所述的质控线上包被有兔抗羊IgG抗体，所述包被的抗体浓度优选地为1mg/mL。
优选的试剂条制备方法包括步骤：
(S1)将0.5-1mg/mL过敏原蛋白和1mg/mL兔抗羊IgG喷涂至硝酸纤维素膜上，分别作为检测线与质控线；
(S2)将喷涂后的硝酸纤维素膜37℃干燥16h；
(S3)样品垫、喷涂后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次连接组装；
(S4)用样本垫处理液浸润样本30min，取出后37℃干燥24h。
优选的样本垫处理液为含1.0％BSA、0.5％Tween-20pH 8.4的0.1M磷酸盐缓冲液。
过敏原
如本文所用，“过敏原”是指能够使人发生过敏反应的抗原，也称为致敏原或变应原。当过敏原第一次进入机体，可导致机体形成过敏原特异性IgE，后者与效应细胞嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE高亲和力受体FcεRI结合，此为致敏过程；当过敏原再次进入机体，其可与效应细胞表面的特异性IgE结合，导致相邻的FcεRI交联，引起效应细胞激活，引起局部或全身过敏反应症状。
本发明的“过敏原”可以是任何能够引起过敏反应的抗原，包括(但不限于)户尘螨、粉尘螨、德国小蠊、艾蒿、烟曲霉、狗毛屑、猫皮屑、虾、小麦、花生、蟹、虾、鸡蛋、牛奶、芝麻、大豆、普通豚草、艾蒿、藜、苍耳、及其组分、及其组合。
本发明检测试剂盒的试剂条上设置有检测线，所述检测线包被有过敏原。若样本中存在过敏原特异性IgE，过敏原特异性IgE可与本发明的偶联物形成“抗体偶联物-过敏原特异性IgE”复合物；所述检测线上的过敏原能够与所述“过敏原特异性IgE-抗体偶联物”复合物再次结合形成“过敏原-过敏原特异性IgE-抗体偶联物”三聚物。
本发明所述的过敏原包括过敏原粗提物、天然提取的过敏原组分和重组过敏原组分。
检测方法
在本发明的一个优选实施方式中，量子点过敏原特异性IgE快速检测方法包括标准品检测流程和样本检测方法，其中标准品检测流程包括如下步骤：
(1)提供已知浓度的过敏原特异性IgE阳性血清作为标准品，和过敏原特异性IgE阴性对象混合血清作为稀释血清，利用稀释血清将标准品稀释至梯度浓度；
(2)将稀释的标准品、如本发明第二方面所述的偶联物和稀释液制备混合液；
(3)将所述混合液滴加在样本垫上；
(4)读取检测线值(T)和质控线值(C)，计算比值(即T/C)；
(5)以T/C比值为横坐标，过敏原特异性IgE为纵坐标，制作标准曲线。
样本检测方法包括如下步骤：
(1)提供来自检测对象的待测样本；
(2)将待测样本、如本发明第二方面所述的偶联物和稀释液混合制备混合液；
(3)将所述混合液滴加在样本垫上；
(4)读取检测线值(T)和质控线值(C)，计算比值(即T/C)；
(5)根据T/C比值，参照标准曲线计算得到所述待测样本中的过敏原特异性IgE浓度。
在本发明的检测方法中，待测样本-稀释液-偶联物按体积比为10-100:1-5:10-50，优选地为30:2:20。
在本发明的优选实施方式中，所述标准品检测流程包括步骤：
(1)标准品来源：已知浓度的人过敏原特异性IgE阳性血清；
(2)稀释血清：过敏原特异性IgE阴性体检患者混合血清；
(3)利用稀释血清将阳性血清稀释成0.5和0.2KU/L浓度，与收集的特异性IgE阳性血清形成浓度梯度(73.4、64.7、33、26、9.95、3.92、2、0.5、0.2KU/L)；
(4)稀释血清、量子点微球-抗人IgE和缓释液按30:2:20(v/v/v)比例混合制备混合液；
(5)将混合液滴加在样本区；
(6)等待15min，采用生物读数仪读数，计算检测线值(T)/控制线值(C)；
(7)以T/C比值为横坐标，过敏原特异性IgE为纵坐标，制作标准曲线。
本发明的主要优点包括：
1)本发明中基于量子点标记的过敏原特异性IgE检测方法能用于快速诊断过敏性疾病、明确过敏原和其组分。
2)本发明提供了更佳的抗体偶联物及其制备方法，所制备的检测试剂相比现有技术具有更宽的半定量检测范围。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：量子点微球的合成
采用超声乳化法制备水溶性量子点微球。可见量子点微球在日光(图1A)及紫外灯照射(波长为365nm)(图1B)下的实物照片，其溶液在日光下呈现橘色，在紫外光照射下呈现红色。
实施例2：量子点微球标记的羊抗人IgE抗体的合成
待标记抗体为羊抗人IgE抗体Meridian Goat anti Human IgE(Fc)(货号：G5G41-048)。采用反应工作液(磷酸盐缓冲液，PBS)稀释待标记抗体至2mg/mL，加入活化试剂(活化试剂与抗体的摩尔比约为20:1)，充分混匀。100μL量子点微球溶液(1μM)加入已活化的抗体(抗体与量子点微球的摩尔比约为2.7:1)，快速混匀，37℃继续反应过夜(约16小时)。加入2μL封闭液，37℃反应4小时。8000g离心20分钟，小心吸取并弃去上清，用90μL分散液重悬、混匀，合成了偶联抗人IgE抗体的量子点微球(量子点微球-抗人IgE抗体)，对该偶联物进行表征。采用动态光散射法检测量子点微球-抗人IgE抗体的粒径，检测其zeta电位。此外还检测了偶联前后量子点微球的荧光光谱以及紫外-可见吸收光谱变化。采用SDS-PAGE定量检测抗体交联率。
结果：偶联抗人IgE后量子点微球粒径发生轻微变化，从127.3±0.8nm增加到142.8±2.4nm。Zeta电位由偶联前-28.2±0.2mV增加至-20.6±0.7mV，说明偶联抗体后量子点微球稳定性依然良好。PDI值较低(＜0.2)，说明量子点微球-抗人IgE抗体的均一性较好。
荧光光谱检测结果显示，偶联前后荧光光谱基本没有变化，偶联过程不影响微球荧光特性(图2)。
紫外-可见吸收光谱图结果显示，在300nm以上波长段，量子点微球和量子点微球-抗人IgE的吸收光谱图没有显著区别；在300nm以下波长段量子点微球-抗人IgE的吸光强度较量子点微球更高，该结果表明量子点微球与抗人IgE成功地偶联(图3)。
采用SDS-PAGE分析偶联前后的抗体量，扫描灰度值(图4)。偶联率＝(偶联前溶液灰度值-偶联后上清灰度值)/偶联前溶液灰度值×100％。经计算，抗体偶联效率为46.36±2.91％。
以上结果证明，本实施例成功构建了具有良好稳定性、均一性，并能够保留微球荧光特性的量子点微球-抗人IgE抗体。本实施例的构建方法偶联效率良好。
实施例3：层析试纸条的组装
采用全自动点膜仪将0.5-1mg/mL尘螨过敏原蛋白以及1mg/mL兔抗羊IgG分别喷涂至硝酸纤维素膜上，作为试纸条检测线(T线)与质控线(C线)，37℃干燥16h。
将样品垫、喷涂有检测线与质控线的硝酸纤维素膜、吸水垫，依次相连组装到用于提供组装平台的塑料底衬上方。
用样本垫处理液(含1.0％BSA、0.5％Tween-20pH 8.4的0.1M磷酸盐缓冲液)将样品垫浸30min，取出后于37℃干燥箱中干燥24h，封存备用。
实施例4：检测效果测试
4.1标准曲线的建立
收集Unicap检测的不同浓度的尘螨过敏原IgE血清标本，分装保存，作为标准血清。同时收集尘螨过敏原特异性IgE阴性的血清10例，将其等比例混合，作为稀释血清。将高浓度血清以阴性血清稀释成0.5和0.2KU/L。尘螨特异性IgE浓度梯度为73.4、64.7、33、26、9.95、3.92、2、0.5、0.2KU/L，检测T以及C值，计算T/C值，以T/C为横坐标，Unicap检测结果为纵坐标，制备标准曲线。标准曲线数据如表1所示。血清尘螨过敏原特异性IgE浓度Y＝87.768×(T/C)-0.6855(KU/L)。
表1标准曲线建立
4.2方法验证
收集了Unicap定量检测的14例尘螨过敏患者血清，其中尘螨过敏原特异性IgE达到5级(500-100KU/L)的3例，4级5例(17.5-50KU/L)，3级3例(3.5-17.5KU/L)，2级1例(0.7-3.5KU/L)，1级1例(0.35-0.7KU/L)，收集了5例阴性患者血清。
结果：与Unicap定量检测方法比较，本发明方法的阳性符合率为92.82％(13/14)，等级符合率78.5％(11/14)。阴性符合率为80％(4/5)。该试剂盒可在0.2-73.4KU/L范围半定量检测尘螨特异性IgE。
4.3与欧蒙法比较
采用欧蒙公司印迹法检测过敏原特异性IgE。选取尘螨过敏原特异性IgE等级为5+、4+、3+、2+、1+以及阴性的血清，采用量子点微球免疫层析法检测尘螨过敏原特异性IgE。
结果：检测结果如图5和表2所示。由图5可见，量子点微球免疫层析法与欧蒙检测法具有较好的一致性。欧蒙印迹法测得血清尘螨过敏原特异性IgE浓度从低至高，量子点微球免疫层析法测得T线荧光强度以及T/C值(表2)亦由低变高。共收集了22例阳性标本，阳性符合率为81.82％(18/22)；阴性符合率为80％(4/5)。
表2欧蒙印迹法与量子点微球免疫层析法检测尘螨特异性IgE结果比较
讨论
本领域现有的过敏原特异性IgE免疫层析检测技术能够半定量检测的范围往往较为狭窄，不利于快速准确地评估患者是否存在过敏以及严重程度。本发明在此基础上作出了改进。
影响免疫层析检测结果的因素包括但不限于：量子点-抗体偶联物的粒径、电荷；抗体的质量；量子点的质量；试剂条(包括其包含的膜、结合垫、样品垫、吸水纸)、检测线和质控线上抗原/抗体的浓度、稀释缓冲液、样品的类型、加样量、样本-稀释液-偶联物比例等。
本发明针对上述影响因素作出了改进。一方面，本发明通过调整制备过程中抗人IgE抗体的稀释浓度、活化试剂与抗体的摩尔比和活化抗体与量子点微球的摩尔比，使制备得到偶联物粒径适中、有良好的稳定性和均一性、且不影响微球的荧光特性，从而在免疫层析检测中能够获得更宽的免疫检测范围。
另一方面，本发明提供了优化的检测试剂条制备方法和检测方法。本发明通过调整制备过程中检测线和质控线上抗原/抗体的浓度、样品垫处理条件、样本-稀释液-偶联物比例等条件，使得所制备的免疫层析试剂条检测结果稳定、在可检测范围内灵敏度和特异性均较佳。
实验证明，本发明的检测试剂盒用于尘螨过敏原检测时，至少可以在0.2-73.4KU/L范围内半定量检测过敏原特异性IgE。并且与欧蒙法检测结果具有较好的一致性。
综上所述，本发明的量子点微球偶联物及检测试剂盒具有优秀的灵敏度和特异性、能快速得到检测结果、并较现有技术大大拓宽了检测范围。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备用于检测过敏原特异性IgE的抗体偶联物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(S1)提供量子点微球和待标记的抗人IgE抗体；和
(S2)将所述抗人IgE抗体与量子点微球偶联，从而得到所述的抗体偶联物；
其中，所述的步骤(S2)中包括步骤：
(i)稀释所述待标记的抗人IgE抗体至0.1-10mg/mL，从而得到稀释的抗体；
(ii)在所述稀释的抗体中加入活化试剂，从而得到活化抗体，其中所述的活化试剂与所述抗体的摩尔比为1-100:1；和
(iii)将所述量子点微球与步骤(ii)得到的活化抗体混合反应，以得到反应混合物，其中，所述活化抗体与量子点微球的摩尔比为0.1-10:1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(ii)中所述的活化试剂与所述抗体的优选摩尔比为10-50:1；更优选地为20:1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(iii)中所述活化抗体与量子点微球的优选摩尔比为1-5:1；更优选地为2.7:1。
4.一种用于检测过敏原特异性IgE的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物为量子点微球和抗人IgE抗体的偶联物。
5.如权利要求4所述的偶联物，其特征在于，所述的偶联物由如权利要求1所述的方法制备得到。
6.如权利要求4所述的偶联物，其特征在于，所述的偶联物粒径为50-150nm，优选地为100-150nm，更优选地为140-150nm。
7.如权利要求4所述的偶联物，其特征在于，所述的偶联物Zeta电位为-28～-15mV，优选地为为-25～-18mV，更优选地为为-22～-19mV。
8.如权利要求4所述的偶联物，其特征在于，所述的偶联物多分散指数PDI值为<0.5，优选地为<0.3，更优选地为<0.2。
9.一种检测过敏原特异性IgE的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(A)如权利要求4-8中任一项所述的偶联物；
(B)试剂条，所述试剂条包括：底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
其中，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述检测线包被有过敏原，检测线远端还设置有质控线，所述质控线包被有抗-抗人IgE抗体的第二抗体，所述第二抗体能够与权利要求1所述的偶联物形成“抗体偶联物-第二抗体”复合物。
10.一种如权利要求4-8中任一项所述的偶联物的用途，其特征在于，用于制备试剂盒，所述试剂盒用于：
(a)检测样本中的过敏原特异性IgE；和/或
(b)诊断过敏性疾病。
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